本發(fā)明涉及CD146作為預(yù)防和/或治療缺血性眼部疾病的藥物靶點的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
缺血可引起多種代謝物質(zhì)的缺乏，但最為緊急、損害最重的病變是由缺氧所致。在絕大多數(shù)情況下，缺血性病變的核心為缺氧性損害。大量研究報道，視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜缺血、缺氧是缺血性眼部疾病的重要驅(qū)動因素，是導(dǎo)致視力下降和喪失的重要原因(1,2)。常見的該類眼部疾病包括早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（retinopathyofprematurity,ROP）、年齡相關(guān)性黃斑病變（age-relatedmaculardegeneration,AMD）、糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabeticretinopathy,DR）、新生血管性青光眼（neovascularglaucoma,NVG）等。上述疾病在全球發(fā)病率呈上升趨勢，是兒童、成年人和老年人各年齡段致盲的首要原因(3-6)。氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變小鼠和大鼠模型（OIR）是經(jīng)典的缺血性眼部疾病的動物模型。OIR模型誘導(dǎo)過程中，鼠眼睛組織內(nèi)的缺血缺氧導(dǎo)致眼底血管異常成簇狀生長，血管迂曲、擴張和滲漏。這些缺血性眼部病變會導(dǎo)致眼底出血、視力模糊和視野缺失等臨床癥狀。（2，7）CD146是一種細(xì)胞粘附分子，CD146是I型膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族。1.DorrellM,Uusitalo-JarvinenH,AguilarE,FriedlanderM.2007.Ocularneovascularization:basicmechanismsandtherapeuticadvances.SurvOphthalmol52Suppl1:S3-19.2.SapiehaP,JoyalJS,RiveraJC,Kermorvant-DucheminE,SennlaubF,HardyP,LachapelleP,ChemtobS.2010.Retinopathyofprematurity:understandingischemicretinalvasculopathiesatanextremeoflife.JClinInvest120:3022-3032.3.GilbertC.2008.Retinopathyofprematurity:aglobalperspectiveoftheepidemics,populationofbabiesatriskandimplicationsforcontrol.EarlyHumDev84:77-82.4.XuJ,WeiWB,YuanMX,YuanSY,WanG,ZhengYY,LiYB,WangS,XuL,FuHJ,ZhuLX,PuXL,ZhangJD,DuXP,LiYL,JiY,GuXN,LiY,PanSF,CuiXL,BaiW,ChenYJ,WangZM,ZhuQS,GaoY,LiudeY,JiYT,YangZ,JonasJB.2012.Prevalenceandriskfactorsfordiabeticretinopathy:theBeijingCommunitiesDiabetesStudy6.Retina32:322-329.5.CheungCM,TaiES,KawasakiR,TayWT,LeeJL,HamzahH,WongTY.2012.Prevalenceofandriskfactorsforage-relatedmaculardegenerationinamultiethnicAsiancohort.ArchOphthalmol130:480-486.6.OlmosLC,LeeRK.2011.Medicalandsurgicaltreatmentofneovascularglaucoma.IntOphthalmolClin51:27-36.7.GrossniklausHE,KangSJ,BerglinL.2010.Animalmodelsofchoroidalandretinalneovascularization.ProgRetinEyeRes29:500-519.

