誘導(dǎo)抗原特異性調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及引發(fā)載有凋亡細(xì)胞或凋亡體的未成熟抗原呈遞細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及體外或體內(nèi)獲得抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方法。載有凋亡體/凋亡細(xì)胞的細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可通過(guò)用溶細(xì)胞性CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞凋亡來(lái)獲得。所述細(xì)胞用于抑制或預(yù)防疾病，例如自體免疫疾病、移植物排斥和過(guò)敏性疾病，以及與其相關(guān)的藥物。還公開了用于抑制或預(yù)防疾病，例如自體免疫疾病、移植物排斥和過(guò)敏性疾病的抗原特異性調(diào)節(jié)心T細(xì)胞以及其相關(guān)藥物的應(yīng)用。還公開了通過(guò)所述方法獲得的抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的群。
【專利說(shuō)明】誘導(dǎo)抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及獲得抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方法及其作為藥物治療病癥（如自體 免疫疾病、過(guò)敏性疾病或移植排斥）的應(yīng)用。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg)，尤其是表達(dá)轉(zhuǎn)錄受體Foxp3 (叉頭框P3)的Treg，是維持 正常免疫穩(wěn)定狀態(tài)所必需的。在此類細(xì)胞不存在時(shí)，自體免疫迅速發(fā)展，并伴隨臨床表現(xiàn) 例如糖尿病和其它自體免疫疾?。▍⒁奡akaguchi等·（2012)Nature Med. 18, 54-58)。 Foxp3+Treg在胸腺中被主動(dòng)選擇，并且組成周圍血液中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞群,其穩(wěn)定表達(dá)Foxp3。 在同種識(shí)別由胸腺上皮細(xì)胞呈遞的自身肽后的胸腺中選擇細(xì)胞的閾值使得在外周血中發(fā) 現(xiàn)具有顯著親和性的Foxp3+細(xì)胞，這與效應(yīng)T細(xì)胞不同。目前的觀點(diǎn)是，外周耐受尤其通 過(guò)弱親和性的自身抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞與Foxp3+細(xì)胞之間的平衡由此提供平衡至耐受來(lái) 得以維持。除了對(duì)Treg的所述中心選擇以外，細(xì)胞可在外周被轉(zhuǎn)化以表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3。 然而，表達(dá)低于胸腺選擇的群，并且觀察到獲取的表型具有一些可逆性。
[0004] 天然Treg的性質(zhì),如選擇自胸腺中并且以高度且穩(wěn)定地表達(dá)Foxp3為特點(diǎn)，使其 就作為控制以自體免疫應(yīng)答為特點(diǎn)的疾病的手段以及保持對(duì)移植物或受控過(guò)敏原的不需 要應(yīng)答的治療工具等而言具有吸引力。然而，外周中的抗原特異性天然Treg非常低，并且 使其體內(nèi)甚至體外擴(kuò)增的方法既不確定又不可靠 。一種能夠選擇性擴(kuò)增Treg群的方法將 有可能防止或抑制疾病進(jìn)程但不影響器官產(chǎn)生有益應(yīng)答的整體能力。
[0005] 凋亡，或程序性細(xì)胞死亡，是幫助維持組織穩(wěn)定狀態(tài)的生理學(xué)機(jī)制（參見Fuchs和 Steller(2011)Cell 147,742-758)。已經(jīng)計(jì)算在人體中，每分鐘有多至IO6個(gè)細(xì)胞通過(guò)凋亡 被損毀。須控制通過(guò)細(xì)胞死亡而釋放的大量抗原，從而避免引發(fā)針對(duì)自身蛋白質(zhì)的免疫應(yīng) 答。實(shí)際上，凋亡的細(xì)胞被清除細(xì)胞（主要是未成熟樹突細(xì)胞）攝取，然后以某種方式被處 理以誘導(dǎo)耐受。源自凋亡細(xì)胞的抗原的交叉呈遞出現(xiàn)在II類主要組織相容性復(fù)合體（MHC) 中，已知其引發(fā)F 〇Xp3+Treg的表達(dá)。因此，在炎性狀態(tài)不存在時(shí)發(fā)生的細(xì)胞凋亡，顯示了使 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增的一種生理學(xué)途徑。
[0006] 因此，需要設(shè)計(jì)一種能夠誘導(dǎo)呈遞自體抗原或引起不希望的免疫應(yīng)答（例如，過(guò) 敏性疾病或移植物排斥）的抗原的細(xì)胞凋亡的方法，這之后將產(chǎn)生凋亡體，導(dǎo)致抗原特異 性Treg的表達(dá)。本領(lǐng)域已知的非特異性免疫抑制治療法通常易于發(fā)生嚴(yán)重感染和其它嚴(yán) 重后果，其嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。因此，開發(fā)采用抗原特異性Treg來(lái)治療免疫疾病但不產(chǎn)生 傳統(tǒng)療法的不利后果的方法是有利的。
[0007] W02008/017517中已經(jīng)描述了能夠引發(fā)抗原特異性溶細(xì)胞性CD4+T細(xì)胞（cCD4+T 細(xì)胞）的一般方法。此類細(xì)胞在同類識(shí)別肽-MHC II類復(fù)合體之后誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的 凋亡。不同于且優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供通過(guò)誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞凋亡來(lái)擴(kuò)增抗原特異性 Foxp3 Treg，所述抗原呈遞細(xì)胞攜帶源自移植物釋放的同種抗原、自體抗原或免疫原的II 類限制性表位。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明描述引發(fā)抗原特異性Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方法。
[0010] 這些方法包括如下一般步驟：
[0011] (a)獲得抗原特異性溶細(xì)胞性⑶4+T細(xì)胞；
[0012] (b)通過(guò)使抗原呈遞細(xì)胞接觸所述溶細(xì)胞性CD4+T細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)所述抗原呈遞細(xì)胞 的凋亡；
[0013] (C)由所述抗原呈遞細(xì)胞的凋亡獲得凋亡細(xì)胞和凋亡體；和
[0014] (d)使所述凋亡細(xì)胞或凋亡體與能夠呈遞來(lái)自所述凋亡細(xì)胞或凋亡體的抗原的細(xì) 胞孵育。
[0015] C⑶4+T (溶細(xì)胞性⑶4+細(xì)胞）細(xì)胞可通過(guò)主動(dòng)免疫動(dòng)物然后采用被覆有表面特異 性抗體的磁珠進(jìn)行親和純化來(lái)制備獲得。通常使⑶8+、⑶19+、⑶127+細(xì)胞減少。
[0016] 或者，體外獲得CCD4+T細(xì)胞，該方法包括從動(dòng)物分離原初CD4+T細(xì)胞，并在培養(yǎng)中 接觸包含本文中或W02008/017517中所述的側(cè)接殘基內(nèi)含硫還原酶（thioreductase)基序 的II類限制性表位?；蛘?，可體外獲得cCD4+T細(xì)胞，該方法包括從動(dòng)物分離極化的CD4+T 細(xì)胞，并在培養(yǎng)中接觸包含本文中或W02008/017517中所述的側(cè)接殘基內(nèi)含硫還原酶基序 的II類限制性表位。
[0017] 所述C⑶4+T細(xì)胞可用于體內(nèi)誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的凋亡，該方法包括傳遞動(dòng)物中 的cCD4+T細(xì)胞，該動(dòng)物主動(dòng)產(chǎn)生針對(duì)由cCD4+T細(xì)胞識(shí)別的抗原的免疫應(yīng)答。
[0018] 在本發(fā)明方法的實(shí)施方式中，所述CCD4+T細(xì)胞在體外用于與抗原呈遞細(xì)胞培養(yǎng)， 所述抗原呈遞細(xì)胞呈遞由CCD4+T細(xì)胞識(shí)別的表位，以產(chǎn)生或獲得凋亡體。
[0019] 在本發(fā)明方法的其它實(shí)施方式中，使未成熟抗原呈遞細(xì)胞載上體外培養(yǎng)所得的凋 亡體，并且所述未成熟抗原呈遞細(xì)胞用于采用獲自未處理動(dòng)物的CD4+T細(xì)胞群通過(guò)循環(huán)刺 激來(lái)產(chǎn)生或獲得抗原特異性Treg。
[0020] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，載有體外培養(yǎng)所得的凋亡體的所述未成熟抗原呈遞細(xì) 胞用于被動(dòng)傳送進(jìn)入需要治療的動(dòng)物。
