白藜蘆醇甙在制備治療慢性酒精中毒腦損傷藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了白藜蘆醇甙在制備治療慢性酒精中毒腦損傷藥物中的應用。本發(fā)明的技術方案要點為：白藜蘆醇甙或者其與藥學上可接受的酸或堿所形成的加成鹽或者含有它們中任何一種的藥物組合物與可藥用輔料用于制備治療或預防慢性酒精中毒腦損傷中記憶減退的藥物。本發(fā)明的白藜蘆醇甙具有神經保護的作用，能夠明顯改善慢性酒精中毒模型大鼠的神經損傷和降低慢性酒精中毒模型大鼠海馬區(qū)Cdk5的表達。
【專利說明】白藜蘆醇甙在制備治療慢性酒精中毒腦損傷藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，具體涉及白藜蘆醇甙或白藜蘆醇在制備治療慢性酒精中毒腦損傷藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]酒精中毒是當今世界嚴重的社會問題和醫(yī)學問題，與酒精中毒和酒精濫用相關的健康、心理和社會問題已成為當前重大的公共衛(wèi)生問題之一。酒精中毒對神經系統最大的危害是酒精對神經細胞的毒性作用以及對學習記憶的損害，在哺乳動物腦內，海馬(Hippocampus)是神經元可塑性的重要區(qū)域，與學習記憶的形成密切相關，同時，海馬也是酒精累及的敏感部位，因此本研究選取大鼠海馬作為研究慢性酒精中毒對學習與記憶影響的部位。
[0003]酒精造成中樞神經系統損害的機制比較復雜，目前主要集中于以下三方面的研究:1、酒精導致神經元凋亡；2、酒精干擾神經遞質傳導，酒精影響的主要神經遞質通路包括Y-氨基丁酸(GABA)、5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、谷氨酸、膽堿能系統等；3、酒精相
關基因。
[0004]細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶5 (cyclin-dependent kinase 5, Cdk5)于1992年被多個實驗室先后發(fā)現，因其具有與其它細胞周期依賴性蛋白成員同源的序列而得名。Cdk5幾乎存在于整個中樞和外周神經系統的神經元中，在一些大神經元如海馬的錐體細胞、皮層神經元等表達更高。Cdk5基因定位于7號染色體，具體為7q36，是一個3.95 kb長度的DNA序列。它含有12個外顯子，控制987 bp的轉錄。Cdk5蛋白的分子量為33kDa。單體Cdk5無活性，當與其激活因子結合之后，Cdk5特異性磷酸化其底物蛋白的絲氨酸和蘇氨酸位點。Odk5的激活蛋白主要包括神經元特異的p35和p39蛋白。p35主要分布于大腦皮層，而P39主要分布于小腦，它們在鈣離子和鈣調蛋白參與的情況下，隨著細胞內鈣離子濃度的升高而分別水解成P25和p29，這四者作為激活蛋白可與Cdk5形成異源二聚體而產生活性。在神經系統發(fā)育及成熟階段，Cdk5通過磷酸化細胞骨架蛋白、信號分子以及調節(jié)蛋白等眾多底物蛋白的特異性絲/蘇氨酸位點，而在神經元的遷移分化、存活和突觸的發(fā)生、信息傳遞、可塑性等諸多方面起到了重要的作用。此外，在一些病理條件下，P35的病理性剪切和Cdk5/p25的形成所導致的Cdk5活性失調及其亞細胞分布改變則促進了神經元的凋亡或死亡，參與了阿爾茨海默氏病(Alzheimer’ s disease, AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)、亨廷頓氏病(Huntington’s disease, HD)以及脊髓側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等眾多神經退行性疾病的發(fā)生發(fā)展過程。已有的研究表明，Cdk5廣泛參與學習記憶過程，如Fischer等發(fā)現，在訓練前或訓練后即刻在小鼠的側腦室、側間隔及海馬通過微導管注入Cdk5的抑制劑丁內酯I或細胞周期蛋白B激酶抑制劑roscovitine會明顯損害情景條件性恐懼而不影響聽覺條件性恐懼，在24小時記憶測試前注入則不會有這樣的結果，提示這些部位的Cdk5在訓練時期參與了關聯性學習的鞏固。