包含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑及其在制備化妝品或抗衰老或抗腫瘤藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種包含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。本發(fā)明還涉及一種細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑試劑盒，其包含以下兩種獨(dú)立的組分：第一組分：二氧化氯前體固體，或包含二氧化氯前體的溶液；第二組分：酸性pH調(diào)節(jié)劑的水溶液；二者分開存放，且能在使用前進(jìn)行混合，以現(xiàn)場反應(yīng)并制得包含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑；且第一組分和第二組分的量和濃度能夠使得混合后的溶液的pH=1.5-6.5。本發(fā)明還涉及包含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑或包含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑試劑盒用于制備治療腫瘤的藥物的用途，或者用于制備哺乳動(dòng)物目標(biāo)組織抗衰老藥物的用途，或者用作化妝品的用途，或者用于制備化療藥物的用途。
【專利說明】包含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑及其在制備化妝品或抗衰老或抗腫瘤藥物中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于抗衰老和腫瘤治療領(lǐng)域，具體涉及通過誘導(dǎo)衰老細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抗衰老和治療腫瘤的方法，以及二氧化氯在制備用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的化妝品或藥物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]機(jī)體的衰老不能等同于細(xì)胞的衰老，但是前者是后者累計(jì)的結(jié)果，因此機(jī)體衰老一定程度上可以用衰老細(xì)胞的百分比來刻畫。機(jī)體內(nèi)總有細(xì)胞在不斷地衰老與死亡，同時(shí)又有細(xì)胞增殖產(chǎn)生新生細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)償。如果細(xì)胞增殖產(chǎn)生的新生細(xì)胞不僅全部補(bǔ)充死亡的細(xì)胞，而且能夠?qū)⒉糠值乃ダ霞?xì)胞替換，那么機(jī)體就表現(xiàn)的更為年輕。有研究表明:終身清除衰老細(xì)胞，能夠延遲與年齡相關(guān)的表現(xiàn)型的最初出現(xiàn)時(shí)間。而且，晚年的清除會(huì)延緩已經(jīng)出現(xiàn)的與年齡相關(guān)的病癥的發(fā)展。這表明，衰老細(xì)胞的確能引起與年齡相關(guān)的表現(xiàn)型，而且它們的清除能夠防止或延遲與年齡相關(guān)的組織功能喪失(Baker DJ, et al.Clearanceof pl6Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.Nature, 2011，479:232-236)。可以說，清除衰老細(xì)胞，降低衰老細(xì)胞的比例，機(jī)體就能表現(xiàn)的更為年輕，并且可以防止或者延遲與年齡相關(guān)的組織功能喪失。衰老細(xì)胞的死亡實(shí)質(zhì)上就是細(xì)胞凋亡。(惠宏襄等，《自由基與細(xì)胞凋亡》，《生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展》，1996 ；23:12)。
[0003]衰老并不意味著瀕臨死亡，如果定期更換培養(yǎng)液，衰老細(xì)胞仍可長期生存(Seshadri T, Campisi J.Repression of c-fos transcription and an altered geneticprogram in senescent human fibroblasts.Science, 1990Janl2;247(4939):205-9)。但衰老細(xì)胞的增殖抑制是不可逆的，其生長停滯在細(xì)胞周期Gl期，不能再進(jìn)入S期。這提示衰老細(xì)胞可能比增殖活躍的年輕細(xì)胞抗凋亡，從而長期維持生存(黃英、張宗玉童坦君，《人衰老成纖維細(xì)胞凋亡的可誘導(dǎo)性》，《中華老年醫(yī)學(xué)雜志》，2000年6月第19卷第3期)。
[0004]因此在理論上找到了一種抗衰老的思路，即通過對(duì)衰老細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)，促使衰老細(xì)胞發(fā)生凋亡，走向死亡，從而得以從機(jī)體上清除出去。機(jī)體會(huì)自動(dòng)啟動(dòng)干細(xì)胞再生能力，再生出新的細(xì)胞以代替被清除的細(xì)胞，使該機(jī)體年輕化。
[0005]有意識(shí)的誘導(dǎo)衰老細(xì)胞發(fā)生凋亡，是清除衰老細(xì)胞最適宜的思路。在胚胎發(fā)育階段通過細(xì)胞凋亡清除多余的和已完成使命的細(xì)胞，保證了胚胎的正常發(fā)育；在成年階段通過細(xì)胞凋亡清除衰老和病變的細(xì)胞，保證了機(jī)體的健康。比如，在小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把年老的干細(xì)胞置于一個(gè)年輕的微環(huán)境中，它們能夠返老還童(Rescuing replicationand osteogenesis of aged mesenchymal stem cells by exposure to a youngextracellular matrix Yun Sun,et al.The FASEB Journal, May 2011,vol.25n0.51474-1485)，即年輕化，也表示再生能力更強(qiáng)。從另一個(gè)方面理解，組織中衰老細(xì)胞得以清除，由于特異性的誘導(dǎo)空間存在，組織中的干細(xì)胞會(huì)自動(dòng)再生，再生的組織更為年輕化，因此機(jī)體整體表現(xiàn)為年輕化。
[0006]有較多研究指出細(xì)胞凋亡有助于機(jī)體延遲與衰老相關(guān)的組織功能喪失。比如，DNA斷裂也是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志特征，DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks)在老鼠大腦活動(dòng)的變化關(guān)系表明:這種DNA分子的斷裂，即使在完全健康的小鼠神經(jīng)元中也會(huì)發(fā)生，在適應(yīng)新環(huán)境過程的小鼠大腦中，DNA斷裂的速度是那些待在舊環(huán)境中不動(dòng)小鼠的六倍(Elsa Suberbielle, et al.pHysiologic brain activity causes DNA double-strandbreaks in neurons, with exacerbation by amyloid-β Nature Neuroscience 16, 613 -621 (2013))。顯然適應(yīng)新環(huán)境的小鼠記憶和思維能力更強(qiáng)，這表明DNA雙鏈斷裂的這種細(xì)胞凋亡過程能夠促進(jìn)小鼠的大腦年輕化。
[0007]自噬促進(jìn)了凋亡細(xì)胞最終的降解，也是衰老細(xì)胞清理的最后一步。自噬增多具有抗衰老效應(yīng)(Louis R.Lapierre, et al.The TFEB orthologue HLH-30regulates autopHagy and modulates longevity in Caenorhabditis elegans, NatureCommunications.4, Article number: 2267)。能引起細(xì)胞氧化的因素均能引起細(xì)胞凋亡。通過對(duì)巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的研究，Albina等提出NO也是細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)劑(AlbinaJE, Cui S，Mateo RB et al.Nitric oxide-mediated apoptosis in murine peritonealmacropHages.J Immunol, 1993 Jun I;150 (11):5080-5)?