[0021] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，載有凋亡體的所述未成熟抗原呈遞細(xì)胞用于體外產(chǎn)生 或獲得Treg,以供被動(dòng)傳送至需要治療的動(dòng)物。
[0022] 在本發(fā)明的特定方面中，通過(guò)本文所述的方法獲得（和/或分離）的Treg用于預(yù) 防或治療對(duì)所述預(yù)防或治療有需要的患者的疾病。所述疾病可以是自體免疫疾病、過(guò)敏性 疾病或移植物排斥。
[0023] 本發(fā)明的方面設(shè)計(jì)獲得載有凋亡細(xì)胞或凋亡體的細(xì)胞的方法。這些方法包括如下 步驟：
[0024] a)提供針對(duì)某一抗原的抗原特異性溶細(xì)胞性⑶4+T細(xì)胞，
[0025] b)提供抗原呈遞細(xì)胞，呈遞所述抗原，
[0026] c)使所述抗原呈遞細(xì)胞接觸所述溶細(xì)胞性CD4+T細(xì)胞，由此誘導(dǎo)所述抗原呈遞細(xì) 胞凋亡；
[0027] d)從經(jīng)歷步驟c)中的凋亡的抗原呈遞細(xì)胞分離凋亡細(xì)胞或凋亡體；和
[0028] e)使所述凋亡細(xì)胞或凋亡體與能夠呈遞來(lái)自所述凋亡細(xì)胞或來(lái)自所述凋亡體的 抗原的細(xì)胞孵育，由此獲得載有所述凋亡細(xì)胞或凋亡體的細(xì)胞。
[0029] 除此以外，這些方法還可包括步驟f)用于通過(guò)使步驟e)的負(fù)載細(xì)胞接觸其它 ⑶4+T細(xì)胞源來(lái)獲得抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，由此獲得抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群。這些 細(xì)胞對(duì)已用于產(chǎn)生所述抗原特異性溶細(xì)胞性CD4+T細(xì)胞的抗原具有特異性。
[0030] 此類抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通常是Foxp3高⑶4+Τ細(xì)胞。
[0031] 根據(jù)某些實(shí)施方式，⑶4+T細(xì)胞的源選自下組：原初⑶4+T細(xì)胞、極化的⑶4+T細(xì) 胞，和天然Treg。
[0032] 根據(jù)某些實(shí)施方式，能夠呈遞來(lái)自所述凋亡細(xì)胞或來(lái)自所述凋亡體的抗原的細(xì)胞 選自下組：樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和能夠表達(dá)MHC II類決定簇的細(xì)胞。步驟d) 中分離的凋亡細(xì)胞或凋亡體可通過(guò)親和純化、離心、凝膠過(guò)濾、磁珠分選或熒光激活的分選 來(lái)分離。
[0033] 能夠呈遞來(lái)自凋亡細(xì)胞或凋亡體的抗原的細(xì)胞可以是通過(guò)外周血單核細(xì)胞或骨 髓源性前體轉(zhuǎn)化的未成熟的抗原呈遞細(xì)胞。
[0034] 用于所述方法的實(shí)施方式的抗原可以是自體免疫抗原、免疫原或移植排斥中涉及 的抗原。
[0035] 本發(fā)明方法的實(shí)施方式中，抗原特異性溶細(xì)胞性CD4+T細(xì)胞通過(guò)如下方式獲 得：使外周血細(xì)胞與肽接觸，所述肽包含所述抗原的MHC II類限制性表位和具有基序 [CST] -X (2) -C 或 C-X (2) - [CST]的序列。
[0036] 在本發(fā)明方法的實(shí)施方式中，抗原特異性溶細(xì)胞性CD4+T細(xì)胞獲自原初CD4+T細(xì) 胞、極化的CD4+T細(xì)胞或來(lái)自天然Treg。在這些方法的其它實(shí)施方式中，進(jìn)行將步驟e)中 獲得的載有所述凋亡細(xì)胞或凋亡體的細(xì)胞分離的額外步驟。
[0037] 本發(fā)明方法的其它實(shí)施方式包括將通過(guò)所述方法獲得的抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì) 胞分離的步驟。
[0038] 在特定實(shí)施方式中，基于表面標(biāo)志物⑶25和/或CTLA_4(通常均高度表達(dá)）的表 達(dá)或基于細(xì)胞因子TGF-β和/或IL-10或基于Foxp3的表達(dá)來(lái)將抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì) 胞分成不同亞組。
[0039] 本發(fā)明的另一方面涉及通過(guò)上述方法獲得的抗原特異性Treg的群。
[0040] 本發(fā)明的另一方面涉及作為藥物應(yīng)用的通過(guò)上述方法獲得的載有凋亡細(xì)胞或凋 亡體的細(xì)胞的群。
[0041] 本發(fā)明的另一方面涉及作為藥物應(yīng)用的通過(guò)上述方法獲得的抗原特異性調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的群。
[0042] 另一個(gè)方面涉及包含通過(guò)上述方法獲得的載有凋亡細(xì)胞或凋亡體的細(xì)胞的群和 藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體的藥物組合物。
[0043] 另一方面涉及包含通過(guò)上述方法獲得的抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和藥學(xué)上可接 受的運(yùn)載體的藥物組合物。
[0044] 本發(fā)明的另一方面涉及治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物疾病的方法，所述疾病選自自體免疫 疾病、過(guò)敏性疾病、移植排斥、慢性炎性疾病，所述方法包括如下步驟：給予所述哺乳動(dòng)物對(duì) 象如權(quán)利要求14所述的抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的群。哺乳動(dòng)物通常是人。
[0045] 本發(fā)明的另一方面涉及治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物疾病的方法，所述疾病選自自體免疫 疾病、過(guò)敏性疾病、移植排斥、慢性炎性疾病，所述方法包括如下步驟：給予所述哺乳動(dòng)物對(duì) 象載有凋亡細(xì)胞或凋亡體的細(xì)胞的群。哺乳動(dòng)物通常是人。
[0046] 可用上述細(xì)胞治療的疾病包括自體免疫疾病、過(guò)敏性疾病、移植物排斥、慢性炎性 疾病。
[0047] 所述自體免疫疾病可以是全身性或器官特異性的自體免疫疾病。
[0048] 所述自體免疫疾病可針對(duì)抗原例如甲狀腺球蛋白、甲狀腺過(guò)氧化物酶、TSH受體、 胰島素（胰島素原）、谷氨酸脫羧酶（GAD)、酪氨酸磷酸酶IA-2、髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞蛋白和 熱激蛋白HSP65。
[0049] 針對(duì)過(guò)敏原的過(guò)敏性疾病可以是針對(duì)空氣傳播過(guò)敏原、食物過(guò)敏原、接觸過(guò)敏原 或全身性過(guò)敏原的過(guò)敏反應(yīng)。
[0050] 移植物排斥可以是細(xì)胞來(lái)源或組織來(lái)源的移植物排斥。
[0051] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及通過(guò)上述方法獲得的抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞用于評(píng) 價(jià)抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用機(jī)制的應(yīng)用。
[0052] 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0053] 圖1顯示在女性受者上移植的男性皮膚移植物中的Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的累積。 在該移植物中，有12. 5%的⑶3+淋巴細(xì)胞群顯示為Foxp3+細(xì)胞，對(duì)比正常皮膚中的1 % (η =3只小鼠/組）。
[0054] 發(fā)明詳述
[0055] 定義
[0056] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"肽"指包含由肽鍵連接的2?200個(gè)氨基酸的氨基酸序列的分 子，但其可包含非氨基酸結(jié)構(gòu)（例如，連接有機(jī)化合物）。本發(fā)明方法中所用的肽可包含任 何20個(gè)常規(guī)氨基酸或其修飾形式，或可包含通過(guò)化學(xué)肽合成或通過(guò)化學(xué)或酶修飾引入的 非天然發(fā)生的氨基酸。本文所用的術(shù)語(yǔ)"抗原"指某種大分子結(jié)構(gòu)，通常是蛋白質(zhì)（含或不 含多糖）或由包含一個(gè)或多個(gè)半抗原且包含T細(xì)胞表位的蛋白質(zhì)組合組成。
[0057] 本文所用術(shù)語(yǔ)"抗原性蛋白質(zhì)"指包含一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞表位的蛋白質(zhì)。本文所 用的自體抗原或自體抗原性蛋白質(zhì)指體內(nèi)存在的人或動(dòng)物蛋白質(zhì)，其引發(fā)相同人或動(dòng)物體 內(nèi)的免疫應(yīng)答。
[0058] 術(shù)語(yǔ)"食物或藥物抗原性蛋白質(zhì)"指天然存在于食物或藥物產(chǎn)品（例如疫苗）中 的抗原性蛋白質(zhì)。
