鬼鲉或其肝臟提取物在制備提高免疫力的保健品或藥品中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了鬼鲉或鬼鲉肝臟提取物在制備提高免疫力的保健品或藥品中的應(yīng)用，本發(fā)明以資源豐富的海洋資源鬼鲉為研究對象，通過大量藥理實(shí)驗(yàn)篩選鬼鲉的藥理活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鬼鲉及其肝臟提取物具有明顯的提高免疫器官指數(shù)，減少免疫器官損傷，增加免疫細(xì)胞的數(shù)目，提高血液中和細(xì)胞因子含量以及促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的分裂增殖的作用，顯示出非常好的增強(qiáng)免疫力的作用，并且對非特異性免疫、體液免疫及細(xì)胞免疫均具有很好的增強(qiáng)作用，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用藥安全可靠。鬼鲉資源豐富，可開發(fā)成新的提高免疫力功效的保健品或藥品，具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】鬼鈾或其肝臟提取物在制備提高免疫力的保健品或藥品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及魚類鬼鈾的新用途，具體涉及鬼鈾或其肝臟提取物在制備提高免疫力的保健品或藥品中的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002]鬼鈾，亦稱日本鬼鈾，別名老虎魚，為毒鈾科鬼鈾Inimicusjaponicas (Cuvier&volenciennes)的全體；其為近海小型底層魚類，棲息于沿岸或海島附近石礪底質(zhì)的淺海中，肉食性，攝食甲殼類動物；分布于我國沿海，朝鮮、日本沿海。全年均可捕捉，捕后洗凈，鮮用或曬干備用，日本鬼鈾的魚肉常因肉質(zhì)鮮美而被沿海居民所食用，其內(nèi)部的肝臟等則作為廢棄物而未被利用。鬼鈾魚頭上與頭側(cè)有凹陷和突起，顱骨均被皮膜所覆蓋；頭部、軀干部及各鰭條上到處有小觸須存在。身體呈深褐色或紫紅色，變異很大、各鰭有白點(diǎn)或白線，胸鰭內(nèi)面有褐色斑點(diǎn)，胸鰭完全連于胸部，背鰭的棘有劇毒?，F(xiàn)代研究表明日本鬼鈾的毒液對心肌、骨骼肌、平滑肌等均有直接的麻痹作用，而且毒腺提取液可使大鼠紅細(xì)胞發(fā)生棘突樣變，可明顯降低血液單個(gè)核細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞的活力；明顯降低NK活性；并且降低巨噬細(xì)胞的吞噬能力。
[0003]現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，人類機(jī)體患病的原因大多是由于自身免疫力系統(tǒng)出現(xiàn)問題，機(jī)體免疫力降低導(dǎo)致，對于體質(zhì)較差，年老體弱的疾病患者，提高機(jī)體免疫力具有重要作用，目前市場上提高免疫力的中藥制劑較多，如:十全大補(bǔ)丸、補(bǔ)中益氣丸、歸脾膠囊等等，現(xiàn)有的中藥制劑雖然具有一定的提高免疫力作用，但是均存在處方較大，在提高免疫力作用的同時(shí)，均在一定的副作用。
[0004]因此，很有必要在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)之上，充分利用資源豐富的海洋資源，以鬼鈾為研究對象，研究開發(fā)其新的臨床藥理活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是在鬼鈾現(xiàn)有藥理活性的基礎(chǔ)上，開發(fā)其新的藥理活性，提供一種具有很好提高免疫力作用、安全可靠的鬼鈾或其肝臟提取物制成的保健品或藥品，
[0006]技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為:
[0007]鬼鈾在制備提高免疫力的保健品或藥品中的應(yīng)用。
[0008]鬼鈾肝臟提取物在制備提高免疫力的保健品或藥品中的應(yīng)用。
[0009]作為優(yōu)選方案，以上所述的鬼鈾肝臟提取物在制備提高免疫力的保健品或藥品中的應(yīng)用，所述的鬼鈾肝臟提取物是通過以下方法制備得到:
[0010]取鬼鈾肝臟，剪碎，加入超純水進(jìn)行勻漿，然后在-20?-40°c冷凍12?24h，經(jīng)4?6°C解凍融化12?24h，反復(fù)凍融3次，然后加入超純水，在90°C?95°C下加熱5?IOmin,冷卻至室溫，在4°C條件下8000?10000r/min離心20?30min，收集離心后上清液，上清液_66°C冷凍干燥，得鬼鈾肝臟提取物。
[0011]本發(fā)明提供的鬼鈾或其肝臟提取物可以用于制備提高免疫力的保健品或藥品，如可以將鬼鈾或其肝臟提取物和食品上或藥學(xué)上可接受的載體制備成口服液、片劑或膠囊劑
坐寸O
