生物藥非共價結(jié)合聚合物延長治療濃度的方法及用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物藥的非共價結(jié)合物，制備方法及由所述非共價結(jié)合物形成的藥物組合物的用途，生物藥在高濃度時結(jié)合到高分子聚合物形成所述非共價結(jié)合物，在濃度低時從高分子聚合物解離釋放行使其藥理活性；其特征在于既穩(wěn)定保留物藥，降低藥物的免疫原性、又減緩擴散速度和從血液中清除速度，延長維持藥物血漿有效治療濃度時間、半衰期，基本消除藥物爆發(fā)釋放的特征；本發(fā)明還涉及所述含生物藥非共價結(jié)合物的藥物組合物的用途。
【專利說明】生物藥非共價結(jié)合聚合物延長治療濃度的方法及用途 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種攜帶親和配體的聚合物及與物藥非共價結(jié)合物的方法和試劑，屬 于生物制藥領(lǐng)域。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 蛋白類藥物，具有靶點明確、療效顯著、不易形成抗藥性、副作用小的優(yōu)點，但因 其體內(nèi)半衰期較短，因此臨床應(yīng)用時，為維持其在體內(nèi)的有效血藥濃度，需要多次給藥，患 者依從性較差。為了解決這個問題，歐洲專利EP0539167和美國專利US4904584公開了 用PEG直接修飾蛋白的解決方案。PEG單元可以共價聯(lián)接到蛋白質(zhì)的多個不同氨基位點 上；由于蛋白或多肽分子中存在多個氨基，制備的共價偶聯(lián)物是多種偶聯(lián)產(chǎn)物的混合物， 不同分子大小及分子結(jié)構(gòu)的PEG對活性位點的影響不同，在特異性、被修飾后的蛋白空間 結(jié)構(gòu)、產(chǎn)物穩(wěn)定性及產(chǎn)物活性等反面存在很大不均一性。偶聯(lián)物位置異構(gòu)體的混合物[歐 洲專利 EP593868 ;Monkarsh 等，ACS. Symp. Ser.，680 :207-216,1997]，需要繁瑣的純化步 驟準(zhǔn)備最適偶聯(lián)物。專利PCT/US2004/025864中公開了一種在IL28和IL29分子N-末端 上的氨基進行PEG化的均一化方法，控制反應(yīng)pH條件選擇性控制諸如醛（如甲氧基聚乙 二醇丙醛）等試劑在N-末端的α氨基上反應(yīng)，而不影響賴氨酸殘基的ε氨基，制備蛋 白質(zhì)Ν-末端修飾產(chǎn)物。較未修飾的生物藥，PEG偶聯(lián)物具有較高的可溶性、穩(wěn)定性、較弱 的免疫原性；但盡管連接到藥物蛋白分子氨基酸殘基上的PEG鏈本身并不參與受體的識 別與結(jié)合，但是PEG鏈的空間位阻以及PEG化導(dǎo)致的蛋白分子表面性質(zhì)的改變影響了與 受體的結(jié)合，降低了修飾后蛋白的活性；隨PEG鏈長度增加和PEG修飾度提高，生物活性 降低幅度增大。如PEG-IL-15只有10%的天然活性[中國專利申請201110095641. 6]; Peglntron? (Peginterferon a-2b，Schering-Plough)只有天然活性約 10% 28%， PEGASYS(IFNα-2a)只有約7%天然活性。
[0004] 此外，蛋白質(zhì)PEG化修飾的化學(xué)反應(yīng)、產(chǎn)物不均一性需要純化不僅增加了生產(chǎn)步 驟，造成了產(chǎn)品損失，加大了生產(chǎn)成本。因此需要發(fā)展穩(wěn)定和延長藥物血藥有效濃度的更理 想方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明涉及一種攜帶親和配體的高分子聚合物，物藥能夠以非共價形式與之結(jié)合 形成非共價結(jié)合物；制備操作簡單，活性損失小，易于保存，更穩(wěn)定，與天然物藥比較，具有 更長的體內(nèi)半衰期和有效血藥濃度、用藥次數(shù)少、治療效果長、用藥更為安全。
