具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架的制備方法、及其產(chǎn)品和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架的制備方法、及其產(chǎn)品和應(yīng)用。本發(fā)明的一種具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架不僅復(fù)制了天然骨組織的化學(xué)成分(Ca/P=1.67)，更重要是重現(xiàn)了天然骨礦化膠原的等級結(jié)構(gòu)即納米板狀晶體在纖維內(nèi)形成的周期性橫紋結(jié)構(gòu)（D=67nm）。這種新的具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的礦化膠原支架在干濕狀態(tài)下的機(jī)械性能及生物相容性（細(xì)胞增殖，分化，成骨能力）均優(yōu)于傳統(tǒng)礦化膠原。而且，這種新的具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的礦化膠原支架的機(jī)械性能（13.7±2.6GPa）與骨組織類似。因此本發(fā)明所述的具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架在制備骨組織修復(fù)材料領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架的制備方法、及其產(chǎn)品和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種礦化膠原支架的制備方法，特別涉及一種具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架的制備方法、及其產(chǎn)品和在制備骨組織修復(fù)材料中的應(yīng)用。屬于骨組織修復(fù)與治療領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]骨組織是自然界中一種具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)，多功能礦化組織。在生命過程中，它不斷地改建來適應(yīng)外界機(jī)械應(yīng)力，維持離子平衡并修復(fù)缺損。骨缺損的再生與修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)研究的重要課題。自體骨移植一直被認(rèn)為骨缺損治療的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于來源有限及取材部位需二次手續(xù)而受到質(zhì)疑。近年來，組織工程通過模擬天然骨組織的化學(xué)成分，物理性能及顯微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來解決這一難題。礦化膠原作為骨組織最基本的等級結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是最理想的骨再生修復(fù)材料。而傳統(tǒng)方式合成的礦化膠原僅僅只實(shí)現(xiàn)了和骨組織一致的化學(xué)成分，并未復(fù)制其等級結(jié)構(gòu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)和不足提供一種具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架的制備方法、及由該方法獲得的產(chǎn)品和在制備骨組織修復(fù)材料中的應(yīng)用。
[0004]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)手段為: [0005]本發(fā)明的一種具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
[0006](I)膠原磷酸化:將盛有3 — 4mg/ml鼠尾I型原膠原溶液的透析袋,浸泡于質(zhì)量百分含量為1.25 - 2.5%的三聚磷酸鈉溶液中5 - lOmin，使膠原磷酸化；
[0007](2)無定型磷酸鈣(ACP)的制備:將0.5g — Ig I型白色硅酸鹽水門汀浸泡于30 —40ml含0.5 — lmg/ml聚丙烯酸的人工模擬體液中，于37°C反應(yīng)I 一 2d，得到含有大小為45-50nm的納米無定型磷酸?丐的溶液；
