專利名稱：水稻中度卷葉突變基因rl14及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種水稻突變基因，還涉及該突變基因的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻(Orvza sativa L.)是世界上最重要的糧食作物之一，全世界有近半數(shù)的人口以稻米為主食。隨著世界人口的不斷增加和耕地面積的持續(xù)減少，糧食安全成為世界性問題。水稻是C3植物，光呼吸較強，有效光合速率較低，尤其是在高溫伏旱區(qū)水稻的灌漿期，由于氣溫高，其光呼吸將浪費大量的光合產(chǎn)物，不僅會影響產(chǎn)量，還會嚴(yán)重影響米質(zhì)。因此，提高有效光合速率是提高水稻產(chǎn)量和改善米質(zhì)的一條有效途徑。要達到這一目的，可以通過增加葉面積指數(shù)(LAI)或單位葉面積的凈光合作用來實現(xiàn)，但由于高葉面積指數(shù)與葉片的相互遮光是一對尖銳的矛盾，而水稻適度卷葉有利于保持葉片直立、改善群體結(jié)構(gòu)與透光性能，提高光能利用效率，因此，可通過中度卷葉及其它高光效基因的聚合來提高水稻有效光合速率。但目前已發(fā)現(xiàn)的水稻卷葉材料在葉片的卷曲程度上存在較大差異，多數(shù)在生產(chǎn)上的利用價值不高。因此，篩選和鑒定具有育種利用價值的卷葉基因是水稻育種中的一項重要課題。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種水稻中度卷葉基因，為水稻轉(zhuǎn)基因研究提供有力的工具，進而促進高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻的育種研究。在前期研究工作中，發(fā)明人利用EMS誘變優(yōu)良恢復(fù)系縉恢10號獲得了一個遺傳穩(wěn)定的水稻中度卷葉突變體(命名為r77￥)，表現(xiàn)為葉片一側(cè)高度卷曲成筒狀，另一側(cè)微卷或不卷，與目前已發(fā)現(xiàn)的水稻葉片中、微卷表型均不相同。研究發(fā)現(xiàn)，該性狀由隱性單基因(命名為見20控制，該基因主要影響厚壁細胞、葉肉細胞次生壁的形成和葉脈導(dǎo)管分化，間接影響葉脈導(dǎo)管一葉肉細胞一葉細胞間隙運輸途徑的水分運輸，造成泡狀細胞變異，從而引起卷葉。分子標(biāo)記定位結(jié)果顯示，該基因定位于第10染色體長臂Indel標(biāo)記SID2和SSR 標(biāo)記SW24之間24. 5kb的范圍內(nèi)。在上述基因定位的基礎(chǔ)上，本發(fā)明首先通過基因預(yù)測、同源搜索及基因序列差異比較，初步確定了見#基因為20G-Fe(II)氧化酶基因似仰.2);隨后，本發(fā)明以水稻中度卷葉突變體為材料，克隆了該基因的cDNA并進行了測序，結(jié)果顯示，基因全長cDNA為837bp，由3個外顯子組成，共編碼278個氨基酸，與縉恢10號野生型基因相比，RL14基因在第458位堿基有T-C的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致其編碼蛋白在第153位氨基酸發(fā)生異亮氨酸(He，I)到蘇氨酸(Thr，T)的變異，且該突變位點處于高度保守的20G-Fe (II)氧化酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)；再后，本發(fā)明構(gòu)建了野生型基因重組植物超表達載體并將其轉(zhuǎn)化水稻中度卷葉突變體性狀觀察顯示轉(zhuǎn)基因陽性植株葉片平展，完全恢復(fù)為野生型葉型；組織切片觀察顯示轉(zhuǎn)基因陽性植株葉片泡狀細胞形態(tài)與突變體相比明顯恢復(fù)正常，從而確定了基因為20G-Fe(II)氧化酶基因(tts7處決沒仰.2)，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，編碼蛋白序列如SEQ ID No. 2所示?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，突變基因7PZ24為水稻中度卷葉基因，可以用于水稻例如縉恢 10號卷葉性狀的分子育種?；谕蛔兓驑?gòu)建植物表達載體并轉(zhuǎn)化優(yōu)質(zhì)背景的水稻細胞，再將轉(zhuǎn)化的水稻細胞培育成卷葉植株，即可通過轉(zhuǎn)基因?qū)崿F(xiàn)卷葉等優(yōu)良基因的快速聚合，從而快速地按理想培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的水稻品種。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了一個水稻中度卷葉突變基因見的核苷酸序列及其編碼蛋白序列，為水稻轉(zhuǎn)基因研究提供了有力的工具，可促進高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻的育種研究。