[0012]有益效果:本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0013]本發(fā)明通過大量藥理實(shí)驗(yàn)篩選鬼鈾的藥理活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鬼鈾及其肝臟提取物具有明顯的提高免疫器官指數(shù)，減少免疫器官損傷，增加免疫細(xì)胞的數(shù)目，提高血液中TNFa和一些細(xì)胞因子(IL-Ιβ、IL-2、IL-6)含量以及促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的分裂增殖的作用，顯示出非常好的增強(qiáng)免疫力的作用，并且對非特異性免疫、體液免疫及細(xì)胞免疫均具有很好的增強(qiáng)作用，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用藥安全可靠。鬼鈾資源豐富，可開發(fā)成新的提高免疫力功效的保健品或藥品，具有很好的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價(jià)形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0015]實(shí)施例1
[0016]1、實(shí)驗(yàn)材料
[0017]1.1實(shí)驗(yàn)動物
[0018]ICR小鼠300只，雌雄各半，體重18_22g，揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心(SPF級)提供，動物質(zhì)量合格證號:SCXK(蘇)2012-0004。動物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動物中心SPF級小鼠實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，溫度23°C ±2°C，濕度55±5%，顆粒飼料(分別為湯山龍泉牌實(shí)驗(yàn)鼠顆粒飼料和兔顆粒詞料)喂養(yǎng)，自由飲水。
[0019]1.2藥品與試劑
[0020]日本鬼鈾Inimicus japonicus (Cuvier e tValenciennes)由廈門大學(xué)丁少雄教授提供；注射用環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H32020857);鹽酸左旋咪唑片(南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司)；黃芪多糖注射液(愛迪森(北京)生物科技有限公司，批準(zhǔn)文號:獸藥字(2011) 010122712);綿羊紅細(xì)胞(廣州蕊特生物科技有限公司提供);豚鼠血清(廣州蕊特生物科技有限公司提供)；TNFa、IL-1 β、IL_2、IL-6ELISA試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。
[0021]1.3實(shí)驗(yàn)儀器
[0022]冷凍干燥機(jī)(美國LABC0NC0公司)，冷凍離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)，JJ-2B型組織搗碎勻漿機(jī)(金壇市榮華儀器制造有限公司)，RE-201D升降恒溫水浴鍋(南京金正教學(xué)儀器有限公司)，實(shí)驗(yàn)室級超純水器(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)，紫外分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(PerkinElmer股份有限公司)，全自動血細(xì)胞分析儀(日本希森美康公司)，電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，海爾醫(yī)用低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)。
[0023]2、實(shí)驗(yàn)方法
[0024]2.1鬼鈾肝臟提取物的制備[0025]取鬼鈾肝臟(_80°C凍存)，而后在4°C下融化，去除血管與結(jié)締組織后，將肝臟剪碎，加入兩倍量的超純水進(jìn)行勻漿(低速10000r/min，30s/次，3次)，然后再反復(fù)凍融3次(在-20 V冷凍12h，經(jīng)4°C解凍融化12h左右)。加入兩倍量的超純水，并在95 °C下加熱5min。冷卻至室溫，在4°C條件下離心(8000r/min，20min)，收集離心后上清液。上清液_66°C冷凍干燥，得鬼鈾肝臟粗多肽凍干粉，_20°C下保存。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法測得鬼鈾上清液的蛋白濃度約為40.06 μ g/mg。給藥前用0.2%的CMC-Na溶液配制成低濃度組(I JLL)0.025g/mL、中濃度組(IJLM) 0.05g/mL、高濃度組(IJLH) 0.1 g/mL的溶液。
[0026]2.2免疫低下小鼠造模及給藥
