專(zhuān)利名稱(chēng)：腎上腺素alpha1受體亞型的熒光探針組合及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于核酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種核酸探針組合及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞總數(shù)的90%，其在神經(jīng)系統(tǒng)中的重要性日益受到重視，逐漸成為神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。早先有神經(jīng)生物學(xué)研究者在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了一種具有典型雙極突起、胞體小而不規(guī)則的細(xì)胞，其形態(tài)很難歸入已知的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞范疇，而類(lèi)似不成熟的膠質(zhì)細(xì)胞。根據(jù)其能夠增殖并可分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的特性，研究者將這種細(xì)胞命名為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cell,0PC)。硫酸軟骨素蛋白多糖(NG2)是OPC的特異性免疫標(biāo)記物和鑒定標(biāo)準(zhǔn)。早先的研究認(rèn)為OPC是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育早期的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，其在出生后分化成熟，成為成髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞。但最近研究顯示，成熟的腦內(nèi)也表達(dá)大量的NG2免疫陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞,這些細(xì)胞在形態(tài)上與星狀膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等均有所區(qū)別，胞體稍大，突起短而且豐富，有較多分枝，從形態(tài)學(xué)特征來(lái)看傾向認(rèn)為是腦內(nèi)一類(lèi)成熟的膠質(zhì)細(xì)胞，而這些細(xì)胞在灰質(zhì)、白質(zhì)及海馬區(qū)域的廣泛分布也預(yù)示其可能不嚴(yán)格屬于少突膠質(zhì)細(xì)胞系的前體細(xì)胞，而是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與少突膠質(zhì)細(xì)胞、星狀膠質(zhì)細(xì)胞不同的一種新的膠質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型。由于近年研究顯示OPC與神經(jīng)退行性疾病、毒性物質(zhì)作用、營(yíng)養(yǎng)代謝障礙和缺氧缺血所致的白質(zhì)損害等均密切相關(guān)，從而成為新近神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)。哺乳動(dòng)物腦內(nèi)白質(zhì)與灰質(zhì)OPC形態(tài)有不同。OPC是否與星狀膠質(zhì)細(xì)胞類(lèi)似，在不同腦區(qū)也具有異質(zhì)性，對(duì)于闡明其在體功能具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對(duì)OPC的異質(zhì)性研究，設(shè)計(jì)和構(gòu)建一種熒光探針。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案
I、腎上腺素alphal受體(alphal_AR)亞型的突光探針組合，由腎上腺素alphalA受 體(alphalA-AR)熒光探針和腎上腺素alphalB受體(alphalB_AR)熒光探針組成，所述alphalA-AR熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，alphalB_AR熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述alphalA-AR熒光探針和alphalB_AR熒光探針?lè)謩e用熒光光譜互不重疊的熒光分子進(jìn)行標(biāo)記。優(yōu)選的，所述alphalA-AR熒光探針和alphalB_AR熒光探針中的任意一種用熒光分子Cy5進(jìn)行標(biāo)記,另一種用突光分子Alexa Fluor488進(jìn)行標(biāo)記。