一種內(nèi)源性洋地黃樣因子抑制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種內(nèi)源性洋地黃樣因子抑制劑，本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種名為“酮康唑”的臨床常見(jiàn)藥物作為內(nèi)源性洋地黃樣因子的抑制劑，為早癇的治療開(kāi)辟了一條新的道路，本發(fā)明更深遠(yuǎn)的意義在于，酮康唑?qū)?nèi)源性洋地黃樣因子抑制作用的確定，為進(jìn)一步研究該因子在體內(nèi)的合成途徑，進(jìn)而對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的測(cè)定奠定了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】—種內(nèi)源性洋地黃樣因子抑制劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)療器械【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是一種內(nèi)源性洋地黃樣因子抑制劑。
【背景技術(shù)】
[0002]孕期先兆子癇(孕期早癇)是一種病發(fā)原因復(fù)雜的綜合征，如果不及時(shí)治療，可發(fā)展為子癇，危及生命。主要癥狀有高血壓、蛋白尿，水腫，驚厥，腎功能損傷等，已成為世界上孕婦致死率最高的一種疾病，目前具體病因不明。有研究證明，胎盤(pán)產(chǎn)生的一種導(dǎo)致易感婦女母體血管內(nèi)皮功能障礙的物質(zhì)可能是早癇病發(fā)的其中一個(gè)原因。血壓升高是該疾病最明顯的標(biāo)志，同時(shí)造成對(duì)產(chǎn)婦內(nèi)皮，腎臟和肝臟的損害。
[0003]先兆子癇(早癇)在全球孕婦中發(fā)病率為6_8%，通常發(fā)病于妊娠二期晚期或妊娠三期，大部分在孕期32周之后發(fā)病(32周前發(fā)病被認(rèn)為是早期發(fā)病)，極少數(shù)孕婦會(huì)在孕期20周發(fā)病。初次懷孕的孕婦發(fā)病率最高，并且隨著妊娠次數(shù)的增加，該疾病發(fā)病率大幅度降低。早癇多發(fā)于具有高血壓史，糖尿病史，肥胖癥史，自身免疫性疾病史如狼瘡，和多胎妊娠(雙胞胎或多胞胎)的孕婦中，其發(fā)病過(guò)程因人而異，大多數(shù)病例可以在分娩前被確診，少數(shù)病例在分娩后六周才被確診，稱為“產(chǎn)后早癇”。早癇確診后，可以采用靜脈點(diǎn)滴硫酸鎂防止發(fā)生抽搐，和服用降壓藥降血壓等方式緩解癥狀，但除了剖腹產(chǎn)或引產(chǎn)手術(shù)，沒(méi)有其他的根治方式。早癇是最常見(jiàn)的的妊娠綜合癥，同時(shí)影響母親和胎兒，導(dǎo)致早產(chǎn)兒甚至對(duì)母嬰造成生命危險(xiǎn)。
[0004]在早癇病人的癥狀中，一種鈉鉀泵抑制因子-內(nèi)源性洋地黃樣因子(endogenousdigitalis-like factor, EDLF)水平的升高,是早癇的重要標(biāo)志。這種因子含量過(guò)高能夠?qū)е卵獕荷吆湍I功能損傷。該因子存在于人體和動(dòng)物組織及體液中，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性與植物洋地黃中提取的類固醇強(qiáng)心劑相似，故名“洋地黃樣因子”，該因子能夠以與地高辛等強(qiáng)心劑類似的機(jī)制結(jié)合到鈉鉀泵上，并抑制其活性，但目前為止，此類因子的具體化學(xué)結(jié)構(gòu)仍然未知。許多高 血壓病癥均發(fā)現(xiàn)伴隨內(nèi)源性洋地黃樣因子水平的升高，因此，該因子很可能是造成高血壓的原因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種方便易得有效的該因子抑制劑，為后續(xù)治療提供有利依托。
[0006]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下:
[0007]酮康唑作為抑制內(nèi)源性洋地黃樣因子的應(yīng)用。
[0008]酮康唑作為制備抑制內(nèi)源性洋地黃樣因子藥物的應(yīng)用。
[0009]酮康唑作為制備抑制內(nèi)源性洋地黃樣因子引起相關(guān)疾病的藥物的應(yīng)用。
[0010]而且，所述相關(guān)疾病包括孕期先兆子癇和高血壓。
[0011]酮康唑作為制備抑制內(nèi)源性洋地黃樣因子藥物的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:[0013]1、本發(fā)明提供了一種方便有效易得的內(nèi)源性洋地黃樣因子抑制劑，能很大程度降低內(nèi)源性洋地黃樣因子在早癇患者體內(nèi)的濃度，解決了長(zhǎng)期以來(lái)早癇治療的重大困難。
[0014]2、本發(fā)明提供了一種研究?jī)?nèi)源性洋地黃樣因子化學(xué)結(jié)構(gòu)的新角度，為進(jìn)一步對(duì)該因子的致病機(jī)制、體內(nèi)合成途徑、調(diào)節(jié)機(jī)制的研究打下良好基礎(chǔ)，并使孕期早癇的病理研究工作向前邁進(jìn)了一大步。
[0015]3、本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種名為“酮康唑”的臨床常見(jiàn)藥物作為內(nèi)源性洋地黃樣因子的抑制劑，為早癇的治療開(kāi)辟了一條新的道路，本發(fā)明更深遠(yuǎn)的意義在于，酮康唑?qū)?nèi)源性洋地黃樣因子抑制作用的確定，為進(jìn)一步研究該因子在體內(nèi)的合成途徑，進(jìn)而對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的測(cè)定奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為隨著組織培養(yǎng)時(shí)間的累積，測(cè)出人胎盤(pán)分泌的內(nèi)源性洋地黃樣因子含量逐步增加。其中，橫坐標(biāo)代表培養(yǎng)時(shí)間，單位小時(shí)；縱坐標(biāo)代表內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度，單位10_8摩/升。
