一種碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明的制備方法步驟簡單易行，無需大型設(shè)備。制備得到的符合材料兼具有碳酸鈣微球以及細(xì)胞外基質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，與單純的碳酸鈣微球材料或細(xì)胞外基質(zhì)材料相比，具有很好生物相容性的同時(shí)具有很好的機(jī)械力學(xué)性能，更易于細(xì)胞黏附增值，在醫(yī)學(xué)組織工程修復(fù)上有很高的應(yīng)用前景和實(shí)用價(jià)值，能有效促進(jìn)細(xì)胞的黏附生長、增殖、遷移和分化。
【專利說明】一種碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域，具體涉及一種碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]生物支架材料是組織工程學(xué)中一個(gè)非常重要的組成部分，它不僅是細(xì)胞和生物活性因子進(jìn)入機(jī)體的載體，而且還可以支持細(xì)胞在體內(nèi)的增殖和分化及分泌活性細(xì)胞因子。理想的脂肪組織工程支架應(yīng)具有:①適于細(xì)胞粘附、增殖和分化的三維空間結(jié)構(gòu)；②具有良好的機(jī)械力學(xué)性能，不僅與宿主軟組織特性相匹配，還要能夠抵抗軟組織的壓力支持種子細(xì)胞的生長發(fā)育；③具備良好組成成分，對組織無毒、無副作用、無免疫原性具有特殊的生物刺激作用，如促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)血管生成，促進(jìn)宿主干細(xì)胞的遷移和分化等。存在于細(xì)胞間的纖維狀和球形蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀系統(tǒng)稱之為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，ECM是細(xì)胞環(huán)境的一種重要組成部分，細(xì)胞分泌的各種ECM成分形成基質(zhì)間質(zhì)和基質(zhì)膜，在體內(nèi)細(xì)胞錨定在該構(gòu)架上。這些結(jié)構(gòu)提供了組織特異性組織學(xué)的機(jī)體形成和發(fā)展所需要的空間定位和穩(wěn)定性。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)包括膠原、非膠原糖蛋白、氨基聚糖與蛋白聚糖、以及彈性蛋白，通過維持細(xì)胞存活、決定細(xì)胞形狀、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、控制細(xì)胞分化并參與細(xì)胞遷移來保持組織功能正常，維持新陳代謝旺盛，從而保持機(jī)體的年輕狀態(tài)。成纖維細(xì)胞參與了多種細(xì)胞外基質(zhì)成分分泌的過程，包括膠原蛋白、粘連蛋白、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素及彈性蛋白等的分泌調(diào)控。但是單純使用細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)作為組織工程修復(fù)材料具有機(jī)械力學(xué)性能差，不能有效的抵抗軟組織的壓力等缺點(diǎn)。
[0003]目前國內(nèi)外學(xué)者對碳酸鈣在骨科組織工程方面進(jìn)行了深入的研究:碳酸鈣作為骨科組織工程材料，與傳統(tǒng)的金屬材料制品相比具有以下特點(diǎn):①研究表明在碳酸鈣結(jié)晶過程中添加特定的氨基酸和磷蛋白，可以生成球霰石(Vaterite)結(jié)晶。這種具有粗糙表面的微米級球形顆粒在體外實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)有促進(jìn)形成羥基磷灰石形成的作用較好的力學(xué)性能；③壓電特性:碳酸鈣材料受壓后會產(chǎn)生電壓，刺激刺激骨細(xì)胞的生長，促進(jìn)骨愈合。但是單獨(dú)的碳酸鈣微球材料具有生物相容性差，難降解性以及親水性差的缺點(diǎn)，不利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附以及生長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有細(xì)胞外基質(zhì)材料以及碳酸鈣微球材料的不足，公開一種碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料的制備方法。
[0005]本發(fā)明另一個(gè)目的在于公開一種碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料。
[0006]本發(fā)明還有一個(gè)目的在于公開一種碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的上述目的通過如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料的制備方法，包括如下步驟:51.分別配制濃度為10mlT250mM鈣鹽水溶液和10mlT250mM碳酸鹽水溶液；
52.將步驟SI制得的鈣鹽水溶液和碳酸鹽水溶液攪拌混合、靜置10mirT90min，將沉淀過濾、洗滌、干燥即得碳酸鈣微球；
53.將S2得到的碳酸鈣微球60mg-70mg平鋪在細(xì)胞培養(yǎng)容器中，用培養(yǎng)基浸泡，然后接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~10天，每隔2~3天更換培養(yǎng)基，接著進(jìn)行脫細(xì)胞處理，最后干燥即可得到碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料。
[0008]優(yōu)選地，步驟S2中所述攪拌混合的攪拌速度為100rpm/min~5000rpm/min。
[0009]優(yōu)選地，步驟S2中所述鈣鹽水溶液和碳酸鹽水溶液混合時(shí)鈣離子和碳酸根離子的摩爾比為1:1。
[0010]優(yōu)選地，所述鈣鹽為氯化鈣、硝酸鈣等可溶鈣鹽；所述碳酸鹽為碳酸鈉、碳酸鉀等可溶碳酸鹽。
[0011]優(yōu)選地，步驟S2中所述干燥為冷凍干燥，冷凍干燥時(shí)間為24~72小時(shí)。
[0012]優(yōu)選地，步驟S3中所述培養(yǎng)基中含有濃度為2(T30mM的抗壞血酸。
[0013]步驟S3中接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的密度為1000(T30000/cm2，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為人源P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0014]步驟S3中所述脫 細(xì)胞的步驟為:將細(xì)胞培養(yǎng)容器放入_80°C冰箱冷凍5~10min，接著取出解凍，用去離子水沖洗細(xì)胞培養(yǎng)容器表面，循環(huán)操作2飛次。
[0015]優(yōu)選地，所述解凍為室溫解凍。