2、alphal-AR亞型的熒光探針組合作為區(qū)分不同腦區(qū)OPC的試劑的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種alphal-AR亞型的熒光探針組合，包括alphalA-AR熒光探針和alphalB-AR熒光探針，應(yīng)用該熒光探針組合和熒光原位雜交技術(shù)，在熒光標(biāo)記OPC轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)不同腦區(qū)OPC表達(dá)alphal-AR類(lèi)型不一致，alphalA-AR和alphalB-AR可以作為區(qū)分不同腦區(qū)OPC的標(biāo)志物，該熒光探針組合可以作為區(qū)分不同腦區(qū)OPC的試劑，用于OPC的異質(zhì)性研究。由于現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)alphalA-AR和alphalB-AR的抗體尚不具有特異性區(qū)分alphalA-AR和alphalB-AR的能力，而熒光標(biāo)記技術(shù)具有檢測(cè)簡(jiǎn)單、靈敏度高(相對(duì)于常規(guī)標(biāo)記技術(shù))、特異性強(qiáng)(相對(duì)于受體檢測(cè)技術(shù))等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的熒光探針組合具有良好的應(yīng)用前景。


圖I顯示了 AlphalAAR-I寡核苷酸的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，單吸收峰在16382Da。圖2顯示了 AlphalBAR-I寡核苷酸的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，單吸收峰在14491Da。圖3顯示了海馬CAl區(qū)OPC表達(dá)alphalA-AR (箭頭所示)但不表達(dá)alphalB-AR。圖4顯示了海馬CA2區(qū)OPC表達(dá)alphalA-AR (箭頭所示)但不表達(dá)alphalB-AR。
圖5顯示了大腦皮層灰質(zhì)OPC既不表達(dá)alphalA-AR也不表達(dá)alphalB-AR。圖6顯示了大腦皮層白質(zhì)OPC既表達(dá)alphalA-AR(箭頭所示)也表達(dá)alphalB-AR。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。一、alphalA-AR熒光探針和alphalB-AR熒光探針的制備
根據(jù)GenBank中登錄的alphalA-AR的mRNA全長(zhǎng)序列(登錄號(hào)NM_013461. 3)和alphaIB-AR的mRNA全長(zhǎng)序列(登錄號(hào)NM_007416. 3)設(shè)計(jì)alphalA-AR和alphalB-AR的特異性寡核苷酸探針序列如下
alphalA-AR 的寡核昔酸探針 AlphalAAR-I :5’-gcatcacgaggaagaacggcagccagcagaggaeg- aagcatcccaccacaa-3’ (SEQ ID No. I)；
alphalB-AR 的寡核昔酸探針 AlphalBAR-I :5，-aaggcgcacagctccacgggtggctgcgttccacga- cccaggtat-3’ (SEQ ID No. 2)。AlphalAAR-I探針序列與alphalA-AR mRNA全長(zhǎng)序列的BLAST比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表I。AlphalBAR-I探針序列與alpha IB-AR mRNA全長(zhǎng)序列的BLAST比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表2。表I AlphalAAR-I 與 alphalA-AR mRNA 全長(zhǎng)序列的 BLAST 結(jié)果—....IH— 願(yuàn) SI FelwlrTliwin序遲屢
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表 2 AlphalBAR-I 與 alphalB-AR mRNA 全長(zhǎng)序列的 BLAST 結(jié)果
