本發(fā)明涉及一種結(jié)核亞單位疫苗，具體涉及一種以Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白為抗原成份，以鋁和PolyIC為復(fù)合佐劑的新型亞單位疫苗。

背景技術(shù)：
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種古老而漫長的感染性疾病。近幾年，隨著結(jié)核分枝桿菌多重耐藥性菌株的增多和艾滋病的不斷流行，使結(jié)核病死灰復(fù)燃。結(jié)核病已經(jīng)成為危及全球的公共衛(wèi)生問題。世界衛(wèi)生組織于2012年公布了全球結(jié)核病狀況報(bào)告，報(bào)告中顯示2011年全球有870萬新發(fā)結(jié)核病病例，140多萬結(jié)核病死亡病例。從報(bào)告中可以看出結(jié)核病的發(fā)病、患病和死亡總數(shù)依然很高，造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)很重。我國是世界第二大結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，結(jié)核病患病人數(shù)多，并且每年因結(jié)核病導(dǎo)致的死亡人數(shù)也列于傳染病死亡人數(shù)之首。世界衛(wèi)生組織報(bào)道全球有1/3的人群感染了結(jié)核桿菌，即中國擁有4億多的龐大的結(jié)核桿菌感染者。發(fā)病率高、耐藥率高、因病死亡人數(shù)多、潛伏感染人群數(shù)量龐大，以上情況是中國結(jié)核病的疫情現(xiàn)狀，由此可見中國的結(jié)核病疫情仍十分嚴(yán)重。針對(duì)此種疫情狀況，有效地控制和預(yù)防結(jié)核病的發(fā)生有可能改變結(jié)核病流行現(xiàn)狀。防控結(jié)核病最根本的途徑可能還要依賴有效的結(jié)核病疫苗。到目前為止，卡介苗仍是預(yù)防結(jié)核唯一可用的疫苗。但在世界各國進(jìn)行的數(shù)十次臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，卡介苗對(duì)成人肺結(jié)核的免疫保護(hù)力是0%～80%，對(duì)抑制潛伏期結(jié)核的復(fù)發(fā)毫無作用，因此研制新型結(jié)核疫苗十分必要。新型結(jié)核病疫苗不僅要對(duì)新生兒提供良好的預(yù)防作用，對(duì)于成年人和結(jié)核桿菌潛伏感染者也要起到預(yù)防作用。重組結(jié)核桿菌亞單位疫苗，特別是大腸桿菌中表達(dá)的亞單位疫苗，具有保護(hù)性抗原表位多、表達(dá)效率高、發(fā)酵工藝成熟、生成成本低、易于大規(guī)模生產(chǎn)及廣泛使用和再次使用的特點(diǎn)。并且亞單位疫苗具有較高的安全性、易于被人們接受。但亞單位疫苗的主要缺點(diǎn)是免疫原性弱，往往需要有效的佐劑輔助才能引起理想的免疫應(yīng)答。目前鋁佐劑是應(yīng)用最廣泛的一類疫苗佐劑，但對(duì)于亞單位疫苗誘發(fā)理想的免疫應(yīng)答反應(yīng)效果欠佳。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
基于上述佐劑誘發(fā)免疫應(yīng)答效果欠佳的問題以及對(duì)新型疫苗的迫切需求，本發(fā)明將具有不同特點(diǎn)的結(jié)核桿菌抗原相組合，并添加篩選出的適當(dāng)?shù)淖魟?，制成了含?lián)合佐劑的新型結(jié)合亞單位疫苗。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明選用Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白作為亞單位疫苗的保護(hù)性抗原以及選用鋁和PolyIC作為復(fù)合佐劑。本發(fā)明中的Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白均屬于結(jié)核桿菌保護(hù)性抗原，作為疫苗成分免疫人體后，刺激機(jī)體產(chǎn)生對(duì)這兩種成分的特異性細(xì)胞免疫，當(dāng)有結(jié)核桿菌進(jìn)入或潛伏于人體時(shí)，這種較強(qiáng)的細(xì)胞免疫可以抑制結(jié)核桿菌的增值或促進(jìn)其清除，對(duì)結(jié)核病的預(yù)防起重要作用。本發(fā)明將Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白聯(lián)合使用均能發(fā)揮各自的抗原作用，它們組成的疫苗，適用于結(jié)合桿菌潛伏感染者的治療。在亞單位疫苗中，佐劑是提高免疫活性的重要成分，本發(fā)明篩選出的新型聯(lián)合佐劑為鋁和PolyIC的聯(lián)合佐劑。優(yōu)選，Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10融合蛋白、鋁佐劑和PolyIC佐劑的重量比為1～50:1～50:100～1000:1～100。更優(yōu)選，Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10融合蛋白、鋁佐劑和PolyIC佐劑的重量比為10:10:200:50。在應(yīng)用時(shí)，一個(gè)劑量疫苗中含Ag85b蛋白1～50μg、ESAT6-CFP10融合蛋白1～50μg、鋁佐劑0.1～1mg和PolyIC佐劑1～100μg，優(yōu)選一個(gè)劑量疫苗中含Ag85b蛋白10μg、ESAT6-CFP10融合蛋白10μg、鋁佐劑200μg和PolyIC佐劑50μg。鋁佐劑可以是但不限于氫氧化鋁、磷酸鋁。PolyIC選自聚肌苷酸：聚胞苷酸，聚脫氧肌苷酸：聚胞苷酸，聚肌苷酸：聚脫氧胞苷酸或聚脫氧肌苷酸：聚脫氧胞苷酸。