專利名稱：霍山石斛微衛(wèi)星dna分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子標(biāo)記技術(shù)，具體涉及ー種霍山石斛微衛(wèi)星分子遺傳標(biāo)記。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星(Microsatellite)又稱作短串連重復(fù)(ShortTandem Repeats, STRs)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat, SSRs)、簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(SSLP)。是指ー類遍布于生物基因組中的由幾個(gè)核苷酸對(duì)(稱為核心序列，一般為I 6bps)為重復(fù)單位組成的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)。其重復(fù)次數(shù)在同一物種不同的遺傳型間是高度可變的，但這段重復(fù)的兩端卻是相對(duì)保守的單拷貝序列，據(jù)此設(shè)計(jì)引物，即可通過(guò)PCR技術(shù)分析核心序列重復(fù)次數(shù)的變異，在不同的遺傳型間檢測(cè)到多態(tài)。根據(jù)重復(fù)單元的構(gòu)成，微衛(wèi)星DNA序列被分為3種類型單一型(pure),復(fù)合型(compound)和間斷型(interrupted)。例如
單ー型ATATATATATATATATATATATAT復(fù)合型ATATATCACACACACACACAC間斷型ATATATCAATATATCA ATATATA作為ー種分子標(biāo)記，微衛(wèi)星DNA具有以下特點(diǎn)廣泛分布于真核生物的基因組中，據(jù)估計(jì)每6kb長(zhǎng)度中就有I個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)；核心序列的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間呈高度變異性，多態(tài)性信息容量高呈共顯性，遵循盂德?tīng)柗▌t遺傳；選擇中性等等。基于以上特點(diǎn)，微衛(wèi)星DNA被廣泛用于植物遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、品種鑒定和種質(zhì)保存、數(shù)量性狀基因的分析、輔助育種、構(gòu)建指紋圖譜、遺傳多祥性及物種進(jìn)化與親緣關(guān)系等方面的研究。霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense. C. Z. Tang et S. J. Cheng)又名米斛，蘭科石斛屬植物，原產(chǎn)安徽霍山，是藥用石斛中的極品，并被譽(yù)為“中華仙草之最”。作為瀕危植物，霍山石斛現(xiàn)己被中國(guó)列入國(guó)家ー級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物。由于石斛是ー種附生植物，對(duì)生態(tài)環(huán)境要求比較嚴(yán)格，自然繁殖頻率極低(< 5%)，加上長(zhǎng)期采集，野生植株已瀕臨滅絕?；羯绞蚱滟|(zhì)量上乘而馳名中外，多年來(lái)市場(chǎng)上霍山石斛有名無(wú)實(shí)，有價(jià)無(wú)市，資源接近枯竭?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上，凡冠以“霍山石斛”、“霍斗”或“野生金霍斛”等名稱的ー些楓斗產(chǎn)品，均非用真正的霍山石斛加工而成，多數(shù)是銅皮石斛、鐵皮石斛、扁黃草石斛和鉤狀石斛的仿冒品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題分離克隆霍山石斛的微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，建立霍山石斛微衛(wèi)星DNA技術(shù)體系并用這些分子標(biāo)記進(jìn)行霍山石斛遺傳多祥性，石斛屬植物遺傳關(guān)系的研究，以及進(jìn)行霍山石斛種質(zhì)鑒定。本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案霍山石斛微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記,包括霍山石斛微衛(wèi)星(CT)n富集文庫(kù)的構(gòu)建，微衛(wèi)星序列陽(yáng)性克隆的篩選及測(cè)序，得到51個(gè)含有微衛(wèi)星重復(fù)序列的克隆。得到11個(gè)多態(tài)性高的微衛(wèi)星分子標(biāo)記Hs39、Hs40、Hs41、Hs42、Hs44、Hs47、Hs48、Hs50、Hs54、Hs56、Hs57 ；Hs39 為 600 個(gè)核苷酸，Hs40 為 694 個(gè)核苷酸，Hs41 為503個(gè)核苷酸，Hs42為638個(gè)核苷酸，Hs44為437個(gè)核苷酸，Hs47為704個(gè)核苷酸，Hs48為558個(gè)核苷酸，Hs50為540個(gè)核苷酸，Hs54為458個(gè)核苷酸，Hs56為509個(gè)核苷酸，Hs57為541個(gè)核苷酸。