[0008]一氧化氮(NO)對(duì)諸多衰老性疾病有治療作用，比如，，一氧化氮具有防止導(dǎo)致帕金森氏癥的神經(jīng)細(xì)胞異常的作用，這其中一氧化氮促進(jìn)了廢棄蛋白質(zhì)的分解，起到了保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用(Kentaro Ozawa, et al.S-nitrosylation regulates mitochondrialquality control via activation of parkin Scientific Reports3,Articlenumber:2202 (July2013)。一氧化氮的這種緩解衰老性疾病的機(jī)理似乎就是促進(jìn)衰老細(xì)胞發(fā)生凋亡。
[0009]但是現(xiàn)實(shí)中卻沒有`發(fā)現(xiàn)如何安全方便地靶向清除衰老細(xì)胞，而使機(jī)體年輕化的技術(shù)。
[0010]申請(qǐng)?zhí)枮?01110102598.1的中國專利《紫檀提取物與一氧化氮相結(jié)合的護(hù)膚品》提到:一氧化氮本身對(duì)皮膚的促進(jìn)再生、抵抗衰老的良好功效，還能增加皮膚對(duì)傳統(tǒng)化妝品有效成分的吸收。
[0011]申請(qǐng)?zhí)枮?01210499300.X的專利《一種啟動(dòng)哺乳動(dòng)物干細(xì)胞的方法及二氧化氯在制備用于啟動(dòng)哺乳動(dòng)物干細(xì)胞的藥物的應(yīng)用》，有使用二氧化氯用于啟動(dòng)干細(xì)胞從而促進(jìn)再生，但是沒有提及如何通過清除衰老細(xì)胞使組織年輕化的機(jī)理，也沒有可用于藥物或化妝品中的抗衰老應(yīng)用。盡管該專利依據(jù)干細(xì)胞再生機(jī)理提到二氧化氯治療一些老年性疾病，但是并沒有在預(yù)防這些疾病方面給出更多方案。
[0012]癌癥和衰老的根源是一樣的(CarlosLopez-Otin, et al.The Hallmarks ofAging.Cell, 6June2013)。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為治療腫瘤的一個(gè)重要途徑。如果將腫瘤細(xì)胞看作衰老細(xì)胞，那么通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡從而治療腫瘤的思路和通過誘導(dǎo)衰老細(xì)胞凋亡來抗衰老的思路是一致的。
[0013]腫瘤細(xì)胞通常具有一定的凋亡抵抗機(jī)制，利用細(xì)胞凋亡機(jī)制針對(duì)腫瘤的治療也就是在凋亡調(diào)節(jié)的各個(gè)水平上使促凋亡和抗凋亡的平衡發(fā)生改變，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
[0014]盡管有關(guān)凋亡機(jī)制的研究在近十多年得到了很大的進(jìn)展，但能夠確切詳盡解釋細(xì)胞凋亡，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的機(jī)制并不多，目前普遍接受的經(jīng)典途徑有以下兩條:死亡受體途徑和線粒體途徑。
[0015]針對(duì)腫瘤細(xì)胞特殊的pH環(huán)境，有研究表明，碳酸氫鈉增加了腫瘤pH值抑制了自發(fā)月中瘤轉(zhuǎn)移(Ian F.Robey, et al.Bicarbonate Increases Tumor pH and InhibitsSpontaneous Metastases Cancer Res Marchl5, 200969; 2260),但是其對(duì)腫瘤細(xì)胞本身并未形成凋亡誘導(dǎo)。
[0016]現(xiàn)有的腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑有如下幾個(gè)缺點(diǎn):祀向性不明確、副作用大、治療手段復(fù)雜且不確定性高、會(huì)引起腫瘤細(xì)胞的抵抗、只對(duì)少數(shù)類型腫瘤細(xì)胞有效。
[0017]如果誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡是治療腫瘤的正確思路，那么需要尋找更具靶向性，更低毒副作用，更具有普適性的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。 [0018]二氧化氯是目前國際上公認(rèn)的新一代的高效、廣譜、安全的殺菌、保鮮劑，是氯制劑最理想的替代品，在世界發(fā)達(dá)國家已得到廣泛的應(yīng)用。美國、西歐、加拿大、日本等發(fā)達(dá)國家的有關(guān)組織如美國環(huán)境保護(hù)局、食品藥品管理局、美國農(nóng)業(yè)部均批準(zhǔn)和推薦二氧化氯用于食品、食品加工、制藥、醫(yī)院、公共環(huán)境等的消毒、防霉和食品的防腐保鮮等。世界衛(wèi)生組織(WHO)和世界糧食組織(FAO)也已將二氧化氯列為Al級(jí)安全高效消毒劑。為控制飲水中“三致物質(zhì)”(致癌、致畸、致突變)的產(chǎn)生，歐美發(fā)達(dá)國家已廣泛應(yīng)用二氧化氯替代氯氣進(jìn)行飲用水的消毒。但二氧化氯作為藥品還未被市場所接受。然而，有部分專利涉及到利用二氧化氯用于美容或治療疾病的用途(例如，CN102137651A, CN101641104A和CN1199633C、US5750108、CN102441006A)，這些專利仍未發(fā)現(xiàn)二氧化氯，或者含有二氧化氯的酸性溶液具有清除衰老細(xì)胞的潛力。
[0019]發(fā)明概述
[0020]第一方面，本發(fā)明涉及一種包含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。
[0021]在一種優(yōu)先的實(shí)施方案中，該細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，包含溶解在水中的二氧化氯，其中二氧化氯濃度為500-2900ppm,基于質(zhì)量計(jì)算。
[0022]在一種更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑還含有酸性pH調(diào)節(jié)劑，使得該細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的PH=L 5-6.5，所述酸性pH調(diào)節(jié)劑選自以下各集合中的至少一種:
[0023]有機(jī)酸或其鹽，其選自由甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、丙酮酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、葡糖酸、乙醇酸、富馬酸、丙二酸、馬來酸、草酸、琥珀酸、丙烯酸、巴豆酸、戊二酸和它們的鹽組成的集合；
[0024]無機(jī)酸或其鹽，其選自由鹽酸、磷酸、硼酸、偏磷酸、焦磷酸、氨基磺酸、磷酸二氫鹽、磷酸氫鹽組成的集合。
[0025]最優(yōu)選地，其中所述酸性pH調(diào)節(jié)劑選自檸檬酸、乙酸或磷酸二氫鹽。
[0026]第二方面，本發(fā)明涉及一種包含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑試劑盒，其包含以下兩種獨(dú)立的組分:
[0027]第一組分:二氧化氯前體固體，或包含二氧化氯前體的溶液；
[0028]第二組分:酸性pH調(diào)節(jié)劑的水溶液；
[0029]二者分開存放，且能在使用前進(jìn)行混合，以現(xiàn)場反應(yīng)并制得包含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑；且第一組分和第二組分的量和濃度能夠使得混合后的溶液的PH=L 5-6.5 ；
[0030]其中所述二氧化氯前體選自亞氯酸鈉、亞氯酸鉀、亞氯酸鋰、亞氯酸鈣、亞氯酸鎂或亞氯酸鋇中的至少一種；
[0031]其中所述酸性pH調(diào)節(jié)劑選自以下各集合中的至少一種:
[0032]有機(jī)酸或其鹽，其選自由甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、丙酮酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、葡糖酸、乙醇酸、富馬酸、丙二酸、馬來酸、草酸、琥珀酸、丙烯酸、巴豆酸、戊二酸和它們的鹽組成的集合；
[0033]無機(jī)酸或其鹽，其選自由鹽酸、磷酸、硼酸、偏磷酸、焦磷酸、氨基磺酸、磷酸二氫鹽、磷酸氫鹽組成的集合。
[0034]第三方面，本發(fā)明涉及上述包含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑或上述包含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑試劑盒用于制備誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物的用途。優(yōu)選地，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。
[0035]第四方面，本發(fā)明涉及上述包含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑或上述包含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑試劑盒用于制備治療腫瘤的藥物的用途，或者用于制備哺乳動(dòng)物目標(biāo)組織抗衰老藥物的用途，或者用作化妝品的用途，或者用于制備化療藥物的用途。
