Pten基因過表達(dá)重組腺病毒載體的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種PTEN基因的mRNA，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明還提供了PTEN基因過表達(dá)重組腺病毒載體，是在腺病毒載體的多克隆位點(diǎn)插入有上述PTEN基因的mRNA。本發(fā)明還提供了上述過表達(dá)載體的構(gòu)建方法和用途。本發(fā)明構(gòu)建的PTEN基因過表達(dá)重組腺病毒載體可引起PTEN基因的過量表達(dá)，既可以促進(jìn)脂肪酸的氧化代謝，又能有效地增加決定VLDL組裝與分泌，進(jìn)而增強(qiáng)甘油三酯的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，可用于治療奶牛脂肪肝。
【專利說明】PTEN基因過表達(dá)重組腺病毒載體的構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動物分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，涉及一種PTEN基因過表達(dá)重組腺病毒載體的構(gòu)建及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]圍產(chǎn)期奶牛脂肪肝是因圍產(chǎn)期奶牛能量負(fù)平衡導(dǎo)致的代謝性疾病，但因沒有有效的防治措施給養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大的損失，尋找一種有效的治療方法迫在眉睫。鑒于圍產(chǎn)期奶牛(特別是荷斯坦品種奶牛)肝臟氧化脂肪酸的能力弱，合成和分泌脂蛋白能力不足是脂肪肝發(fā)生的主要環(huán)節(jié)，建立調(diào)控肝臟脂肪酸氧化和VLDL分泌與合成的基因療法，或許能為圍產(chǎn)期奶牛脂肪肝的防治提供新思路。
[0003]憐酸酶張力蛋白同系物(Phosphoatase and tensin homolog, PTEN)是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙重特性磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，通過對細(xì)胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)性調(diào)控，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對維持細(xì)胞的正常生理活動發(fā)揮重要作用。PTEN的抑癌功能一直是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的研究熱點(diǎn)。然而，近來越來越多的研究發(fā)現(xiàn):PTEN通過其脂質(zhì)磷酸酶、蛋白磷酸酶及其不依賴于磷酸酶的生物活性，在脂肪肝臟的發(fā)生和發(fā)展方面發(fā)揮著重要的作用。
[0004]最近幾年，對PTEN基因及其蛋白的研究已經(jīng)延伸至其他領(lǐng)域，而不再僅僅局限于腫瘤。肝臟是機(jī)體內(nèi)重要的新陳代謝器官，在正常機(jī)體內(nèi)，PTEN基因及其蛋白有相對較高的表達(dá)。PTEN基因及其蛋白的異常表達(dá)除了會在肝細(xì)胞癌中出現(xiàn)，也在其他肝臟疾病發(fā)生的重要調(diào)節(jié)。
[0005]分子生物學(xué)技術(shù)，在研究生物學(xué)功能和疾病治療等方面發(fā)揮著重要的作用。目前存在腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒 等基因傳遞載體系統(tǒng)，每種載體都有它特有的優(yōu)勢和缺點(diǎn)。腺病毒對大多數(shù)細(xì)胞，包括分裂和不分裂細(xì)胞及原代細(xì)胞都具有感染效率，感染效率幾乎能達(dá)到100%，同時它攜帶進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)的基因不會不整合到宿主細(xì)胞，不干擾宿主細(xì)胞基因的表達(dá)。但腺病毒也具有自身的缺點(diǎn)，主要是進(jìn)行重組腺病毒的構(gòu)建和包裝步驟比較繁瑣，要求的也比較高，操作起來較其他兩種載體系統(tǒng)要復(fù)雜的多。而逆轉(zhuǎn)錄病毒與腺病毒相比，對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率要差的很多，對大多數(shù)細(xì)胞種類的的感染效率都比較低，一般都不超過30%，從而影響實(shí)驗(yàn)效果，尤其是本實(shí)驗(yàn)使用的原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果會更差。同時慢病毒的轉(zhuǎn)染效率還依賴細(xì)胞的分裂，而本實(shí)驗(yàn)的肝細(xì)胞是原代的并且沒有分裂功能，所以更加不適用。另外逆轉(zhuǎn)錄病毒載體也有自身的缺點(diǎn)，主要是它會將轉(zhuǎn)入的外源性基因整合到宿主細(xì)胞的基因組上，引起宿主細(xì)胞內(nèi)的基因突變、甚至有激活癌基因的風(fēng)險(xiǎn)，一旦發(fā)生突變可能會對宿主細(xì)胞造成極大的破壞和損傷。