本發(fā)明中的PolyIC是一種高效的干擾素誘生劑，在體內(nèi)可以產(chǎn)生類似病毒感染的免疫反應(yīng)，可誘導(dǎo)CD4+和CD8+T細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，PolyIC在豬體內(nèi)能有效地誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，同時(shí)可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞MHC-II和CD80/CD86的基因表達(dá)以及趨化因子、TLR-5、TLR-9、IL-12和p35的產(chǎn)生，證明其可以有效增強(qiáng)Th1型反應(yīng)。鋁佐劑是目前應(yīng)用最廣泛的一類疫苗佐劑，其安全性已被驗(yàn)證和認(rèn)可，并且具有緩釋作用，對(duì)疫苗的持續(xù)釋放實(shí)現(xiàn)緩釋給藥有幫助，因此本發(fā)明的鋁佐劑可以發(fā)揮上述優(yōu)勢。影響佐劑效果的因素很多，如與其配伍的蛋白種類與蛋白的配比等。本發(fā)明將鋁和PolyIC聯(lián)合Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白使用降低了聯(lián)合佐劑兩者的使用量，其中鋁佐劑的使用量為0.2mg，PolyIC的量僅為50μg，上述劑量均遠(yuǎn)低于通常用量范圍，卻能達(dá)到較顯著的增強(qiáng)免疫的效果，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，本發(fā)明疫苗可減輕Mtb感染豚鼠各臟器的病變程度，并有效抑制或殺死豚鼠體內(nèi)潛伏感染的結(jié)核分枝桿菌。附圖說明圖1，Ag85b蛋白的SDS-PAGE電泳圖；圖2，ESAT6-CFP10融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖；圖3-4，本發(fā)明的結(jié)核亞單位疫苗體內(nèi)Ag85b和ESAT6-CFP10抗原特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞頻率結(jié)果；圖5-6，本發(fā)明的結(jié)核亞單位疫苗體內(nèi)產(chǎn)生抗Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白抗體的結(jié)果；圖7顯示的是攻毒后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組豚鼠臟器綜合病變指數(shù)；圖8顯示的是攻毒后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組豚鼠脾活菌數(shù)（log10）；圖9顯示的是攻毒后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組豚鼠肺活菌數(shù)（log10）。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的修飾或者替換，均屬于本發(fā)明的范疇。實(shí)施例1Ag85b和ESAT6-CFP10兩種抗原的制備1.1、試驗(yàn)方法1）Ag85b基因的擴(kuò)增以及蛋白的純化從Genbank查詢結(jié)核桿菌H37Rv抗原ESAT6和CFP10的核酸和氨基酸序列，根據(jù)目的序列設(shè)計(jì)引物。表1首先以H37Rv全基因組為模板，引物見表1，對(duì)Ag85b在50μLPCR體系中進(jìn)行擴(kuò)增（ddH2O30.5μL、10×Buffer5μL、Taq酶0.5μL、dNTP4μL、上游引物4μL、下游引物4μL、DNA模板2μL）。擴(kuò)增條件為：94℃10min；94℃45s，62.2℃45s，72℃1min，循環(huán)33次；72℃5min。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，進(jìn)行膠回收，獲得目的片段，經(jīng)NdeI和EcoRI雙酶切后在T4DNA連接酶催化下與pET30a克隆表達(dá)載體16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α，37℃培養(yǎng)過夜。挑選菌落于10mLLB培養(yǎng)基擴(kuò)增，提取質(zhì)粒后用上述內(nèi)切酶消化，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定正確后的陽性菌落經(jīng)質(zhì)粒測序進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，并確認(rèn)其基因序列正確。從測序正確的菌落中提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組菌，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組菌，待菌液在600nm光密度（opticaldensity，OD）下的值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其終濃度為0.8mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)4h。離心經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，菌體沉淀用T-E緩沖液（Tris50mmol/L,EDTA2mmol/L）洗滌后重懸，冰浴超聲裂解后離心，棄上清液。沉淀用4mol/L的T-E緩沖液重懸后洗1-3遍，離心棄上清。沉淀用含6mol/L尿素的T-E緩沖液重懸，離心去沉淀。上清完全透析至6mol/L尿素的T-E緩沖液中。用source30Q陰離子交換柱進(jìn)行純化。