[0008](3)膠原的纖維化及再礦化:將步驟(1)得到的磷酸化的膠原置于步驟(2)得到的含ACP的溶液中，膠原質(zhì)量與溶液體積比例為0.5-lmg:lml,5 - 7d后，磷酸化的膠原將誘導(dǎo)納米無定型磷酸鈣在膠原纖維內(nèi)的有序排列與成核，形成具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的礦化膠原；
[0009](4)三維礦化膠原支架的合成:將步驟(3)得到的礦化膠原于0.1M磷酸緩沖液中透析30min，之后置于4°C，3000 一 5000g離心5 — IOmin,去掉上清液，向沉淀中加入適量的0.1M磷酸緩沖液，充分混勻后制備成懸濁液，倒入24孔板，于-25~-40°C冷凍24 — 48h，并凍干形成三維的疏松的多孔礦化膠原支架；再使用含有1- (3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺及N-羥基丁二酰亞胺的混合液交聯(lián)4 一 24h，采用甘氨酸溶液與雙蒸水交替沖洗，凍干，即得到孔徑為80 - 300 μ m的，具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架。[0010]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(2)中所述的人工模擬體液，其溶質(zhì)組成如下:136.SmMNaCl，4.2mM NaHCO3, 3.0mM KCl, 1.0mM K2HPO4.3H20,1.5mMMgCl2.6H20, 2.5mM CaCl2,0.5mMNa2SO4以及3.08mM Na3N,溶劑為水，用HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)ρΗ=7.0。
[0011]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(4)中向沉淀中加入的0.1M磷酸緩沖液的體積為沉淀體積的 1/20 — 1/10。
[0012]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(4)中，所述的混合液按照以下方法制備得到:使用摩爾濃度為0.3mol/L的1- (3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺溶液及摩爾濃度為0.06mol/L的N-羥基丁二酰亞胺溶液按照體積比=I:1配制 。
[0013]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(4)中所述的甘氨酸溶液的質(zhì)量百分濃度為1%。
[0014]本發(fā)明中，將0.5g -1g I型白色硅酸鹽水門汀浸泡于30 - 40ml含0.5 — Img/ml聚丙烯酸的人工模擬體液中，于37°C反應(yīng)I 一 2d，I型白色硅酸鹽水門汀在人工模擬體液中將逐漸釋放Ca2+和0H-，使溶液的pH升高至9.5 — 10，Ca2+與P043_結(jié)合形成ACP，帶負(fù)電的聚丙烯酸將吸附在ACP表面，從而控制ACP的大小約45 - 50nm (納米ACP)；
[0015]在本發(fā)明中，本發(fā)明將磷酸化的膠原置于含ACP的溶液中，膠原質(zhì)量與溶液體積比例約為0.5-lmg:1ml，溶液中k +及堿性pH值能夠促進(jìn)膠原的纖維化，形成白色絮狀纖維，同時(shí)納米ACP進(jìn)入纖維內(nèi)的間隙區(qū)域，約5 - 7d后，磷酸化的膠原將誘導(dǎo)納米ACP在纖維內(nèi)的有序排列與成核，形成具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的礦化膠原。
[0016]進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了由以上所述的方法制備得到的具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架。及
[0017]所述的具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架在制備骨組織修復(fù)材料中的應(yīng)用。
[0018]相較于傳統(tǒng)礦化膠原，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0019]1、本發(fā)明通過這種新的仿生法合成的礦化膠原(MO不僅復(fù)制了天然骨組織的化學(xué)成分(Ca/P=l.67)，更重要是重現(xiàn)了天然骨礦化膠原的等級結(jié)構(gòu)即納米板狀晶體在纖維內(nèi)形成的橫紋結(jié)構(gòu)(D=67nm)(圖1)。