[0006] 具體地說，本發(fā)明在于提供一種帶親和配體的高分子聚合物，物藥通過非共價形 式與之結(jié)合形成非共價結(jié)合物，可以加賦形劑、非離子表面活性劑等，過濾除菌、分裝，如果 需要可以凍干存放。因此該高分子聚合物有望開發(fā)成為一種保健產(chǎn)品或藥物或者輔佐藥物 而用于臨床。
[0007] 因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種藥物-高分子聚合物的非共價聚合物。
[0008] 其特征在于：
[0009] [1]高分子聚合物分子上含共價連接的親和配體；
[0010] [2]高分子聚合物在藥物制劑階段加入，混勻、除菌、過濾后形成。
[0011] [3]所述的藥物包括但不限于重組生物藥、提取生物藥和合成生物藥。
[0012] 本發(fā)明中所述物藥-高分子非共價結(jié)合物具有如下通式：
[0013] BioPM …Ligand一Polymer
[0014] 式中，所述非共價結(jié)合物的優(yōu)選摩爾比為：BioPM : Ligand - Polymer = 0. 5-1. 5 ： 0. 5-2 ： 5
[0015] 式中，BioPM為所述的生物藥指蛋白/多肽類藥物：包括促紅細胞生成素（ΕΡ0)、 重組人粒細胞集落刺激因子（G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)、疫苗、干擾 素（INF)、生長激素（GH)、胰島素（Insulin)、表皮生長因子（EGF)、成纖維細胞生長因子 (FGF)、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-B)、胰島素樣生長因子（IGF)、血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF)、 血小板生長因子（PDGF)、內(nèi)皮生長因子（ECGF)、神經(jīng)生長因子（NGF)、骨衍生性生長因子 (BDGF)、骨形成蛋白（BNIP)、組織多肽抗原（TPA)、抗體（antibody)、凝血因子VIII (VIII) 及IX遺傳因子和用于治療的蛋白質(zhì)或多肽。
[0016] BioPM為所述的生物藥指蛋白/多肽類以外的藥物為：反義核苷酸（anti-RNA)、小 分子RNA(RNAi)、基因（DNA)、抗體、疫苗、或脂質(zhì)體。
[0017] 所述的生物藥可以是天然的、重組蛋白或同樣具有天然功能的基因突變產(chǎn)物，當(dāng) 然，也包括通過組織培養(yǎng)、有機合成的、蛋白質(zhì)合成、細胞培養(yǎng)（天然、重組細胞活突變體） 方法得到的產(chǎn)品。
[0018] Polymer為所述的高分子聚合物，指聚酯、聚酸酐、或骨架非肽鍵的聚氨基酸，其 中包括：聚乳酸、聚乳酸一聚羥基乙酸及其組合；還包括卡波母、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、肝 素、明膠、膠原蛋白、纖維蛋白原、纖維蛋白、、葡聚糖、烯丙基葡聚糖、瓊脂糖、纖維素、聚乙 二醇、聚乙二醇一聚乳酸嵌合高分子、聚乙二醇一聚羥基乙酸嵌合高分子、聚羥基乙酸一聚 乙二醇一聚羥基乙酸嵌合高分子、聚乳酸一聚乙二醇一聚乳酸嵌合高分子、糖敏型凝膠和 酸敏型凝膠高分子、聚氰基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯；以本發(fā)明優(yōu)選的PEG、透明質(zhì)酸、 肝素、硫酸軟骨素、葡聚糖、纖維素；
[0019] PEG聚乙二醇分子可以是直鏈型或分支型，可以是單鏈、雙鏈或多鏈。優(yōu)選直鏈型 單鏈聚乙二醇分子。基本乙烯單位的20到2000,優(yōu)選為500-1500之間的整數(shù)值，更優(yōu)選為 700-1300之間的整數(shù)，聚乙二醇的分子量在lkDa、100kDa之間，優(yōu)選為200-50kDa之間，更 優(yōu)選為30-40kDa。以本發(fā)明優(yōu)選的20-40KDa的mPEG ;