[0017]圖2為加入酮康唑的人體胎盤(pán)分泌的內(nèi)源性洋地黃樣因子含量隨培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)而逐漸降低。其中，橫坐標(biāo)代表培養(yǎng)時(shí)間，單位小時(shí)；縱坐標(biāo)代表內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度，單位10_8摩/升。
[0018]圖3為經(jīng)過(guò)24小時(shí)培養(yǎng)時(shí)間，酮康唑?qū)μケP(pán)分泌的內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度的抑制作用。其中，橫坐標(biāo)代表胎盤(pán)組織培養(yǎng)液中加入的酮康唑溶液濃度，單位微摩/升，縱坐標(biāo)代表內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度，單位納摩/升。
[0019]圖4為經(jīng)過(guò)48小時(shí)培養(yǎng)時(shí)間，酮康唑?qū)μケP(pán)分泌的內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度的抑制作用。其中，橫坐標(biāo)代表胎盤(pán)組織培養(yǎng)液中加入的酮康唑溶液濃度，單位微摩/升，縱坐標(biāo)代表內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度，單位納摩/升。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0021]酮康唑是一種已知的體內(nèi)類固醇合成抑制劑，它通過(guò)廣泛抑制類固醇合成途徑中幾種酶(細(xì)胞色素P-450-依賴酶家族)的活性來(lái)抑制該途徑，因此，通過(guò)其對(duì)內(nèi)源性洋地黃樣因子合成的抑制作用，可以推斷出該因子在體內(nèi)的合成途徑與類固醇合成途徑相似，該因子與類固醇有相似結(jié)構(gòu)，這個(gè)發(fā)現(xiàn)對(duì)于解決長(zhǎng)期以來(lái)研究該因子的最大困難，即由于其在體內(nèi)含量非常低而無(wú)法將其分離，進(jìn)而確定其結(jié)構(gòu)有突破性的幫助。
[0022]本發(fā)明所述的一抗地高辛抗體購(gòu)自GlaxoSmithKline (又名抗地高辛抗體)、二抗鼠抗羊 IgG 均購(gòu)自 JacksonlmmunoResearchLaboratories, Inc、3H 標(biāo)記烏本苷購(gòu)自PerkinElmer、聚乙二醇4000購(gòu)自Calbiochem、pH=7.4的憐酸緩沖液(PBS緩沖液)自配、3H閃爍液購(gòu)自NationalDiagnostics、烏本苷購(gòu)自Sigma、pH=7.4的三輕甲基氨基甲燒緩沖液(Tris緩沖液)購(gòu)自Sigma, DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自Gibson,酮康唑購(gòu)自Sigma。
[0023]本發(fā)明所述的方法 需要可以測(cè)量3H放射性的儀器設(shè)備進(jìn)行測(cè)量。(設(shè)備名為scintiIIationcounterο任何做放射性實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室都有,操作過(guò)程為把樣品放進(jìn)去,運(yùn)行操作軟件，直接出結(jié)果。)
[0024]實(shí)施例1:
[0025]測(cè)量胎盤(pán)組織分泌的內(nèi)源性洋地黃樣因子含量隨時(shí)間變化
[0026]⑴采集分娩時(shí)間少于6小時(shí)的新鮮人胎盤(pán)；
[0027]⑵撥開(kāi)羊膜，取5mmX5mmX5mm大小的組織塊4_5塊，放入PBS中洗掉殘留血液；
[0028]⑶將組織塊剪成微粒，去除肉眼可見(jiàn)血塊和血管，用PBS洗至無(wú)血液殘留，在無(wú)菌濾紙上吸干PBS，放入DMEM培養(yǎng)液中，37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0029]⑷經(jīng)過(guò)12，24，36，48小時(shí)，分別收集培養(yǎng)液，離心去除殘留組織塊，4°C保存；
[0030](5)取出試劑盒中地高辛抗體、二抗、3H標(biāo)記烏本苷，分別取100微升，與100微升待測(cè)樣品充分混合，室溫孵育；
[0031](6)再加入400微升PEG4000溶液，離心，得到沉淀物；
[0032](7)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重懸，加入4毫升3H閃爍液；
[0033](8)測(cè)量樣品放射量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中所含內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度。
[0034]結(jié)果如圖1所示，胎盤(pán)分泌的內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)而升聞。
[0035]實(shí)施例2:.