[0059] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"表位"指抗原性蛋白質(zhì)的一個(gè)或數(shù)個(gè)部分（其可定義一個(gè)構(gòu)象 表位），所述部分被抗體或其部分（Fab'、Fab2'等）或存在于B或T細(xì)胞淋巴細(xì)胞的細(xì)胞 表面的受體特異性識(shí)別并結(jié)合，并能夠通過(guò)所述結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
[0060] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
中的術(shù)語(yǔ)"T細(xì)胞表位"指顯性、亞顯性或隱性T細(xì)胞表位，S卩，被T淋 巴細(xì)胞的細(xì)胞表面受體特異性識(shí)別并結(jié)合的抗原性蛋白質(zhì)的部分。表位是顯性、亞顯性或 是隱性取決于針對(duì)所述表位引起的免疫反應(yīng)。顯性取決于所述表位在蛋白質(zhì)的所有可能T 細(xì)胞表位中被T細(xì)胞識(shí)別以及能夠激活T細(xì)胞的頻率。在【具體實(shí)施方式】中，T細(xì)胞表位是 由MHC II類分子識(shí)別的表位，其由與所述MHC II分子的槽契合的8或9個(gè)氨基酸的序列 (視該II類單體型而定）組成。在代表T細(xì)胞表位的肽序列中，將該表位中的氨基酸編號(hào) 為P1-P9,該表位N末端的氨基酸編號(hào)為P-1、P-2等，該表位C末端的氨基酸編號(hào)為P+1、 P+2 等。
[0061] 術(shù)語(yǔ)"自體抗原"指由相同物種的兩個(gè)個(gè)體之間的蛋白質(zhì)多態(tài)性產(chǎn)生的抗原。
[0062] 術(shù)語(yǔ)"自體反應(yīng)性"指針對(duì)移植物受體和供體之間的等位差異而產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。 自體反應(yīng)性應(yīng)用于抗體和T細(xì)胞。在本
【發(fā)明內(nèi)容】
中，其涉及T細(xì)胞自體反應(yīng)性，這基于T細(xì) 胞對(duì)由肽-MHC復(fù)合體的MHC決定簇內(nèi)容中呈遞的自體抗原的識(shí)別。
[0063] 術(shù)語(yǔ)"主要組織相容性抗原"指屬于人HLA系統(tǒng)（小鼠的H2)的分子，其被分為兩 個(gè)一般類別。MHC I型分子由含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域的單一多態(tài)性鏈組成（α 1、2和3)，其與細(xì)胞 表面上的β 2微球蛋白相關(guān)。I類分子由在人類中稱為Α、Β和C的3個(gè)基因座編碼。此類 分子向⑶8+亞組的T淋巴細(xì)胞呈遞肽。II型分子由2條多態(tài)性鏈組成，其各自含有2條 鏈（α 1和2,以及β 1和2)。這些II類分子由在人類中稱為DP、DQ和DR的3個(gè)基因座編 碼。
[0064] 術(shù)語(yǔ)"次要組織相容性抗原"指源自正常細(xì)胞蛋白質(zhì)并且被屬于I類和/或II類 復(fù)合體的MHC呈遞的肽。在質(zhì)上或量上影響此類肽在細(xì)胞表面上呈現(xiàn)的任何遺傳多態(tài)性可 產(chǎn)生次要組織相容性抗原。
[0065] 述及表位時(shí)，本文所用的術(shù)語(yǔ)"同源物"指這樣的分子：所述分子與天然發(fā)生的表 位具有至少50%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%氨基酸序列相同 性，由此保持該表位與抗體或B細(xì)胞和/或T細(xì)胞的細(xì)胞表面受體結(jié)合的能力。某一表位 的具體同源物對(duì)應(yīng)于天然表位而言在至多三個(gè)，更具體地至多兩個(gè)，更具體地至多一個(gè)氨 基酸上有修飾。
[0066] 述及肽，本文所用的術(shù)語(yǔ)"衍生物"是指至少含有肽活性部分（例如，能夠引發(fā)細(xì) 胞溶解性CD4+T細(xì)胞活性）的分子，并且所述分子還包含可以具有不同目的（諸如使所述 肽穩(wěn)定或改變所述肽的藥代動(dòng)力學(xué)或藥效性質(zhì)）的互補(bǔ)部分。
[0067] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
中，術(shù)語(yǔ)"具有還原活性的有機(jī)化合物"指對(duì)蛋白質(zhì)的二硫鍵具有還原 活性的化合物，更具體地，氨基酸序列。
[0068] 所述術(shù)語(yǔ)"免疫紊亂"或"免疫疾病"指生物體內(nèi)免疫系統(tǒng)的反應(yīng)引起或維持失常 或非生理狀況的疾病。免疫疾病包括過(guò)敏性疾病和自體免疫疾病。
[0069] 本文所用術(shù)語(yǔ)"過(guò)敏性疾病"或"過(guò)敏性紊亂"指以免疫系統(tǒng)對(duì)于稱作免疫原的特 定物質(zhì)（例如花粉、刺毛、藥物或食物）的超敏反應(yīng)為特征的疾病。過(guò)敏，是遺傳性過(guò)敏癥 個(gè)體患者接觸使其敏感化的過(guò)敏原時(shí)所顯示的跡象和癥狀的統(tǒng)稱，其可導(dǎo)致發(fā)展出各種疾 病，尤其是呼吸道疾病和癥狀，例如支氣管哮喘。存在不同類型的分類方法，并且大多數(shù)過(guò) 敏性疾病根據(jù)其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生的位置而具有不同的名稱。"超敏反應(yīng)"是不希望的 (破壞性、造成不舒適而有時(shí)致命）的反應(yīng)，其在個(gè)體接觸使其敏感化的抗原之后于該個(gè)體 中產(chǎn)生；"速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)"視IgE抗體的產(chǎn)量而定并因而等同于過(guò)敏癥。
[0070] 術(shù)語(yǔ)"自體免疫疾病"或"自體免疫紊亂"指生物體針對(duì)其自身細(xì)胞或組織的異常 免疫應(yīng)答導(dǎo)致的疾病，這歸因于該生物體無(wú)法識(shí)別其自身組成部分（低至亞分子水平）為 "自身"。該組疾病可被分為兩類：器官特異性（例如愛迪生病、溶血性貧血或惡性貧血、古 德帕斯丘綜合征、格氏病、特發(fā)性血小板減少性紫癜、胰島素依賴型糖尿病、青少年糖尿病、 葡萄膜炎、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、天皰瘡、過(guò)敏性皮膚炎、自體免疫性肝炎、原發(fā)性膽 汁性肝硬化、自體免疫性肺炎、自體免疫性心肌炎、重癥肌無(wú)力、血管球性腎炎和自發(fā)性不 育癥，以及全身性疾病，例如紅斑狼瘡、銀屑病、血管炎、多肌炎、硬皮病、多發(fā)性硬化、強(qiáng)直 性脊柱炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和干燥綜合征。因此，自身免疫病癥針對(duì)自身細(xì)胞或組織，并且 包含針對(duì)"自體抗原"的反應(yīng)，自體抗原表示的抗原（例如，蛋白質(zhì)）是特定哺乳動(dòng)物生物 體自己的組成部分。在這種機(jī)制中，由B-細(xì)胞和/或T-細(xì)胞識(shí)別自體抗原，其會(huì)引起針對(duì) 所述自體抗原的免疫反應(yīng)。
[0071] 術(shù)語(yǔ)"自體免疫疾病"或"自體免疫紊亂"所包括的疾病的非限制性列表包含：急 性播散性腦脊髓炎（ADEM)、阿狄森氏病、斑禿、抗磷脂抗體綜合征（APS)、自身免疫性溶血、 自體免疫性肝炎、大皰性類天皰瘡、白塞氏病、腹部疾病、炎性腸?。↖BD)(諸如克羅恩病和 潰瘍性結(jié)腸炎）、皮肌炎、1型糖尿病、古德帕斯徹氏綜合征、格雷夫斯氏病、格-巴二氏綜 合征（Guillain-Barr6 syndrome) (GBS)、橋本病、特發(fā)性血小板減少性紫癜、紅斑狼瘡、混 合型結(jié)締組織病、多發(fā)性硬化（MS)、重癥肌無(wú)力、嗜睡癥、慢性天皰瘡、惡性貧血、銀屑病、銀 屑病性關(guān)節(jié)炎、多肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)、舍格倫綜合征、顳動(dòng)脈 炎、脈管炎、韋格納肉芽腫病和特應(yīng)性皮炎。
[0072] "過(guò)敏原"定義為一種物質(zhì)，通常是大分子或蛋白質(zhì)成分，其在有傾向的、尤其是遺 傳傾向的個(gè)體（特應(yīng)性）患者中引發(fā)IgE抗體產(chǎn)生。相似定義見于Liebers等.（1996) Clin. Exp. Allergy 26,494-516。