[0027]小鼠70只，雌雄各半，稱重編號，隨機(jī)分成7組，設(shè)空白組，模型組，陽性對照1(左旋咪唑，37.5mg/kg)組，陽性對照2 (黃芪多糖)組，以上2.1制備得到的鬼鈾肝臟提取物低濃度組(IJLL)、中濃度組(IJLM)、高濃度組(IJLH)。第3d，空白組每天灌胃CMC-Na溶液0.4mL和腹腔注射生理鹽水0.4mL，模型組每天灌胃CMC-Na溶液0.4mL和腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX) 50mg/kg,陽性對照I組和CTX50mg/kg。各組每天給藥2次,連續(xù)5d,模型組、陽性對照組、給藥組均連續(xù)造模3d。鬼鈾肝臟提取物組每天分別灌胃給藥，同時(shí)腹腔注射CTX50mg/kg,陽性對照2組每天皮下注射給藥0.1mL/次，同時(shí)腹腔注射。
[0028]2.3體重和免疫器官指數(shù)觀察
[0029]每天給小鼠稱重并記錄，按劑量灌胃、造模，眼眶采血后處死小鼠，解剖取出脾臟和胸腺，分別用生理鹽水漂洗后濾紙吸干，稱重并計(jì)算臟器指數(shù)。
[0030]臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg) /體重(g)
[0031]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P〈0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0032]2.4巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定
[0033]采用碳粒廓清法，在末次給藥30min后，經(jīng)小鼠尾靜脈注入3倍稀釋的印度墨汁0.05mL/10g。分別于30s和360s從眼眶后取血20 μ L，并將其加入到0.l%Na2C03溶液2mL中搖勻，在分光光度計(jì)680nm波長處測光密度值，ODl表示30s的光密度值，0D2表示360s的光密度值。根據(jù)公式計(jì)算廓清指數(shù)K，K值經(jīng)體重及肝脾重量換算后，得吞噬指數(shù)a。
[0034]廓清指數(shù)K= (lg0Dl-lg0D2) / (t2_tl)
[0035]吞噬指數(shù)α =體重/肝脾重X 3Κ
[0036]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P〈0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0037]2.5血清溶血素的含量測定
[0038]造模與給藥方法同2.2。各組小鼠于給藥第3d，腹腔注射2%SRBC0.2mL致敏。末次給藥后24h，處死動物，小鼠眼眶取血，分離血清，用生理鹽水將血清稀釋200倍，各組樣品管中分別加入1:200試驗(yàn)小鼠血清稀釋液lmL、l:10補(bǔ)體血清稀釋液lmL、以及10%SRBC0.5ml震蕩混勻另取空白管，分別加入等量的補(bǔ)體、SRBC及ImL生理鹽水。然后各管于37°C水浴鍋中輝育lOmin，冰浴IOmin終止反應(yīng)，2000rpm離心lOmin，取上清液，以空白管調(diào)零，在可見光分光光度計(jì)540nm處測定各管OD值，記錄結(jié)果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以I表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P〈0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0039]2.6外周血常規(guī)觀察
[0040]造模與給藥方法同2.2。在末次給藥30min后，眼眶采血20 μ L7EDTA抗凝后迅速用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測小鼠外周血常規(guī)，分別對白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P〈0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0041]2.7 血清中 TNF α、IL-1 β、IL-2、IL-6 的測定
[0042]造模與給藥方法同2.2。在末次給藥30min后，眼眶采血0.5mL,分離得到血清，血清中TNFa、IL-1 β、IL_2、IL_6采用ELISA法測定。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P〈0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0043]2.8小鼠脾細(xì)胞周期的檢測
[0044]造模與給藥方法同2.2。在末次給藥30min后，小鼠脫頸處死后，取小鼠脾臟用載玻片碾磨，用生理鹽水制成細(xì)胞取小鼠脾臟用載玻片碾磨，用生理鹽水制成細(xì)胞懸液備用。取脾細(xì)胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾，用PBS洗滌2次后70%冷乙醇固定，4°C保存。上機(jī)前PBS洗漆，制成細(xì)胞懸液，加入含RNA酶的碘化丙啶(PI)染液，4°C，30min,經(jīng)300目尼龍網(wǎng)濾過后，上流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞周期。每個(gè)樣本獲取30000個(gè)細(xì)胞。以MULTICYCLE軟件分析細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P〈0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0045]2.9小鼠胸腺組織的形態(tài)觀察