[0020]2、這種新的具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的礦化膠在干濕狀態(tài)下的機(jī)械性能(圖2)及生物相容性(細(xì)胞增殖，分化，成骨能力(圖3、4))均優(yōu)于傳統(tǒng)礦化膠原(EMC)。而且，這種新的具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的礦化膠原的機(jī)械性能(13.7±2.6GPa)與骨組織類似。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為掃描(SEM)和透射電鏡(TEM)分別觀察不同膠原支架的顯微結(jié)構(gòu)；
[0022]未礦化膠原(Col)負(fù)染可見D周期性橫紋；IMC中納米晶體沿膠原內(nèi)D周期排列(箭頭所示);EMC晶體無規(guī)則排列在膠原表面(箭頭所示)，負(fù)染可見膠原呈D周期性橫紋；
[0023]圖2為干、濕狀態(tài)下礦化膠原的納米機(jī)械性能；
[0024]對干燥組，柱條上不同的大寫字母表示組間存在顯著性差異(P〈0.05);對濕潤組，柱條上相同的小寫字母表示組間無顯著性差異(P>0.05);對不同礦化組，相鄰柱條上方的黑色線條表示組間存在顯著性差異(P〈0.05)；
[0025]圖3為MTS檢測MG63細(xì)胞的增殖(A)以及ALP活性(B)；
[0026]數(shù)據(jù)均采用均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析數(shù)據(jù)間的差異；*:與第I天比 ρ〈0.05 ；#:與第 3 天比 ρ〈0.05。[0027]圖4為茜素紅染色檢測MG63在不同支架上的成骨能力；
[0028]圖5為動物骨損傷模型的建立:
[0029]圖6為6w后micro-CT新生骨量的比較:
[0030]對照組=1.3±0.4mm3，未礦化膠原(Col) =10.2±1.8mm3, EMC=17.7±4.3mm3，頂〇=23.9±5.6臟3組間存在明顯的差異；6w后，MC組缺損區(qū)域已大部分修復(fù)，明顯優(yōu)于EMC組。擬12w后繼續(xù)掃CT;
[0031]圖7為未礦化膠原(Col)組缺損區(qū)組織切片染色結(jié)果；
[0032]A:HE 染色，B_D:Masson 染色；
[0033]圖8為EMC組缺損區(qū)組織切片染色結(jié)果；
[0034]A:HE 染色，B_D:Masson 染色；[0035]圖9為MC組缺損區(qū)組織切片Masson染色結(jié)果。
[0036]A:可見部分未降解支架材料，支架間隙被細(xì)胞及新生血管充滿，B, C:局部可見新生骨島，表面排列著立方狀的成骨細(xì)胞以及多核破骨細(xì)胞，其內(nèi)部的纖維與骨細(xì)胞的排列趨勢呈同心圓狀，類似環(huán)形骨單位；D:組織中還出現(xiàn)類似骨髓腔的結(jié)構(gòu)，其中含有成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和大量毛細(xì)血管與紅細(xì)胞(箭頭所示)。
【具體實(shí)施方式】
[0037]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0038]材料及其購買來源:
[0039]鼠尾I型原膠原溶液(BD Bio-sciences)
[0040]透析膜(3500Da,Invitrogen, Paisly, UK)
[0041]甘氨酸(Sigma-Aldrich,USA)
[0042]I 型白色娃酸鹽水門汀(Lehigh Cement C0., Allentown, PA, USA)
[0043]憐酸緩沖液(Gibco,Invitrogen, Paisly, UK)
[0044]聚丙烯酸(Sigma-Aldrich,USA)
[0045]三聚憐酸鈉(Sigma-Aldrich,USA)
[0046]人工模擬體液按照以下配方制備:溶質(zhì)組成如下:136.8mM NaCl,4.2mMNaHC03,
3.0mM KCl，1.0mM K2HPO4.3Η20，1.5mM MgCl2.6Η20，2.5mM CaCl2,0.5mM Na2SO4 以及 3.08mMNa3N,溶劑為水，用HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH=7.0。
[0047]實(shí)施例1具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架的制備
[0048](I)膠原磷酸化:將盛有3mg / ml鼠尾I型原膠原溶液的透析袋，浸泡于質(zhì)量百分含量為1.25%的三聚磷酸鈉溶液中5min，使膠原磷酸化；