[0036]發(fā)明詳述
[0037]在對(duì)現(xiàn)有技術(shù)研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供二氧化氯在制備用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的藥物或化妝品的應(yīng)用。根據(jù)該應(yīng)用，用于抗衰老的藥物或化妝品中有含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，該藥物或化妝品能夠清除目標(biāo)組織中的衰老細(xì)胞，促進(jìn)身體的再生，再生年輕的組織，以達(dá)到抗衰老的作用。該應(yīng)用具有很小的副作用或者無副作用。
[0038]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供二氧化氯在制備用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的藥物的應(yīng)用。根據(jù)該應(yīng)用，用于`促進(jìn)哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物中有含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，該藥物能夠靶向明確的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，達(dá)到更好的腫瘤治療效果，且具有很小的副作用或者無副作用，對(duì)患者的負(fù)擔(dān)較輕。
[0039]為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:制備含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑以及對(duì)哺乳動(dòng)物目標(biāo)組織給予所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的步驟，其中所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑被給予哺乳動(dòng)物目標(biāo)組織時(shí)提供有效量的二氧化氯。
[0040]進(jìn)一步，制備含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的方法為:將二氧化氯氣體溶于含酸性pH調(diào)節(jié)劑的pH值為1.5~6.5的酸性溶液A中，制備500~2900ppm的二氧化氯溶液。
[0041]進(jìn)一步，制備含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的方法為:將二氧化氯前體溶解于水中制備成1%~40%的水溶液，向該水溶液中加入含有酸性pH調(diào)節(jié)劑的酸性溶液B，調(diào)節(jié)混合溶液的pH值為1.5~6.5。
[0042]進(jìn)一步，制備含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑試劑盒的方法為:將二氧化氯前體溶解于水中，制成濃度為1%~40%的水溶液C ;將酸性pH調(diào)節(jié)劑溶于水中制備出酸性溶液D ；使用前混合溶液C、D，調(diào)節(jié)混合溶液的pH值為1.5~6.5。
[0043]再進(jìn)一步，二氧化氯前體為亞氯酸鈉、亞氯酸鉀、亞氯酸鋰、亞氯酸鈣、亞氯酸鎂和亞氯酸鋇。
[0044]再進(jìn)一步，酸性pH調(diào)節(jié)劑為檸檬酸、乙酸或磷酸二氫鈉。
[0045]進(jìn)一步，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑通過動(dòng)脈注射、肌肉注射、皮下注射、心內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、關(guān)節(jié)內(nèi)注射、穿刺注射、直腸給藥、鼻腔給藥、經(jīng)皮給藥或吸入給藥的方式直接給到損傷的器官或組織或給到其它目標(biāo)組織中。
[0046]進(jìn)一步，可將細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑制成注射劑、軟膏劑、吸入劑、滴鼻劑、洗劑、栓劑、貼劑、糊劑、片劑、口服液、膠囊劑、顆粒劑、沖劑、丸劑或糖漿劑。
[0047]本發(fā)明提供了二氧化氯在制備用于二氧化氯在制備用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的藥物、化妝品的應(yīng)用，其中，該藥物或化妝品用于哺乳動(dòng)物目標(biāo)組織的抗衰老，使其年輕化。
[0048]進(jìn)一步，這種抗衰老包括，皮膚年輕化即皮膚美容，身體其他組織年輕化，比如增加記憶力、提高睡眠治療、預(yù)防阿爾茲海默癥、帕金森綜合癥、骨質(zhì)疏松、糖尿病、心腦血管疾病等老年性疾病等，包括但不限于這些。
[0049]更進(jìn)一步，二氧化氯在制備用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的藥物、化妝品的應(yīng)用，其中，該藥物用于人體組織抗衰老，并預(yù)防阿爾茲海默癥、帕金森綜合癥、骨質(zhì)疏松、糖尿病、心腦血管疾病等老年性疾病等；該化妝品用于皮膚美容護(hù)膚、祛痘或去除痤瘡，也可以用于口腔護(hù)理的漱口水，包括但不限于這些。
[0050]本發(fā)明還提供了二氧化氯在制備用于誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用，其中，該藥物用于治療癌癥，具體為誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞凋亡。
[0051]進(jìn)一步，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其中針對(duì)的癌癥包括:
[0052]顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤、腦膜瘤、顱骨腫瘤、腦癌、腦垂體腺瘤、聽神經(jīng)鞘瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦腫瘤；上頜竇癌、喉癌、鼻咽癌、舌癌、甲狀腺癌、牙齦癌、唇癌；胸腺瘤、肺癌、腺癌、乳房肉瘤、肺轉(zhuǎn)移瘤、乳房纖維瘤、乳腺癌；胰頭癌、胃癌、膽囊癌、直腸癌、胰腺癌、食管癌、結(jié)腸癌、肝癌；腎盂腫瘤、陰莖癌、尿路上皮癌、前列腺癌、尿道癌、睪丸癌、膀胱癌、腎母細(xì)胞瘤、腎癌；卵巢癌、輸卵管腫瘤、外陰癌、陰道腫瘤、子宮癌、宮頸癌、絨毛膜癌、盆腔癌；皮膚癌、脂肪肉瘤、惡性畸胎瘤、纖維瘤、神經(jīng)纖維瘤、黑色素瘤、膽管癌、鱗癌、基底細(xì)胞癌；脊索瘤、骨瘤、軟骨瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤、骨巨細(xì)胞瘤、骨纖維肉瘤；急性白血病、惡性淋巴瘤、慢性白血??；肝血管瘤、胰島細(xì)胞類癌、母細(xì)胞瘤、粘液瘤、頸部轉(zhuǎn)移癌、賁門癌。包括但不限于這些癌癥。
[0053]進(jìn)一步，本發(fā)明的二氧化氯在制備用于誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用，該應(yīng)用中的藥物可投予存在發(fā)展癌癥的風(fēng)險(xiǎn)、經(jīng)診斷患有癌癥、處于癌癥治療期間或處于癌癥治療后恢復(fù)期間的受檢者個(gè)體，或該藥物可作為預(yù)防劑投予受檢者個(gè)體以阻止或延緩
癌癥的發(fā)展。
【具體實(shí)施方式】
[0054]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0055]本發(fā)明將細(xì)胞凋亡定義為細(xì)胞的死亡、并被降解清除，而不嚴(yán)格區(qū)分是否屬于凋亡(apoptosis)、壞死(necrosis)或自卩遼(autophagy)。本發(fā)明中的誘導(dǎo)衰老細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞凋亡就是指促使衰老細(xì)胞死亡、并被降解清除和腫瘤細(xì)胞死亡、并被降解清除，而并不細(xì)究死亡的方式和過程。 [0056]在描述本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】之前，首先對(duì)本發(fā)明所提供方法的機(jī)理進(jìn)行描述。這些描述再結(jié)合具體實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明的技術(shù)方案和保護(hù)范圍。
[0057]有研究表明:終身清除衰老細(xì)胞，能夠延遲與年齡相關(guān)的表現(xiàn)型的最初出現(xiàn)時(shí)間。而且，晚年的清除會(huì)延緩已經(jīng)出現(xiàn)的與年齡相關(guān)的病癥的發(fā)展。這表明，衰老細(xì)胞的確能引起與年齡相關(guān)的表現(xiàn)型，而且它們的清除能夠防止或延遲與年齡相關(guān)的組織功能喪失° (Baker DJ, et al.Clearance of pl6Ink4a-positive senescent cells delaysageing-associated disorders.Nature, 2011, 479:232-236)?？梢哉f，清除衰老細(xì)胞，降低衰老細(xì)胞的比例，機(jī)體就能表現(xiàn)的更為年輕，并且可以防止或者延遲與年齡相關(guān)的組織功能喪失。衰老細(xì)胞的死亡實(shí)質(zhì)上就是細(xì)胞凋亡。(惠宏襄等，《自由基與細(xì)胞凋亡》.《生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展》，1996 ；23:12)。
