被修飾的含CpG序列單元的寡聚脫氧核苷酸分子及其用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種免疫治療【技術(shù)領(lǐng)域】的被修飾的含CpG序列單元的寡聚脫氧核苷酸分子及其用途；本發(fā)明涉及被修飾的含CpG序列單元的寡聚脫氧核苷酸作為免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用；同時(shí)還涉及被修飾的含CpG序列單元的寡聚脫氧核苷酸作為治療腫瘤的口服或者吸入制劑的應(yīng)用。本發(fā)明涉及一種經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾的CpG寡聚脫氧核苷酸（CpG?ODN），由特定組合的肽段、特定鏈長(zhǎng)的脂肪酸、或類(lèi)脂結(jié)構(gòu)修飾具有免疫調(diào)節(jié)功能的CpG?ODN而得。這種結(jié)構(gòu)修飾的CPG?ODN具有更好的口服生物利用度以及免疫調(diào)節(jié)功能，可以作為口服免疫增強(qiáng)和免疫治療藥物，提高生物體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，應(yīng)用于過(guò)敏性疾病、傳染性疾病、免疫缺陷性疾病及癌癥等。
【專(zhuān)利說(shuō)明】被修飾的含CpG序列單元的寡聚脫氧核苷酸分子及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫治療【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種被修飾的含CpG序列單元的寡聚脫氧核苷酸分子及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]早在19世紀(jì)90年代，美國(guó)腫瘤醫(yī)生Coley發(fā)現(xiàn)將細(xì)菌粗提取物應(yīng)用于900名長(zhǎng)期腫瘤患者，有40%患者腫瘤能自行消退，當(dāng)時(shí)人們認(rèn)為是細(xì)菌粗提取物中的脂多糖起到活性作用，并未引起足夠重視。后來(lái)，用卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)進(jìn)行的小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用DNA酶處理過(guò)的BCG不具有抗腫瘤作用，說(shuō)明細(xì)菌DNA才是介導(dǎo)這種抗腫瘤效應(yīng)的物質(zhì)[Tokunaga, T.，et al., Antitumor activity of deoxyribonucleicacid fraction from Mycobacteriumbovis BCG.1.1solation, physicochemicalcharacterization, and antitumor activity.J Natl Cancer Inst, 1984.72(4):955-62]。隨后，研究者證實(shí)細(xì)菌DNA具有直接的免疫剌激作用和抗腫瘤作用[Yamamoto，S.，etal., DNA from bacteria,but not from vertebrates,induces interferons,activatesnatural killer cells and inhibits tumor growth.MicrobiolImmunolj 1992.36(9):983-97]。Pisetsky課題組報(bào)道了純化的細(xì)菌DNA (bDNA)和poly-(dG，dC)可以誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖并分泌抗體，而哺乳動(dòng)物的DNA不能[Messina, J.P.，G.S.Gilkesonj andD.S.Pisetskyj Stimulation of in vitro murine lymphocyte proliferation bybacterial DNA.J Immunol, 1991.147 (6): 1759-64]。隨后，研究者發(fā)現(xiàn) poly-(dG，dC)中胞啼卩定的甲基化會(huì)導(dǎo)致絲裂原活性喪失[Messina，J.P.，G.S.Gilkesonj andD.S.Pisetskyj The influence of DNA structure on the in vitro stimulation ofmurine lymphocytes by natural and synthetic polynucleotide antigens.CellImmunol, 1993.147 (I): 148-57]。但是當(dāng)時(shí)的研究者并沒(méi)有把CpG的甲基化與細(xì)菌和哺乳動(dòng)物DNA的不同免疫活性聯(lián)系起來(lái)，他們只是猜測(cè)甲基化破壞了 bDNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0003]通過(guò)用合成的寡聚脫氧核糖核苷酸(oligodeoxynucleotides，ODN)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌DNA具有免疫剌激作用是由于其中含有具有特異性側(cè)翼序列的非甲基化 CpG 核苷酸基序[Yamamoto, T.，et al.，Lipofection of syntheticoligodeoxyribonucleotide having a palindromic sequence of AACGTT to murinesplenocytes enhances interferon production and natural killer activity.MicrobiolImmunolj 1994.38(10):831-6]。與細(xì)菌DNA不同，哺乳動(dòng)物和其他脊椎動(dòng)物DNA分子中CpG基序出現(xiàn)的頻率很低，并且60%~90%的CpG基序中胞嘧啶的第五碳原子發(fā)生甲基化，因此，哺乳動(dòng)物本身的DNA分子不具有免疫剌激作用[Barton，G.Μ.，J.C.Kagan,and R.Medzhitovj Intracellular localization of Toll-like receptor 9prevents recognition of self DNA but facilitates access to viral DNA.NatureImmunology，2006.7 (I):49-56]。