[0049](2)無定型磷酸鈣(ACP)的制備:將0.5g I型白色硅酸鹽水門汀浸泡于30ml含0.5mg / ml聚丙烯酸的人工模擬體液中，于37°C反應(yīng)ld，得到含有大小為45_50nm的納米無定型磷酸鈣的溶液；
[0050](3)膠原的纖維化及再礦化:將步驟(1)得到的磷酸化的膠原置于步驟(2)得到的含ACP的溶液中，膠原質(zhì)量與溶液體積比例為Img:lml，5d后，磷酸化的膠原將誘導(dǎo)納米無定型磷酸鈣在膠原纖維內(nèi)的有序排列與成核，形成具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的礦化膠原；
[0051](4)三維礦化膠原支架的合成:將步驟(3)得到的礦化膠原于0.1M磷酸緩沖液中透析30min,之后置于4°C,3000g離心IOmin,去掉上清液，向沉淀中加入1/20沉淀體積的0.1M磷酸緩沖液，充分混勻后制備成懸濁液，倒入24孔板，于-25°C冷凍48h，并凍干形成三維的疏松的多孔礦化膠原支架；再使用含有1- (3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺及N-羥基丁二酰亞胺的混合液交聯(lián)24h，采用質(zhì)量百分濃度為I %的甘氨酸溶液與雙蒸水交替沖洗，凍干，即得到孔徑為80 — 300 μ m的，具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架。
[0052]其中，所述的混合液按照以下方法制備得到:使用摩爾濃度為0.3mol/L的1- (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺溶液及摩爾濃度為0.06mol/L的N-羥基丁二酰亞胺溶液按照體積比=1:1配制。
[0053]實(shí)施例2具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架的制備
[0054](1)膠原磷酸化:將盛有4mg / ml鼠尾I型原膠原溶液的透析袋,浸泡于質(zhì)量百分含量為2.5%的三聚磷酸鈉溶液中l(wèi)Omin，使膠原磷酸化；
[0055](2)無定型磷酸鈣(ACP)的制備:將Ig I型白色硅酸鹽水門汀浸泡于40ml含Img / ml聚丙烯酸的人工模擬體液中，于37°C反應(yīng)2d，得到含有大小為45-50nm的納米無定型磷酸鈣的溶液；
[0056](3)膠原的纖維化及再礦化:將步驟(1)得到的磷酸化的膠原置于步驟(2)得到的含ACP的溶液中，膠原質(zhì)量與溶液體積比例為0.5mg:lml，7d后，磷酸化的膠原將誘導(dǎo)納米無定型磷酸鈣在膠原纖維內(nèi)的有序排列與成核，形成具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的礦化膠原；
[0057](4)三維礦化膠原支架的合成:將步驟(3)得到的礦化膠原于0.1M磷酸緩沖液中透析30min,之后置于4°C, 5000g離心5min,去掉上清液，向沉淀中加入1/15倍沉淀體積的0.1M磷酸緩沖液，充分混勻后制備成懸濁液，倒入24孔板，于-40°C冷凍24h，并凍干形成三維的疏松的多孔礦化膠原支架；再使用含有1- (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺及N-羥基丁二酰亞胺的混合液交聯(lián)20h，采用質(zhì)量百分濃度為I %的甘氨酸溶液與雙蒸水交替沖洗，凍干，即得到孔徑為80 — 300 μ m的，具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架。
[0058]其中，所述的混合液按照以下方法制備得到:使用摩爾濃度為0.3mol/L的1- (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺溶液及摩爾濃度為0.06mol/L的N-羥基丁二酰亞胺溶液按照體積比=1:1配制。
[0059]實(shí)施例3具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架的制備
[0060](I)膠原磷酸化:將盛有3.5mg / ml鼠尾I型原膠原溶液的透析袋,浸泡于質(zhì)量百分含量為2%的三聚磷酸鈉溶液中l(wèi)Omin，使膠原磷酸化；
[0061](2)無定型磷酸鈣(ACP)的制備:將Ig I型白色硅酸鹽水門汀浸泡于30_40ml含Img / ml聚丙烯酸的人工模擬體液中，于37°C反應(yīng)36h，得到含有大小為45-50nm的納米無定型磷酸鈣的溶液；