圖I :Hs39位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖2 Hs40位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增20個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖3 Hs41位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增25個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖4 Hs42位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增28個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖5 Hs44位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖6 Hs47位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖7 Hs48位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖8 Hs50位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增31個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖9 Hs54位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增29個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖10 Hs56位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增24個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖11 Hs57位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增30個(gè)霍山石斛的DNA的銀染PAGE圖。圖12 Hs42位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增I個(gè)霍山石斛(第I泳道，片段長(zhǎng)度在331bp左右)、2個(gè)河南石斛(2-3泳道，片段長(zhǎng)度在331bp左右)、7個(gè)鐵皮石斛(4_10泳道，片段長(zhǎng)度230-275bp)、7個(gè)銅皮石斛(11-17泳道，沒(méi)有產(chǎn)物條帶)、4個(gè)扁黃草石斛(18-21泳道，沒(méi)有產(chǎn)物條帶)和3個(gè)鉤狀石斛(22-24泳道，沒(méi)有產(chǎn)物條帶)的DNA的銀染PAGE圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例I :霍山石斛微衛(wèi)星DNA富集文庫(kù)的構(gòu)建I)基因組的提取與酶切 用Doyle J 介紹的 CTAB 法(Doyle J. DNA protocols for plants-CTAB totalDNA isolation [A]. In Hewitt GM, Johnston A (eds.), Molecular Techniques inTaxonomy [M]· Berlin Springer, 1991, 283-293)提取基因組。用限制性內(nèi)切酶 Sau 3AI(購(gòu)于TaKaRa公司)酶切基因組。2%的瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外光下切下400_900bp的DNA片段。用膠回收試劑盒(購(gòu)于Axygen公司)回收。2)加接頭將膠回收純化后的產(chǎn)物加入接頭oligo A(5-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3)oligo B(5-P04-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3)，在T4 DNA Ligase (購(gòu)于Fermentas公司)作用下于16°C水浴連接過(guò)夜。3) PCR檢測(cè)接頭連接以oligo A為引物，以連接產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(50 μ I反應(yīng)體系如下25μ IGoTaq 丨 Green Master Mix (購(gòu)于 Promega 公司)，5 μ I 引物 oligoA, 5 μ I 連接產(chǎn)物，加水補(bǔ)
