一種少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)基及其擴(kuò)增方法和用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)基及其擴(kuò)增方法和用途。本發(fā)明提供的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)基的關(guān)鍵組份為bFGF、PDGF-AA、NT-3、乳酸鈉。通過(guò)本發(fā)明提供的培養(yǎng)基及方法可以使OPCs穩(wěn)定擴(kuò)增至少10代，在擴(kuò)增過(guò)程中保持OPCs的生物學(xué)性狀維持不變。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)基及其擴(kuò)增方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)基及其擴(kuò)增方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]各種各樣的髓鞘相關(guān)疾病，如腦白質(zhì)損傷、脊髓損傷、多發(fā)性硬化等疾病由于神經(jīng)元的髓鞘化障礙或脫髓鞘化，導(dǎo)致了神經(jīng)元不能正常傳遞電興奮，從而導(dǎo)致機(jī)體運(yùn)動(dòng)等功能失能，給這些疾病的患者及家庭帶來(lái)了極大的傷害，但是目前還沒(méi)有任何一種藥物可以有效地治療這些髓鞘相關(guān)疾病。
[0003]不論是髓鞘化障礙還是脫髓鞘病變，其根源都是神經(jīng)元軸突髓鞘程度減少或丟失，因此如果能夠恢復(fù)神經(jīng)元軸突的髓鞘化程度，使得神經(jīng)元電流得以穩(wěn)定快速地傳導(dǎo)，理論上這些疾病就可以被治愈。研究發(fā)現(xiàn)，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte progenitorcells, OPCs)是負(fù)責(zé)中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘化的關(guān)鍵細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，OPCs可以分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocyte, 0L), OL進(jìn)一步包繞神經(jīng)元軸突形成完整的髓鞘結(jié)構(gòu)，從而保證神經(jīng)元電流的穩(wěn)定快速傳導(dǎo)。髓鞘相關(guān)的疾病一方面是因?yàn)榧膊∑茐牧艘呀?jīng)形成的髓鞘結(jié)構(gòu)，另一方面更是由于神經(jīng)系統(tǒng)中OPCs受到了損傷，使得OL失去了源泉，因此難以髓鞘再生。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，向先天性髓鞘化形成障礙的shiver小鼠或腦白質(zhì)損傷大鼠移植OPCs時(shí)，移植的OPCs可以在體內(nèi)正常包繞神經(jīng)元軸突形成髓鞘使得這些動(dòng)物的神經(jīng)功能恢復(fù)，表明OPCs移植可能是治療髓鞘損傷疾病的一個(gè)新的方向。
[0004]人OPCs是一種狀態(tài)不穩(wěn)定的細(xì)胞，非常容易進(jìn)一步分化成熟為0L，但OL將失去OPCs的遷移能力，一旦OPCs在體外分化為0L，其在臨床上的治療意義將完全喪失，因此，在體外維持OPCs的性狀非常 重要，但在已知的文獻(xiàn)中均未有體外穩(wěn)定長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)增培養(yǎng)人OPCs的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于以上缺陷，本發(fā)明的主要目的在于提供一種少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)基及其擴(kuò)增方法和用途，該種OPCs擴(kuò)增培養(yǎng)基可以使OPCs穩(wěn)定擴(kuò)增至少10代，在擴(kuò)增過(guò)程中保持OPCs的生物學(xué)性狀維持不變。
[0006]為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明提供的該種少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)基，其關(guān)鍵組份為堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子-AA(TOGF-AA)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(NT3)、乳酸鈉。
[0007]更進(jìn)一步的，本發(fā)明提供的該種少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物構(gòu)成，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基米用商用Neural Basal Medium或自行配制的DF medium任
--種；另外加上商用Neural Basal Medium(無(wú)糖型)；所述商用Neural Basal Medium或
自行配制的DF medium與商用無(wú)糖型Neural Basal Medium兩者的體積比為(1-3):1 ；
[0008]DF medium培養(yǎng)基由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖組成，其中，DMEM和F12比例為體積比(1-3): 1，服^濃度為10-20臟01/1，0-葡萄糖濃度為質(zhì)量/體積比1-28/1111。
[0009]所述添加物包括B27、乳酸鈉、堿性成纖維生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子-AA、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3、轉(zhuǎn)鐵蛋白、孕酮、腐胺、亞硒酸鈉、胰島素、肝素，其中，B27為IX，乳酸鈉濃度為3-lOmmol/L，堿性成纖維生長(zhǎng)因子濃度5_25ng/ml，血小板源性生長(zhǎng)因子-AA濃度10_20ng/ml,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3濃度5_25ng/ml,轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度5-50 μ g/ml,孕酮5-20mmol/L,腐胺 20-50 μ mol/L,亞硒酸鈉 10-20mmol/L,胰島素 5-20 μ g/ml,肝素 2-10 μ g/ml,青鏈霉素(可選)100U/ml。