用A液（含6mol/L尿素的T-E緩沖液）平衡柱子后上樣（流速2mL/min），待流穿完全流出基線穩(wěn)定后，用B液（含6mol/L尿素和1mol/L氯化鈉的T-E緩沖液）線性洗脫（流速3mL/min），收集流穿后，梯度復(fù)性至T-E緩沖液中（6-4-2-0mol/L）。2）ESAT6-CFP10基因的擴(kuò)增以及蛋白的純化從Genbank查詢結(jié)核桿菌H37Rv抗原ESAT6和CFP10的核酸和氨基酸序列，根據(jù)目的序列應(yīng)用基因拼接法設(shè)計(jì)引物。表2首先以H37Rv全基因組為模板，引物見表2，對(duì)ESAT6和CFP10分別在50μLPCR體系中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50μL（ddH2O30.5μL、10×Buffer5μL、Taq酶0.5μL、dNTP4μL、上游引物4μL、下游引物4μL、DNA模板2μL）；然后利用OverlapPCR反應(yīng)擴(kuò)增ESAT6-CFP10融合基因，擴(kuò)增體系為50μL（ddH2O28.5μL、10×Buffer5μL、Taq酶0.5μL、dNTP4μL、上游引物4μL、下游引物4μL、CFP10PCR純產(chǎn)物2μL，ESAT6PCR純產(chǎn)物2μL）。CFP10擴(kuò)增條件為：96℃5min；96℃45s，60℃45s，72℃1min，循環(huán)30次；72℃7min，4℃保存。ESAT6擴(kuò)增條件為：96℃5min；96℃45s，62℃45s，72℃1min，循環(huán)30次；72℃7min，4℃保存。ESAT6-CFP10融合基因的擴(kuò)增條件為：96℃5min；96℃1min，64℃1min，72℃1min，循環(huán)30次；72℃7min。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，進(jìn)行膠回收，獲得目的片段，經(jīng)NdeI和EcoRI雙酶切后在T4DNA連接酶催化下與pET30a克隆表達(dá)載體16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α，37℃培養(yǎng)過夜。挑選菌落于10mLLB培養(yǎng)基上擴(kuò)增，提取質(zhì)粒后用上述內(nèi)切酶消化，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定正確后的陽性菌落經(jīng)質(zhì)粒測序進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，并確認(rèn)其基因序列正確。從測序正確的菌落中提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組菌，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組菌，待菌液在600nm光密度（opticaldensity，OD）下值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其終濃度為0.8mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)4h。離心經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，菌體沉淀用PB緩沖液洗滌后重懸，冰浴超聲裂解后離心，取上清液待做純化。用陰離子交換柱（QHP，QSepharoseHighPerformance）進(jìn)行純化。用A液（PB緩沖液）平衡柱子后上樣（流速2mL/min），待流穿完全流出基線穩(wěn)定后，用5%B液（含1mol/L氯化鈉的PB緩沖液）梯度洗脫（流速2mL/min），收集洗脫液。1.2試驗(yàn)結(jié)果純化后的蛋白用12%的SDS-PAGE電泳確定分子量，并進(jìn)行N末端測定。結(jié)果顯示，Ag85b和ESAT6-CFP10分子量分別約為34.4KD和23KD，N末端氨基酸序列分別為MTDVSRKIRAWGRRL和MAEMKTDAATLAQEAG。實(shí)施例2：本發(fā)明中的含聯(lián)合佐劑結(jié)核亞單位疫苗的免疫學(xué)研究1、材料研究對(duì)象：30只SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠（6-8周齡）2、方法與結(jié)果2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)30只雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分成5個(gè)組，每組6只小鼠，小鼠日齡與體重相近。試驗(yàn)分組見表2：（EC為ESAT6-CFP10）表3組別免疫劑量（/只）鋁+PolyICAl(OH)3(0.2mg)+polyIC(50μg)蛋白Ag85b(10μg)+EC(10μg)蛋白+鋁Ag85b(10μg)+EC(10μg)+Al(OH)3(0.2mg)蛋白+PolyICAg85b(10μg)+EC(10μg)+polyIC(50μg)蛋白+鋁+PolyICAg85b(10μg)+EC(10μg)+Al(OH)3(0.2mg)+polyIC(50μg)分別對(duì)小鼠后腿肌內(nèi)免疫接種上述試劑，免疫3針，間隔10天。在末次免疫后第2周分離脾淋巴細(xì)胞和血清。用ELISPOT方法檢測2.5×105個(gè)脾淋巴細(xì)胞中Ag85b和EC抗原特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞頻率，結(jié)果用斑點(diǎn)生成細(xì)胞數(shù)（Spotformingcells,SFC）表示，同時(shí)對(duì)分離的血清用ELISA方法檢測Ag85b和EC的抗體效價(jià)（Log10對(duì)數(shù)值表示，*：P<0.05,***：P<0.001）。