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探針的熒光標(biāo)記釆用末端標(biāo)記法，在每條寡核苷酸探針的5’端和3’端都標(biāo)記上同一種焚光分子。本實(shí)施例中用Cy5標(biāo)記AlphalAAR-I探針，用Alexa Fluor488標(biāo)記AlphalBAR-I探針。Cy5的激發(fā)波長(zhǎng)為649nm，發(fā)射波長(zhǎng)為670nm ；Alexa Fluor488的激發(fā)波長(zhǎng)為490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520nm ;二者熒光光譜互不重疊，從而避免了后續(xù)熒光檢測(cè)中的互相干擾。當(dāng)然，本發(fā)明也可以用Alexa Fluor488標(biāo)記AlphalAAR-I探針，用Cy5標(biāo)記AlphalBAR-I探針；也可以采用熒光光譜互不重疊的其它熒光分子分別標(biāo)記AlphalAAR-I探針和AlphalBAR-I探針。AlphalAAR-I探針的合成序列經(jīng)DNA質(zhì)譜分析(圖I )，單吸收峰出現(xiàn)在16382Da，與預(yù)測(cè)分子量16382Da —致。AlphalBAR-I探針 的合成序列經(jīng)DNA質(zhì)譜分析(圖2)，單吸收峰出現(xiàn)在14491Da，與預(yù)測(cè)分子量14491Da —致。二、熒光轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織切片的制備
以紅色熒光DsRed標(biāo)記OPC轉(zhuǎn)基因小鼠(購(gòu)自美國(guó)Jaxson實(shí)驗(yàn)室，品種名稱(chēng)為STOCKTg(Cspg4-DsRed. Tl) lAkik/J，編號(hào)為008241)為實(shí)驗(yàn)小鼠，該小鼠在硫酸軟骨素蛋白聚糖
4(Cspg4)啟動(dòng)子調(diào)控下啟動(dòng)DsRed. Tl基因的表達(dá)，Cspg4翻譯后特異性表達(dá)NG2，從而使所有OPC細(xì)胞表達(dá)紅色熒光蛋白DsRed. Tl，DsRed. Tl的激發(fā)波長(zhǎng)為554nm，發(fā)射波長(zhǎng)為586nm,與Cy5和Alexa Fluor488的熒光光譜互不重疊。將小鼠自左心室主動(dòng)脈沿體循環(huán)灌注，先用20mL無(wú)菌生理鹽水，再用20-30mL 4%多聚甲醛溶液；然后剝離全腦，置4%多聚甲醛溶液中固定24小時(shí)，用30%無(wú)菌蔗糖溶液脫水至完全沉底，冰凍切片(40 μ m)，漂于無(wú)RNA 水解酶的 O. OlM PBS (ρΗ7· 4)中。三、原位雜交實(shí)驗(yàn)研究OPC的異質(zhì)性
將Cy5標(biāo)記的AlphalAAR-I探針、Alexa Fluor488標(biāo)記的AlphalBAR-I探針與紅色熒光DsRed標(biāo)記OPC轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織切片中的核酸進(jìn)行雜交，原位檢測(cè)腦組織切片中alphalA-AR和alphalB-AR的mRNA。由于本發(fā)明構(gòu)建的熒光探針為熒光速標(biāo)記，故采用直接法原位雜交，探針與組織細(xì)胞內(nèi)靶核酸所形成的雜交體不經(jīng)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，直接用熒光顯微鏡或激光共聚焦掃描顯微鏡觀(guān)察。具體實(shí)驗(yàn)方法為腦組織切片先用O. OlM PBS(ρΗ7· 4)洗3次，每次5分鐘，再用O. 3% Triton X-100于37°C浸泡4小時(shí)，再用2 X SSC洗10分鐘，加入濃度為Sng/yL的探針工作液，42°C雜交16小時(shí)，再依次應(yīng)用2XSSC、1XSSC、O. 5XSSC、0. 2 X SSC各洗3次，每次10分鐘，最后置O. OlM PBS (ρΗ7· 4)中漂洗并貼片，用I μ g/mL DAPI溶液復(fù)染細(xì)胞核，甘油封片觀(guān)察，以未雜交的腦組織切片(CSpg4(NG2)DSRed)為對(duì)照。結(jié)果如圖3飛所示，可見(jiàn)小鼠不同腦區(qū)OPC表達(dá)alphal-AR的類(lèi)型不一致，海馬區(qū)域的OPC僅僅表達(dá)alphalA-AR而不表達(dá)alphalB-AR，大腦皮層灰質(zhì)區(qū)域OPC既不表達(dá)alphalA-AR也不表達(dá)alphalB-AR,而大腦皮層白質(zhì)區(qū)域OPC既表達(dá)alphalA-AR也表達(dá)alphalB-AR，說(shuō)明alphalA-AR和alphalB-AR可以作為區(qū)分不同腦區(qū)OPC的標(biāo)志物，Cy5標(biāo)記的AlphalAAR-I探針和Alexa Fluor488標(biāo)記的AlphalBAR-I探針組合,可以作為區(qū)分不同腦區(qū)OPC的試劑，用于OPC的異質(zhì)性研究。alphal-AR是一種G蛋白偶聯(lián)受體，激活后通過(guò)Gq蛋白發(fā)揮生物學(xué)作用。其中，Gq蛋白的α亞單位通過(guò)水解磷脂酰肌醇，產(chǎn)生如三磷酸肌醇(ΙΡ3)和二?；视?DAG)等第二信使，激活蛋白酶C (PKC)調(diào)控細(xì)胞功能，產(chǎn)生效應(yīng)；Gq蛋白的β Y亞單位可以直接調(diào)控細(xì)胞膜的Kca通道，影響細(xì)胞內(nèi)K+平衡，介導(dǎo)細(xì)胞增殖或凋亡。