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種CD146作為靶點在制備預(yù)防和/或治療缺血性眼部疾病的藥物中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述缺血性眼部疾病可為早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑病變或新生血管性青光眼。上述應(yīng)用中，所述缺血性眼部疾病可為缺血性眼底病變。上述應(yīng)用中，所述缺血性眼底病變可為視網(wǎng)膜病變或脈絡(luò)膜病變。上述應(yīng)用中，所述視網(wǎng)膜病變可為視網(wǎng)膜血管迂曲擴張或視網(wǎng)膜血管滲漏或視網(wǎng)膜出血。上述應(yīng)用中，所述視網(wǎng)膜病變可為視網(wǎng)膜血管新生或視網(wǎng)膜血管從視網(wǎng)膜遷移到玻璃體腔。上述應(yīng)用中，所述脈絡(luò)膜病變可為脈絡(luò)膜血管迂曲擴張或脈絡(luò)膜血管滲漏或脈絡(luò)膜出血。上述應(yīng)用中，所述脈絡(luò)膜病變可為脈絡(luò)膜血管新生。本發(fā)明首次提出CD146是缺血性眼部疾病的藥物靶點。實驗證明，CD146在患有缺血性眼部疾病小鼠的視網(wǎng)膜中過度表達；而CD146被特異性敲除后能夠顯著抑制發(fā)病小鼠視網(wǎng)膜血管的迂曲、擴張和滲漏，進而減輕疾病的嚴(yán)重程度?？笴D146的抗體AA98及抑制其表達的microRNAmiR-329也能有效預(yù)防和治療缺血性眼部疾病。AA98或miR-329能夠減輕發(fā)病鼠的視網(wǎng)膜血管迂曲擴張、滲漏以及血管呈簇狀異常生長的嚴(yán)重程度,使視網(wǎng)膜形態(tài)與結(jié)構(gòu)正?；?，從而緩解眼底出血、視力模糊和視野缺失等臨床癥狀，并抑制疾病的發(fā)生發(fā)展。這些結(jié)果表明CD146是缺血性眼部疾病的重要治療靶點，對今后的該類疾病的藥物開發(fā)和預(yù)防治療具有重要意義。附圖說明圖1為正常小鼠和OIR模型小鼠的視網(wǎng)膜表型，顯示OIR小鼠模型構(gòu)建成功。圖2為在OIR小鼠的視網(wǎng)膜中，CD146的mRNA表達顯著上調(diào)。圖3為在OIR小鼠的視網(wǎng)膜中，CD146的蛋白表達顯著上調(diào)。圖4為CD146基因特異性敲除后能夠明顯減輕OIR小鼠的發(fā)病程度。圖5為miR-329基因治療顯著抑制OIR小鼠視網(wǎng)膜血管的迂曲、擴張和出血。圖6為miR-329基因治療能夠抑制OIR小鼠視網(wǎng)膜中CD146的過度表達。圖7為抗CD146抗體AA98能夠預(yù)防OIR小鼠疾病的發(fā)生發(fā)展。圖8為抗CD146抗體AA98治療能夠顯著減輕OIR小鼠的發(fā)病程度。圖9為抗CD146抗體AA98能夠特異性識別CD146。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中進行的視網(wǎng)膜熒光鋪片實驗均按照如下步驟進行：1、將小鼠麻醉，左心室心臟灌流600μl50mg/ml的FITC熒光標(biāo)記的dextran，此時小鼠的全身血管都灌注有熒光分子。2、將小鼠的眼睛剝離，4%多聚甲醛固定1小時。3、剝離視網(wǎng)膜，并用剪刀剪成四葉草狀。用體式熒光顯微鏡觀察并拍照。實施例1、CD146在患有缺血性眼部疾病的小鼠視網(wǎng)膜上過度表達一、構(gòu)建OIR小鼠模型我們以氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變小鼠（OIR小鼠）為缺血性眼部疾病的動物模型。將出生后第7天的C57BL/6J乳鼠（P7）和母鼠放入含75%氧氣的高氧培養(yǎng)箱中5天，在第12天（P12）將其從氧箱中取出，放在正常氧氣（21%氧氣）中飼養(yǎng)，造成相對低氧的環(huán)境。在第17天（P17）的乳鼠即為模型鼠。將正常鼠（未經(jīng)任何誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠）和模型鼠進行視網(wǎng)膜熒光鋪片實驗。結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，與正常鼠相比，模型鼠（OIR）的視網(wǎng)膜血管呈現(xiàn)明顯的迂曲、擴張和滲漏，并成血管簇狀異常生長。視網(wǎng)膜血管的熒光滲漏點表示視網(wǎng)膜出血嚴(yán)重。以上視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常表示模型構(gòu)建成功。二、CD146的實時熒光定量PCR將出生后第17天（P17）的模型鼠和正常鼠的視網(wǎng)膜剝離，利用實時熒光定量PCR對CD146進行定量分析。