圖I為RL14基因的遺傳和物理圖譜，其中A為RL14的初定位，在第10染色體長臂SSR標(biāo)記RMl 162和RM3123之間；B為RL14的精細定位，在BAC克隆AC079874上，標(biāo)記 SID2與SW24之間24. 5kb的范圍內(nèi)；C為RL14候選基因0sl0g40960. I的結(jié)構(gòu)及突變位置； D為突變體r77￥和野生型WT的0sl0g40960. I基因表達量。圖2為基因RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖，其中I泳道為PLAS 2000 DNA Marker, 2泳道為野生型縉恢10號的RT-PCR產(chǎn)物，3泳道為突變體r77￥的RT-PCR產(chǎn)物，4泳道為空白對照。圖3為基因與野生型基因的序列比對圖，基因CDNA在第458位發(fā)生了 T-C的轉(zhuǎn)變。圖4為見基因編碼蛋白與野生型基因編碼蛋白的序列比對及保守結(jié)構(gòu)域分析圖，見2￥基因編碼蛋白在第153位發(fā)生了 I-T的變異，且該突變位點處于高度保守的 20G-Fe(II)氧化酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)(下劃線部分)。圖5為見野生型基因重組植物超表達載體的構(gòu)建圖。圖6為突變體rl 14的互補表型分析，其中A分別為野生型WT、突變體r77￥、轉(zhuǎn)基因陽性植株c-r77￥ ;B分別為野生型WT、突變體r77￥、轉(zhuǎn)基因陽性植株c-r77￥的葉片；(分別為野生型WT、突變體r77A轉(zhuǎn)基因陽性植株c-r77￥的葉片組織橫切面；D分別為野生型 WT、突變體r77￥、轉(zhuǎn)基因陽性植株c-r77￥的葉片見2￥基因表達分析。圖7為見2￥基因編碼蛋白的進化樹分析，與水稻Q94LP4的親緣性較近，與高粱 C5WZM7的親緣性次之。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件， 例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。優(yōu)選實施例中使用的材料野生型縉恢10號和水稻中度卷葉突變體r77￥由西南大學(xué)水稻研究所培育；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、高保真DNA聚合酶PFU、T4 DNA連接酶、Trizol 試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自TaKaRa公司；氨節(jié)青霉素(Ampicillin,Amp)為Sigma公司產(chǎn)品；引物合成和DNA測序由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成；其它化學(xué)試劑購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。一、水稻中度卷葉突變基因RL14的預(yù)測
在前期對見#基因精細定位的基礎(chǔ)上，本發(fā)明通過在線基因預(yù)測(http V/mendel. cs. rhul. ac. uk)、BLAST在線比對(http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/)及基因功能互補分析，初步確定了見#基因為20G-Fe(II)氧化酶基因處勿晰Z 7)(圖I)。20G-Fe(II)氧化酶基因家族在高粱、玉米、水稻、擬南芥、日本黃連、葡萄、蓖麻中均存在直系同源蛋白，其中已報道的有擬南芥SRGl和日本黃連NCSl。在日本黃連中，NCSl 和PRlO蛋白一起催化黃連素的合成，但其實際功能尚不清楚。二、水稻中度卷葉突變基因RL14的克隆、測序及功能驗證
I、水稻中度卷葉突變基因見#的克隆及測序
根據(jù)GenBank登錄的水稻日本晴20G_Fe (II)氧化酶基因序列(AK068525),利用Vector NTI 軟件設(shè)計 I 對特異引物上游引物 RL14 F :5’-ggacacaacctgaaagcaggttc_3’ (SEQ ID No. 3);下游引物R :5，-tatgagtcagtttctaagttcgttcg-3，(SEQ ID No. 4)。分別取水稻中度卷葉突變體和野生型縉恢10號光照培養(yǎng)兩周的幼葉2g，迅速放入液氮中研磨成粉末，按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，電泳結(jié)果顯示，所得突變體和野生型總RNA的主帶清晰完整，28S和18S的條帶亮度比約為2:1，說明RNA的濃度和純度符合實驗要求，可以用于合成雙鏈cDNA。分別以所得突變體和野生型總RNA為模板，按照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說明書，使用 Oligo (dT)引物進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA ;再以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，采用特異引物 RL14V/RL14R及高保真DNA聚合酶PFU進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘； 然后94°C變性30秒，55°C復(fù)性30秒，72°C延伸I分鐘，共35個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。