[0020] Ligand為所述的親和配體，指具有結(jié)合目標(biāo)生物藥的分子基團，可以生物藥的天 然配體、多肽配體、藥物分子、有機小分子，以及以生物藥為靶點設(shè)計合成的具有結(jié)合所述 生物藥能力分子實體，包含乙二胺、三乙烯四胺、3-二乙基氨基丙胺、1，2_二氨基環(huán)己烷、 5-氨基-2, 2,4_三甲基環(huán)戊甲胺、庚胺、辛胺、任胺、葵胺、環(huán)戊胺、環(huán)庚胺、環(huán)辛胺、環(huán)任胺、 環(huán)葵胺、組胺、色胺、酪胺、苯胺、3-氨基苯酚、對-氨基苯酚、苯甲胺、3-氨基吡啶、2-胺甲 基吡咯、3, 5-二氨基苯甲酸、2-氨基苯并咪唑、5-氨基苯并咪唑、4,4' -二氨基二苯醚、3， 3'-二甲基聯(lián)苯胺；
[0021] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種帶親和配體的高分子聚合物制備方法。
[0022] 本發(fā)明專利所述攜帶親和配體的高分子聚合物可以用常規(guī)化學(xué)方法制備步驟：
[1]多糖高分子-親和配體合成步驟：準(zhǔn)確稱取多糖若干，根據(jù)除以單糖摩爾質(zhì)量數(shù)（約 180)計算摩爾數(shù)。然后加入0. 1-1倍單糖摩爾數(shù)量的NaOH，1倍單糖摩爾數(shù)量的環(huán)氧氯丙 烷或其它二環(huán)氧基試劑，密閉后于60°C攪拌反應(yīng)0.5-8小時。取出反應(yīng)物，于通風(fēng)櫥中，用 去離子水以超濾方式換緩沖液洗滌，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，得環(huán)氧活化多糖聚 合物，測定環(huán)氧基密度；取環(huán)氧活化多糖聚合物若干，計算環(huán)氧基摩爾數(shù)；取1-2倍摩爾量 的配體分子，溶解在PH8以上的緩沖液中，與活性化多糖聚合物混合，密閉后于60°C攪拌反 應(yīng)10-24小時。取出反應(yīng)物，于通風(fēng)櫥中，用去離子水以超濾方式換緩沖液洗滌，至pH值和 電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，得多糖聚合物-親和配體物質(zhì)；
[0023] [2] 1-3鏈mPEG-親和配體合成步驟：準(zhǔn)確稱取1-3鏈PEG-活性基團（PEG分子量 2-50kd，活性基團為環(huán)氧基、琥珀酰亞胺脂、琥珀酰亞胺碳酸酯、醛基、三氟乙基磺酸酯、異 氰酸酯、肼、2-巰基噻唑啉、苯駢三氮唑、馬來酰亞胺、二-2-吡啶基二硫化物、乙烯砜、鄰二 硫吡啶、碘乙酰胺）若干，計算活性基團摩爾數(shù)；取2-10倍摩爾量的配體分子，溶解在反應(yīng) 緩沖液中，與1-3鏈PEG-活性基團混合，密閉后于反應(yīng)溫度下攪拌反應(yīng)10-24小時。取出 反應(yīng)物，于通風(fēng)櫥中，用去離子水以超濾方式換緩沖液洗滌，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水 相當(dāng)，得PEG-親和配體物質(zhì)；
[0024] [3]三氮嗪骨架親和配體-多糖聚合物的合成
[0025] 取多糖若干溶解于1-10% NaOH中，加入環(huán)氧氯丙烷，混勻，密閉60°C下反應(yīng)2小 時；取出反應(yīng)物，于通風(fēng)櫥中，用去離子水以超濾方式換緩沖液，至pH值和電導(dǎo)率與去離子 水相當(dāng)，得環(huán)氧活化-多糖聚合物，