[0058]自噬促進(jìn)凋亡細(xì)胞的降解，所以也能起到衰老細(xì)胞清除的作用。研究發(fā)現(xiàn)，果蠅的記憶缺失能夠通過食用富含多胺的食物扭轉(zhuǎn)過來。喂果蠅等吃多胺能夠增強(qiáng)生物體的壽命。它似乎通過逆轉(zhuǎn)與年齡相關(guān)的自噬的衰退來起作用。自吞噬是指細(xì)胞用來清除自身殘片的機(jī)制。通過基因技術(shù)或限制卡路里攝入提高自吞噬，也能夠延長果蠅的壽命。(VarunK Gupta, et al.Restoring polyamines protects from age-1nduced memory impairmentin an autopHagy-dependent manner.Nature Neuroscience, 01 September 2013)。
[0059]高水平的ROS 可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Lau AT, Wang Y, Chiu JF.Reactive oxygenspecies:current knowledge and applications in cancer research and therapeutic.J Cell Biochem.2008Mayl5; 104(2):657-67)。研究顯示當(dāng)線蟲以生產(chǎn)一氧化氮的細(xì)菌為食時(shí)，壽命得到顯著延長(Ivan Gusarov, et al.Bacterial Nitric Oxide Extends theLifespan of C.elegans Cell, Volume 152, Issue 4，818-830，14February2013)。這說明氧化物可以促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。
[0060]盡管抗氧化作為抗衰老的有效標(biāo)準(zhǔn)一直存在，但是現(xiàn)實(shí)證據(jù)卻很少支持。如果無法及時(shí)清除缺陷型的蛋白，就會(huì)導(dǎo)致蛋白內(nèi)穩(wěn)態(tài)的喪失，引發(fā)衰老相關(guān)疾病。例如在阿爾茨海默癥中，無法清除的蛋白形成斑塊，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。雖然大量的自由基可能有害，但它們的存在也會(huì)觸發(fā)保護(hù)性的應(yīng)答。沒有任何遺傳學(xué)證據(jù)能說明，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化防御能夠延緩衰老。(Carlos Lopez-Otin, et al.The Hallmarks of Aging.Cell, 6June2013)。
[0061]在一些實(shí)施例中，本發(fā)明也證明了具有較強(qiáng)氧化性物質(zhì)(二氧化氯)可以促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且有助于機(jī)體的年輕化。
[0062]另一方面，在生長因子依賴的細(xì)胞株凋亡過程中普遍存在細(xì)胞內(nèi)酸化，細(xì)胞內(nèi)酸化是細(xì)胞凋亡過程中的一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)變化，它促進(jìn)細(xì)胞凋亡已有以下幾方面的事實(shí)所支持:①特異性Na+/H+交換抑制劑通過抑制Na+/H+交換體使細(xì)胞內(nèi)酸化可誘導(dǎo)凋亡，除Na+/H+交換器外，Na+-HCCV協(xié)同運(yùn)輸器與C1_/HC03_交換器的改變也與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，細(xì)胞漿酸化程度與細(xì)胞凋亡發(fā)生率存在量效關(guān)系；②單純的堿處理通過減少胞內(nèi)酸化程度而表現(xiàn)出對(duì)抗誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；③細(xì)胞內(nèi)存在酸性核酸內(nèi)切酶，細(xì)胞內(nèi)酸化能激活該酶，觸發(fā)核小體DNA裂解，該酶是細(xì)胞酸化介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要物質(zhì)基礎(chǔ)；④許多與細(xì)胞凋亡有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)的活性在酸性環(huán)境中增強(qiáng)(邊肖海等，《胞內(nèi)PH值在細(xì)胞凋亡中的研究進(jìn)展》，《長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)》2004年4期)。
[0063]衰老或者凋亡細(xì)胞在酸性的條件下更容易走向死亡。凋亡細(xì)胞糖酵解作用加強(qiáng)，酸性代謝產(chǎn)物增多，如果外部施加酸壓力(降低PH值)，凋亡細(xì)胞將加速走向死亡。比如，心肌肥大是心肌組織對(duì)負(fù)荷增加的一種防御性反應(yīng)，以暫時(shí)適應(yīng)總體或局部心肌應(yīng)力的改變，如果心臟生理機(jī)能的需要超過心肌細(xì)胞的代償適應(yīng)能力，心肌細(xì)胞將發(fā)生自殺性死亡即細(xì)胞凋亡，成為心肌肥大向心力衰竭轉(zhuǎn)化的主要機(jī)制之一。在缺氧時(shí)，肥大心肌細(xì)胞糖酵解率僅輕度下降，但在復(fù)氧后糖酵解率迅速升高，呈爆發(fā)樣達(dá)峰值后又逐漸恢復(fù)到缺氧前水平。糖酵解率的升高必然引起細(xì)胞內(nèi)乳酸酸中毒。常氧培養(yǎng)時(shí)肥大心肌細(xì)胞凋亡率即顯著高于正常心肌細(xì)胞，二者在缺氧后的細(xì)胞凋亡均顯著增加，復(fù)氧后正常心肌細(xì)胞凋亡逐漸減少，而肥大心肌細(xì)胞在復(fù)氧早期細(xì)胞凋亡率繼續(xù)大幅度上升，此后逐漸減少。(馮兵，劉偉，徐靜，何作云，楊惠標(biāo)，《缺氧復(fù)氧時(shí)肥大心肌細(xì)胞凋亡及其與能量代謝途徑轉(zhuǎn)換的關(guān)系》，ActapHysiologica Sinica, 0ctober25, 2005, 57 (5): 636-642)
[0064]肌酸(creatine)在生物化學(xué)中，是一種自然存在于脊椎動(dòng)物體內(nèi)的一種含氮的有機(jī)酸，能夠輔助為肌肉和神經(jīng)細(xì)胞提供能量。研究發(fā)現(xiàn)，口服肌酸能夠改善G93A轉(zhuǎn)基因小鼠(肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥)機(jī)體性能，并延長壽命，該種作用呈現(xiàn)量效關(guān)系，同時(shí)還保護(hù)小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和黑質(zhì)神經(jīng)元的損傷(Klivenyi P, et al.Neuroprotective effects ofcreatine in a transgenic animal model of amyotropHic lateral sclerosis..NatureMedicine.1999.mar, 5 (3): 347 - 350)?研究也發(fā)現(xiàn)硫辛酸(lipoic acid)能夠減緩衰老過程。
[0065]普遍認(rèn)為L-抗壞血酸的抗衰老作用在于其抗氧化能力。但是,2009年，由德國耶拿大學(xué)的邁克爾?瑞斯托實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的重要實(shí)驗(yàn)表明ROS對(duì)于維持肝臟的基本功能必不可少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體育鍛煉通過提高來自線粒體(細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)能的微小器官，產(chǎn)能原理部分經(jīng)由氧化還原鏈)內(nèi)的電子傳遞鏈體系ROS的產(chǎn)生，阻止II型糖尿病的發(fā)生。然而如果同時(shí)每天服用抗氧化劑維生素C和維生素E，鍛煉就沒有積極的效果。2009年2月出版的《臨床營養(yǎng)》就發(fā)表了一篇綜述，總結(jié)了總參與人數(shù)多達(dá)十幾萬的22項(xiàng)公開發(fā)表的隨機(jī)雙盲對(duì)照研究，結(jié)論是沒有支持“抗氧化劑防止冠狀動(dòng)脈硬化”的說法。而《美國醫(yī)學(xué)會(huì)雜志》2007年2月發(fā)表的一篇綜述更加打擊抗氧化劑保健品。對(duì)總共涉及23萬多人的68項(xiàng)研究進(jìn)行總結(jié)，分析的幾種抗氧化劑對(duì)于死亡率沒有影響。如果剔除那些質(zhì)量不高的研究，只對(duì)47項(xiàng)總計(jì)超過18萬人參與的高質(zhì)量研究進(jìn)行分析，那么這幾種抗氧化劑甚至小幅度增加了死亡率。因此，本發(fā)明人認(rèn)為，L-抗壞血酸的抗衰老作用在于其酸性。