至50 μ I。PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性50秒，56°C退火一分鐘，72°C延伸2分鐘，變性、退火、延伸三個(gè)步驟循環(huán)25次，最后72°C充分延伸10分鐘。在2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，PCR產(chǎn)物用純化試劑盒(購(gòu)于Axygen公司)進(jìn)行純化。4)磁珠富集用親合素包被的磁珠Streptavidin MagneSphere ParamagneticParticles(PMPs)(購(gòu)于Promega公司)結(jié)合微衛(wèi)星探針上的生物素，由于親和素和生物素的結(jié)合是ー個(gè)牢固的，不可逆的過(guò)程，因此在二者結(jié)合的同時(shí)，磁珠也吸附了“微衛(wèi)星探針及包含微衛(wèi)星的基因組DNA單鏈”，在此同時(shí)通過(guò)多次洗脫去除不含微衛(wèi)星的基因組片斷，最后通過(guò)高溫變性打開(kāi)微衛(wèi)星探針與DNA鏈的結(jié)合，從而達(dá)到富集含微衛(wèi)星片斷的目的。將雜交液加入已處理好的磁珠，室溫靜置30分鐘。將離心管放在磁力架上，吸去上清，依次用O. 5 X SSC，6 X SSC在室溫下洗三次，再用6\55(，2父55(，1\55(在60で下洗兩次，最后 用O. I X SSC室溫下洗一次。加入TE緩沖液，在PCR儀上95°C變性10分鐘，收集上清。重復(fù)兩次。5) PCR 富集以磁珠富集產(chǎn)物為模板，oligo A為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25 μ I反應(yīng)體系如下，
12.5 μ I GoTaq Green Master Mix (購(gòu)于 Promega 公司)，I. 5 μ I 引物 oligo A, 2. 5 μ I 富集后的DNA，加水補(bǔ)至25 μ I。PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性35秒，60°C退火性35秒，72°C延伸I分鐘，變性、退火、延伸三個(gè)步驟循環(huán)25次，最后72°C充分延伸12分鐘。PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用純化試劑盒(購(gòu)于Axygen公司)進(jìn)行純化。6)感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取平板上E. coli DH-5單菌落，接種于5ml的不含Amp的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取Iml培養(yǎng)液于50ml的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)，2 4h至對(duì)數(shù)期。測(cè)OD (O. 2 O. 6)。將培養(yǎng)液分裝至EP管中(每管I. 5ml菌液)，水浴10 15min。在4°C離心，4000rpm，10min (先降溫后再離心)棄上清。棄上清后三管并一管，冰浴30min (第一管加入O. lmol/L, Iml事先冰中預(yù)冷的CaC12，混勻，吸出至第二管，如此將三管并一管)。取出后梯度離心，4°C，4000rpm，5 8min。棄上清。加入200 μ I預(yù)冷甘油(15% )/CaC12(0. 1M)混勻，_80°C保存。7)連接轉(zhuǎn)化取PCR富集后的純化產(chǎn)物連接入TA克隆載體(pMD19-T Simple Vector)(購(gòu)于TaKaRa公司)，16 °C水浴連接2_3小吋。取出凍存管，冰上復(fù)蘇IOmin ；^10μ I的連接產(chǎn)物加入200 μ I感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30min ;42°C水浴熱休克90s ;冰浴2min，加入600 μ ILB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)I. 5h ;取70μ I培養(yǎng)液，滴入LB/Amp/X-gal/IPTG平板上并涂布均勻(X-Gal需避光);將平板37°C正向放置培養(yǎng)O. 5h，然后于37°C烘箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜。經(jīng)過(guò)12h的培養(yǎng)，待平板上的菌落大小適中，取出平板于4°C放置使藍(lán)斑充分顯現(xiàn)。用滅過(guò)菌的牙簽挑取平板上白色單克隆菌落，置于96深孔板中(深孔板事先加入了 400μ I的含Amp抗性的LB/Amp培養(yǎng)基)。當(dāng)白色單菌落挑取結(jié)束后，用不干膠將孔板蓋好后于37°C，225rpm振蕩培養(yǎng)4h。