[0026] 環(huán)氧活化多糖聚合物若干溶解于1-5 %氨水中，混勻，密閉60°C下反應(yīng)過夜； 取出反應(yīng)物，于通風(fēng)櫥中，用0. lNaHC03溶液以超濾方式換緩沖液，至pH值和電導(dǎo)率與 0. lNaHC03溶液相當(dāng)，得氨基-多糖聚合物，分析氨基密度；取氨基-多糖聚合物若干溶解 在0. lNaHC03溶液，計算氨基摩爾數(shù)，取1-2倍摩爾量的三氯三氮嗪溶解在冷丙酮中，逐步 加入，并用飽和NaHC03將pH維持在7. 0-7. 5之間，反應(yīng)溫度維持在0-4°C繼續(xù)攪拌2h-4h， 至白色消失停止反應(yīng)。用去離子水以超濾方式換緩沖液洗滌，至pH值和電導(dǎo)率與去離子 水相當(dāng)，得三氮嗪活化-多糖聚合物；稱取三氮嗪活化-多糖聚合物溶解用〇. lNaHC03溶 液，取1-5倍摩爾量的目標(biāo)氨基化合物（R1)，將其溶解于一定量的蒸餾水中，加入混勻，密 閉與50°C反應(yīng)24h，反應(yīng)過程中，用飽和NaHC03和1M醋酸使溶液pH保持在7-7. 5之間； 用0. lNaHC03溶液以超濾方式換緩沖液，至pH值和電導(dǎo)率與0. lNaHC03溶液相當(dāng)；稱取取 1-5倍摩爾量的目標(biāo)氨基化合物（R2)，溶解，加入，95°C反應(yīng)24-60h，反應(yīng)過程中，用飽和 NaHC03和1M醋酸使溶液pH保持在7-7. 5之間；用去離子水以超濾方式換緩沖液，至pH值 和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，干燥待用。這種方法合成的雙基團三氮嗪骨架親和配體-多糖 聚合物，按不同氨基化合物數(shù)字編號命名為"Cx"，"C"代表以三氮嗪為骨架，"X"為氨基數(shù) 字標(biāo)號數(shù)字編號。
[0027] 所述的常規(guī)化學(xué)方法，是指C. R. Lowe在《親和色譜導(dǎo)論》（洛（C. R. Lowe)著；劉 毓秀譯.科學(xué)出版社，1983以"年5月第1版，第61-84頁）中提到的聚合物活化與功能化 方法，如多糖基及含羥基的聚合物，可用鹵化氰、三嗪（均二氯三嗪或三氯三嗪）、高碘酸氧 化，環(huán)氧乙烷（1，4-二羥基正丁烷雙縮水甘油醚），環(huán)氧氯丙醇，環(huán)氧溴丙醇，雙氮丙啶，二 乙烯砜，苯醌類化合物如醌，溴乙酰溴進行活化和功能化；配體合成方法還可以參考文獻親 和配體的設(shè)計合成及其吸附蛋白質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系[J. S印.Sci. 2011，34, 3145-3150]。從而在 聚合物上連接需要的親和配體，或原位合成親和配體。
[0028] 本發(fā)明的再一個目的，提供了該藥物組合物制備方法
[0029] 本發(fā)明專利所述非共價結(jié)合物的制備步驟：將2倍濃度原料藥（BioPM)的注射劑 緩沖液與2倍濃度聚合物-配體（Ligand - Polymer)注射劑緩沖液，加賦形劑溶解、非離 子表面活性劑，在無菌容器中混合均勻后，靜置2小時，過濾除菌，溫度優(yōu)選4-KTC，摩爾比 為 BioPM : Ligand - Polymer = 1 : 1. 1 ?1 : 5，BioPM 原料藥與聚合物結(jié)合率> 95%。 制備條件的選擇和制備方法在實例中詳細說明。
[0030] 本發(fā)明的又一個目的是提供了制備該藥物組合物的輔料。
[0031] 本發(fā)明專利所述賦形劑可以是任何多元醇，與制劑的其它組分一起產(chǎn)生穩(wěn)定的生 物藥-高分子聚合物非共價結(jié)合物制劑。多元醇的例子有甘露醇、山梨醇、海藻糖醇、麥芽 糖醇，木糖醇和麥芽糖醇。優(yōu)選的多元醇賦形劑是甘露醇。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的另一個目的，本發(fā)明提供了制備該藥物組合物的非離子表面活性 劑。
[0033] 按照本發(fā)明所述非離子表面活性劑。非離子表面活性劑包括多元醇衍生物、丙二 醇二乙酸酯、聚氧乙烯酯和醚、壬基苯基醚、聚乙烯醇、泊洛沙姆（泊洛沙姆188)、鏈烷醇酰 胺。非離子表面活性劑可優(yōu)選泊洛沙姆，特別優(yōu)選泊洛沙姆188。