[0016]一種根據(jù)本發(fā)明碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料的制備方法制備得到的碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料。
[0017]本發(fā)明制備得到的碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料在組織工程領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明制備得到的碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料在間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)中的應(yīng)用。
[0019]優(yōu)選地，所述體外培養(yǎng)為細(xì)胞增殖、分化或遷移。
[0020]本發(fā)明制備得到的碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料中，碳酸鈣微球既可以增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的強(qiáng)度、提高機(jī)械力學(xué)性能，同時(shí)碳酸鈣微球表面具有的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)能增強(qiáng)細(xì)胞的粘附，與常規(guī)的平面培養(yǎng)相比更有利于細(xì)胞的遷移和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。此外，本發(fā)明選用的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)含有大量的膠原蛋白以及生長因子，這些都能促進(jìn)細(xì)胞的粘附和增殖。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
本發(fā)明公開一種碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明的制備方法步驟簡單易行，無需大型設(shè)備。制備得到的符合材料兼具有碳酸鈣微球以及細(xì)胞外基質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，與單純的碳酸鈣微球材料或細(xì)胞外基質(zhì)材料相比，具有很好生物相容性的同時(shí)具有很好的機(jī)械力學(xué)性能，更易于細(xì)胞黏附增值，在醫(yī)學(xué)組織工程修復(fù)上有很高的應(yīng)用前景和實(shí)用價(jià)值，能有效促進(jìn)細(xì)胞的黏附生長、增殖、遷移和分化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料電鏡圖；
圖2為碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料免疫熒光染色圖；圖3為碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料的細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞活力(MTT)檢測結(jié)果圖；
圖4為碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料FDA染色圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋說明，但具體實(shí)施例并不對本發(fā)明作任何限定。除非特別說明，實(shí)施例中所涉及的試劑、方法均為本領(lǐng)域常用的試劑和方法。
[0024]實(shí)施例1-3
(一)碳酸韓微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料的制備
實(shí)施例1-3鈣鹽溶液和碳酸鹽溶液的種類和濃度如表1所示。
[0025]表1
【權(quán)利要求】
1.一種碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 51.分別配制濃度為10mlT250mM鈣鹽水溶液和10mlT250mM碳酸鹽水溶液； 52.將步驟SI制得的鈣鹽水溶液和碳酸鹽水溶液攪拌混合、靜置，將沉淀過濾、洗滌、干燥即得碳酸鈣微球； 53.將S2得到的碳酸鈣微球稱量60mg~70mg平鋪在細(xì)胞培養(yǎng)容器中，用培養(yǎng)基浸泡，然后接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~10天，每隔2~3天更換培養(yǎng)基，接著進(jìn)行脫細(xì)胞處理，最后干燥即可得到碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟S2中所述鈣鹽水溶液和碳酸鹽水溶液混合時(shí)鈣離子和碳酸根離子的摩爾比為1:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述制備方法，其特征在于，所述鈣鹽為氯化鈣或硝酸鈣；所述碳酸鹽為碳酸鈉或碳酸鉀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟S2中所述干燥為冷凍干燥，冷凍干燥時(shí)間為24~72小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟S3中接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的密度為1000(T30000/cm2，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為人源P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，所述脫細(xì)胞的步驟為:將細(xì)胞培養(yǎng)容器放入-80°C冰箱冷凍^lOmin，接著取出解凍，用去離子水沖洗細(xì)胞培養(yǎng)容器表面，循環(huán)操作2~6次。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述制備方法，其特征在于，所述解凍為室溫解凍。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法制備得到的碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料。
9.權(quán)利要求1所述制備方法制備得到的碳酸鈣微球-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料在間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述應(yīng)用，其特征在于，所述體外培養(yǎng)為細(xì)胞增殖、分化或遷移。
【文檔編號】A61L27/44GK103611193SQ201310605594
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】龔逸鴻, 許哲武, 徐勇, 李燕, 張志光, 蔣慶 申請人:中山大學(xué)