[0073] 術(shù)語(yǔ)"炎性疾病"或"炎性紊亂"指其中顯示炎癥的典型特征的疾病。因此，該術(shù)語(yǔ) 可能與其中也顯示炎性方面的其它疾病重疊。本領(lǐng)域已知"急性炎癥"和"慢性炎性疾病" 之間存在差異。術(shù)語(yǔ)"炎性疾病"或"炎性紊亂"包括但不限于選自下組的疾?。侯愶L(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎、類風(fēng)濕性脊椎炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、支氣管炎、結(jié)核、慢性膽囊炎、 炎性腸病、急性胰炎、敗血癥、哮喘、慢性阻塞性肺病、皮膚炎性疾病例如銀屑病和特應(yīng)性皮 炎、全身炎性反應(yīng)綜合征（SIRS)、急性呼吸窘迫綜合征（ARDS)、癌癥相關(guān)炎癥、腫瘤相關(guān)血 管生成的減少、糖尿病、移植物V.宿主疾病與相關(guān)聯(lián)的組織排斥炎性反應(yīng)的治療、克羅恩 氏病、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、免疫介導(dǎo)的和炎性CNS疾病要素；例如，阿茲海默癥、帕金森病、多 發(fā)性硬化等。術(shù)語(yǔ)"治療有效量"指在患者中產(chǎn)生所需治療或預(yù)防效果的細(xì)胞數(shù)。例如，述 及疾病或紊亂，其為一定程度上使所述疾病或紊亂的一種或多種癥狀減少，尤其是使與所 述疾病或紊亂相關(guān)或引起所述疾病或紊亂的生理學(xué)參數(shù)或生化參數(shù)部分或完全回復(fù)至正 常的細(xì)胞數(shù)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】，所述治療有效量是導(dǎo)致正常生理狀況改善 或恢復(fù)的細(xì)胞數(shù)。例如，當(dāng)用于治療性治療受免疫疾病影響的哺乳動(dòng)物時(shí)，其為每天的細(xì)胞 數(shù)/kg該哺乳動(dòng)物體重。
[0074] 本文中述及肽或序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)"天然的"指該序列與天然發(fā)生的序列相同。這包括 群體中大多數(shù)所具有的野生型序列，但也包括群體中出現(xiàn)的不常見的多態(tài)性和突變。相反， 術(shù)語(yǔ)"人工的/人造的"指自然中不存在的序列或肽。任選地，人工序列通過(guò)對(duì)天然序列進(jìn) 行有限修飾而獲得，所述修飾例如更換天然發(fā)生序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，向天然發(fā)生 序列的N末端或C末端添加氨基酸。本文中，氨基酸采用其全名、三字母縮寫形式或單字母 縮寫形式表示。
[0075] 〃F〇xp3〃（叉頭框P3)是叉-翼螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，其在天然發(fā)生的⑶4-陽(yáng) 性/⑶25-陽(yáng)性T調(diào)節(jié)細(xì)胞（Treg)的發(fā)育和功能中起重要作用。
[0076] 〃Treg〃（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）Treg涉及對(duì)不適當(dāng)免疫應(yīng)答的主動(dòng)抑制。這些細(xì)胞是 CD4+、CD25+、FoxP3+ 細(xì)胞。
[0077] "原初cd4+T細(xì)胞〃表達(dá)⑶62L，低度或中度表達(dá)⑶44,低產(chǎn)細(xì)胞因子，無(wú)優(yōu)選通路。 〃極化的⑶4+細(xì)胞〃具有高⑶44表達(dá)并生成有限的細(xì)胞因子組。
[0078] 〃cCD4+T細(xì)胞〃溶細(xì)胞性CD4+T細(xì)胞已在WO 2009/101207中具體表征，并且以如 下性質(zhì)中的一種或多種為特點(diǎn)：_轉(zhuǎn)錄阻遏物Foxp3的表達(dá)不可檢測(cè)，
[0079] -絲氨酸-蘇氨酸激酶AKT相較于天然⑶4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而言活性增加，
[0080] -TGF-β的產(chǎn)量不可檢測(cè)，并且IL-10的產(chǎn)量不可檢測(cè)或與天然⑶4+調(diào)節(jié)性T細(xì) 胞相比產(chǎn)量極低，
[0081] -相較于天然⑶4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而言的高IFN- Y濃度，
[0082] -抗原性刺激后，轉(zhuǎn)錄活化劑T-bet和GATA3共表達(dá)，
[0083] -NKG2D 表達(dá)，
[0084] -產(chǎn)生高濃度的可溶性Fas配體（Fasl)。
[0085] 發(fā)明描述
[0086] 本發(fā)明的一般原理涉及獲自載有特異性抗原的抗原呈遞細(xì)胞的凋亡體用于引發(fā) 抗原特異性F 〇Xp3+Treg生成的應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明的目的是：提供從以MHC II類決定 簇呈遞自體抗原或引發(fā)不希望的免疫應(yīng)答的抗原（例如，過(guò)敏原、來(lái)自移植物的自體抗原 或用于治療目的的同種異體因子）的抗原呈遞細(xì)胞獲得選擇性凋亡的方法。如下文更詳細(xì) 地描述，因此，本發(fā)明提供產(chǎn)生、獲得或分離抗原特異性Treg的方法，由此提供使特定針對(duì) 給定抗原的免疫應(yīng)答停止的可能性。
[0087] 被誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞經(jīng)歷許多表面變化，包括磷脂酰絲氨酸、多糖和糖脂的氧化，這 使所述細(xì)胞可被吞噬細(xì)胞識(shí)別。此外，凋亡細(xì)胞表達(dá)新蛋白質(zhì)，例如凝血栓蛋白-1和/或 使胞內(nèi)組分定位于其表面，所述胞內(nèi)組分例如磷脂酰絲氨酸、DNA和核小體。這些表面變化 共同為巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞而不觸發(fā)先天免疫反應(yīng)提供可能（在先天受體例如Toll樣 受體、NOD或RIG不存在的情況下）。
[0088] 移除凋亡細(xì)胞的吞噬細(xì)胞具有識(shí)別受體（例如CD14)、清除受體和C型凝集素受體 (Ravichandran 和 Lorenz (2007) Nature Rev. Tmmunol. 7, 964-974)。清除受體是能夠與氧 化的或乙?；牡兔芏戎鞍祝↙DL)以及多陰離子配體和凋亡細(xì)胞結(jié)合的表面糖蛋白。清 除受體的例子包括⑶36、L0X-1和CLA-1。識(shí)別之后是快速內(nèi)化，以及在凋亡細(xì)胞的情況中 的破裂和與內(nèi)體和溶酶體的融合。特別感興趣的是凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的凝血栓蛋白-1，其作為 連接吞噬細(xì)胞上表達(dá)的CD36的可溶橋。凝血栓蛋白-1的表達(dá)是半胱天冬酶依賴性的。 [0089] 可溶因子還在凋亡細(xì)胞的移除中起作用。示例包括膠原凝集素和膠原凝集素樣 分子，例如甘露糖結(jié)合凝集素和Clq。所述兩者均與吞噬細(xì)胞表面表達(dá)的鈣網(wǎng)蛋白相互作 用。正五聚蛋白家族，其包括血清淀粉體P(SAP)和C-反應(yīng)性蛋白（CRP)，而原型正五聚 蛋白（PTX)也結(jié)合凋亡細(xì)胞?？傊?，有許多因子在生理學(xué)條件下用于處理經(jīng)歷自然程序 性細(xì)胞死亡或凋亡的細(xì)胞（Jeannin 等·（2008) Curr. Opinion in Immunol. 20, 530-537)。 哺乳動(dòng)物中，細(xì)胞持續(xù)更新以維持正常細(xì)胞數(shù)量和活性（Steinman等.（2000) J. Exp. Med. 191，411-416)。在不存在炎性條件的情況下，凋亡體被器官由抗原呈遞細(xì)胞攝取，所述 細(xì)胞遷移至局部淋巴結(jié)，并在此處與淋巴結(jié)樹突細(xì)胞進(jìn)行凋亡體交換，該交換直接發(fā)生或 因遷移抗原呈遞細(xì)胞快速裂解而發(fā)生。發(fā)現(xiàn)遷移至局部淋巴結(jié)的樹突細(xì)胞中的至少一些是 未成熟的，其顯示吞噬凋亡細(xì)胞的高能力。在淋巴結(jié)中，樹突細(xì)胞開始處于未成熟狀態(tài)，但 似乎屬于顯示以I類和II類決定簇呈遞抗原的能力的亞組。在與非炎性條件相關(guān)的共刺 激信號(hào)不存在的情況下，MHC II類呈遞提供對(duì)Treg所需信號(hào)的募集和活化。此類Treg是 抗原特異性的（導(dǎo)向自體抗原）并且阻遏針對(duì)此類自體抗原的反應(yīng)的活性。因此，在非炎 性情況下發(fā)生的凋亡引發(fā)抗原特異性Treg，這維持對(duì)于自身抗原的耐受。
[0090] 相反地，在炎性條件下，因?yàn)槠渥泽w免疫疾病中發(fā)生或響應(yīng)同種抗原或過(guò)敏原或 在準(zhǔn)確針對(duì)感染劑的免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)生，所以凋亡體產(chǎn)量增加，其被帶至局部淋巴結(jié)。所 述載有凋亡體的細(xì)胞的大量流入超過(guò)了淋巴結(jié)樹突細(xì)胞捕獲并呈遞所述凋亡體從而招募 并激活Treg的能力。因此，促炎性細(xì)胞因子的存在改變了淋巴結(jié)樹突細(xì)胞的表型，其被誘 導(dǎo)成熟并且最終使效應(yīng)T細(xì)胞活化增加至破壞Treg。盡管這是對(duì)感染劑的響應(yīng)過(guò)程中希望 的效果，但在自體免疫疾病、過(guò)敏性反應(yīng)和移植物排斥中，這不幸地導(dǎo)致其它組織損傷和炎 癥。因此，設(shè)計(jì)一種使非炎性情況下生成或獲得凋亡體的能力增加，以產(chǎn)生、獲得或分離抗 原特異性Treg的方法是有利的。
[0091] 在對(duì)于采用側(cè)接殘基內(nèi)攜帶硫還原酶基序的MHC II類限制性表位的CCD4+T細(xì) 胞的引發(fā)的研究（尚未公開）過(guò)程中，出乎預(yù)料地發(fā)現(xiàn)CD4+誘導(dǎo)的結(jié)果是目標(biāo)器官中 F〇Xp3+Treg的累積。因此，在皮膚移植物排斥模型中，同種異源移植物的長(zhǎng)期持續(xù)伴隨該移 植物本身中Foxp3+Treg的存在。在多種硬化癥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭羞M(jìn)行了相同觀察，其中疾病的預(yù) 防和抑制伴隨著中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)白質(zhì)中Foxp3+Treg的累積。