Arthur M.Krieg 等人通過(guò)分析合成的不同序列 CpG ODN的免疫剌激活性，初步得出免疫剌激性CpG ODN結(jié)構(gòu)的基本規(guī)律:序列必須含有非甲基化的CpG基序；CpG基序的基本結(jié)構(gòu)為5’ -Xl X2 CGYl Y2-3’，其中Xl代表一個(gè)嘌呤，X2代表一個(gè)嘌呤或者一個(gè)胸腺嘧啶，Yl和Y2代表嘧啶。在一個(gè)CpG ODN中可以有一個(gè)或者多個(gè)CpG基序，CpG基序兩側(cè)特異的嘌呤和嘧啶，以及CpG基序間相隔堿基的不同都會(huì)影響 CpG 基序的免疫刺激類(lèi)型和強(qiáng)度[Krieg, A.M.，et al., CpG motifs in bacterial DNAtrigger direct B-cell activation.Nature,1995.374 (6522):546-9;Krieg,A.M.,CpGmotifs in bacterial DNA and their immune effects.Annual Review of Immunology, 2002.20:709-760;Krieg, A.M., G.Hartmann, and A.K.Yi, Mechanism of action of CpG DNA.1mmunobiology of Bacterial Cpg-DNA, 2000.247:1-21]。
[0004]人體免疫系統(tǒng)能夠發(fā)現(xiàn)病原體感染，并對(duì)感染進(jìn)行歸類(lèi)以產(chǎn)生不同的細(xì)胞效應(yīng)，關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)是免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞，B細(xì)胞)上具有的特異的、高親和力的抗原受體，稱(chēng)為模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptor, PRR) JRR能與病原體上面的抗原相結(jié)合,這些抗原被統(tǒng)稱(chēng)為病原體相關(guān)模式分子(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)?含有非甲基化CpG 二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸就是PAMP之一。迄今為止，人們共發(fā)現(xiàn)了四種類(lèi)型的CpG ODN:D型(或A型)，K型(或B型)，C型和P型，每種類(lèi)型都有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生物功能特點(diǎn)。它們被分布在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的TLR9識(shí)別，而表達(dá)TLR9的，小鼠體內(nèi)主要是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、mDC細(xì)胞、pDC細(xì)胞和B細(xì)胞，人體內(nèi)主要是后兩種[Klinman，D.M., Currie, D., Gursel, 1.&Verthelyi, D.Use of CpGoligodeoxynucleotides as immuneadjuvants.1mmunological Reviews 199, 201-216(2004)]?
[0005]因此CpG寡聚脫氧核苷酸能直接刺激這些細(xì)胞，并間接激活T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞，誘導(dǎo)以Thl型為主的免疫應(yīng)答，而最新的研究的表明它可以直接抑制mMDSC細(xì)胞[Y.Shirota, H.Shirota, D.M.Klinman, Journal of immunology 2012, 188, 1592-1599],被公認(rèn)為一種新型的高效低毒的免疫佐劑或者免疫治療藥物，在治療感染性疾病、過(guò)敏性疾病、免疫缺陷性疾病、及癌癥腫瘤中有著強(qiáng)大的潛在應(yīng)用價(jià)值，正受到越來(lái)越多科學(xué)家的關(guān)注。
[0006]目前對(duì)CpG寡聚脫氧核苷酸的骨架全硫代或者部分硫代修飾，能夠部分解決CpG寡聚脫氧核苷酸被核酸酶水解的問(wèn)題，但依然存在生物利用度不高的問(wèn)題，因此本發(fā)明對(duì)CpG寡聚脫氧核苷酸進(jìn)行小分子修飾以解決這一問(wèn)題，特別是口服給藥的生物利用度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種被修飾的含CpG序列單元的寡聚脫氧核苷酸分子及其用途。本發(fā)明的結(jié)構(gòu)修飾的CPG ODN具有更好的口服生物利用度以及免疫調(diào)節(jié)功能。 [0008]第一方面，本發(fā)明涉及一種被修飾的含CpG序列單元的寡聚脫氧核苷酸，所述修飾分子選擇下式中的一種:
[0009]
【權(quán)利要求】
1.一種被修飾的含CpG序列單元的寡聚脫氧核苷酸，其特征在于，所述修飾分子選擇下式中的一種:
2.如權(quán)利要求1所述的被修飾的含CpG序列單元的寡聚脫氧核苷酸，其特征在于，所述寡聚脫氧核苷酸含有1-5個(gè)CpG單元，其鏈長(zhǎng)為10-30nt。
3.如權(quán)利要求1所述的被修飾的含CpG序列單元的寡聚脫氧核苷酸，其特征在于，所述修飾分子修飾的位點(diǎn)是寡聚脫氧核苷酸的5’ -末端、3’ -末端或者中間位置。
4.如權(quán)利要求1所述的被修飾的含CpG序列單元的寡聚脫氧核苷酸，其特征在于，所述寡聚脫氧核苷酸含有如下序列中的一種:
5.如權(quán)利要求1所述的被修飾的含CpG序列單元的寡聚脫氧核苷酸，其特征在于，所述寡聚脫氧核苷酸的骨架為全硫代修飾、部分硫代修飾或者無(wú)硫代修飾。
6.一種如權(quán)利要求1所述的被修飾的含CpG序列單元的寡聚脫氧核苷酸作為免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用。
7.—種如權(quán)利要求1所述的被修飾的含CpG序列單元的寡聚脫氧核苷酸作為治療腫瘤的口服或者吸入制劑的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103773769SQ201310554389
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】徐宇虹, 吳彩興, 張沖, 向小飛 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)