（一）取P17的模型鼠的兩個視網(wǎng)膜為一個樣品，每個樣品加入1mlTrizol，用勻漿器將視網(wǎng)膜打碎，室溫放置5分鐘。同樣取正常鼠的兩個視網(wǎng)膜為一個樣品進行上述處理。（二）將兩個樣品分別移入EP管，每管加入200μl三氯甲烷，用手上下顛倒EP管使管中的液體乳化。（三）將EP管4℃，12000rpm離心15分鐘。（四）分別將上層透明液體轉(zhuǎn)移至新管，加入一倍體積的預(yù)冷異丙醇混勻，-20℃靜置2小時。（五）4℃，12000rpm離心15分鐘，棄上清。（六）將沉淀分別用70%乙醇洗一次并再次離心，得到兩種沉淀，即P17的模型鼠和正常鼠的視網(wǎng)膜RNA。將兩種沉淀晾干。（七）分別加入適量無RNA酶的水溶解RNA。（八）分別取2μgP17的模型鼠和正常鼠的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。（九）利用兩種cDNA進行實時熒光定量PCR（方法按照SYBRgreenPCRmastermix試劑盒的說明書），GAPDH作為表達內(nèi)參。PCR擴增條件：95℃，5分鐘；95℃30s，55℃30s，72℃20s，40個循環(huán)。（十）用2-△△Ct方法進行定量分析。結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，與正常鼠相比，P17模型鼠的視網(wǎng)膜中CD146的mRNA的表達明顯上調(diào)。三、Western-blot檢測CD146蛋白表達量。結(jié)果如圖3所示，顯示p17模型鼠的視網(wǎng)膜中CD146的蛋白的表達明顯上調(diào)。GADPH為表達內(nèi)參。實施例2、CD146基因特異性敲除抑制缺血性眼部疾病的發(fā)生發(fā)展CD146內(nèi)皮特異性敲除小鼠（CD146EC-KO）是將正常C57BL/6J小鼠中的CD146編碼基因敲除得到的小鼠，該小鼠在“DuanH,XingS,LuoY,FengL,GramagliaI,ZhangY,LuD,ZengQ,FanK,FengJ,YangD,QinZ,CouraudPO,RomeroIA,WekslerB,YanX.2013.TargetingendothelialCD146attenuatesneuroinflammationbylimitinglymphocyteextravasationtotheCNS.SciRep3:1687.”中公開過。本實施例中的非敲除小鼠（WT）為野生型的C57BL/6J小鼠，記作正常鼠。一、將CD146特異性敲除小鼠（CD146EC-KO）和非敲除小鼠（WT）均構(gòu)建OIR模型。方法如實施例1的步驟一。二、視網(wǎng)膜熒光鋪片實驗。圖4所示為正常CD146EC-KO、正常WT，OIR-CD146EC-KO和OIR-WT的視網(wǎng)膜表型。結(jié)果表明，與WT小鼠相比，OIR-WT小鼠的視網(wǎng)膜血管呈現(xiàn)明顯的迂曲、擴張和滲漏并成血管簇狀異常生長，視網(wǎng)膜出血嚴(yán)重。與OIR-WT小鼠相比，OIR-CD146EC-KO小鼠視網(wǎng)膜血管迂曲、擴張、滲漏和異常成簇狀生長的嚴(yán)重程度明顯減輕，視網(wǎng)膜出血癥狀也減輕，呈現(xiàn)較好的視網(wǎng)膜形態(tài)。上述實驗表明，CD146被敲除后能夠有效減緩OIR小鼠疾病的嚴(yán)重程度，揭示CD146在缺血性眼部疾病視網(wǎng)膜中的過度表達能夠促進疾病的發(fā)展。實施例3、miR-329能夠有效治療缺血性眼部疾病一、構(gòu)建OIR小鼠疾病模型：與實施例1中步驟一相同。二、miR-329注射后顯著減輕了OIR小鼠疾病的嚴(yán)重程度在乳鼠出生后第12天，將修飾過的鼠miR-329（5μg/ul，1μl）、對照miRNA（5μg/μl，1μl）或溶劑對照0.9%NaCl（1μl）的水溶液注射到乳鼠眼睛玻璃體腔內(nèi)。在第17天，對乳鼠視網(wǎng)膜進行熒光鋪片分析。小鼠miR-329序列：5’-AACACACCCAGCUAACCUUUUU-3’（SEQIDNo.1）；對照miRNA為線蟲miR-239b，與人、小鼠、大鼠的miRNA具有最小同源性。對照miRNA序列：5’-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3’（SEQIDNo.2）；以下實驗均使用雙鏈的小鼠miR-329和對照miRNA，并分別對其序列進行如下修飾：2’-甲氧基修飾，硫代硫酸骨架修飾和序列5’端連接膽固醇。上述修飾過的小鼠miR-329序列和修飾過的對照miRNA序列均購自廣州銳博生物公司。