[0092] 因此，在【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明方法包括攜帶W02008/017517(其通過(guò)引用納入 本文）中所述側(cè)接殘基內(nèi)含硫還原酶基序的MHC II類限制性表位的應(yīng)用。
[0093] 一般而言，用于本發(fā)明實(shí)施方式的肽是包含可能觸發(fā)免疫反應(yīng)的抗原（自身 或非自身）的至少一種T細(xì)胞表位的肽，其偶聯(lián)至具有還原活性的有機(jī)化合物，例如含 硫還原酶序列基序[CST]-X(2)-[CST]，其中至少一個(gè)[CST]是Cys;因此所述基序是 [C]-X(2)-[CST]或[CST]-X(2)-[C]。在【具體實(shí)施方式】中，肽包含序列基序[C]-X(2)-[CS] 或[CS]-X(2)-[C]。在更具體的實(shí)施方式中，肽包含序列基序C-X(2)-S、S-X⑵-C或 C-X(2)-C。所述T細(xì)胞表位和所述有機(jī)化合物任選地由接頭序列分隔。
[0094] 這些肽可以通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備，其允許引入非天然氨基酸。因此，在還原性化合 物的基序中，C代表半胱氨酸或具有硫醇基團(tuán)的其它氨基酸，例如巰基纈氨酸、同型半胱氨 酸或具有硫醇功能的其它天然或非天然氨基酸。為了具有還原活性，所述基序中存在的半 胱氨酸應(yīng)不作為胱氨酸二硫橋的部分或作為氧化的半胱氨酸出現(xiàn)。不過(guò)，該基序可包含經(jīng) 修飾的半胱氨酸，例如甲基化的半胱氨酸，其在體內(nèi)被轉(zhuǎn)化成具有三個(gè)硫醇基團(tuán)的半胱氨 酸。
[0095] 還原性化合物的[CST]-X(2)-[CST]基序中的氨基酸X可以是任何天然氨基酸，包 括S、C或T或可以是非天然氨基酸。具體而言，X是具有小側(cè)鏈例如Gly、Ala、Ser或Thr 的氨基酸?；蛘撸皇蔷哂写髠?cè)鏈例如Tyr的氨基酸。更具體地，[CST]-X(2)-[CST]基序 中的至少一個(gè)X是His或Pro。
[0096] 在包含上述基序的作為還原性化合物的肽中，所述基序如此定位：當(dāng)表位嵌合進(jìn) 入MHC槽時(shí)，該基序留在該MHC結(jié)合槽的外側(cè)。所述基序的位置直接毗鄰所述肽內(nèi)的毗鄰 所述表位序列，或與所述T細(xì)胞表位由一個(gè)接頭隔開。更具體地，所述接頭包括7個(gè)或更少 氨基酸的氨基酸序列。最具體地，所述接頭包含1、2、3或4個(gè)氨基酸。或者，接頭包含5、6、 7、8、9或10個(gè)氨基酸。在基序序列與表位序列相鄰的那些肽中，這指示為相較于表位序列 的P-4位至P-I位或Ρ+l位至P+4位。
[0097] 除還原性基序以外，此類肽包含（如現(xiàn)有技術(shù)中所述）源自抗原的T細(xì)胞表位，所 述抗原通常是過(guò)敏原或自體抗原，視應(yīng)用而定。蛋白質(zhì)序列中的此類T細(xì)胞表位可通過(guò)功 能性實(shí)驗(yàn)和/或一種或多種計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定。
[0098] 合適算法見述于，例如 Zhang 等，（2005)Nucleic Acids Res 33,W180-W183(PREDBALB) !Salomon 和 Flower(2006)BMC Bioinformatics 7,501(MHCBN) ;Schuler 等，（2007)Methods Mo/Biol. 409,75-93(SYFPEITHI) ;Donnes 和 Kohlbacher(2006)Nucleic Acids Res.34,W194-W197(SVMHC) ;Kolaskar 和 Tongaonkar(1990)FEBS Lett. 276, 172-174 和 Guan 等，（2003)Appl Bioinformatics 2, 63-66(MHCPred)。
[0099] T細(xì)胞表位序列中的氨基酸根據(jù)其在MHC蛋白的結(jié)合槽中的位置來(lái)編號(hào)。通常，肽 內(nèi)存在的T細(xì)胞表位由8?25個(gè)氨基酸組成，然而更具體地，由8?16個(gè)氨基酸組成，然 而最具體地，由7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個(gè)氨基酸組成。
[0100] 更具體地，所述T細(xì)胞表位由9或8個(gè)氨基酸的序列組成。更具體地，所述T細(xì)胞 表位是由MHC II類分子呈遞至T細(xì)胞的表位。尤其所述T細(xì)胞表位序列是嵌合進(jìn)入MHC II蛋白裂隙的表位序列，更具體而言是嵌合進(jìn)入所述MHC II裂隙的九肽。
[0101] 肽的T細(xì)胞表位可以對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的天然表位序列，或者可以是其修飾形式，前提 是修飾的T細(xì)胞表位與天然T細(xì)胞表位序列相似，保留其在MHC縫隙內(nèi)結(jié)合的能力。修飾 的T細(xì)胞表位就MHC蛋白而言可具有與天然表位相同的結(jié)合親和性，但也可以具有較低親 和性。在此類情況中，經(jīng)修飾肽的結(jié)合親和性相較原始肽降低不小于10倍，更優(yōu)選降低不 小于5倍。
[0102] 可衍生用于本發(fā)明方法的實(shí)施方式的T細(xì)胞表位的（自體）抗原的示例有甲狀腺 球蛋白、甲狀腺過(guò)氧化物酶、TSH受體、胰島素（胰島素原）、谷氨酸脫羧酶（GAD)、酪氨酸磷 酸酶IA-2、髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞蛋白和熱激蛋白HSP65。
[0103] 并不意在限制并受理論限制，作用的一般機(jī)制包括如下步驟：
[0104] (a)載有凋亡體的未成熟樹突細(xì)胞引發(fā)對(duì)以MHC II類決定簇中存在的決定簇具 有特異性的Treg。
[0105] (b)這些Treg遷移至不希望的免疫應(yīng)答發(fā)生的位置。
[0106] (c)這些Treg在所述目標(biāo)位置處的累積導(dǎo)致因所述Treg的大量抗炎性性質(zhì)所致 的對(duì)于炎癥的控制。
[0107] (d)抑制組織破壞和凋亡細(xì)胞產(chǎn)生，并重新建立該目標(biāo)位置處正常細(xì)胞的周轉(zhuǎn)，由 此恢復(fù)正常組織功能。
[0108] 本發(fā)明提供能夠獲得抗原特異性Treg的方法的多種實(shí)施方式。在本發(fā)明方法的 一個(gè)實(shí)施方式中，抗原呈遞細(xì)胞的凋亡可通過(guò)與CCD4+T細(xì)胞接觸而在體外獲得。使未成熟 樹突細(xì)胞載有凋亡體。載有凋亡體的未成熟樹突細(xì)胞用于細(xì)胞治療，或用于體外產(chǎn)生、分離 或獲得供于細(xì)胞治療的抗原特異性Treg。本
【發(fā)明內(nèi)容】
中的細(xì)胞治療包括制備用于給予哺乳 動(dòng)物的細(xì)胞的步驟。
[0109] 本領(lǐng)域中描述并已知用于誘導(dǎo)細(xì)胞體外凋亡的一般方法。例如，⑶4+T細(xì)胞淋巴 細(xì)胞的凋亡可通過(guò)在針對(duì)CD3和CD28的不溶性抗體存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞來(lái)獲得。用于測(cè) 定細(xì)胞是否實(shí)際凋亡的方法是本領(lǐng)域中熟知的。這些方法包括使膜聯(lián)蛋白V與凋亡細(xì)胞表 面上表達(dá)的磷脂結(jié)合，胱冬酶的激活，以及核酸降解。關(guān)于這些方法的綜述可見于出版物如 Fuchs 和 Steller (2011)，Cell 147, 742-758。
[oho] 與現(xiàn)有技術(shù)不同，本發(fā)明中，抗原呈遞細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡需要在所述抗原呈遞細(xì) 胞（APC)和所述誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞（即，CCD4+T細(xì)胞）之間形成突觸。所述突觸的形成激活 cCD4+T細(xì)胞的溶細(xì)胞性質(zhì)，導(dǎo)致僅誘導(dǎo)呈遞對(duì)應(yīng)抗原衍生的II類限制性表位的細(xì)胞的凋 亡。有利的是，這提供嚴(yán)格的抗原特異性。在用于該試驗(yàn)系統(tǒng)的任何其它試劑（例如抗CD3 抗體）不存在時(shí)，本發(fā)明方法中描述的凋亡的體外誘導(dǎo)再現(xiàn)與體內(nèi)存在那些接近的條件。
[0111] 通過(guò)⑶4+T細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞的凋亡已被Janssens等人報(bào)道，Janssens 等.（2008) J. Immunol. 171,4604-4612)。在一些情況中，Treg可能誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，而凋亡 的多種機(jī)制已經(jīng)描述，包括在穿孔蛋白存在或不存在下激活粒酶B的IDO釋放。關(guān)于這些 機(jī)制的綜述可見于（Shevach (2011)Adv. Immunol. 112, 137-176)。在本發(fā)明方法中，cCD4+T 細(xì)胞代表獨(dú)特的細(xì)胞亞組，與Treg在表型上和功能性質(zhì)上均有差異。能夠誘導(dǎo)此類cCD4+T 細(xì)胞的方法可見于W02008/017517。