`[0066]多種酸性物質(zhì)有美容的作用。比如，以30%高濃度的水楊酸作為化學(xué)換膚的藥劑，可達(dá)到和70%果酸換膚相同的淡化色素斑、縮小毛孔、去除細(xì)小皺紋及改善日曬引起的老化等多項(xiàng)效果。皮膚美容就是讓皮膚年輕化，所以大致可以得出結(jié)論，酸性物質(zhì)能夠清除衰老細(xì)胞，促進(jìn)年輕皮膚再生。中劑量和高劑量檸檬酸處理組引起了小鼠睪丸組織細(xì)胞的凋亡(王艷杰:檸檬酸對(duì)小鼠睪丸組織凋亡的影響[D];河南科技大學(xué):2012年)。
[0067]發(fā)明人猜想，L-抗壞血酸，肌酸，硫辛酸等酸性物質(zhì)能夠抗衰老的作用，更多的是因?yàn)槠渌嵝蕴卣髂軌蚣铀偎ダ霞?xì)胞發(fā)生凋亡，從而引起機(jī)體年輕化。發(fā)明人意外的發(fā)現(xiàn)，用有較高氧化電位的二氧化氯液劑并輔以酸性環(huán)境能夠抗衰老。
[0068]在一些實(shí)施例中，本發(fā)明通過試驗(yàn)證明了，酸性環(huán)境有助于提高二氧化氯制劑對(duì)細(xì)胞的凋亡作用。
[0069]在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施例中，我們采用酸性二氧化氯溶液靶向給予目標(biāo)組織，證明可以使目標(biāo)組織年輕化。
[0070]腫瘤細(xì)胞有十大特征:自給自足生長信號(hào)(Self-Sufficiency in GrowthSignals);抗生長信號(hào)的不敏感(Insensitivity to Anti growth Signals);抵抗細(xì)胞死亡(Resisting Cell Death);潛力無限的復(fù)制能力(Limitless Replicative Potential)；持續(xù)的血管生成(Sustained Angiogenesis);組織浸潤和轉(zhuǎn)移(Tissue Invasion andMetastasis);避免免疫摧毀(Avoiding Immune Destruction);促進(jìn)腫瘤的炎癥(TumorPromotion Inflammation);細(xì)胞倉泛量異常(Deregulating Cellular Energetics);基因組不穩(wěn)定和突變(Genome Instability and MutationXHanahan D, Weinberg RA.Hallmarksof cancer:the next generation.Cell.2011Mar4; 144(5):646_74)。如果抑制其抵抗細(xì)胞死亡，也就是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，很大程度抑制了癌癥的發(fā)生。從邏輯上考慮，由于腫瘤細(xì)胞是非正常細(xì)胞，機(jī)體自身天生應(yīng)該對(duì)其有抑制作用，也就是這些細(xì)胞應(yīng)該自動(dòng)發(fā)生凋亡，之所以不發(fā)生凋亡與其自身特征有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，一些癌癥或許不能完全歸因?yàn)檫z傳損傷，而是衰老細(xì)胞繞過了告訴它們停止生長的開關(guān)所引起，衰老細(xì)胞與癌細(xì)胞之間的行為存在相似之處表明，如果衰老細(xì)胞設(shè)法逃脫死亡，它們有潛力變?yōu)榘┌Y(HazelA.Cruickshanks,et al.Senescent cells harbour features of the cancer epigenome,Nature Cell Biology (2013))。新的觀點(diǎn)認(rèn)為，癌癥和衰老的根源是一樣的(CarlosLopez-Otin, et al.The Hallmarks of Aging.Cell, 6June2013)。發(fā)明人將腫瘤細(xì)胞看作衰老細(xì)胞，它理應(yīng)走向凋亡。因此發(fā)明人認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞是因?yàn)榫哂械囊恍┨厥饽芰ψ屍洳蛔呦虻蛲?，而長期滯留在機(jī)體內(nèi)。
[0071]針對(duì)腫瘤細(xì)胞的兩個(gè)特征也許是消滅腫瘤的最佳方式。該兩個(gè)特征就是，抵抗細(xì)胞死亡和細(xì)胞能量異常。參考誘導(dǎo)衰老細(xì)胞發(fā)生凋亡的思路同樣適用于腫瘤細(xì)胞。盡管腫瘤細(xì)胞有自身的特征，一般癌癥病人存在是由于腫瘤細(xì)胞不在機(jī)體環(huán)境作用下自動(dòng)走向死亡，但是相對(duì)于正常的細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞本身發(fā)生了變化，比如更怕氧化物，也更怕酸性環(huán)境。
[0072]通過口服西地那非治療3例患有囊狀淋巴管瘤的兒童，通過用藥，3位患兒的腫瘤體積均出現(xiàn)明顯的縮小(Glenda L.et al.Swetman, Sildenafil for Severe LympHaticMalformations N Engl J Med2012; 366:384_386January26, 2012)。西地那非是 5-磷酸二酯酶抑制劑，磷酸二酯酶是NO-cGMP通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，因此西地那非能夠通過釋放生物活性物質(zhì)一氧化氮。因此，本發(fā)明人認(rèn)為一氧化氮這種氧化物起到抑制腫瘤的直接作用。
[0073]在針對(duì)乳腺和黑素瘤癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，硝酸甘油通過產(chǎn)生一氧化氮可以加強(qiáng)一般化療藥物殺死癌細(xì)胞的作用(Barsoum IB, et al.Hypoxia induces escape frominnate immunity in cancer cells via increased expression of ADAMlO:role ofnitric oxide.Cancer Res.201 IDec15; 71 (24): 7433-41 )? 促一氧化氮釋放的前體藥物，誘導(dǎo)乳腺癌癌細(xì)胞死亡，同時(shí)保留正常乳腺上皮細(xì)胞(Vanity McMurtry, et al.JS-K, anitric oxide-releasing pro-drug, induces breast cancer cell death while sparingnormal mammary epithelial cells,International of journal of oncology, Publishedonline on:Tuesday, January25, 2011, Pages:963-971)。普遍認(rèn)為，高濃度的一氧化氮合酶表達(dá)，可以對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制其生長的毒性作用(Xu W，et al.The role of nitricoxide in cancer.Cell Res.2002Dec;12 (5-6):311-20)。
[0074]細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，400 μ mol/L、800 μ mol/L、1600 μ mol/L對(duì)體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞有不同程度的細(xì)胞毒性，最高達(dá)89.0%。過氧化氫處理后，細(xì)胞衰老率和活性氧產(chǎn)生水平隨過氧化氫濃度升高而增高，呈現(xiàn)量效關(guān)系。結(jié)論:過氧化氫對(duì)Hela細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性，還能誘導(dǎo)其衰老和影響活性氧的產(chǎn)生水平。[0075]腫瘤細(xì)胞和衰老細(xì)胞一樣，更多的是依靠低氧的糖酵解方式提供能量。早在80多年前就發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的糖代謝較正常細(xì)胞旺盛，而且即使是在有氧條件下也依賴于糖酵解，該現(xiàn)象稱為“Warburg效應(yīng)”，其機(jī)制與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Glut)功能活躍，且己糖激酶活性增強(qiáng)有關(guān)?！癢arburg效應(yīng)”的結(jié)果是細(xì)胞產(chǎn)生大量糖酵解產(chǎn)物——乳酸。從糖脫下來的大量H+不能像有氧氧化那樣經(jīng)過呼吸鏈氧化為水，大量的H+聚集將使細(xì)胞內(nèi)面臨pH (pHi)酸化和發(fā)生凋亡的威脅，而腫瘤細(xì)胞增強(qiáng)的泌酸功能使細(xì)胞內(nèi)PHi得以維持，但對(duì)周圍正常的宿主細(xì)胞將產(chǎn)生不利影響。腫瘤細(xì)胞的“Warburg效應(yīng)”使腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞產(chǎn)生更多的酸，但對(duì)腫瘤細(xì)胞PH檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)pHi值較正常細(xì)胞無明顯區(qū)別，而細(xì)胞外pH (pHe)和細(xì)胞內(nèi)酸性囊泡內(nèi)的pH (ρΗν)明顯低于正常細(xì)胞,提示可能與腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的泌酸功能有關(guān)。(Izumi H, Torigoe T, Ishiguchi H, et al.CellularpH regulators:potentially promising molecular targets for cancer chemotherapy.Cancer Treat Rev，2003，29(6):541-549)。 [0076]為了躲避酸性微環(huán)境的毒性，腫瘤細(xì)胞遂向外排出氫離子，最終產(chǎn)生細(xì)胞外的酸性環(huán)境以及細(xì)胞內(nèi)的堿性環(huán)境。腫瘤細(xì)胞通過上調(diào)細(xì)胞質(zhì)膜的氫離子相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如鈉氫交換蛋白(Na+ / H+)、Na+ / K+-ATPase、囊泡型H+-ATPases、H+ / CF共輸送體和單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MCT)等,來實(shí)現(xiàn)這一機(jī)制(Harguindey S, et al.The role of pH dynamics andthe Na+/H+antiporter in the etiopathogenesis and treatment of cancer.Two facesof the same coin—one single nature, [J].Biochim BiopHys Acta,2005,1756 (I):1-24)。