8)含微衛(wèi)星序列的陽(yáng)性克隆的篩選以連接轉(zhuǎn)化所得的菌液為模板，利用引物oligo A和引物(CT) 12進(jìn)行PCR擴(kuò)增。15 μ I PCR 反應(yīng)體系包括rTaq 酶 O. 375U (購(gòu)自 TaKaRa 公司)，10 X Buffer I. 5 μ I，dNTPO. 2yM,MgC12 1.5yMj_0.4yM(oligo A，(CT) 12)，水，模板。反應(yīng)程序94 °C 預(yù)變性 3分鐘，94°C變性50秒，56°C退火35秒，72°C延伸I分鐘，變性、退火、延伸三個(gè)步驟循環(huán)30次。最后72°C充分延伸12分鐘。I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。對(duì)于PCR產(chǎn)物檢測(cè)中有2條或3條帶的克隆，則這些克隆內(nèi)可能含有微衛(wèi)星的插入片段。9)陽(yáng)性克隆測(cè)序及引物設(shè)計(jì)選取擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度在300_900bp的可能含有微衛(wèi)星插入片段的陽(yáng)性克隆菌液，送生エ生物(上海)有限公司測(cè)序，共得到51條含有微衛(wèi)星DNA的序列。利用軟件PrimerPremier 5. O根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端的序列來(lái)設(shè)計(jì)引物。10)篩選有多態(tài)性的引物 用上述的CTAB法提取霍山石斛的基因組。用設(shè)計(jì)好的引物(表I)擴(kuò)增基因組。反應(yīng)程序94V預(yù)變性4分鐘，94V變性45秒，相應(yīng)的退火溫度30秒，72°C延伸35秒，變性、退火、延伸三個(gè)步驟循環(huán)35次。最后72°C充分延伸8分鐘。I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物用PAGE電泳進(jìn)行檢測(cè)。共得到11個(gè)有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記。Hs39為600個(gè)核苷酸，Hs40為694個(gè)核苷酸，Hs41為503個(gè)核苷酸，Hs42為638個(gè)核苷酸，Hs44為437個(gè)核苷酸，Hs47為704個(gè)核苷酸，Hs48為558個(gè)核苷酸，Hs50為540個(gè)核苷酸，Hs54為458個(gè)核苷酸，Hs56為509個(gè)核苷酸，Hs57為541個(gè)核苷酸。11)結(jié)果分析 使用Cervus3. O軟件計(jì)算期望雜合度和觀察雜合度。使用Genepop3. 4軟件計(jì)算哈代-溫伯格以及連鎖不平衡的值，以此來(lái)描述11個(gè)霍山石斛微衛(wèi)星DNA多態(tài)位點(diǎn)的特征。由附圖1-11可看出，本發(fā)明的11個(gè)微衛(wèi)星序列的長(zhǎng)度在供試的20-31個(gè)霍山石斛中都出現(xiàn)了多祥性，條帶都在210-400個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。由此可見(jiàn)，本發(fā)明的這11個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記能用于研究霍山石斛的遺傳多樣性，石斛屬植物種間和居群間的變異和進(jìn)化關(guān)系，具有很高的重復(fù)性，是ー種可靠有效的分子標(biāo)記。12)霍山石斛微衛(wèi)星分子標(biāo)記在石斛屬其它幾種中的應(yīng)用通過(guò)PCR方法用霍山石斛的這11對(duì)微衛(wèi)星引物擴(kuò)增石斛屬其它4種石斛基因組DNA、電泳分離和銀染檢測(cè)等步驟，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中HS-42引物在銅皮石斛和鐵皮石斛，扁黃草石斛及鉤狀石斛等個(gè)體中在此范圍內(nèi)均未擴(kuò)增出條帶。見(jiàn)附圖12.表I引物特性表
權(quán)利要求
1.霍山石斛微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，其特征在干所述微衛(wèi)星標(biāo)記的標(biāo)號(hào)分別為Hs39、Hs40、Hs41、Hs42、Hs44、Hs47、Hs48、Hs50、Hs54、Hs56、Hs57 ； 其核苷酸序列分別為 Hs39 gatcagactt ccttccaact gccaaccacc gcctgacttt cacctgacca ccactcgata60gtcaattgtc gttagatcac cgcttgtcca tcaaacttct gcccttaagc tatcggactt120ccgcctgact gctgccagat ttctactcaa ctctccaaac tattataatt ccacaaccta180taagttaaag gacgggtcaa cctttgtaat taactcacat ttagtgaaat cttttcatct240aggagaggcc tcatggtttt tcccactatg ggttttccac ataaaaaaat ctgttgtttt300acttctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctcaaatt360acatgtttgt atgttggata tccgtgtatt gctaagatga aaaatttaca cgctcaacca420ttgcgaatat tctaacttgc aacaatgaca aaagtcaaac