[0036]測(cè)量酮康唑?qū)μケP(pán)組織分泌的內(nèi)源性洋地黃樣因子含量隨時(shí)間的影響
[0037]⑴采集分娩時(shí)間少于6小時(shí)的新鮮人胎盤(pán)；
[0038]⑵撥開(kāi)羊膜，取5mmX5mmX5mm大小的組織塊4_5塊，放入PBS中洗掉殘留血液；
[0039]⑶將組織塊剪成微粒，去除肉眼可見(jiàn)血塊和血管，用PBS洗至無(wú)血液殘留，在無(wú)菌濾紙上吸干PBS，放入DMEM培養(yǎng)液中，
[0040]⑷在組織培養(yǎng)液中加入20微摩/升的酮康唑溶液，混合均勻，放入37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0041](5)經(jīng)過(guò)12，24，36，48小時(shí)，分別收集培養(yǎng)液，離心去除殘留組織塊，4°C保存；
[0042](6)取出試劑盒中地高辛抗體、二抗、3H標(biāo)記烏本苷，分別取100微升，與100微升待測(cè)樣品充分混合，室溫孵育；
[0043](7)再加入400微升PEG4000溶液，離心，得到沉淀物；
[0044](8)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重懸，加入4毫升3H閃爍液；
[0045]⑶測(cè)量樣品放射量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中所含內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度。
[0046]結(jié)果如圖2所示，酮康唑的加入抑制了圖1所示胎盤(pán)分泌內(nèi)源性洋地黃樣因子含量隨時(shí)間的累積。
[0047]實(shí)施例3:
[0048]測(cè)量酮康唑?qū)μケP(pán)組織分泌的內(nèi)源性洋地黃樣因子含量的影響
[0049]⑴采集分娩時(shí)間少于6小時(shí)的新鮮人胎盤(pán)；
[0050]⑵撥開(kāi)羊膜，取5mmX5mmX5mm大小的組織塊4_5塊，放入PBS中洗掉殘留血液；[0051 ] ⑶將組織塊剪成微粒，去除肉眼可見(jiàn)血塊和血管，用PBS洗至無(wú)血液殘留，在無(wú)菌濾紙上吸干PBS，放入DMEM培養(yǎng)液中，
[0052] ⑷在組織培養(yǎng)液中分別加入I微摩/升，2微摩/升，5微摩/升，10微摩/升和20微摩/升的酮康唑溶液，混合均勻，放入37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24或48小時(shí)；[0053](5)收集培養(yǎng)液，離心去除殘留組織塊，4°C保存；
[0054](6)取出試劑盒中地高辛抗體、二抗、3H標(biāo)記烏本苷，分別取100微升，與100微升待測(cè)樣品充分混合，室溫孵育；
[0055](7)再加入400微升PEG4000溶液，離心，得到沉淀物；
[0056](8)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重懸，加入4毫升3H閃爍液；
[0057](9)測(cè)量樣品放射量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中所含內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度。
[0058]結(jié)果如圖3，4所示，酮康唑可以極大減少內(nèi)源性洋地黃樣因子在胎盤(pán)中的分泌量，這種抑制作用隨著酮康唑用量的增加而變大，并且48小時(shí)培養(yǎng)時(shí)間的抑制率比24小時(shí)培養(yǎng)時(shí)間的抑制率要高，充分 說(shuō)明酮康唑在胎盤(pán)中抑制了該因子的合成分泌。
【權(quán)利要求】
1.酮康唑作為抑制內(nèi)源性洋地黃樣因子的應(yīng)用。
2.酮康唑作為制備抑制內(nèi)源性洋地黃樣因子藥物的應(yīng)用。
3.酮康唑作為制備抑制內(nèi)源性洋地黃樣因子引起相關(guān)疾病的藥物的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酮康唑作為制備抑制內(nèi)源性洋地黃樣因子引起相關(guān)疾病的藥物的應(yīng)用，其特征在于:所述相關(guān)疾病包括孕期先兆子癇和高血壓。
5.酮康唑作為制備抑 制內(nèi)源性洋地黃樣因子藥物的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/496GK103432135SQ201310404027
【公開(kāi)日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】馬潔, 劉小兵, 張慕軍 申請(qǐng)人:天津市康婷生物工程有限公司