[0112] 用于鑒定和分離凋亡體的方法是本領(lǐng)域已知的。凋亡細(xì)胞或凋亡體在其表面上 表達(dá)多種新組分，從而使所述凋亡細(xì)胞或凋亡體易受可溶性因子的調(diào)理，如上所述。這兩 種變化形式提供分離凋亡細(xì)胞或凋亡體的方式。關(guān)于此的示例可見于本領(lǐng)域（Schiller 等·（2008)Cell Death Diff. 15, 183-191)。一個(gè)示例是采用針對(duì)凝血栓蛋白的抗體來(lái)分離 細(xì)胞或細(xì)胞碎片，其因進(jìn)入凋亡周期而表達(dá)凝血栓蛋白。
[0113] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，使分離的凋亡體或凋亡細(xì)胞與樹突細(xì)胞孵育以允許吞 噬、加工和在MHC II類決定簇中的呈遞。已描述了樹突細(xì)胞的不同亞組，其在功能上、表面 表型和成熟度上均有差異。一般而言，未成熟的樹突細(xì)胞具有攝取凋亡細(xì)胞和凋亡體的高 能力，但可能就在MHC II類決定簇中表達(dá)表位而言并不有效。然而，樹突細(xì)胞的一些亞基， 尤其是封在淋巴結(jié)內(nèi)的那些，結(jié)合這兩種性質(zhì)，在其表面表位呈遞攝取凋亡細(xì)胞或凋亡體。
[0114] 然而，在本
【發(fā)明內(nèi)容】
中，樹突細(xì)胞通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法衍生自體外并且保持在 未成熟狀態(tài)。本領(lǐng)域教導(dǎo)樹突細(xì)胞在干擾素 -Y (IFN- γ )存在下的衍生化誘導(dǎo)高度成熟狀 態(tài)，而IL-4將樹突細(xì)胞保持在未成熟狀態(tài)。樹突細(xì)胞可源自外周血單核細(xì)胞或骨髓前體。 如上所述獲得的凋亡細(xì)胞和凋亡體與未成熟的樹突細(xì)胞孵育，由此允許通過(guò)MHC II類決定 族呈遞。
[0115] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚，優(yōu)選樹突細(xì)胞，但并不排除獲得能夠呈遞由凋亡細(xì)胞或 凋亡體加工的抗原的呈遞細(xì)胞的方法。代替方式包括但不限于巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或上皮 細(xì)胞，其可以MHC II類表達(dá)誘導(dǎo)。
[0116] 本發(fā)明的另一方面涉及載有源自凋亡細(xì)胞或凋亡體的抗原的樹突細(xì)胞在細(xì)胞治 療中的應(yīng)用。通過(guò)示例方式，將通過(guò)呈遞自體抗原的抗原呈遞細(xì)胞上的CCD4+T細(xì)胞的溶細(xì) 胞作用所獲得的樹突細(xì)胞靜脈內(nèi)給予受疾病影響的動(dòng)物，所述樹突細(xì)胞呈遞源自凋亡體的 II類限制性表位，該疾病中涉及針對(duì)自體抗原的免疫應(yīng)答。所述細(xì)胞治療的結(jié)果是特異性 抑制所述免疫應(yīng)答并治愈所述疾病。其它示例如下所示，但本發(fā)明的范圍不限于這些示例。 在本發(fā)明方法的特定實(shí)施方式中，使載有凋亡細(xì)胞或凋亡體的未成熟樹突細(xì)胞維持在培養(yǎng) 中，并向其添加 CD4+T細(xì)胞的群，孵育以產(chǎn)生、分離或獲得Treg。可采用數(shù)種CD4+T細(xì)胞的 可能來(lái)源，包括但不限于：從未處理動(dòng)物獲得并采用例如被覆有特異性抗體的磁珠通過(guò)親 和性來(lái)制備的細(xì)胞；獲自動(dòng)物脾、淋巴結(jié)、組織或外周血的極化的CD4+T細(xì)胞，其中所述動(dòng) 物具有涉及針對(duì)（自體）抗原的免疫應(yīng)答的疾病病程，就該疾病而言需要引發(fā)Treg;或確 定為顯示高且穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄Foxp3受體表達(dá)的天然Treg。
[0117] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚，這三種CD4+T細(xì)胞來(lái)源在給定相關(guān)環(huán)境中可能各有優(yōu) 勢(shì)。例如，原初CD4+T細(xì)胞甚至更易從外周血進(jìn)入并提供足夠大的庫(kù)以識(shí)別任何抗原。在 優(yōu)選預(yù)防疾病進(jìn)程的情況中，而其中可尤其根據(jù)給定動(dòng)物的MHC II類單體型來(lái)選擇抗原， 原初CD4+T細(xì)胞將是最佳選擇。另一方面，極化的CD4+T細(xì)胞是用于在優(yōu)選采用對(duì)肽-MHC 復(fù)合體具有較高親和性的細(xì)胞的情況中實(shí)踐本發(fā)明方法的細(xì)胞來(lái)源。一個(gè)例子是，在1型 糖尿病中發(fā)現(xiàn)自體反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞，其中對(duì)CD4+T細(xì)胞對(duì)胰島素原型肽的識(shí)別主要通過(guò) 與肽-MHC復(fù)合體的不完全結(jié)合而發(fā)生，導(dǎo)致相對(duì)低的T細(xì)胞受體親和性。
[0118] 本發(fā)明中，一個(gè)實(shí)施方式是采用天然Treg作為來(lái)源。Treg的庫(kù)針對(duì)對(duì)于自體抗原 的識(shí)別而形成，并且如上所述，此類細(xì)胞具有足夠的親和性來(lái)與抗原呈遞細(xì)胞功能上形成 突觸。針對(duì)給定抗原的抗原特異性天然Treg的數(shù)量過(guò)低，因?yàn)榇祟怲reg僅為總CD4+T細(xì) 胞數(shù)的5-10%。本發(fā)明提供能使所述低數(shù)量體外增加的方法。在本發(fā)明方法中，采用胸腺 選擇的天然Treg的另一個(gè)好處是,經(jīng)報(bào)道它們表型穩(wěn)定性。因此,在天然Treg中,Foxp3高 表達(dá)且隨時(shí)間在不同活化條件下維持穩(wěn)定。相反，Treg誘導(dǎo)進(jìn)入外周并且獲取Foxp3表達(dá) 可能不穩(wěn)定，這是因?yàn)闆]有對(duì)于Treg系確定的表觀特征，從而在其活化的環(huán)境變化時(shí)（例 如在炎性條件下）其調(diào)節(jié)性質(zhì)減弱。
[0119] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，采用通過(guò)與呈遞來(lái)自凋亡細(xì)胞或凋亡體的抗原的未成 熟的樹突細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增的Treg (天然Treg)或誘導(dǎo)的（原初或極化的）Treg進(jìn)行基因 治療。所述治療可作為預(yù)防性治療給予，例如預(yù)防移植物排斥，或作為抑制治療給予，例如 在1型糖尿病中。
[0120] 任選地，通過(guò)本發(fā)明所述的方法獲得的Treg在需要更大數(shù)量的此類Treg時(shí)可另 采用非特定方法擴(kuò)增。此類非特定方法的示例是本領(lǐng)域中已知的。例如，在不溶性抗CD3 和抗CD28抗體和IL-2存在下孵育的細(xì)胞可被擴(kuò)增數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0121] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚，在給予細(xì)胞之前，可添加其它步驟。一種可能是通過(guò)將細(xì) 胞與載有一種或多種合成肽的MHC II類決定簇的四聚體孵育來(lái)進(jìn)一步限制Treg的特異 性，所述合成肽是希望用于定向Treg的肽。另一種可能是，通過(guò)表面標(biāo)志物或不同F(xiàn)oxp3 的表達(dá)程度來(lái)分選出細(xì)胞。已知Foxp3表達(dá)特別高的細(xì)胞群是整個(gè)天然Treg群的部分，并 且顯示使其適合于本
【發(fā)明內(nèi)容】
的特點(diǎn)。
[0122] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，通過(guò)本發(fā)明方法獲得的Treg可用于建立關(guān)于疾病進(jìn)程 發(fā)展的給定抗原或表位的關(guān)聯(lián)性。在許多疾病中，有多于一種抗原涉及病程，而仍舊難以鑒 定最重要的一種。通過(guò)實(shí)施本發(fā)明方法來(lái)產(chǎn)生抗原特異性Treg提供關(guān)閉特異性抗原的方 法，以作為分離和鑒定疾病發(fā)展中特異性抗原的作用的手段。
[0123] 通過(guò)本發(fā)明方法獲得的抗原特異性Treg提供確定Treg表型在其功能中的重要 性的方法。舉例而言，比較根據(jù)粒酶的表達(dá)和粒酶+與粒酶（_)的群來(lái)分選的抗原特異性 Treg的抑制體外或體內(nèi)應(yīng)答的能力。
[0124] 本發(fā)明的多個(gè)方面和實(shí)施方式通過(guò)如下實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。然而，這并不意在將本 發(fā)明的范圍限制到這些實(shí)施例。 實(shí)施例