[0077]因此，發(fā)明人判斷如果通過增加壓力讓腫瘤細(xì)胞泌酸功能降低，那就會(huì)引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)PHi降低，使其酸中毒，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。而增加壓力，即使腫瘤細(xì)胞外環(huán)境的pH(pHe)降低，讓腫瘤細(xì)胞的運(yùn)輸H+離子的質(zhì)子泵增加壓力，并最終崩潰。
[0078]有較多的文獻(xiàn)支持，酸性環(huán)境能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。比如，酸性環(huán)境，通過p53介導(dǎo)誘導(dǎo)人腺癌和胃癌的細(xì)胞株凋亡(A C Williams, et al.An acidic environmentleads to p53dependent induction of apoptosis in human adenoma and carcinomacell lines:1mplications for clonal selection during colorectal carcinogenesis,Oncogene.1999May27;18(21):3199-204)。
[0079]實(shí)驗(yàn)表明:給予體外培養(yǎng)的胃癌AGS細(xì)胞一個(gè)pH為6.0的酸性環(huán)境，這種酸性環(huán)境使細(xì)胞外H+離子濃度升高，可能通過抑制腫瘤細(xì)胞的NHE—1的Na+-H+交換功能使細(xì)胞內(nèi)糖酵解產(chǎn)生的過多H+離子無法排出使本來偏堿性的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境明顯酸化，這樣既起到了改變胃癌細(xì)胞外環(huán)境的作用，同時(shí)也改變了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。胃癌細(xì)胞的這種內(nèi)外環(huán)境的酸化作用改變了適合它生長增殖的細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的酸堿度，從而使大部分胃癌細(xì)胞停止增殖(高艷等，《胃癌A G S細(xì)胞內(nèi)pH值的測定及酸性環(huán)境對(duì)其增殖和凋亡的影響》，《現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展》，2008年09期)。
[0080]Rich IN等證明了從白血病患者體內(nèi)獲得的白細(xì)胞系及外周淋巴血細(xì)胞有著比正常造血組織細(xì)胞普遍的、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的高的PH值。說明了在胞內(nèi)pH值與正常造血細(xì)胞和白血病細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控之間存在一種直接的關(guān)系。利用這種關(guān)系，他們用Na+/H+交換體的抑制劑5_ (N, N-hexamethylene) -amiloride (HMA)處理白血病細(xì)胞，降低了胞內(nèi) pH 值，從而誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。(Rich IN, Worthington-White D, Garden 0A, MuskP.Apoptosis of leukemic cells accompanies reduction in intracellular pH aftertargeted inhibition of the Na +/H+exchanger.Blood.2000，15，95 (4): 1427 ~1434)。
[0081]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，我們采用酸性二氧化氯溶液靶向給予腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且隨著酸性環(huán)境的加強(qiáng),腫瘤細(xì)胞死亡率相應(yīng)上升。
[0082]本領(lǐng)域技術(shù)人員均理解強(qiáng)氧化劑和酸性環(huán)境對(duì)正常細(xì)胞有損傷作用，也就是說，酸性二氧化氯溶液對(duì)正常細(xì)胞也有加速凋亡作用。但是，本發(fā)明人認(rèn)為，正常細(xì)胞的損傷會(huì)刺激機(jī)體干細(xì)胞的再生，因此一般性損傷可以完全被修復(fù)；另外，衰老細(xì)胞或癌細(xì)胞是功能不全的細(xì)胞，他們抵御氧化劑或酸性環(huán)境的凋亡誘導(dǎo)能力更弱。因此本發(fā)明的技術(shù)方案是靶向明確而副作用較小的一種抗衰老或抗腫瘤的技術(shù)。
[0083]在一些實(shí)施例中，本發(fā)明證明了酸性二氧化氯制劑對(duì)衰老細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的凋亡誘導(dǎo)作用，而對(duì)正常細(xì)胞損傷較小，或者說這種損傷是在可以被彌補(bǔ)的程度。
[0084]本發(fā)明所述的含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑可以單獨(dú)包含二氧化氯的單一劑型或者包含二氧化氯前體的若干份組合。其中單獨(dú)包含二氧化氯的單一劑型可以如下地制成:[0085]方法1:向水中添加pH調(diào)節(jié)劑，制成pH值為1.5~6.5的酸性水溶液。通過合乎規(guī)范，并且濃度在99.9%以上二氧化氯氣體的制備方式(優(yōu)選為亞氯酸鹽與酸反應(yīng))產(chǎn)生二氧化氯氣體。通過將該二氧化氯氣體向上述酸性水溶液中鼓泡并溶解從而制備500~2900ppm的二氧化氯溶液。該溶液在使用于本發(fā)明所述用途之前,應(yīng)當(dāng)避光密閉保存,并一直保存于4°C~15°C較低溫狀態(tài)下。該制備含二氧化氯制劑的方法并不要求一定是水溶液，唯有保證在施用于目標(biāo)組織時(shí)能夠在目標(biāo)組織中發(fā)揮作用的物質(zhì)主要為二氧化氯，且在一定酸性環(huán)境下。
[0086]方法2:將二氧化氯前體溶解于水中制備1%~40%的水溶液。向該水溶液中加入含有PH調(diào)節(jié)劑的酸性溶液(優(yōu)選為2%~50%的檸檬酸溶液)，調(diào)節(jié)混合溶液的pH值為1.5~6.5。該溶液在使用于本發(fā)明所述用途之前，應(yīng)當(dāng)避光密閉保存，并一直保存于4°C~15°C較低溫狀態(tài)下。該制備含二氧化氯制劑的方法并不要求一定是水溶液，唯有保證在施用于目標(biāo)組織時(shí)能夠在目標(biāo)組織中發(fā)揮作用的物質(zhì)主要為二氧化氯，且在一定酸性環(huán)境下。
[0087]包含二氧化氯前體的若干份組合可以如下地制成:將二氧化氯前體溶解于水中制備1%~40%的水溶液，這是第一份溶液；用pH調(diào)節(jié)劑制備出酸性溶液(優(yōu)選為2%~50%的檸檬酸溶液)，這是第二份溶液。在使用于本發(fā)明所述用途之前，現(xiàn)場混合以上溶液，最終混合溶液的PH值調(diào)整為1.5~6.5，待反應(yīng)產(chǎn)生二氧化氯后，將該溶液施用于目標(biāo)組織。該制備含二氧化氯制劑的方法并不要求一定是水溶液，唯有保證在施用于目標(biāo)組織時(shí)能夠在目標(biāo)組織中發(fā)揮作用的物質(zhì)主要為二氧化氯，且在一定酸性環(huán)境下。
[0088]作為能在本發(fā)明中使用的二氧化氯前體，可以舉出例如亞氯酸堿金屬鹽、亞氯酸堿土類金屬鹽。作為亞氯酸堿金屬鹽，可以舉出例如亞氯酸鈉、亞氯酸鉀、亞氯酸鋰；作為亞氯酸堿土類金屬鹽，可以舉出例如亞氯酸鈣、亞氯酸鎂、亞氯酸鋇。
[0089]其中，不僅從獲得容易的理由，而且從二氧化氯活性的持續(xù)性優(yōu)異的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選亞氯酸鈉、亞氯酸鉀，更優(yōu)選亞氯酸鈉。
[0090]作為能在本發(fā)明中使用的pH調(diào)節(jié)劑，只要是具有緩沖性的酸就可以很好的使用。