[0062](3)膠原的纖維化及再礦化:將步驟(1)得到的磷酸化的膠原置于步驟(2)得到的含ACP的溶液中，膠原質(zhì)量與溶液體積比例為Img:lml，6d后，磷酸化的膠原將誘導(dǎo)納米無定型磷酸鈣在纖維內(nèi)的有序排列與成核，形成具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的礦化膠原；
[0063](4)三維礦化膠原支架的合成:將步驟(3)得到的礦化膠原于0.1M磷酸緩沖液中透析30min,之后置于4°C, 4000g離心8min,去掉上清液，向沉淀中加入1/10倍沉淀體積的
0.1M磷酸緩沖液，充分混勻后制備成懸濁液，倒入24孔板，于-30°C冷凍36h，并凍干形成三維的疏松的多孔礦化膠原支架；再使用含有1- (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺及N-羥基丁二酰亞胺的混合液交聯(lián)16h，采用質(zhì)量百分濃度為I %的甘氨酸溶液與雙蒸水交替沖洗，凍干，即得到孔徑為80 — 300 μ m的，具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架。
[0064]其中，所述的混合液按照以下方法制備得到:使用摩爾濃度為0.3mol/L的1- (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺溶液及摩爾濃度為0.06mol/L的N-羥基丁二酰亞胺溶液按照體積比=1:1配制。
[0065]試驗(yàn)例I本發(fā)明的具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架的性能測試
[0066]供試材料:具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架(實(shí)施例3制備)
[0067]方法:
[0068]1.采用掃描電鏡(SEM)觀察不同膠原支架的微觀形貌(圖1)。將實(shí)施例3制備得到的的支架材料經(jīng)梯度酒精脫水(50% — 100%)，并凍干。噴金后，在15kV電壓下觀察。
[0069]2.采用透射電鏡(TEM)觀察不同膠原支架的納米顯微結(jié)構(gòu)(圖1)。將組裝完成的膠原支架用3.7%福爾馬林固定4h，梯度酒精脫水(30% — 100%)，樹脂包埋后切成90 —IlOnm厚度切片，附在銅網(wǎng)上進(jìn)行觀察。未礦化的膠原(Col)用1%磷鎢酸負(fù)染后觀察。
[0070]從圖1結(jié)果可以看出，本發(fā)明采用新的仿生法合成的礦化膠原(MO不僅復(fù)制了天然骨組織的化學(xué)成分(Ca /P=l.67)，更重要是重現(xiàn)了天然骨礦化膠原的等級結(jié)構(gòu)即納米板狀晶體在纖維內(nèi)形成的橫紋結(jié)構(gòu)D=67nm。
[0071]3.原子力顯微鏡測量不同礦化膠原支架的力學(xué)性能(圖2)。采用BrukerMultiMode8SPM 在 peak-force tapping 模式下，以 1.0Hz 的掃描速率和 200mV 的振幅設(shè)定點(diǎn)定量測定支架材料的納米機(jī)械性能。在室內(nèi)常規(guī)環(huán)境和Tris-HCl緩沖液(IOmMTris-HCl, 50mM NaCl，pH7.4)中分別進(jìn)行測量。在室內(nèi)常規(guī)環(huán)境下的測量中，采用硬度高的RTESP懸臂(彈性常數(shù)為25.89N/m),因?yàn)橛捕容^高低的懸臂粘附力較大。在緩沖液進(jìn)行測量時(shí)，我們采用中等硬度的懸臂，其彈性常數(shù)為0.975N/m。采用Derjaguin-Muller-Toporov(DMT)模型擬合力對分離圖的收縮曲線，來計(jì)算楊氏模量。每組選用2個樣本，每個樣本選擇5個圖，每個圖中選10個點(diǎn)，這樣每組共100個數(shù)據(jù)，并采用Kruskal-Wallis方差分析。
[0072]4.細(xì)胞增殖:用 CellTiter96Aqueous One Solution 估計(jì)活細(xì)胞的數(shù)量(圖 3A)。先建立MG63細(xì)胞的校準(zhǔn)曲線，以便從吸光指數(shù)估計(jì)活細(xì)胞的數(shù)量。在固定的時(shí)點(diǎn)，去除孔板內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS清洗三次，將MTS檢測試劑與無血清的a-MEM培養(yǎng)基1:5混合后加入到不同組，在37°C孵育3h。孵育后將樣本移至96孔板。用酶標(biāo)儀在490nm處讀出吸光度值，
每組重復(fù)三次，取平均值。