文獻(xiàn)報(bào)道，表達(dá)于海馬的alphalA-AR在調(diào)節(jié)新生小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分化和調(diào)控成年小鼠膠質(zhì)細(xì)胞增殖中均有重要作用，也參與了注意和記憶過(guò)程，在后腦的發(fā)育中與突觸可塑性和抑郁、情緒障礙等的發(fā)生均有一定關(guān)系。此外，在圍生期缺氧缺血性腦損傷(HIBD)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)，損傷腦組織內(nèi)以去甲腎上腺素為典型的兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)釋放有顯著增加，從而激活突觸后膜的alphal-AR。在起始期、臨床癥狀出現(xiàn)之前，可能產(chǎn)生不可逆的損傷特征，尤其是對(duì)突觸后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的病理性損傷。OPC在HIBD引起的腦癱中是最敏感的易損性細(xì)胞，是腦室周?chē)踪|(zhì)軟化等病理過(guò)程的關(guān)鍵靶細(xì)胞。這與其特異表達(dá)的alphal-AR功能可能具有一定關(guān)系。其作用可能在于HIBD病理過(guò)程早期由于應(yīng)激釋放的去甲腎上腺素，激活突觸后OPC的alphal-AR，通過(guò)調(diào)控OPC的KCa通透性，影響細(xì)胞內(nèi)K+水平，改變細(xì)胞膜電位和細(xì)胞興奮性，從而加速了 OPC在缺氧缺血性腦損傷早期的易損性。而OPC在不同腦區(qū)所表達(dá)的alphal-AR亞型不一致，形成了 OPC在不同腦區(qū)的異質(zhì)性，也給出了圍生期腦癱中以白質(zhì)病 變和少突膠質(zhì)細(xì)胞系損傷為主的病理依據(jù)。最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.腎上腺素alphal受體亞型的熒光探針組合，其特征在于，由腎上腺素alphalA受體熒光探針和腎上腺素alphalB受體熒光探針組成,所述腎上腺素alphalA受體熒光探針的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，腎上腺素alphalB受體熒光探針的核苷酸序列如SEQ IDNo. 2所示；所述腎上腺素alphalA受體熒光探針和腎上腺素alphalB受體熒光探針?lè)謩e用熒光光譜互不重疊的熒光分子進(jìn)行標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的腎上腺素alphal受體亞型的熒光探針組合，其特征在于，所述腎上腺素alphalA受體熒光探針和腎上腺素alphalB受體熒光探針中的任意一種用熒光分子Cy5進(jìn)行標(biāo)記,另一種用突光分子Alexa Fluor488進(jìn)行標(biāo)記。
3.權(quán)利要求I所述的腎上腺素alphal受體亞型的熒光探針組合作為區(qū)分不同腦區(qū)的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的試劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種腎上腺素alpha1受體亞型的熒光探針組合，由腎上腺素alpha1A受體(alpha1A-AR)熒光探針和腎上腺素alpha1B受體(alpha1B-AR)熒光探針組成，alpha1A-AR熒光探針和alpha1B-AR熒光探針的核苷酸序列分別如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示；應(yīng)用上述熒光探針組合和熒光原位雜交技術(shù)，在熒光標(biāo)記少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPC)轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)不同腦區(qū)OPC表達(dá)alpha1-AR類(lèi)型不一致，說(shuō)明alpha1A-AR和alpha1B-AR可以作為OPC異質(zhì)性的標(biāo)記，本發(fā)明的熒光探針組合可以作為區(qū)分不同腦區(qū)OPC的試劑，用于OPC的異質(zhì)性研究。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102719428SQ20121009820
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月6日
發(fā)明者阮懷珍, 陳鵬慧 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)