同樣，有實驗證實在小鼠海馬區(qū)通過微導管注入丁內酯I或roscovitine有利于情景恐懼記憶的消除。Tanaka等在轉基因動物模型中也得到了一致的結果。Ohshima等在Cdk5的激活蛋白p35敲除的小鼠模型中進行Morris水迷宮行為學測試，發(fā)現敲除小鼠表現出空間學習能力缺陷及長時程抑制(long-term depression, LTD)的受損，而在激活蛋白p25短暫表達增多的轉基因小鼠中學習能力和長時程增強(long-term potentiation,LTP)都得到增強。因此可以推斷Cdk5在學習記憶中起著重要的作用。另外，多方面的研究也證實Cdk5和藥物成癮密切相關，我們先前的研究也證實Cdk5與酒精暴露有密切的關系O [0005]目前，市場上存在的治療慢性酒精中毒的藥物都存在一定的局限性。如戒酒硫(Disulfiram)能干擾酒精的代謝過程，喝少量酒就會引起惡心、嘔吐、意識模糊和呼吸困難；環(huán)丙甲羥二羥嗎啡酮(Naltrexone)能減少對酒精的依賴，但存在較大副作用，需在醫(yī)生指導下使用；苯并二氮卓(Benzodiazepine)是抗焦慮藥物，常用于治療戒酒癥狀如焦慮和失眠，也用來預防癲癇發(fā)作和譫妄，應用它們時要小心，因為它們也有成癮性；三環(huán)類抗抑郁藥物可以用來控制任何原因引起的焦慮和抑郁，但是由于這些癥狀隨著戒酒有可能消失，因此直到戒酒后如仍存在這些癥狀才使用此類藥物。
[0006]白藜蘆醇甙(Polydatin，PD)是從植物中提取的天然化學物質，即羥基二苯乙烯類化合物，其化學名稱為3，4’，5-三羥基芪-3- β -D-葡萄糖苷(C2tlH22O8, 3，4’，5-trihydrox-ystibene-3- β -mono-D-glucoside),目前至少已經在70余種植物中發(fā)現了白藜蘆醇式，研究表明白藜蘆醇甙具有多方面的藥理作用，如對抗局部缺血再灌注、保護心肌細胞的作用、保護血管平滑肌細胞、抗血小板聚集、改善微循環(huán)，還能夠減輕多種因素造成的組織器官損傷，并且白藜蘆醇甙還具有保護神經的作用。
[0007]據此，我們研究了白藜蘆醇甙對慢性酒精中毒的神經保護作用及其與Cdk5的關系，白藜蘆醇甙具有神經保護的作用，能夠明顯改善慢性酒精中毒模型大鼠的神經損傷和降低慢性酒精中毒模型大鼠海馬區(qū)Cdk5的表達。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明解決的技術問題在于提供白藜蘆醇甙的新用途，即在制備慢性酒精中毒腦損傷藥物中的新應用。
[0009]本發(fā)明的技術方案為:白藜蘆醇甙或白藜蘆醇在制備治療或預防慢性酒精中毒腦損傷中記憶減退的藥物中的應用。
[0010]本發(fā)明所述的白藜蘆醇甙或者其與藥學上可接受的酸或堿所形成的加成鹽或者含有它們中任何一種的藥物組合物與可藥用輔料用于制備治療或預防慢性酒精中毒腦損傷中記憶減退的藥物。
[0011]本發(fā)明所述的白藜蘆醇或者其與藥學上可接受的酸或堿所形成的加成鹽或者含有它們中任何一種的藥物組合物與可藥用輔料用于制備治療或預防慢性酒精中毒腦損傷中記憶減退的藥物。
[0012]本發(fā)明的動物實驗中，學習記憶測試結果顯示慢性酒精中毒大鼠訓練成績較正常大鼠明顯下降，而高低劑量的白藜蘆醇甙對慢性酒精中毒大鼠的學習記憶能力均有保護作用；免疫熒光結果顯示慢性酒精中毒大鼠海馬區(qū)Cdk5陽性細胞明顯增加，而用藥組，尤其高劑量組陽性細胞數目減少；XTT結果顯示，高低劑量白藜蘆醇甙對原代培養(yǎng)海馬神經元細胞均具有保護作用；WeStern blot結果表明酒精處理后海馬神經元細胞Cdk5蛋白表達水平明顯升高，而高低劑量白藜蘆醇甙與酒精共同作用于海馬神經元細胞可以使Cdk5蛋白表達水平明顯下降；Cdk5激酶活性測定顯示，酒精處理后原代培養(yǎng)海馬神經元細胞Cdk5激酶活性與對照組相比明顯升高(P〈0.01)，而高低劑量白藜蘆醇甙可以使Cdk5激酶活性明顯下降。這說明白藜蘆醇甙確實對慢性酒精中毒引起的腦細胞損傷具有保護作用，這種作用可以降低大鼠海馬區(qū)Cdk5蛋白的表達。