[0046]造模與給藥方法同2.2。在末次給藥30min后，小鼠脫頸處死后，剖取胸腺。胸腺經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4?5 μ m，HE染色，病理專業(yè)人員閱片，根據(jù)各臟器病變由輕到重的程度，分別標(biāo)記為輕度I分“ + ”，中度2分“++”，重度3分“+++”，極重度4分“++++”，無明顯病變?yōu)殛幮設(shè)分，輕微病變?yōu)?.5分“土 ”，累加所有分?jǐn)?shù)，并計(jì)算出每組每只動物的均分，以T± Y表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P〈0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0047]3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0048]3.1對免疫低下小鼠體重的影響
[0049]與空白組比較，模型組小鼠的體重在第3d顯著性減少(P〈0.05)，在第4、5d明顯減少(P〈0.01);與模型組比較，陽性對照I組在第3d顯著性減少(P〈0.05)，在第4、5d明顯減少(P〈0.01);陽性對照2組和IJLM組在第4d顯著性減少(P〈0.05)，在第6d明顯減少(P〈0.0D5IJLH組在第6d顯著性減少(P〈0.05)。結(jié)果提示，鬼鈾肝臟提取物可以減緩免疫低下小鼠體重的下降趨勢。
[0050]3.2對免疫低下小鼠免疫器官指數(shù)的影響
[0051]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組比較，模型組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺顯著性減小(P〈0.01);與模型組比較，陽性對照I組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著性增大(分別為P〈0.05，P〈0.01)，陽性對照2組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著性增大(P〈0.01)，鬼鈾肝臟提取物低濃度組(ULL)組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著性增大(分別為P〈0.05，P〈0.01)，鬼鈾肝臟提取物中濃度組(IJLM)組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著性增大(分別為P〈0.05, P<0.01)，鬼鈾肝臟提取物高濃度組(IJLH)組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著性增大(P〈0.01)。結(jié)果提示，鬼鈾肝臟提取物可以減少免疫低下小鼠脾臟和胸腺的損傷，顯示出了很好的保護(hù)免疫器官損傷等功效。
[0052]3.3對免疫低下小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響
[0053]由表I實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組比較，模型組小鼠的吞噬指數(shù)和吞噬系數(shù)顯著性減小(P〈0.01);與模型組比較，陽性對照組(左旋咪唑、黃芪多糖)、鬼鈾肝臟提取物低、中、高濃度組(IJLL、IJLM、IJLH)的吞噬指數(shù)和吞噬系數(shù)顯著性的增大(P〈0.01)。結(jié)果表明，鬼鈾肝臟提取物可以增加免疫低下小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能。[0054]表1各組對免疫低下小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(?±〃，η = 10)
【權(quán)利要求】
1.鬼鈾在制備提高免疫力的保健品或藥品中的應(yīng)用。
2.鬼鈾肝臟提取物在制備提高免疫力的保健品或藥品中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鬼鈾肝臟提取物在制備提高免疫力的保健品或藥品中的應(yīng)用，其特征在于，所述的鬼鈾肝臟提取物是通過以下方法制備得到: 取鬼鈾肝臟，剪碎，加入超純水進(jìn)行勻漿，然后在-2(T-40°C冷凍12?24h，經(jīng)4?6°C解凍融化12?24 h，反復(fù)凍融3次，然后加入超純水，在90°C、5°C下加熱5?10 min，然后冷卻至室溫，在4°C條件下800(Tl0000 r/min離心20?30 min,收集離心后上清液，上清液_66°C冷凍干燥，得鬼鈾肝臟提取物。
【文檔編號】A61K35/12GK103689597SQ201310719926
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】唐于平, 劉欣, 段金廒, 林祥志, 林汝榕 申請人:南京中醫(yī)藥大學(xué), 國家海洋局第三海洋研究所