[0010]本發(fā)明還提供一種少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的擴(kuò)增方法，包括以下步驟:
[0011]1.將OPCs收集至離心管中；
[0012]2.400g離心5分鐘收集細(xì)胞；
[0013]3.棄上清，將細(xì)胞重懸于擴(kuò)增培養(yǎng)基，調(diào)整密度為2~10 X105/ml ；
[0014]4.將細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；
[0015]5.每3~5天更換一次擴(kuò)增培養(yǎng)基；
[0016]6.待OPCs生長(zhǎng)至80%左右匯合時(shí)(約需一周)，進(jìn)行OPCs傳代，傳代方法同上步驟1-5所述，如此循環(huán)。
[0017]上述方法所采用的擴(kuò)增培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物構(gòu)成，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基采
用商用Neural Basal Medium或自行配制的DF medium任--種；另外加上商用Neural`Basal Medium (無(wú)糖型)；所述商用Neural Basal Medium或自行配制的DF medium與商用無(wú)糖型Neural Basal Medium兩者的體積比為(1-3):1 ；
[0018]DF medium培養(yǎng)基由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖組成，其中，DMEM和F12比例為體積比(1-3): 1，服^濃度為10-20臟01/1，0-葡萄糖濃度為質(zhì)量/體積比1-28/1111。
[0019]所述添加物包括B27、乳酸鈉、堿性成纖維生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子-AA、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3、轉(zhuǎn)鐵蛋白、孕酮、腐胺、亞硒酸鈉、胰島素、肝素，其中，B27為IX，乳酸鈉濃度為3-lOmmol/L，堿性成纖維生長(zhǎng)因子濃度5_25ng/ml，血小板源性生長(zhǎng)因子-AA濃度10_20ng/ml,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3濃度5_25ng/ml,轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度5-50 μ g/ml,孕酮5-20mmol/L,腐胺 20-50 μ mol/L,亞硒酸鈉 10-20mmol/L,胰島素 5-20 μ g/ml,肝素 2-10 μ g/ml。
[0020]本發(fā)明方法及通過(guò)該方法擴(kuò)增獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，可應(yīng)用于治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療研究。
[0021]本發(fā)明方法及通過(guò)該方法擴(kuò)增獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，可應(yīng)用于制備治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病藥物。
[0022]上述神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括:腦白質(zhì)損傷、多發(fā)性硬化癥、脊髓損傷等髓鞘相關(guān)疾病。
[0023]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0024]1、本方法不但有助于髓鞘疾病的臨床治療和藥物篩選，也有利于髓鞘發(fā)育基礎(chǔ)理論的研究:①獲得高純度OPCs有望應(yīng)用于髓鞘相關(guān)疾病的臨床治療研究通過(guò)體外擴(kuò)增獲得大量OPCs為臨床應(yīng)用提供足夠量的細(xì)胞；③研究少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控機(jī)制；④為髓鞘相關(guān)的疾病提供藥物篩選模型；
[0025]2、本發(fā)明方法使得OPCs可以在體外擴(kuò)增至少10代以上同時(shí)維持生物學(xué)性狀不變，擴(kuò)增倍數(shù)上千倍，因此可以為基礎(chǔ)或臨床研究提供足夠的細(xì)胞；
[0026]3、本發(fā)明所擴(kuò)增獲得的OPCs可以冷凍保存和復(fù)蘇繼續(xù)培養(yǎng)，且凍存復(fù)蘇后其生物學(xué)性狀維持不變，這將進(jìn)一步有助于OPCs臨床移植治療臨床研究的廣泛推廣。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1為采用本發(fā)明方法擴(kuò)增第I代OPCs的可見(jiàn)光圖片；
[0028]圖2為采用本發(fā)明方法擴(kuò)增第3代OPCs的可見(jiàn)光圖片；
[0029]圖3為采用本發(fā)明方法擴(kuò)增第5代OPCs的可見(jiàn)光圖片；
[0030]圖4為采用本發(fā)明方法擴(kuò)增第10代OPCs的可見(jiàn)光圖片；
[0031]圖5為采用本發(fā)明方法擴(kuò)增第10代OPCs的04免疫熒光染色，結(jié)果顯示OPCs陽(yáng)性率仍然高達(dá)80-90% ；
[0032]圖6為采用本發(fā)明方法擴(kuò)增第10代OPCs的神經(jīng)元標(biāo)志物Tuj-1免疫熒光染色；
[0033]圖7為采用本發(fā)明方法擴(kuò)增第10代OPCs的星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP免疫熒光染色。
【具體實(shí)施方式】
[0034]以下結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步說(shuō)明，但不作對(duì)其的限定:
[0035]實(shí)施例1
[0036]本實(shí)施例所來(lái)源OPCs是通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)技術(shù)獲得的OPCs。
[0037]1.0PCs生長(zhǎng)至80%左右匯集時(shí)可以進(jìn)行傳代操作；