所得RT-PCR產(chǎn)物進行I. 0% (g/mL)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖2所示，突變體和野生型RT-PCR產(chǎn)物均在約IOOObp處呈單一特異性條帶。用DNA凝膠回收試劑盒切膠回收純化目的DNA片段，再將該DNA片段和pMD-19T載體在T4 DNA連接酶的作用下于16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，PCR鑒定后測序。結(jié)果顯示，欣基因全長cDNA為837bp (SEQ ID No. 1)，由3個外顯子組成，共編碼278個氨基酸(SEQ ID No. 2);與野生型基因相比，基因在第458位堿基(即第2個外顯子的第190位堿基)處有T-C的轉(zhuǎn)換(圖3)，并導(dǎo)致編碼蛋白序列的第153 位氨基酸發(fā)生Ile-Thr的變異(圖4)。2、水稻中度卷葉突變基因RL14的功能驗證
按照圖5所示構(gòu)建見野生型基因重組植物超表達載體，并轉(zhuǎn)化水稻中度卷葉突變體 rll4。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因陽性植株(命名為c-r77W葉片平展，完全恢復(fù)為野生型葉型(圖 6AB)。組織切片觀察表明，轉(zhuǎn)基因陽性植株葉片的泡狀細胞形態(tài)與突變體相比明顯恢復(fù)正常(圖6C)。對6葉期野生型、突變體r77￥及轉(zhuǎn)基因陽性植株葉片基因進行QPCR分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因陽性植株的見#基因表達量與野生型相當(dāng)(圖6D)。從而確定了見24 基因就是20G-Fe(II)氧化酶基因處勿撕ft I)。三、水稻中度卷葉突變基因RL14的生物信息學(xué)分析
洛 RL14 基因序列利用 NCBI 中的 ORF Finder(http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf.html)進行開放閱讀框識別。結(jié)果顯示，見基因由一個完整且連續(xù)的開放閱讀框組成。將基因編碼蛋白序列利用 CDD( conserved domain database)(http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi)進行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)果顯示， 見#基因編碼蛋白有I個高度保守區(qū)域(第128-228位氨基酸)，即20G-Fe(II)氧化酶結(jié)構(gòu)域，而由RL14基因突變導(dǎo)致的氨基酸突變位點就在該高度保守區(qū)域內(nèi)。將見基因編碼蛋白序列利用MEG4軟件進行序列比對及系統(tǒng)進化樹的生成。序列比對結(jié)果顯示，見2￥基因與水稻(Q財Z/￥)、高粱(C5FZ#7)、玉米(以/17)編碼蛋白的同源性高達50%以上。系統(tǒng)進化樹如圖7所示，可見見2￥基因編碼蛋白與水稻W(wǎng)4LP4的親緣性較近，與高粱C5WZM7的親緣性次之。四、水稻中度卷葉突變基因RL14的應(yīng)用
水稻中度卷葉是水稻高產(chǎn)的重要理想株型。本發(fā)明的見#基因為水稻的分子育種提供了重要的基因資源?；谝?基因構(gòu)建植物表達載體并轉(zhuǎn)化優(yōu)質(zhì)背景的水稻細胞，再將轉(zhuǎn)化的水稻細胞培育成卷葉植株，即可通過轉(zhuǎn)基因?qū)崿F(xiàn)卷葉等優(yōu)良基因的快速聚合，從而快速地按理想培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的水稻品種。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.水稻中度卷葉突變基因見#，其核苷酸序列如SEQID No. I所示。
2.水稻中度卷葉突變基因見編碼蛋白，其氨基酸序列如SEQID No. 2所示。
3.權(quán)利要求I所述基因在水稻卷葉性狀的分子育種中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述水稻品種為縉恢10號。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個水稻中度卷葉突變基因RL14的核苷酸序列及其編碼蛋白序列，為水稻轉(zhuǎn)基因研究提供了有力的工具，可促進高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻的育種研究。
文檔編號C12N9/02GK102604971SQ20121009822
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月6日
發(fā)明者何光華, 凌英華, 方立魁, 李云峰, 楊正林, 桑賢春, 趙芳明 申請人:西南大學(xué)