視網(wǎng)膜熒光鋪片結(jié)果如圖5所示，結(jié)果顯示，與對照miRNA或溶劑對照0.9%NaCl相比，miR-329注射組小鼠的視網(wǎng)膜呈現(xiàn)較好的結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為顯著減少的視網(wǎng)膜血管的迂曲、擴張及視網(wǎng)膜出血點的面積。這種視網(wǎng)膜形態(tài)的正常化，可以緩解眼底出血、視力模糊和視野缺失等臨床癥狀，減輕疾病的發(fā)病程度。三、miR-329注射后抑制體內(nèi)CD146的過度表達檢測視網(wǎng)膜組織中CD146蛋白的相對表達量。結(jié)果如圖6所示，表明miR-329可以顯著抑制OIR小鼠視網(wǎng)膜中CD146的過度表達。綜合以上結(jié)果，抑制CD146表達的miR-329基因治療可以顯著減輕缺血性眼部疾病的嚴(yán)重程度，揭示CD146是該疾病的重要靶點。實施例4、抗CD146抗體預(yù)防和治療缺血性眼部疾病本實施例中使用的抗體AA98見專利“CN1124284C”?？贵w重鏈和輕鏈可變區(qū)的序列分別見專利第2頁和第3頁。一、抗CD146抗體AA98預(yù)防OIR大鼠疾病的發(fā)生發(fā)展（一）構(gòu)建OIR大鼠疾病模型將出生后第7天的SD大鼠乳鼠（P7）和母鼠放入含75%氧氣的高氧培養(yǎng)箱中5天，在第12天（P12）將其從氧箱中取出，放在正常氧氣（21%）中飼養(yǎng)，造成相對低氧的環(huán)境，繼續(xù)飼養(yǎng)。在第18天（P18）的乳鼠即為模型鼠。（二）玻璃體腔注射在乳鼠出生后第7天，將AA98（1μg/μl，1μl），對照mIgG（1μg/μl，1μl）分別注射到乳鼠的左、右眼睛的玻璃體腔內(nèi)，再按照構(gòu)建OIR大鼠模型的構(gòu)建方法進行飼養(yǎng)，即為AA98組實驗鼠和mIgG組實驗鼠。不注射的乳鼠按照OIR大鼠模型的構(gòu)建方法進行飼養(yǎng)，即為模型鼠。在第18天將AA98組、mIgG組、模型鼠和正常鼠，分別剝離眼球進行實驗。（三）視網(wǎng)膜熒光鋪片實驗實驗結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明，與正常鼠相比，模型鼠（OIR）的視網(wǎng)膜血管呈現(xiàn)明顯的迂曲、擴張和滲漏。視網(wǎng)膜血管的熒光滲漏點表示視網(wǎng)膜出血嚴(yán)重。以上視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常表示模型構(gòu)建成功。與mIgG組和模型組相比，AA98注射組顯著減輕了視網(wǎng)膜血管的迂曲、擴張和滲漏，顯著減輕了視網(wǎng)膜出血，使其形態(tài)結(jié)構(gòu)正?；D7中ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ展示了不同拍照視野下小鼠視網(wǎng)膜的表型。這些結(jié)果表明AA98可以有效預(yù)防缺血性眼部疾病的發(fā)生發(fā)展。二、抗CD146抗體AA98治療能夠有效減輕OIR大鼠疾病的嚴(yán)重程度。（一）構(gòu)建OIR大鼠模型：與實驗一中相同。（二）玻璃體腔注射在乳鼠出生后第15天，將1μl1μg/μl的AA98，對照mIgG（1μg/μl，1μl）分別注射到乳鼠的左、右眼睛的玻璃體腔內(nèi)，再將注射后的鼠按照OIR大鼠模型的構(gòu)建方法進行飼養(yǎng)即為AA98組實驗鼠和mIgG組實驗鼠。不注射的乳鼠按照OIR大鼠模型的構(gòu)建方法進行飼養(yǎng)即為模型鼠。在第20天將AA98組、mIgG組、模型鼠和正常鼠，分別剝離眼球進行實驗。（三）視網(wǎng)膜熒光鋪片實驗方法如實施例2的步驟三。實驗結(jié)果如圖8所示。結(jié)果表明，與模型組和mIgG組相比，AA98注射后顯著減輕了視網(wǎng)膜血管的迂曲和擴張，并且減輕了視網(wǎng)膜出血。這種視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的正?；?，可以緩解眼底出血、視力模糊和視野缺失等臨床癥狀，減輕疾病的嚴(yán)重程度。圖8中ⅰ、ⅱ展示了不同拍照視野下小鼠視網(wǎng)膜的表型。這些結(jié)果表明AA98可以有效治療缺血性眼部疾病。三、抗CD146抗體AA98特異性識別CD146用免疫印跡方法檢測抗體AA98對鼠內(nèi)皮瘤細(xì)胞系SEND中CD146的識別。結(jié)果如圖9所示，顯示抗體AA98僅能識別CD146，說明抗體AA98是特異作用于CD146的。圖中，抗CD146的抗體AA7為正對照；二抗交叉為不加一抗，只加二抗的負(fù)對照，排除了AA98對CD146識別的非特異性。綜合以上結(jié)果，進一步確定了以CD146作為靶點可以有效預(yù)防和治療缺血性眼部疾病，CD146是缺血性眼部疾病的一個重要靶點。