但從它的構(gòu)建及包裝來說，要比腺病毒操作程序要簡單很多，易于操作。第三種載體傳遞系統(tǒng)慢病毒也是實(shí)驗(yàn)研究中常用的一種基因載體傳遞系統(tǒng)，就轉(zhuǎn)染效率而言，基本介于腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體傳遞系統(tǒng)之間，感染效率能夠達(dá)到30%以上。但慢病毒載體傳遞系統(tǒng)的缺點(diǎn)與逆轉(zhuǎn)錄病毒相類似，它也能將轉(zhuǎn)入的外源性基因整合到宿主細(xì)胞基因組上，對宿主細(xì)胞基因表達(dá)具有一定的風(fēng)險(xiǎn)，可能會造成基因突變、癌變等。但慢病毒傳遞系統(tǒng)的構(gòu)建和包裝步驟不是很繁瑣，易于操作。
[0006]腺病毒是一種無包膜雙鏈DNA的動物病毒。基因組大小約為36kb，常用于研究DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和作為基因工程載體。上世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)了腺病毒，一共有100余種血清型。能感染多種組織和器官，包括肝臟、尿道和膀胱、呼吸道、胃腸道和眼等。腺病毒感染細(xì)胞的過程是從腺病毒纖毛的頭節(jié)區(qū)粘附到細(xì)胞表面的特異性受體開始的，與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞相比，腺病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核的效率要高出很多，一般可以達(dá)到40%以上，尤其是進(jìn)入細(xì)胞核的效率是脂質(zhì)體的1000倍。
[0007]腺病毒載體可廣泛的用于哺乳動物的基因表達(dá)，在很多組織中都能表達(dá)重組蛋白，被廣泛的應(yīng)用于體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因治療和體內(nèi)接種疫苗等各個領(lǐng)域。腺病毒對許多哺乳動物細(xì)胞都比較易感，能夠轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類也比較多，無論是細(xì)胞系，還是原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞，亦或是常規(guī)轉(zhuǎn)染試劑難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型，腺病毒都能夠很好轉(zhuǎn)染效率，與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比，具有瞬時轉(zhuǎn)染基因轉(zhuǎn)移效率更高的優(yōu)點(diǎn)。同時腺病毒系統(tǒng)具有高效、安全、生產(chǎn)周期短、病毒滴度高、易于濃縮及貯存等優(yōu)點(diǎn)。因此，可以考慮將PTEN基因的mRNA構(gòu)建入腺病毒載體，用于目的基因的過表達(dá)，研究PTEN基因在奶牛脂肪肝中所起的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種PTEN基因的mRNA，用于構(gòu)建過表達(dá)重組腺病毒載體。
[0009]本發(fā)明的第二個目的是提供PTEN基因過表達(dá)重組腺病毒載體，能夠使得目的基因過表達(dá)。
[0010]本發(fā)明的第三個目的是提供上述PTEN基因過表達(dá)重組腺病毒載體的構(gòu)建方法。
[0011]本發(fā)明的第四個目的是提供上述PTEN基因過表達(dá)重組腺病毒載體的用途。
[0012]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0013]一、一種PTEN基因的mRNA，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0014]二、一種PTEN基因過表達(dá)重組腺病毒載體,是在腺病毒載體的多克隆位點(diǎn)插入有上述PTEN基因的mRNA。
[0015]三、上述的PTEN基因過表達(dá)重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，該方法包括以下步驟:
[0016](I)PTEN基因cDNA的獲取以及逆轉(zhuǎn)錄成mRNA ；
[0017](2)將目的片段PTEN構(gòu)建入穿梭質(zhì)粒載體中；
[0018](3)將目的片段PTEN構(gòu)建入腺病毒質(zhì)粒載體中。
[0019]四、上述的PTEN基因過表達(dá)重組腺病毒載體在治療奶牛脂肪肝中的應(yīng)用。
[0020]采用上述技術(shù)方案的積極效果:本發(fā)明構(gòu)建的PTEN基因過表達(dá)重組腺病毒載體可引起PTEN基因的過量表達(dá)，既可以促進(jìn)脂肪酸的氧化代謝，又能有效地增加決定VLDL組裝與分泌，進(jìn)而增強(qiáng)甘油三酯的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，可用于治療奶牛脂肪肝。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是PTEN基因PCR結(jié)果圖
[0022]圖中，M:DL2000 ;1:PTEN ;