[0091]作為有機(jī)酸或其鹽可以舉出甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、丙酮酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、葡糖酸、乙醇酸、富馬酸、丙二酸、馬來酸、草酸、琥珀酸、丙烯酸、巴豆酸、戊二酸及他們的鹽。
[0092]作為無機(jī)酸可以舉出鹽酸、磷酸、硼酸、偏磷酸、焦磷酸、氨基磺酸等。作為無機(jī)酸鹽，例如可以舉出磷酸二氫鹽(鈉鹽、鉀鹽，下同)、磷酸二氫鹽與磷酸氫鹽的混合物等。PH調(diào)節(jié)劑可以單獨(dú)使用I種，也可以并用2種以上。
[0093]從使用于人體安全方面的考慮，pH調(diào)節(jié)劑優(yōu)選為檸檬酸、乙酸和磷酸二氫鈉，更優(yōu)選為檸檬酸。
[0094]另外，二氧化氯液劑的最終pH值優(yōu)選為1.5~5.5，更優(yōu)選為1.5~3.5。
[0095]本發(fā)明中的含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑優(yōu)選為液劑。
[0096]本發(fā)明中的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的藥劑量因患者的年齡、體重、疾病性質(zhì)和狀況而變化。但是在成人的情況下，例如為每日I毫克至5000毫克的二氧化氯，優(yōu)選為每日I毫克
至1000毫克的二氧化氯。
[0097]本發(fā)明中的含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑可以通過多種方式給藥。含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑可以全身性地給藥，如通過靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥；也可以局部患處的直接給藥，該方法可以通過透皮、穿刺等方法直達(dá)患處給藥。
[0098]本發(fā)明中的含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的給藥方式，可以通過任何一種能到達(dá)預(yù)期組織的途徑給藥，比如，可以經(jīng)由靜脈點(diǎn)滴、靜脈注射、動(dòng)脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、心內(nèi)注射、腹腔注射、鞘內(nèi)注射、關(guān)節(jié)內(nèi)注射、穿刺注射、直腸給藥、舌下給藥、鼻腔給藥、經(jīng)皮給藥、吸入或者局部給藥到目標(biāo)的器官或組織等，但不限于這些。
`[0099]通過以上方式給藥時(shí)，因目標(biāo)組織的大小，本發(fā)明中的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的有效量范圍為每日0.1~500mg/kg 二氧化氯，有時(shí)候目標(biāo)組織用面積更容易表述，則本發(fā)明中的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的有效范圍為每日0.1~500mg 二氧化氯/IOOcm2，按所述劑量給藥時(shí)，至少10天后有效。
[0100]無論如何，本發(fā)明所述的含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，唯有保證在適用于目標(biāo)有效劑量的二氧化氯以合適方式進(jìn)入目標(biāo)組織中，發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，而不限于任何的形式、方式和步驟，及其他輔助性物質(zhì)的幫助。
[0101]《中國藥典制劑通則》中的任何制劑都能夠作為本發(fā)明中的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的劑型。本發(fā)明方法中的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑作為藥物的劑型的實(shí)例包括直接用于體內(nèi)的注射劑(包括混懸液、乳劑)；軟膏劑(包括油脂性軟膏、乳劑型軟膏(霜)、水溶性軟膏等)、吸入劑、液劑制劑(包括滴眼劑、滴鼻劑等)、栓劑、貼劑、糊劑、洗劑等外用劑；或片劑(包括糖衣、薄膜、膠衣)、液體制劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑(包括細(xì)粒級(jí))、丸劑、糖漿劑、含片等。這些制劑可按照中國藥典制劑通則的方法進(jìn)行制備。
[0102]此外，本發(fā)明方法中的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑給藥時(shí)還可以包括可藥用的固態(tài)或液態(tài)載體或介入治療材料。作為可藥用的固態(tài)或液態(tài)載體，可列舉溶劑、穩(wěn)定劑、助溶解劑、乳化劑、懸濁劑、緩沖劑、等滲劑、著色劑、基質(zhì)、增稠劑、賦形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、包衣齊?、矯味劑、調(diào)理劑、發(fā)泡劑、高吸水性樹脂、表面活性劑、滲透促進(jìn)劑和pH調(diào)節(jié)劑等，但并不限于這些。
[0103]具體實(shí)例包括去離子水、乳糖、白糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖醇等糖或糖醇；結(jié)晶纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、低取代羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、醋酸羥丙基甲基纖維素琥珀酸酯、羥甲基纖維素、羥甲基纖維素鈣、羥甲基纖維素鈉、交聯(lián)羥甲基纖維素鈉、羥甲基乙基纖維素、乙酸鄰苯二酸纖維素等纖維素及其相關(guān)衍生物；玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯淀粉、環(huán)糊精、支鏈淀粉等點(diǎn)功夫及其相關(guān)衍生物；瓊脂、藻酸鈉、阿拉伯膠、明膠、膠原、蟲膠、黃薯膠、黃原膠等天熱高分子(海藻類、植物粘質(zhì)、蛋白質(zhì)等)；聚乙烯吡咯烷酮、氨基烷基甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、羥基乙烯基共聚物、聚乙烯醇、二甲基聚硅氧烷等合成高分子；橄欖油、可可油、巴西棕櫚蠟、牛油、硬化油、大豆油、芝麻油、山茶油、亞麻籽油、石蠟、液體石蠟、黃蜂蠟、白色凡士林、椰子油、微晶蠟等油脂類；硬脂酸、硬脂酸鋁、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、檸檬酸三乙酯、三乙酯甘油酯、中鏈脂肪酸三甘油酯、硬脂、肉豆蘧酸異丙酯等脂肪酸及其衍生物；乙醇、甘油、硬脂醇、鯨蠟醇、丙二醇、聚乙二醇等醇和多元醇；氧化鋅、磷酸氫鈣、沉降碳酸鈣、合成硅酸鋁、硅酸酐、高嶺土、干燥氫氧化鋁凝膠、合成水滑石、氧化鈦、滑石、膨潤土、硅酸鋁鎂、硫酸鋁鉀、次沒食子酸鉍、次水楊酸鉍、乳酸鈣、檸檬酸鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉等無機(jī)物質(zhì)和金屬鹽化合物；蔗糖脂肪酸酯、硬脂酸聚烴氧酯、氫化蓖麻油聚氧乙烯醚、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、倍伴油酸脫水山梨醇酯、三油酸脫水山梨醇酯、單硬脂酸脫水山梨醇酯、但棕櫚酸脫水山梨醇酯、單月桂酸脫水山梨醇酯、聚山梨醇酯、單硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸鈉、聚桂醇等表面活性劑；二甲基亞砜及其類似物、氮酮類化合物、吡咯酮衍生物、醇類化合物及脂肪酸類化合物等滲透促進(jìn)劑；色素；香料等。但并不限于這些。
[0104]介入治療材料的實(shí)例包括注射器、支架、人工血管、穿刺注射器、導(dǎo)管、球囊等，但并不限于這些。
[0105]本發(fā)明中的含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑在給藥前，可以依據(jù)給藥方式而施用麻醉劑，如巴比妥酸鹽等注射型麻醉劑、一氧化二氮等吸入型麻醉劑、利多卡因等表面麻醉劑等，但不限于這些。
[0106]本發(fā)明中的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑應(yīng)用于哺乳動(dòng)物，哺乳動(dòng)物的具體實(shí)例包括人、猴、狗、豬、貓、兔、大鼠和小鼠。其中，人是優(yōu)選者。 實(shí)施例
[0107]提供以下實(shí)施例以說明本發(fā)明，而不以任何方式限制本發(fā)明。
[0108]實(shí)施例1:含二氧化氯制劑對(duì)增生性瘢痕皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的影響
[0109]增生性瘢痕作為一種影響器官功能、美觀的疾病，病因有多種，但凡損傷累及真皮深層的損傷,都有可能產(chǎn)生增生性瘢痕。普遍認(rèn)為成纖維細(xì)胞凋亡不足是增生性瘢痕產(chǎn)生的原因(Ogawa, R.The most current algorithms for the treatment and prevention ofhypertropHic scars and keloids [J].Plast Reconstr Surg, 2010，125:557-568)。常識(shí)表明，同樣大小的傷口，相對(duì)比年輕人，老年人的傷口愈合慢且容易留下疤痕。因此，增生性瘢痕的形成可以理解為一種皮膚老化的現(xiàn)象，通過誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡可能是治愈瘢痕性皮膚的好方法。