[0034] 能維持該藥物組合物穩(wěn)定的任何緩沖液均可使用，包括但不限于醋酸鈉緩沖液或 PBS溶液，優(yōu)選醋酸鈉緩沖液。在本發(fā)明一個優(yōu)選實施例中，PEG-ligand，干擾素-γ、表面 活性劑、賦形劑和緩沖液的液體藥物組合物，其中所述所述緩沖液是醋酸鈉緩沖液，賦形劑 是海藻糖醇，所述表面活性劑是泊洛沙姆188。
[0035] PBS溶液配制：準(zhǔn)確稱取氯化鈉8g、氯化鉀0. 2g、磷酸氫二鈉1. 44g、磷酸二氫鉀 0. 24g，用去離子水配成1000mL溶液，分裝，121°C高壓滅菌15min。

【具體實施方式】
[0036] 以下實施例用于詳細說明本發(fā)明及其效果，但是本發(fā)明并不僅僅局限于這些實施 例，這些實施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改 動或修改，但所作的類似的改動或修改同樣落在本申請權(quán)利要求書所限定的范圍之內(nèi)。
[0037] 實施例 1 mPEG-TEQA 合成
[0038] 準(zhǔn)確稱取 mPEG-環(huán)氧基團（mPEG-Epoxide，分子量 20KD)10g 溶解于 500ml 0.01M NaOH，量取三乙烯四胺5ml加入混合，放入1L玻璃瓶，密封蓋嚴(yán)后防御60°C搖床反應(yīng)過夜。 取出反應(yīng)物，于通風(fēng)櫥中，用去離子水以超濾方式換緩沖液洗滌，至pH值和電導(dǎo)率與去離 子水相當(dāng)，得PEG-TEQA ;
[0039] 實施例 2 diPEG-DaCH 合成
[0040] 準(zhǔn)確稱取雙鏈PEG-琥珀酰亞胺脂（diPEG-su，分子量40KD) 10g溶解于500ml 0. 1M乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH4. 5,量取1，2-二氨基環(huán)己烷5ml加入混合，調(diào)pH4. 5,放入1L 玻璃瓶，密封蓋嚴(yán)后防御50°C搖床反應(yīng)過夜。取出反應(yīng)物，于通風(fēng)櫥中，用去離子水以超濾 方式換緩沖液洗滌，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，得diPEG-DaCH ;
[0041] 實施例 3 diPEG-APn 合成
[0042] 準(zhǔn)確稱取雙鏈PEG-琥珀酰亞胺碳酸脂（diPEG-su，分子量60KD) lOg溶解于500ml 0. 1M乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH4. 5,量取氨基環(huán)戊烷5ml加入混合，調(diào)pH4. 5,放入1L玻璃 瓶，密封蓋嚴(yán)后防御50°C搖床反應(yīng)過夜。取出反應(yīng)物，于通風(fēng)櫥中，用去離子水以超濾方式 換緩沖液洗滌，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，得diPEG-APn ;
[0043] 實施例 4 diPEG-ABZMZ 合成
[0044] 準(zhǔn)確稱取雙鏈PEG-三氟乙基磺酸酯（diPEG-TrS，分子量50KD) 10g溶解于500ml 0. 1M碳酸氫鈉緩沖液，pH8. 0,稱取5-氨基苯并咪唑5g加入混合，調(diào)pH4. 5,放入1L玻璃 瓶，密封蓋嚴(yán)后防御50°C搖床反應(yīng)過夜。取出反應(yīng)物，于通風(fēng)櫥中，用去離子水以超濾方式 換緩沖液洗滌，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，得diPEG-ABZMZ ;
[0045] 實施例 5 diPEG-ABZMZ 合成
[0046] 準(zhǔn)確稱取雙鏈PEG-三氟乙基磺酸酯（diPEG-TrS，分子量10KD) 10g溶解于500ml 0. 1M碳酸氫鈉緩沖液，pH8. 0,稱取5-氨基苯并咪唑5g加入混合，調(diào)pH4. 5,放入1L玻璃 瓶，密封蓋嚴(yán)后防御50°C搖床反應(yīng)過夜。取出反應(yīng)物，于通風(fēng)櫥中，用去離子水以超濾方式 換緩沖液洗滌，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，得diPEG-ABZMZ ;