[0125] 實(shí)施例1.體外凋亡的誘導(dǎo)
[0126] 抗原呈遞細(xì)胞（APC)制備自C57BL/6小鼠并用涵蓋實(shí)驗(yàn)性自體免疫腦脊髓炎 (EAE)中涉及的自體抗原的II類限制性T細(xì)胞表位的肽加載，用于多發(fā)性硬化癥模型。
[0127] 因此，具有序列VGffYRSPFSRVVHLYRTSEQ ID. NO: 1]的髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白 (MOG)肽，對(duì)應(yīng)于MOG蛋白的氨基酸殘基37-52，被用于加載細(xì)胞。
[0128] 該肽包含優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞表位。Pl位，即錨定至MHC II類槽的第一個(gè)氨基酸是 Y40(P1-P9序列加有下劃線）。
[0129] 溶細(xì)胞性⑶4+Τ細(xì)胞（c⑶4+Τ細(xì)胞）獲自動(dòng)物的脾，所述動(dòng)物用氫氧化鋁和50 μ g 的SEQ ID. NO: 1的肽免疫四次，其中所述肽的氨基末端的3個(gè)氨基酸被序列CGPC替代，生 成序列 CGPCYRSPFSRVVHLYR「SEQ ID.N0:2]的肽。
[0130] c⑶4+T細(xì)胞細(xì)胞在加載的APC存在下于37°C下培養(yǎng)過(guò)夜并洗滌，而采用針對(duì)活化 的半胱天冬酶3的抗體來(lái)檢測(cè)APC的凋亡程度。
[0131] 實(shí)施例2.凋亡體的分離
[0132] 實(shí)施例1中獲得的凋亡細(xì)胞的上清液經(jīng)收集并進(jìn)行兩次離心步驟（500xg，5分鐘） 以移除細(xì)胞。然后，將該上清液過(guò)濾通過(guò)1. 2 μ M親水性注射器濾器。以100, OOOxg離心30 分鐘后，沉淀中所含的凋亡體經(jīng)收獲并用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
[0133] 或者，凋亡細(xì)胞和凋亡體可采用針對(duì)因凋亡而表達(dá)的細(xì)胞表面組分的抗體來(lái)通過(guò) 親和性分離。這些的示例有抗凝血栓蛋白抗體。在優(yōu)選的制備步驟中，抗凝血栓蛋白抗體 共價(jià)偶聯(lián)至磁性微珠。在20°C下柔和振蕩孵育1小時(shí)后，磁珠保留在磁鐵上。然后，通過(guò)用 弱酸性緩沖液洗脫來(lái)回收凋亡體。
[0134] 這些方法是本領(lǐng)域已知的。（Schiller 等·（2008)Cell Death Diff. 15, 183-191 ; Gautier 等·（1999)J. Tmmunol. Methods 228, 49-58)
[0135] 實(shí)施例3.產(chǎn)生或獲得未成熟的樹突細(xì)胞（iDC)
[0136] 從上膝和下膝骨獲得骨髓祖細(xì)胞。分別采用CD19和CD90微珠利用磁性減少來(lái)移 出B和T淋巴細(xì)胞。包含⑶19-⑶90-iDC祖細(xì)胞的陰性分離部分重懸在含有500U/ml重組 GM-CSF的無(wú)血清培養(yǎng)基中并接種（3xl06個(gè)細(xì)胞/ml)在組織培養(yǎng)板上并保持在37°C。細(xì) 胞每隔一天清洗一次，持續(xù)6天，避免破壞聚集體。在第6天，移出iDC聚集體，清洗并加至 新板。在第7天，收獲細(xì)胞并用于分析。
[0137] 這些方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如，Inaba等.（2009)Curr. Prot. iHiMinoI. 1 (86)，第 3. 7.單兀第 10-12 頁(yè)。
[0138] 實(shí)施例4.產(chǎn)生或獲得載有抗原的未成熟樹突細(xì)胞
[0139] iDC顯示吞噬凋亡體的高能力。因此，將實(shí)施例3中獲得的iDC與實(shí)施例2中獲得 的凋亡體孵育。就此而言，通過(guò)在37°C孵育30分鐘來(lái)將2xl0 5個(gè)iDC鋪板于微型培養(yǎng)孔。 然后將凋亡體的懸液添加至培養(yǎng)物并在37°C另孵育16小時(shí)。細(xì)胞然后經(jīng)清洗并重懸于培 養(yǎng)基中。
[0140] 實(shí)施例5.載有抗原的樹突細(xì)胞用于細(xì)胞治療的應(yīng)用
[0141] 載有凋亡體的iDC通過(guò)靜脈內(nèi)途徑注射（2xl05)進(jìn)入疾病誘導(dǎo)之前或之后的動(dòng) 物。
[0142] 因此，對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行如下方案，包括在完全弗氏佐劑中給予MOG肽（參見實(shí) 施例1的SEQ ID:N01的肽）和分枝桿菌提取物，并注射2次百日咳毒素。該方案在MOG肽 給予后兩周內(nèi)引發(fā)與人多發(fā)性硬化癥相當(dāng)?shù)牟≌鞯陌l(fā)展。
[0143] 在該模型中，載有凋亡體的iDC (如實(shí)施例4中所得）在疾病誘導(dǎo)前一天或首次觀 察到疾病病征之后（即誘導(dǎo)后兩周）注射至小鼠。
[0144] 未經(jīng)iDC注射的動(dòng)物，或未載有iDC的動(dòng)物經(jīng)注射作為對(duì)照。在實(shí)驗(yàn)組和兩組對(duì) 照組中評(píng)價(jià)疾病病征的預(yù)防或抑制。
[0145] 實(shí)施例6.載有抗原的樹突細(xì)胞用于引發(fā)抗原特異性Treg的應(yīng)用。
[0146] 允許載有凋亡體的iDC體外產(chǎn)生Treg。
[0147] 因此，使實(shí)施例4中所述的iDC保持在培養(yǎng)中。
[0148] 采用抗體通過(guò)磁性微珠分選從未處理小鼠的脾分離T細(xì)胞，以排除⑶8+、⑶19+、 ⑶127+細(xì)胞，然后進(jìn)行⑶25+細(xì)胞正選擇。⑶4+F 〇Xp3s細(xì)胞的百分比通過(guò)熒光活化的細(xì)胞 分選（facs)采用Foxp3特異性抗體在細(xì)胞透過(guò)后檢測(cè)。本領(lǐng)域公開了獲得此類細(xì)胞的方 法（Peters 等.（2003)Plos one 3,574-584)。獲得純度高于 85%的細(xì)胞。
[0149] 然后將⑶4+F〇Xp3S細(xì)胞（IxlO6個(gè)細(xì)胞/孔）添加至實(shí)施例4所述的iDC培養(yǎng)物。 在37°C 7天的刺激循環(huán)后，在IL-2 (20IU/ml)存在下，細(xì)胞經(jīng)洗滌并根據(jù)相同方案采用載有 凋亡體的新一批iDC再孵育。在該第二次刺激循環(huán)之后，可任選地通過(guò)與被覆有抗CD3和 抗CD28抗體的磁珠在IL-2的存在下孵育來(lái)進(jìn)一步擴(kuò)增細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)洗滌并通過(guò)facs評(píng) 價(jià)Foxp3表達(dá)。
[0150] 實(shí)施例7.抗原特異性Treg用于細(xì)胞治療的應(yīng)用
[0151] 實(shí)施例6中制備的細(xì)胞可用于在自體免疫疾病的情況下被動(dòng)給予。
[0152] 因此，按照與實(shí)施例5中所述相似的方案但包括IV注射2xl05個(gè)⑶4+Foxp3 S細(xì)胞 代替iDC。
[0153] 顯示相較于未注射⑶4+Foxp3S細(xì)胞的對(duì)照動(dòng)物而言，有疾病病征的顯著預(yù)防和/ 或抑制。
[0154] 實(shí)施例8.分選出抗原特異性Treg供于分析目的
[0155] 還可分析⑶4+Foxp3 S細(xì)胞群來(lái)確定單一組分或合并組分重要性的作用機(jī)制。
[0156] 因此，⑶4+F〇Xp3 S細(xì)胞采用被覆有針對(duì)FasL的抗體的微珠分離。然后，功能性測(cè) 試兩群細(xì)胞FasL+和FasL(-)，并比較其引發(fā)耐受的能力。這采用分析系統(tǒng)進(jìn)行，其中，多克 隆效應(yīng)⑶4+淋巴細(xì)胞（以⑶4+⑶25(-)表型為特點(diǎn)）從未處理動(dòng)物的脾分離。
[0157] 天然Treg通常通過(guò)其顯示對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的旁路抑制的能力來(lái)確定。本文所用的 分析系統(tǒng)涉及⑶4+⑶25+T細(xì)胞群的活化，所述活化通過(guò)非特異性刺激，即聯(lián)合抗-⑶3和 抗-⑶28抗體進(jìn)行。
[0158] 將FasL+CD4+Foxp3高細(xì)胞抑制CD4+CD25 (_) T細(xì)胞增殖的能力與FasL (_) ⑶4+Foxp3*細(xì)胞做比較。
[0159] 顯示表達(dá)FasL的細(xì)胞顯示較高的抑制效應(yīng)細(xì)胞增殖的能力。
[0160] 實(shí)施例9. Foxp3Treg在皮膚移植物中的累積
[0161] 8?10周齡的C57BL/6雌性小鼠注射50 μ g的肽來(lái)免疫，然后進(jìn)行皮膚移植，所述 肽涵蓋側(cè)接殘基內(nèi)含硫氧還基序的Dby(ccDby)的II類限制性表位，如W02009/100505中 所述。
[0162] 將雄性同系供體的完整厚度的皮膚移植在受體的背部，并跟蹤排斥跡象。所有小 鼠耐受該移植物。在移植后6周取該移植物的活檢，供于組織學(xué)分析。顯示Foxp3+細(xì)胞在 該移植物中累積。
[0163] 作為比較，正常皮膚中Foxp3+T細(xì)胞的含量示于圖1。
【權(quán)利要求】