[0023]圖2是重組穿梭質(zhì)粒pShuttIe-GFP-PTEN酶切鑒定結(jié)果圖；[0024]圖中，M:Marker (lkb DNA ladder);從上到下是:IOkb, 8kb, 6kb, 5kb, 4kb, 3.5kb, 3kb, 2.5k, 2kb, 1.5kb, lkb, 750bp, 500bp, 250bp ;1_3:陽性克隆
[0025]圖3是重組腺病毒質(zhì)粒pAdxs1-GFP-PTEN酶切鑒定結(jié)果圖；
[0026]圖中，M:Marker (lkb DNA ladder)從上到下是:IOkb, 8kb, 6kb, 5kb, 4kb, 3.5kb, 3k
b,2.5k, 2kb, 1.5kb, lkb, 750bp, 500bp, 250bp ;1_3.陽性克??；
[0027]圖4是轉(zhuǎn)染pAdxs1-GFP-PTEN48h后PTEN mRNA相對表達(dá)量熒光定量PCR結(jié)果?！揪唧w實(shí)施方式】
[0028]下面通過實(shí)施例和試驗(yàn)例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制:
[0029]本發(fā)明中的生物材料來源:
[0030]1、pGPU6/GFP/Neo購自上海吉瑪生物有限公司，pShutt I e_CMV_EGFP重組穿梭載體、pAdxsi載體購自諾賽基因組研究中心有限公司；
[0031]2、引物為自行設(shè)計(jì)并委托上海生工合成。
[0032]實(shí)施例1
[0033]根據(jù)Genbank公布的PTEN基因mRNA序列，設(shè)計(jì)并合成熒光定量PCR引物，送上海生工合成。引物具體序列為:F:AAGCTTATGAGAGACGGCGGCGG (SEQ ID N0.2) ；R:GGATCCTCAGACTTTTGTAATTTGTGTATGC (SEQ ID N0.3)。
[0034]采用肝穿刺的方法采取少量奶牛肝臟組織，快速放入液氮中，用于總RAN的提取。使用TRIZOL法提取肝臟組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0035]以cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)體系為10XPCR Buffer2.5 μ L，dNTP Mixture2.0μ L，模板 cDNA2.0 μ L，上游引物(10 μ M/μ L) 1.0 μ L，下游引物(10 μ M/μ L) 1.0 μ L, TaKaRa Ex Taq (5U/ μ L) 0.25 μ L, dd Η2016.25 μ L,總體積 25.0 μ L。
[0036]PCR 反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 30s，30個循環(huán)；72°C延伸IOmin。
[0037]取3 μ L PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。
[0038]按照膠回收試劑盒說明書操作，具體過程此處略。將回收的DNA貯存_20°C備用。目的基因的鏈接轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取及測序按常規(guī)方法進(jìn)行。構(gòu)建成功后，送上海生物工程有限公司測序鑒定。對PTEN基因質(zhì)粒進(jìn)行了 PCR鑒定，鑒定結(jié)果見圖1。
[0039]實(shí)施例2
[0040]本實(shí)施例說明重組穿梭載體的構(gòu)建。
[0041]用內(nèi)切酶EcoRV/Sall酶切(CIP去磷酸化處理)pShuttle-CMV-EGFP重組穿梭載體，1%凝膠電泳后切膠分別回收約5.1Kb載體目的基因片段，因?yàn)樽贤饩€照射過久可能會損傷DNA，所以本步驟不存電泳圖。具體酶切體系及反應(yīng)條件見表1。
[0042]表1穿梭質(zhì)粒酶切體系及反應(yīng)條件
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種PTEN基因的mRNA，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.—種PTEN基因過表達(dá)重組腺病毒載體,是在腺病毒載體的多克隆位點(diǎn)插入有權(quán)利要求I所述的PTEN基因的mRNA。
3.權(quán)利要求2所述的PTEN基因過表達(dá)重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: (1)PTEN基因cDNA的獲取以及逆轉(zhuǎn)錄成mRNA ； (2)將目的片段PTEN構(gòu)建入穿梭質(zhì)粒載體中； (3)將目的片段PTEN構(gòu)建入腺病毒質(zhì)粒載體中。
4.權(quán)利要求2 所述的PTEN基因過表達(dá)重組腺病毒載體在治療奶牛脂肪肝中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P1/16GK103468725SQ201310449340
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】付世新, 羅春海, 賀顯晶, 沈冰蕾, 郭景茹 申請人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)