[0047] 實施例6 HA-Lig的合成
[0048] 稱取透明質(zhì)酸（Hyaluronan、hyaluronic acid) 15g 溶解于 4% NaOH 中，加入環(huán)氧 氯丙烷5ml，混勻，密閉60°C下反應(yīng)2小時；取出反應(yīng)物，于通風(fēng)櫥中，用去離子水以超濾方 式換緩沖液，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，干燥得環(huán)氧活化-透明質(zhì)酸14g。稱取環(huán)氧 活化-透明質(zhì)酸9g溶解于5%氨水中，混勻，密閉60°C下反應(yīng)過夜；取出反應(yīng)物，于通風(fēng)櫥 中，，用去離子水以超濾方式換緩沖液，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，干燥得氨基-透 明質(zhì)酸8g ;取氨基-透明質(zhì)酸5g溶解在0. lNaHC03溶液，取3g三氯三氮嗪溶解在冷丙酮 中，逐步加入，并用飽和NaHC03將pH維持在6. 8-7. 2之間，在4°C攪拌反應(yīng)4h。取出用去離 子水以超濾方式換緩沖液洗滌，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，干燥得三氮嗪活化-透 明質(zhì)酸5g ;稱取三氮嗪活化一透明質(zhì)酸4. 5g用0. lNaHC03溶液200ml溶解，取lg的環(huán)庚 胺（R1)加入混勻，密閉與50°C反應(yīng)18h，反應(yīng)過程中，用飽和NaHCOjP 1M醋酸使溶液pH保 持在6. 8-7. 2之間；取出用去離子水以超濾方式換緩沖液洗滌，至pH值和電導(dǎo)率與去離子 水相當(dāng)，干燥得環(huán)庚胺基-氯三氮嗪-透明質(zhì)酸4. 7g ;稱取環(huán)庚胺基-氯三氮嗪-透明質(zhì)酸 4g用0. lNaHC03溶液250ml溶解，取3,5_二氨基苯甲酸（R2)1.2g加入溶解混勻，95°C反 應(yīng)24h，反應(yīng)過程中，用飽和似!10) 3和1M醋酸使溶液pH保持在7-8之間；用去離子水以超 濾方式換緩沖液，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，干燥待用，得環(huán)庚胺基-3-氨基-5-羧 基苯氨基三氮嗪-透明質(zhì)酸4. 2g。
[0049] 實施例7 HP-Lig的合成
[0050] 稱取肝素（h印arin)50g溶解于3% NaOH中，加入環(huán)氧氯丙烷10ml，混勻，密閉 65°C下反應(yīng)1. 5小時；取出反應(yīng)物，于通風(fēng)櫥中，用去離子水以超濾方式換緩沖液，至pH值 和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，干燥得環(huán)氧活化-肝素48g。稱取環(huán)氧活化-肝素45g溶解于 4%氨水中，混勻，密閉60°C下反應(yīng)過夜；取出反應(yīng)物，于通風(fēng)櫥中，，用去離子水以超濾方 式換緩沖液，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，干燥得氨基-肝素44g ;取氨基-肝素35g 溶解在0. lNaHC03溶液，取10g三氯三氮嗪溶解在冷丙酮中，逐步加入，并用飽和NaHC03將 pH維持在6. 5-7. 5之間，在2°C攪拌反應(yīng)6h。取出用去離子水以超濾方式換緩沖液洗滌，至 pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，干燥得三氮嗪活化-肝素35g ;稱取三氮嗪活化-肝素30g 用0. lNaHC03溶液200ml溶解，取10g的1，2-二氨基環(huán)己烷（R1)加入混勻，密閉與55°C 反應(yīng)20h，反應(yīng)過程中，用飽和NaHC03和1M醋酸使溶液pH保持在6. 