aaagtcaaac ataaaatgtg480cctttcccta atagtaatca tataacaaca atgactcata atctttttac tattatggct540ccaagaatat tgttctaaaa tattttcata atcaactaca tgcaagctgc acctcaccat600Hs40 gatcagagtt caacgccagat tagaaaagtc cttgtagagg ccatcacccc ggcggagggc60gcggcatccc cacaggagaa ggtcaggttt gacaagtaat gtcaaaagat gatgaaatta120ttacgtgcaa gcacaggacg tcgtccagag 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tctctctctc tctctctctc tcaccttccc 360 atagttgaac aataaaaaat tatctttatt tttttaatag gcaaacaggg atgtgacaag 420 gatggagata ttttgttctc ttgttcatct gcttgaacca actactgcac aatctatgct 480 taacagcaaa atgccccaaa aaagattcaa cctgccttgt gttcctgcaa ccggcgcatc 540 t541。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種霍山石斛微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，其特征在于 所述的 Hs39、Hs40、Hs41、Hs42、Hs44、Hs47、Hs48、Hs50、Hs54、Hs56、Hs57 -j^一個(gè)位點(diǎn)的引物序列為 Hs39-F CAC CGC TTG TCC ATC AAA CTT C Hs39-R CGC AAT GGT TGA GCG TGT AAA T Hs40-F AAG ATT GAG GCG ATG TTG T Hs40-R ACT TGC TGG AAT TTG TGG T Hs41-F CAG GCG GCA GAG TTA CAG Hs41-R GCC AAA GCA AAA CAA AGT AGA G Hs42-F TCC ATC TAT CCA TCA ACT AAG C Hs42-R GAC GAG TAT GTT CAG CAG ATT G Hs44-F ATG GCA TAA AAC CTC CCC G Hs44-R GAG CGG ACA ATC GCA TCT AAG T Hs47-F TGA AAT AGC CAT CCT GAA GAG Hs47-R GGA GAA GAT TAT TGG GTT TGA GT Hs48-F AGG GAA AGG CCG TAA TGA TGA T Hs48-R AGA GTT GTA ATG TTG GCT CCG CTA Hs50-F CCA AGC AAA CCT CAA GAA CTC Hs50-R CGA AAG GAC CGA CCT AAT ACTHs54-F CAG CCA ACA GCC ACT CTT CTT C Hs54-R CGC CGT CAA ATA GTT TAT CGT AG Hs56-F GCA GAA GCA AGA ATA AAA GTC G Hs56-R ATA AGA TTA GAT GAG CCC CAG A Hs57-F CCT TGA ATT TGC ATG GAG TT Hs57-R TTT TGG GGC ATT TTG CTG TT。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種霍山石斛微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，包括霍山石斛微衛(wèi)星(CT)n富集文庫(kù)的構(gòu)建，微衛(wèi)星序列陽(yáng)性克隆的篩選及測(cè)序，得到51個(gè)含有微衛(wèi)星重復(fù)序列的克隆，篩選得到了11個(gè)高多態(tài)性的微衛(wèi)星分子標(biāo)記Hs39、Hs40、Hs41、Hs42、Hs44、Hs47、Hs48、Hs50、Hs54、Hs56、Hs57，其中Hs42可較好地區(qū)分霍山石斛與鐵皮石斛、銅皮石斛、扁黃草石斛和鉤狀石斛。采用本方法開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記可用于研究霍山石斛的遺傳多樣性，鑒別霍山石斛幾種偽品，具有準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，為霍山石斛的去偽存真提供了新的工具。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102649955SQ20121009791
公開(kāi)日2012年8月29日 申請(qǐng)日期2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月6日
發(fā)明者何祥林, 宋平, 曹正宇, 朱國(guó)萍, 王暉, 王鵬, 鄭基陽(yáng), 陳乃富, 高鵬 申請(qǐng)人:安徽師范大學(xué)