1. 一種獲得載有凋亡細(xì)胞或凋亡體的細(xì)胞的體外方法，所述方法包括如下步驟： a) 提供針對(duì)某一抗原的抗原特異性溶細(xì)胞性CD4+T細(xì)胞， b) 提供抗原呈遞細(xì)胞，呈遞所述抗原， c) 使所述抗原呈遞細(xì)胞接觸所述溶細(xì)胞性CD4+T細(xì)胞，由此誘導(dǎo)所述抗原呈遞細(xì)胞凋 亡； d) 從經(jīng)歷步驟c)中的凋亡的抗原呈遞細(xì)胞分離凋亡細(xì)胞或凋亡體；和 e) 使所述凋亡細(xì)胞或所述凋亡體與能夠呈遞來(lái)自所述凋亡細(xì)胞或來(lái)自所述凋亡體的 抗原的細(xì)胞孵育，由此獲得載有所述凋亡細(xì)胞或凋亡體的細(xì)胞。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法用于獲得抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，所述方法還 包括如下步驟： f) 使權(quán)利要求1所述的步驟e)的加載細(xì)胞與另一個(gè)CD4+細(xì)胞來(lái)源接觸，由此獲得抗 原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的群。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是Foxp3高 ⑶4+T細(xì)胞。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述CD4+T細(xì)胞的來(lái)源選自下組：原初 ⑶4+T細(xì)胞、極化的⑶4+T細(xì)胞，和天然Treg。
5. 如權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述能夠呈遞來(lái)自所述凋亡細(xì) 胞或來(lái)自所述凋亡體的抗原的細(xì)胞選自下組：樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和能夠表達(dá) MHC II類決定簇的細(xì)胞。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述凋亡細(xì)胞或凋亡體在步驟d)中通過(guò)親 和純化、離心、凝膠過(guò)濾、磁珠分選或熒光活化的分選來(lái)分離。
7. 如權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述能夠呈遞來(lái)自所述凋亡細(xì) 胞或所述凋亡體的抗原的細(xì)胞選自下組：通過(guò)轉(zhuǎn)化外周血單核細(xì)胞或骨髓源性的祖細(xì)胞獲 得的未成熟抗原呈遞細(xì)胞。
8. 如權(quán)利要求1?7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗原是自體免疫抗原、過(guò) 敏原或涉及移植物排斥的抗原。
9. 如權(quán)利要求1?8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗原特異性溶細(xì)胞性 CD4+T細(xì)胞通過(guò)如下方式獲得：使外周血細(xì)胞與肽接觸，所述肽包含所述抗原的MHC II類 限制性表位和具有基序[CST] -X (2) -C或C-X (2) - [CST]的序列。
10. 如權(quán)利要求1?9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗原特異性溶細(xì)胞性 ⑶4+T細(xì)胞獲自原初⑶4+T細(xì)胞、極化的⑶4+T細(xì)胞或源自天然Treg。
11. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括如下步驟：分離步驟e)中 獲得的所述載有凋亡細(xì)胞或凋亡體的細(xì)胞。
12. 如權(quán)利要求2或3中所述的方法，其特征在于，所述方法還包括如下步驟：分離所 述抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法還包括如下步驟：基于表面標(biāo)志 物⑶25和/或CTLA-4的表達(dá)或基于細(xì)胞因子TGF-0和/或IL-10的產(chǎn)生或基于Foxp3 的表達(dá)來(lái)將所述抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分成不同的亞組。
14. 如權(quán)利要求2?10中任一項(xiàng)所述獲得的抗原特異性Treg的群。
15. 如權(quán)利要求1或權(quán)利要求5?11中任一項(xiàng)所述獲得的載有凋亡細(xì)胞或凋亡體的細(xì) 胞的群。
16. 作為藥物應(yīng)用的如權(quán)利要求14所述的抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的群。
17. 用于治療或預(yù)防自體免疫疾病、過(guò)敏性疾病、移植物排斥或慢性炎性疾病的如權(quán)利 要求14所述的抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的群。
18. 用于治療或預(yù)防全身性或器官特異性自體免疫疾病的如權(quán)利要求14所述的抗原 特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的群。
19. 用于治療或預(yù)防針對(duì)某抗原的自體免疫疾病的如權(quán)利要求14所述的抗原特異性 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的群，所述抗原選自下組：甲狀腺球蛋白、甲狀腺過(guò)氧化物酶、TSH受體、胰島 素（胰島素原）、谷氨酸脫羧酶（GAD)、酪氨酸磷酸酶IA-2、髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞蛋白和熱激 蛋白HSP65。
20. 用于治療或預(yù)防針對(duì)某過(guò)敏原的過(guò)敏性疾病的如權(quán)利要求14所述的抗原特異性 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的群，所述過(guò)敏原選自下組：空氣傳播過(guò)敏原、食物過(guò)敏原、接觸過(guò)敏原和全 身性過(guò)敏原。
21. 用于治療或預(yù)防細(xì)胞來(lái)源或組織來(lái)源的移植物排斥的如權(quán)利要求14所述的抗原 特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的群。
22. 如權(quán)利要求14所述的抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在評(píng)價(jià)所述抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì) 胞作用機(jī)制中的應(yīng)用。
23. 用于治療或預(yù)防自體免疫疾病、過(guò)敏性疾病、移植物排斥或慢性炎性疾病的如權(quán)利 要求15所述的載有凋亡細(xì)胞或凋亡體的細(xì)胞的群。
24. 用于治療或預(yù)防全身性或器官特異性自體免疫疾病的如權(quán)利要求15所述的載有 凋亡細(xì)胞或凋亡體的細(xì)胞的群。
25. 用于治療或預(yù)防針對(duì)某抗原的自體免疫疾病的如權(quán)利要求15所述的載有凋亡細(xì) 胞或凋亡體的細(xì)胞的群，所述抗原選自下組：甲狀腺球蛋白、甲狀腺過(guò)氧化物酶、TSH受體、 胰島素（胰島素原）、谷氨酸脫羧酶（GAD)、酪氨酸磷酸酶IA-2、髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞蛋白和 熱激蛋白HSP65。
26. 用于治療或預(yù)防針對(duì)某過(guò)敏原的過(guò)敏性疾病的如權(quán)利要求15所述的載有凋亡細(xì) 胞或凋亡體的細(xì)胞的群，所述過(guò)敏原選自下組：空氣傳播過(guò)敏原、食物過(guò)敏原、接觸過(guò)敏原 和全身性過(guò)敏原。
27. 用于治療或預(yù)防細(xì)胞來(lái)源或組織來(lái)源的移植物排斥的如權(quán)利要求15所述的載有 凋亡細(xì)胞或凋亡體的細(xì)胞的群。
28. -種治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物對(duì)象疾病的方法，所述疾病選自下組：自體免疫疾病、過(guò) 敏性疾病、移植物排斥、慢性炎性疾病，所述方法包括如下步驟：給予所述哺乳動(dòng)物對(duì)象如 權(quán)利要求14所述的抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的群。
29. -種治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物對(duì)象疾病的方法，所述疾病選自下組：自體免疫疾病、過(guò) 敏性疾病、移植物排斥、慢性炎性疾病，所述方法包括如下步驟：給予所述哺乳動(dòng)物對(duì)象如 權(quán)利要求15所述的載有凋亡細(xì)胞或凋亡體的細(xì)胞的群。
【文檔編號(hào)】A61P37/06GK104411818SQ201380022688
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2013年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月30日
【發(fā)明者】J-M·圣萊美 申請(qǐng)人:英塞斯股份有限公司, 魯汶天主教大學(xué)