[0073]5.堿性磷酸酶活性測定(ALP)(圖3B):在細(xì)胞培養(yǎng)24h后，向完整培養(yǎng)基中添加IO-7M地塞米松、IOmM β -磷酸甘油和0.05mM2-磷酸抗壞血酸。在固定時(shí)點(diǎn)采用ELISA需要的堿性磷酸酶底物，在37°C孵育30分鐘后，通過在每孔加入100 μ L的3N NaOH終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在490nm處讀出吸光度值，每組重復(fù)三次，取平均值。
[0074]6.通過茜素紅染色分析MG63細(xì)胞在不同礦化膠原的成骨能力(圖4)。用PBS洗滌三次,并用4%甲醛固定細(xì)胞lOmin。固定后的樣本再用去離子水洗滌三次，并用2%的茜素紅在室溫下染色。在用去離子水洗滌數(shù)次后，在光鏡下觀察。
[0075]以上結(jié)果表明，本發(fā)明的這種具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的骨樣礦化膠原，具有合成簡單，成本低，塑形方便，免疫原性低，機(jī)械性能及生物相容性良好等特點(diǎn)，在干濕狀態(tài)下的機(jī)械性能(圖2)及生物相容性(細(xì)胞增殖，分化，成骨能力(圖3、4))均優(yōu)于傳統(tǒng)礦化膠原(EMC)。而且，這種新的具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的礦化膠原的機(jī)械性能(13.7±2.6GPa)與骨組織類似。[0076]試驗(yàn)例2頜骨缺損修復(fù)的實(shí)施方案
[0077]供試材料:具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架(實(shí)施例3制備)
[0078]方法:
[0079]1.按照缺損區(qū)域大小修剪材料，使材料面積略大于缺損區(qū)。
[0080]2.消毒:環(huán)氧乙烷
[0081]3.取SD大鼠頜骨骨髓干細(xì)胞接種在材料上，或者取SD大鼠新鮮血液直接與材料混合。
[0082]4.動物模型建立:200-300g SD大鼠，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，剪毛，固定，消毒鋪巾；于頸部至頜下L形切口，分離肌層，暴露下頜骨骨面；使用種植機(jī)(W&H) 1200轉(zhuǎn)/min配合環(huán)形骨鉆(外徑4.8mm)于下頜升支磨除全層骨組織(圖5)，無菌生理鹽水冷卻，壓迫止血；取已接種細(xì)胞的支架材料，修剪邊緣使之適合缺損大小，植入缺損部位，分層縫合肌肉，皮膚(圖5)。
[0083]5、Micro-CT掃描:6周(W)后，將一半樣本處死，固定，并用Inveon MMCT(SIEMENS, USA)掃描缺損區(qū)域(電壓80V，電流500uA，分辨率為18.4um),使用Acquisition Workplace 與 Inveon Research Workplace 軟件進(jìn)行重建與數(shù)據(jù)分析，計(jì)算缺損區(qū)骨體積，每個樣品重復(fù)測三次。使用SPSS對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，圖6為6w后micro-CT新生骨量的比較，對照組=1.3±0.4mm3,未礦化膠原組(Col) =10.2±1.8mm3,EMC=17.7±4.3mm3, IMC=23.9±5.6mm3組間存在明顯的差異。表明6w后，IMC組缺損區(qū)域已大部分修復(fù)，明顯優(yōu)于EMC組。擬12w后繼續(xù)掃M(jìn)icro-CT。
[0084]6、缺損區(qū)的組織學(xué)檢查:分別取修復(fù)6w后的未礦化膠原組(Col)、EMC組以及IMC組的缺損區(qū)組織，于含蔗糖的EDTA脫鈣液中脫鈣3-4w ;梯度酒精脫水，浸蠟，石蠟包埋，因組織切片機(jī)切片，厚度5um。二甲苯-酒精脫蠟至水，蘇木精-伊紅(HE)染色或Masson染色，封片，顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖7-9所示。
[0085]圖7為未礦化膠原(Col)組缺損區(qū)組織切片染色結(jié)果，可見材料基本降解完全，新生骨主要位于缺損邊緣，中心區(qū)僅有少量成骨。
[0086]圖8為EMC組缺損區(qū)組織切片染色結(jié)果，可見材料基本降解完全，新生骨主要位于缺損邊緣，中心區(qū)僅有少量成骨。