[0013]說明書附圖
圖1是Y-迷宮檢測酒精處理對大鼠空間學習記憶改變的影響，圖2是免疫熒光檢測大鼠海馬組織Cdk5蛋白表達情況，圖3是Western blot法檢測大鼠海馬原代培養(yǎng)神經元Cdk5表達情況，圖4是Cdk5激酶活性的比較。
【具體實施方式】
[0014]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例白藜蘆醇甙對慢性酒精中毒大鼠學習記憶及海馬Cdk5表達的影響。
[0015]一、材料與方法
1、白藜蘆醇甙的提取
虎杖粗粉水煎、過濾、濃縮；體積分數為95%的乙醇溶解過濾除雜質，回收乙醇；用乙酸乙脂萃取4次，合并萃取液；減壓回收乙酸乙脂至浸膏狀，用稀乙醇溶解，放置，過濾，析出物為白色針狀晶體，難溶于水，為白藜蘆醇式。
[0016]2、藥品及試劑
兔抗鼠Cdk5多克隆抗體:北京博奧森；Cy3標記羊抗兔IgG，DAPI，抗熒光淬滅封片液:碧云天；四氮唑鹽復合物(XTT): Sigma ；HRP標記羊抗兔IgG:中杉金橋。
[0017]3、動物及分組
清潔級雄性SD (Sprague-Dawley)大鼠,體重200g_220g,由鄭州大學動物中心提供,許可證號:SCXk (豫)2005-0001，隨機分為4組(/7=10):A正常組、B酒精中毒模型組、C酒精+低劑量白藜蘆醇甙組、D酒精+高劑量白藜蘆醇甙組。
[0018]4、慢性酒精中毒模型的建立
米用被廣泛使用的雙瓶自由選擇法(2-bottle free-choice procedures betweenwater and ethanol (EtOH))制備慢性酒精中毒大鼠模型,分為三個階段:糖水遞減誘導階段、雙瓶選擇測試(Two-bottle choice tests)階段、強制供應階段。
[0019]5、給藥
第9周開始，C、D組大鼠繼續(xù)飲酒的同時，每天上午9點分別以質量濃度為0.1%、0.4%的白藜蘆醇甙生理鹽水溶液(2 ml/kg)灌胃，A組、B組以等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃10 cL
[0020]6、電刺激Y迷宮任務 Y-迷宮法檢測大鼠的學習記憶。以10次電刺激后有9次做出正確反應為學會，用大鼠學會所需訓練的次數來表示其空間分辯反應的學習記憶成績。訓練次數越少，說明大鼠學習能力越強。所有學習記憶測試均于晚間安靜、暗光下進行。
[0021]7、熒光免疫檢測法大鼠經Zoletil 50? (10 mg/kg, 1.ρ.)麻醉后處死，50mM磷酸鹽緩沖液(PBS)灌注，4%多聚甲醛固定，斷頭取腦。將鼠腦置于特制大鼠腦分割槽內，自視交叉處切開，取視交叉后腦組織于恒溫冷凍切片機內切成8μπι切片，貼于防脫載玻片上；微波修復15分鐘，山羊血清封閉20分鐘；加入兔抗鼠Cdk5多克隆抗體(I: 100), 4°C過夜；加入Cy3標記羊抗兔IgG (I: 500)，室溫放置2小時；DAPI核復染3分鐘；抗熒光淬滅封片液封片；倒置熒光顯微鏡(Leica DMRXA)觀察并拍照。
[0022]8、Cdk5激酶活性檢測
Cdk5激酶活性檢測方法參照文獻方法進行。(Chen PC, Chen JC.Enhanced Cdk5activity and p35 translocation in the ventral striatum of acute and chronicmethamphetamine-treated rats.Neuropsychopharmacology.2005;30:538-549.)
9、大鼠海馬原代神經元培養(yǎng)
大鼠海馬原代神經元培養(yǎng)方法參照文獻方法進行。(Li R, Guo M, Zhang G, Xu X，Li Q.Neuroprotection of nicotiflorin in permanent focal cerebral ischemia andin neuronal cultures.Biol Pharm Bull.2006 Sep;29 (9):1868-72.)