5-7. 0之間；取出用去 離子水以超濾方式換緩沖液洗滌，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，干燥得2-氨基環(huán)己氨 基-氯三氮嗪-肝素27g ;稱取2-氨基環(huán)己氨基-氯三氮嗪-肝素25g用0. lNaHC03溶液 250ml溶解，取4,4' -二氨基二苯醚（R2) 13g加入溶解混勻，90°C反應(yīng)48h，反應(yīng)過程中，用 飽和NaHC03和1M醋酸使溶液pH保持在7-8之間；用去離子水以超濾方式換緩沖液，至pH 值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，干燥待用，得2-氨基環(huán)己氨基-4-(4'_氨基苯醚）苯胺基-三 氮嗪-肝素25g。
[0051] 實施例8 CS-Lig的合成
[0052] 稱取硫酸軟骨素 （Chondroitin sulfate)80g溶解于3% Na0H600ml中，加入環(huán)氧 氯丙烷60ml，混勻，密閉55°C下反應(yīng)6小時；取出反應(yīng)物，于通風(fēng)櫥中，用去離子水以超濾方 式換緩沖液，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，干燥得環(huán)氧活化-硫酸軟骨素78g。稱取環(huán) 氧活化-硫酸軟骨素75g溶解于2%氨水中，混勻，密閉60°C下反應(yīng)30小時；取出反應(yīng)物， 于通風(fēng)櫥中，，用去離子水以超濾方式換緩沖液，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，干燥得 氨基-硫酸軟骨素74g ;取氨基-硫酸軟骨素70g溶解在0. 2NaHC03溶液，取20g三氯三氮 嗪溶解在200ml冷丙酮中，逐步加入，并用飽和NaHC0 3將pH維持在6. 5-7. 0之間，在7°C攪 拌反應(yīng)4h。取出用去離子水以超濾方式換緩沖液洗滌，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)， 干燥得三氮嗪活化-硫酸軟骨素74g ;稱取三氮嗪活化-硫酸軟骨素60g用0. lNaHC03溶 液300ml溶解，取30g的5-氨基-2, 2,4-三甲基環(huán)戊甲胺（R1)加入混勻，密閉與48°C反應(yīng) 30h，反應(yīng)過程中，用飽和NaHC03和1M醋酸使溶液pH保持在6. 5-7. 0之間；取出用去離子水 以超濾方式換緩沖液洗滌，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，干燥得5-氨基-2, 2,4-三甲 基環(huán)戊甲胺-氯三氮嗪-硫酸軟骨素65g ;稱取5-氨基-2, 2,4-三甲基環(huán)戊甲胺基-氯三 氮嗪-硫酸軟骨素55g用0. lNaHC03溶液550ml溶解，取2-氨基苯并咪唑（R2) 24g加入溶 解混勻，95°C反應(yīng)36h，反應(yīng)過程中，用飽和NaHC03和1M醋酸使溶液pH保持在7-8之間；用 去離子水以超濾方式換緩沖液，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，干燥待用，得5-氨基-2， 2,4-三甲基環(huán)戊甲胺基-苯并咪唑-2-氨基三氮嗪-硫酸軟骨素57g。
[0053] 實施例9 TiPEG-Lig的合成