[0038]2.采用巴斯德吸管輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞脫落；
[0039]3.將OPCs收集至離心管中，400g離心5分鐘收集細(xì)胞；
[0040]4.棄上清，將細(xì)胞重懸于擴(kuò)增培養(yǎng)基，調(diào)整密度為2~IOX 105/ml，將細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。擴(kuò)增培養(yǎng)基組成如下:
【權(quán)利要求】
1.一種少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)基，其特征在于，其關(guān)鍵組份為堿性成纖維生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子-AA、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3、乳酸鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物構(gòu)成，其特征在于: 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基米用商用Neural Basal Medium或自行配制的DF medium任--種；另外加上商用無(wú)糖型Neural Basal Medium ； 所述商用Neural Basal Medium或自行配制的DF medium與商用無(wú)糖型Neural BasalMedium兩者的體積比為(1-3): I ； DF medium培養(yǎng)基由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖組成，其中，DMEM和F12比例為體積比(1-3): 1，HEPES濃度為10-20mmol/L，D-葡萄糖濃度為質(zhì)量/體積比l_2g/ml ； 所述添加物包括B27、乳酸鈉、堿性成纖維生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子-AA、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3、轉(zhuǎn)鐵蛋白、孕酮、腐胺、亞硒酸鈉、胰島素、肝素，其中，B27為IX，乳酸鈉濃度為3-10mmol/L,堿性成纖維生長(zhǎng)因子濃度5_25ng/ml,血小板源性生長(zhǎng)因子-AA濃度10_20ng/ml,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3濃度5-25ng/ml,轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度5_50 μ g/ml,孕酮5_20mmol/L,腐胺20-50 μ mol/L,亞砸酸納 10-20mmol/L,膜島素 5-20 μ g/ml,肝素 2-10 μ g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)基，其特征在于，所述添加物還可以根據(jù)需要包括濃度為100U/ml的青鏈霉素。
4.一種少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將OPCs收集至離心管中；` 2)400g離心5分鐘收集細(xì)胞； 3)棄上清，將細(xì)胞重懸于擴(kuò)增培養(yǎng)基，調(diào)整密度為2~10X 105/ml ； 4)將細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中； 5)每3~5天更換一次培養(yǎng)基； 6)待OPCs生長(zhǎng)至80%左右匯合時(shí)，進(jìn)行OPCs傳代，傳代方法同上步驟I)-5)所述，如此循環(huán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，所述擴(kuò)增培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物構(gòu)成，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基采用商用Neural Basal Medium或自行配制的DF medium任--種；另外加上商用無(wú)糖型Neural Basal Medium ； 所述商用Neural Basal Medium或自行配制的DF medium與商用無(wú)糖型Neural BasalMedium兩者的體積比為(1-3): I ； DF medium培養(yǎng)基由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖組成，其中，DMEM和F12比例為體積比(1-3): 1，HEPES濃度為10-20mmol/L，D-葡萄糖濃度為質(zhì)量/體積比l_2g/ml ； 所述添加物包括B27、乳酸鈉、堿性成纖維生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子-AA、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3、轉(zhuǎn)鐵蛋白、孕酮、腐胺、亞硒酸鈉、胰島素、肝素，其中，B27為IX，乳酸鈉濃度為3-10mmol/L,堿性成纖維生長(zhǎng)因子濃度5_25ng/ml,血小板源性生長(zhǎng)因子-AA濃度10_20ng/ml,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3濃度5-25ng/ml,轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度5_50 μ g/ml,孕酮5_20mmol/L,腐胺20-50 μ mol/L,亞砸酸納 10-20mmol/L,膜島素 5-20 μ g/ml,肝素 2-10 μ g/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，所述擴(kuò)增培養(yǎng)基的添加物還包括濃度為100U/ml的青鏈霉素。
7.權(quán)利要求4所述的方法及通過(guò)其方法擴(kuò)增獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞在制備治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病藥物中的應(yīng)用。`
【文檔編號(hào)】A61P25/00GK103484431SQ201310455908
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】欒佐 申請(qǐng)人:欒佐