2.2試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果見圖3-6。試驗(yàn)結(jié)果圖3-4（一元方差分析的Holm-Sidak多重比較，*：P<0.05,***：P<0.001，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示）表明，蛋白亞單位與鋁和PolyIC配伍試驗(yàn)組相比于單純的蛋白組、鋁和PolyIC聯(lián)合組、蛋白+鋁、蛋白+PolyIC組可顯著提高脾淋巴細(xì)胞中Ag85b和EC抗原特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞頻率（P<0.05）。IFN-γ可以激活Th細(xì)胞，有效增強(qiáng)Th1型細(xì)胞免疫免疫應(yīng)答反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果圖5-6（一元方差分析的Holm-Sidak多重比較，*：P<0.05，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示）表明，蛋白亞單位與鋁和PolyIC配伍試驗(yàn)組相比于單純的蛋白組、鋁和PolyIC聯(lián)合組、蛋白+鋁、蛋白+PolyIC組可顯著提高血清中Ag85b和EC抗體效價(jià)，以EC蛋白效果尤為顯著（P<0.05）。上述結(jié)果表明，本發(fā)明的使用鋁和PolyIC聯(lián)合佐劑的蛋白亞單位疫苗可以有效增強(qiáng)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，這對(duì)預(yù)防結(jié)核病有重要作用。實(shí)施例3動(dòng)物保護(hù)力試驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)方法Mtb感染豚鼠的免疫治療SPF級(jí)Hartley豚鼠16只（300-350g/只），雌雄各半，分成兩組（實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組），每組8只。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組豚鼠于皮下攻毒5.0×103CFUMtb后，實(shí)驗(yàn)組注射參考疫苗進(jìn)行治療，共6針，每針間隔2周，每針劑量為[Ag85b(10μg)+EC(10μg)+Al(OH)3(0.2mg)+polyIC(50μg)]/0.5mL/只。對(duì)照組豚鼠注射等量的生理鹽水作為對(duì)照。末次免疫后1周，解剖豚鼠。分析肝、脾和肺臟器綜合病變指數(shù)和脾肺荷菌量。臟器病變指數(shù)評(píng)分Mtb感染的豚鼠解剖后，先對(duì)肝、脾、肺臟器按輕、中、重進(jìn)行分級(jí)，然后按《現(xiàn)代結(jié)核病學(xué)》中《結(jié)核菌感染后病變指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行評(píng)分。脾、肺活菌分離剪取1/2的脾臟或肺置于研磨器中，加入3mL生理鹽水研磨均勻，進(jìn)行10倍系列稀釋，根據(jù)臟器病變程度接種不同的稀釋度，每個(gè)稀釋度接種改良羅氏培養(yǎng)基2支，0.1mL/支，37℃培養(yǎng)，4周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)分析雙側(cè)t檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2、結(jié)果及分析結(jié)果如圖7～9所示，可得出：與對(duì)照組相比經(jīng)疫苗治療6針后，實(shí)驗(yàn)組各項(xiàng)指標(biāo)均顯著降低。這表明，本疫苗可減輕Mtb感染豚鼠各臟器的病變程度，并有效抑制或殺死豚鼠體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌。序列表<110>中國食品藥品檢定研究院<120>一種含聯(lián)合佐劑的結(jié)核亞單位疫苗<130>PN1305328-02<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>1cacgcatatgacagacgtgagcc23<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2ttgaattctcagccggcgcct21<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>3gatagtctcatatggcagagatgaagaccg30<210>4<211>59<212>DNA<213>人工序列<400>4gcttccacctcctccgcttccaccacctccgcttccaccgccaccgaagcccatttgcg59<210>5<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>5gctggcggtggaagcggaggtggtggaagcggaggaggtggaagcatgacagagcagcag60<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>6catgaattcctatgcgaacatcccagtgacg31<210>7<211>15<212>PRT<213>氨基酸序列<400>7MetThrAspValSerArgLysIleArgAlaTrpGlyArgArgLeu151015<210>8<211>16<212>PRT<213>氨基酸序列<400>8MetAlaGluMetLysThrAspAlaAlaThrLeuAlaGlnGluAlaGly151015