[0110]I)凋亡試驗(yàn)
[0111]增生性瘢痕患者共6例，男5例，女I例，平均年齡42歲。實(shí)驗(yàn)共分4組:瘢痕中央部(中央2/3半徑范圍內(nèi))、瘢痕邊緣部(周邊1/3半徑范圍內(nèi))、瘢痕周圍皮膚(距瘢痕疙瘩邊緣0.5cm范圍內(nèi))、瘢痕病人其他部位正常皮膚。[0112]成纖維細(xì)胞的培養(yǎng):所取標(biāo)本按上述方法分組后在無菌條件下切除其表皮及皮下組織，在少量胎牛血清中將標(biāo)本切成Imm3左右的組織塊，在37°C、5%C02飽和濕度條件下培養(yǎng)4-6h，使組織塊粘附于瓶壁上，然后加入含15%胎牛血清的DMEM(dulbeccc/ s modifiedeagle medium)培養(yǎng)基適量,3_4天換液I次,2_3周后,原代細(xì)胞長滿并匯合成片,每3_5天傳代I次，實(shí)驗(yàn)用第6-8代細(xì)胞。
[0113]用去離子水配置濃度為7.47%亞氯酸鈉和1.59%氯化鈉的混合溶液，制備出第一份溶液；用去離子水配置濃度為16.7%的檸檬酸溶液，制備出第二份溶液。分別從不同份溶液的容器中取出相同體積的溶液，混合，等待溶液混合靜止3~5分鐘，再用0.22 μ m的雙層濾膜過濾，用去離子水稀釋，制備不同濃度的二氧化氯酸性溶液。
[0114]細(xì)胞接種并施加不同處理因素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。各組分別取一瓶處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組細(xì)胞于每塊板接種I個(gè)孔(I X IO5個(gè)細(xì)胞/孔)，共接種6塊板24個(gè)孔，繼續(xù)在37°C、5%C02飽和濕度條件下培養(yǎng)48_72h，至細(xì)胞長滿孔底，取其中
I塊板，吸出培養(yǎng)基，用Hank液(一種平衡鹽溶液)洗滌后加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，另取3塊板分別加入含二氧化氯制劑,使其終濃度分別達(dá)到100ppm、1000ppm、2900ppm,取I塊板加入FasMcAb (Fas單抗)，使其終濃度達(dá)到I μ g/ml，另外I塊板不施加任何處理因素，繼續(xù)培養(yǎng)24h后檢測其凋亡率。
[0115]PI染色、流式細(xì)胞儀檢測比較各組成纖維細(xì)胞的凋亡率。將上述處理過的細(xì)胞消化后收集于IOml離心管中，1000r/min離心IOmin,預(yù)冷的PBS (磷酸鹽緩沖溶液)洗遍后加入70%乙醇4°C固定過夜，再低速離心10min，PBS洗滌后重懸細(xì)胞，在剩余的0.5ml細(xì)胞懸液中加入RNase A 2μ I (20mg/ml)，37°C孵育30min后立即投入冰浴中停止RNase A作用，再加入500μ1 PI染液(100 μ g/ml)避光孵育30min，吹散細(xì)胞，300目濾網(wǎng)過濾后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞DNA分析檢測細(xì)胞凋亡率。
[0116]所有各組細(xì)胞經(jīng)無`血清培養(yǎng)24h后其細(xì)胞凋亡率均有不同程度的增高，然而經(jīng)過比較各組無血清培養(yǎng)后細(xì)胞凋亡的增長率，發(fā)現(xiàn)正常皮膚顯著高于瘢痕疙瘩邊緣部(P<0.01)，而瘢痕疙瘩周圍皮膚和瘢痕疙瘩中央部介于兩者之間，與各組比較差異均無顯著性意義(P > 0.05，表1)。這說明被看作老化組織的瘢痕處具有明顯的抗凋亡能力，所以瘢痕組織不僅不能得以自動(dòng)清除，反而會(huì)增生。
[0117]表1無血清培養(yǎng)24h后瘢痕及其周圍皮膚成纖維細(xì)胞凋亡率
[0118]
【權(quán)利要求】
1.一種包含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，其包含溶解在水中的二氧化氯，其中二氧化氯濃度為500-2900ppm,基于質(zhì)量計(jì)算。
3.權(quán)利要求2的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，其還含有酸性pH調(diào)節(jié)劑，使得該細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的pH= 1.5-6.5,所述酸性pH調(diào)節(jié)劑選自以下各集合中的至少一種: 有機(jī)酸或其鹽，其選自由甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、丙酮酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、葡糖酸、乙醇酸、富馬酸、丙二酸、馬來酸、草酸、琥拍酸、丙烯酸、巴豆酸、戍二酸和它們的鹽組成的集合； 無機(jī)酸或其鹽，其選自由鹽酸、磷酸、硼酸、偏磷酸、焦磷酸、氨基磺酸、磷酸二氫鹽、磷酸氫鹽組成的集合。
4.權(quán)利要求3的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，其中所述酸性pH調(diào)節(jié)劑選自檸檬酸、乙酸或磷酸二氫鹽。
5.一種包含二氧 化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑試劑盒，其包含以下兩種獨(dú)立的組分: 第一組分:二氧化氯前體固體，或包含二氧化氯前體的溶液； 第二組分:酸性PH調(diào)節(jié)劑的水溶液； 二者分開存放，且能在使用前進(jìn)行混合，以現(xiàn)場反應(yīng)并制得包含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑；且第一組分和第二組分的量和濃度能夠使得混合后的溶液的PH=L 5-6.5 ； 其中所述二氧化氯前體選自亞氯酸鈉、亞氯酸鉀、亞氯酸鋰、亞氯酸鈣、亞氯酸鎂或亞氯酸鋇中的至少一種； 其中所述酸性PH調(diào)節(jié)劑選自以下各集合中的至少一種: 有機(jī)酸或其鹽，其選自由甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、丙酮酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、葡糖酸、乙醇酸、富馬酸、丙二酸、馬來酸、草酸、琥拍酸、丙烯酸、巴豆酸、戍二酸和它們的鹽組成的集合； 無機(jī)酸或其鹽，其選自由鹽酸、磷酸、硼酸、偏磷酸、焦磷酸、氨基磺酸、磷酸二氫鹽、磷酸氫鹽組成的集合。
6.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑或權(quán)利要求5的包含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑試劑盒用于制備誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物的用途。
7.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的包含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑或權(quán)利要求5的包含二氧化氯的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑試劑盒用于制備治療腫瘤的藥物的用途，或者用于制備哺乳動(dòng)物目標(biāo)組織抗衰老藥物的用途，或者用作化妝品的用途，或者用于制備化療藥物的用途。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述腫瘤包括:顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤、腦膜瘤、顱骨腫瘤、腦癌、腦垂體腺瘤、聽神經(jīng)鞘瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦腫瘤；上頜竇癌、喉癌、鼻咽癌、舌癌、甲狀腺癌、牙齦癌、唇癌；胸腺瘤、肺癌、腺癌、乳房肉瘤、肺轉(zhuǎn)移瘤、乳房纖維瘤、乳腺癌；胰頭癌、胃癌、膽囊癌、直腸癌、胰腺癌、食管癌、結(jié)腸癌、肝癌；腎盂腫瘤、陰莖癌、尿路上皮癌、前列腺癌、尿道癌、睪丸癌、膀胱癌、腎母細(xì)胞瘤、腎癌；卵巢癌、輸卵管腫瘤、外陰癌、陰道腫瘤、子宮癌、宮頸癌、絨毛膜癌、盆腔癌；皮膚癌、脂肪肉瘤、惡性畸胎瘤、纖維瘤、神經(jīng)纖維瘤、黑色素瘤、膽管癌、鱗癌、基底細(xì)胞癌；脊索瘤、骨瘤、軟骨瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤、骨巨細(xì)胞瘤、骨纖維肉瘤；急性白血病、惡性淋巴瘤、慢性白血??；肝血管瘤、胰島細(xì)胞類癌、母細(xì)胞瘤、粘液瘤、頸部轉(zhuǎn)移癌、賁門癌；獨(dú)立地，其中所述抗衰老藥物包括預(yù)防記憶力下降、失眠、阿爾茲海默癥、帕金森綜合癥、骨質(zhì)疏松、糖尿病或心腦血管疾病的藥物:獨(dú)立地， 其中所述化妝品包括使皮膚美白、皮膚保水、減輕或消除皺紋、彈性增強(qiáng)、祛痘、祛斑、祛疤痕或使 皮膚年輕化的化妝品。
【文檔編號(hào)】A61P25/28GK103720709SQ201310681687
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】劉學(xué)武 申請(qǐng)人:劉學(xué)武