[0087]圖9為MC組缺損區(qū)組織切片Masson染色結(jié)果，可見部分未降解支架材料，支架間隙被細(xì)胞及新生血管充滿(圖9A);局部可見新生骨島，表面排列著立方狀的成骨細(xì)胞以及多核破骨細(xì)胞，其內(nèi)部的纖維與骨細(xì)胞的排列趨勢呈同心圓狀，類似環(huán)形骨單位(圖9B、9C);組織中還出現(xiàn)類似骨髓腔的結(jié)構(gòu)，其中含有成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和大量毛細(xì)血管與紅細(xì)胞(圖9D，箭頭所示)。
[0088]以上結(jié)果表明，本發(fā)明的三維礦化膠原支架可用于硬組織如顱骨，頜骨，長骨等缺損的修復(fù)。由于其微觀結(jié)構(gòu)與天然骨組織類似，此材料不僅可以作為良好的支架材料，而且可以直接作為骨替代材料 用于骨組織修復(fù)。
【權(quán)利要求】
1.一種具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)膠原磷酸化:將盛有3- 4mg/ml鼠尾I型原膠原溶液的透析袋，浸泡于質(zhì)量百分含量為1.25 - 2.5%的三聚磷酸鈉溶液中5 - lOmin，使膠原磷酸化； (2)無定型磷酸鈣(ACP)的制備:將0.5g -1g I型白色硅酸鹽水門汀浸泡于30 —40ml含0.5 — lmg/ml聚丙烯酸的人工模擬體液中，于37 V反應(yīng)I 一 2d，得到含有大小為45-50nm的納米無定型磷酸?丐的溶液； (3)膠原的纖維化及再礦化:將步驟(1)得到的磷酸化的膠原置于步驟(2)得到的含ACP的溶液中，膠原質(zhì)量與溶液體積比例為0.5-lmg:lml, 5 - 7d后，磷酸化的膠原將誘導(dǎo)納米無定型磷酸鈣在膠原纖維內(nèi)的有序排列與成核，形成具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的礦化膠原； (4)三維礦化膠原支架的合成:將步驟(3)得到的礦化膠原于0.1M磷酸緩沖液中透析30min，之后置于4°C，3000 — 5000g離心5 — lOmin，去掉上清液，向沉淀中加入適量的0.1M磷酸緩沖液，充分混勻后制備成懸濁液，倒入24孔板，于-25~-40°C冷凍24 — 48h，并凍干形成三維的疏松的多孔礦化膠原支架；再使用含有1- (3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺及N-羥基丁二酰亞胺的混合液交聯(lián)4 一 24h，采用甘氨酸溶液與雙蒸水交替沖洗，凍干，即得到孔徑為80 — 300 μ m的，具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的人工模擬體液，其溶質(zhì)組成如下:136.8mM NaCl, 4.2mM NaHCO3, 3.0mM KCl，1.0mMK2HPO4.3H20,1.5mM MgCl2.6H20,2.5mM CaCl2,0.5mM Na2SO4 以及 3.08mMNa3N，溶劑為水，用 HCl 和 NaOH 溶液調(diào)節(jié) ρΗ=7.0。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中向沉淀中加入的0.1M磷酸緩沖液的體積為沉淀體積的1/20 - 1/10。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中，所述的混合液按照以下方法制備得到:使用摩爾濃度為0.3mol/L的1- (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺溶液及摩爾濃度為0.06mol/L的N-羥基丁二酰亞胺溶液按照體積比=I:1配制。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中所述的甘氨酸溶液的質(zhì)量百分濃度為1%。
6.由權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法制備得到的具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架。
7.權(quán)利要求6所述的具嚴(yán)格等級結(jié)構(gòu)的三維礦化膠原支架在制備骨組織修復(fù)材料中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61L27/24GK103536965SQ201310449456
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】劉燕, 周彥恒, 劉帥, 付玉 申請人:北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院