10、XTT法檢測細胞存活率
對數期細胞以5X IO5個/ml接種，以5X105cell/ml接種于96孔板內，100 μ 1/well，細胞貼壁培養(yǎng)24h后，加藥處理。白藜蘆醇甙劑量設置為12.5,50( μ g/ml)單獨或與酒精(25mmol/ml)共同作用，同時設空白對照。每個濃度設六個平行孔。細胞加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入50 μ I XTT/PMS混合液，置培養(yǎng)箱中37°C 孵育2h，酶標儀測定450nm波長處吸光度值(A)。根據下列公式計算細胞平均存活率:存活率=A藥物處麵/Amm X 100%,實驗重復3次。
[0023]11> Western blot方法檢測Cdk5蛋白表達
Western blot檢測Cdk5蛋白表達的方法參照文獻描述[Rajgopal Y, VemuriMC.Ethanol induced changes in cyclin-dependent kinase-5 activity andits activators, P35, P67 (Munc-18) in rat brain.Neurosci Lett.2001 Aug10;308(3): 173-6.]。取含等量蛋白(50 mg/lane)的細胞裂解物進行SDS-PAGE凝膠電泳。結束后電轉移至PVDF膜，轉移條件為60 V,4.5 h于Towbin buffer [25 mM Tris-HCl (pH8.3), 192 mM glycine, 20% (v/v) methanol]。轉移后洗膜，加入一抗(anti_Cdk5, 1:300)過夜。二抗孵育Ih，DAB顯色，拍照。
[0024]12、統計分析
采用SPSS11.5軟件(version 11.5，SPSS Inc.，USA)進行數據統計，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)和LSD檢驗。所有的數據均以均數土標準差(X 土s)表不。
[0025]二、結果
1、酒精處理大鼠Y-迷宮成績比較
圖1為Y-迷宮檢測酒精處理對大鼠學習記憶成績的影響。n=10。1:對照組；2:模型組；3:低劑量組；4:高劑量組;*與對照組相比，P < 0.01 ;與模型組相比，# P < 0.05，##P< 0.010
[0026]Y-迷宮行為檢測結果顯示，慢性酒精中毒大鼠訓練成績(99.73±11.78)較正常大鼠明顯下降(32.18±10.41)，而高低劑量白藜蘆醇甙(88.15±6.51)和(41.00±4.65)對慢性酒精中毒大鼠學習記憶能力均有保護作用，高劑量白藜蘆醇甙保護作用更加明顯。
[0027]2、免疫熒光檢測Cdk5
圖2為免疫熒光檢測大鼠海馬組織(Alexa Fluor 488，400X)。Cdk5表達細胞顯綠色熒光。A:對照組Cdk5蛋白表達；B:模型組Cdk5蛋白表達；C:低劑量組Cdk5蛋白表達；D:高劑量組Cdk5蛋白表達。Scale=IO μ m。
[0028]Cdk5在海馬區(qū)神經元細胞表達，陽性細胞胞質呈綠色。模型組組與正常對照組及飲酒對照組相比較，鏡下見大量的熒光著色細胞，分布密集，且熒光強度增加。用藥組，尤其高劑量組陽性細胞數目減少。
[0029]3、白藜蘆醇甙對原代培養(yǎng)海馬神經元細胞存活率的影響
XTT法結果顯示，25mmol/ml酒精作用于原代培養(yǎng)海馬神經元細胞，與對照組相比，細胞存活率明顯下降，說明酒精對神經元細胞具有毒性作用；而12.5 μ g/ml和50 μ g/ml白藜蘆醇甙作用于原代培養(yǎng)海馬神經元細胞，與對照組相比，對細胞存活率無明顯影響，提示此濃度范圍內的白藜蘆醇對神經元細胞的毒性相對較低；12.5 μ g/ml和50 μ g/ml白藜蘆醇甙與25mmol/ml酒精共同作用于原代培養(yǎng)海馬神經元細胞，與酒精單獨作用組相比，細胞存活率明顯上升(P < 0.05或P < 0.01)，說明高低劑量白藜蘆醇甙對神經元細胞均具有保護作用。
[0030]表.1白藜蘆醇甙和酒精對海馬神經元細胞存活率的影響
【權利要求】
1.白藜蘆醇甙或白藜蘆醇在制備治療或預防慢性酒精中毒腦損傷中記憶減退的藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的白藜蘆醇甙或白藜蘆醇在制備治療或預防慢性酒精中毒腦損傷中記憶減退的藥物中的應用，其特征在于:所述的白藜蘆醇甙或者其與藥學上可接受的酸或堿所形成的加成鹽或者含有它們中任何一種的藥物組合物與可藥用輔料用于制備治療或預防慢性酒精中毒腦損傷中記憶減退的藥物中的應用。
3.根據權利要求1所述的白藜蘆醇甙或白藜蘆醇在制備治療或預防慢性酒精中毒腦損傷中記憶減退的藥物中的應用，其特征在于:所述的白藜蘆醇或者其與藥學上可接受的酸或堿所形成的加成鹽或者含有它們中任何一種的藥物組合 物與可藥用輔料用于制備治療或預防慢性酒精中毒腦損傷中記憶減退的藥物中的應用。
【文檔編號】A61P25/28GK103690547SQ201310692332
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月17日 優(yōu)先權日:2013年12月17日
【發(fā)明者】張瑞嶺, 杜愛林, 徐春陽, 李爽, 牛敬媛, 姜洪波, 郭珂一, 孫莉莉, 弓茹月, 蘇慧潔, 吳雅倩, 仲麗麗, 靳玫, 李慧智, 解娜, 林瑞峰, 馬世江, 李靜, 于小免, 李天超, 馮素萍, 黃艷芬, 靖素華, 陳璇, 王樂男, 陳璐 申請人:新鄉(xiāng)醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院