[0054] 稱取4鏈PEG胺（TiPEG，60kD) 10g溶解在(λ lNaHC03溶液200ml，取5g三氯三氮 嗪溶解在l〇〇ml冷丙酮中，逐步加入，并用飽和NaHC0 3將pH維持在6. 5-7. 0之間，在4°C攪 拌反應(yīng)5h。取出用去離子水以超濾方式換緩沖液洗滌，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)， 干燥得三氮嗪活化-4鏈PEG胺（Amino-TiPEG) 9g ;稱取Amin〇-TiPEG8g用0· lNaHC03溶液 100ml溶解，取20g的3-氨基-1，5-苯二羧酸（R1)加入混勻，密閉先于50°C反應(yīng)30h，反 應(yīng)過程中，用飽和NaHC0 3和1M醋酸使溶液pH保持在6. 5-7. 0之間；再升溫至95°C，再反應(yīng) 24h,反應(yīng)過程中，用飽和似!10)3和1M醋酸使溶液pH保持在7-8之間；用去離子水以超濾 方式換緩沖液，至pH值和電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，干燥待用，得二（3, 5-二羧甲基苯胺基） 三氮嗪-4 鏈 PEG (TiPEG-Lig) 8g。
[0055] 實施例10重組胰島素的HA-Lig制劑
[0056] 胰島素 HA-Lig溶液配置：用0. 01mol/l pH7. 4磷酸鹽緩沖液配制lU/ml的重組 人胰島素，用0. 〇lmol/l pH7. 4磷酸鹽緩沖液配制2U/ml的重組人胰島素和20mg/ml的實 施例6制備的HA-Lig溶液混合制成lU/ml的重組人胰島素-10mg/mlHA-Lig的重組人胰島 素-HA-Lig溶液。
[0057] 小鼠皮下注射給藥降血糖試驗：取18只健康雄性小鼠，隨機分為3組。實驗前禁 食12h，可自由飲水。稱重，按照0. 5U/kg胰島素量皮下分別注射lU/ml的重組人胰島素溶 液和 lU/ml 的重組人胰島素-HA-Lig 的溶液，于 0,15, 30,60,90,120,180, 240, 300, 360， 48〇11^11時自尾靜脈取血2(^1加入18(^10.129111〇1/1枸櫞酸鈉抗凝劑溶液中，立即混勻， 3000rpm離心20min，精密量取20μ 1上清，按葡萄糖氧化酶法（G0D-PAP)測定血糖值。結(jié) 果，胰島素給藥后30min左右血糖降至低谷，為初始值的25%左右；給藥后3h，血糖回復(fù)到 初始值的90%以上。重組人胰島素-HA-Lig給藥后280min左右血糖降至低谷，為初始值 的65%左右；給藥后10h,血糖回復(fù)到初始值的90%以上。用梯形法計算曲線上面積（area above curve，AAC)，以胰島素的面積為基準(zhǔn)，計算重組人胰島素-HA-Lig相對天然胰島素的 生物活性百分比。相對重組胰島素組，重組人胰島素-HA-Lig的生物活性百分比87%。
[0058] 大鼠尾靜脈注射給藥降血糖試驗：取12只健康雄性SD大鼠，隨機分為3組。 實驗前禁食12h，可自由飲水。稱重，尾靜脈分別注射（0. 5U/kg)胰島素和重組人胰島 素-HA-Lig 溶液，于 0,15,30,45,60,90,120,180,240,300,360,480min 時自尾靜脈取血 20μ 1加入180μ 1 0. 129mol/l枸櫞酸鈉抗凝劑溶液中，立即混勻，3000rpm離心20min，精 密量取20μ 1上清，按葡萄糖氧化酶法（G0D-PAP)測定血糖值。重組胰島素給藥后20min 左右血糖值降至低谷，為初始值的50%左右，90min左右血糖回復(fù)到初始水平。重組人胰島 素-HA-Lig給藥后lOOmin左右血糖降至低谷，為初始值的55%左右；給藥后6h，血糖回復(fù) 到初始值的95 %左右。相對重組胰島素組，重組人胰島素-HA-Lig的生物活性百分比91 %。
[0059] 實施例11重組胰島素的diPEG-DaCH制劑
[0060] 胰島素 DiPEG-DaCH溶液配置：用0· 01mol/l ρΗ7· 4磷酸鹽緩沖液配制lU/ml的重 組人胰島素，用0. 〇lmol/l pH7. 4磷酸鹽緩沖液配制2U/ml的重組人胰島素和20mg/ml的 實施例2制備的DiPEG-DaCH溶液混合制成lU/ml的重組人胰島素-10mg/mlDiPEG-DaCH的 重組人胰島素-DiPEG-DaCH溶液。
[0061] 小鼠皮下注射給藥降血糖試驗：取18只健康雄性小鼠，隨機分為3組。實驗前禁食 12h，可自由飲水。稱重，按照0.5U/kg胰島素量皮下分別注射lU/ml的重組人胰島素溶液 和 lU/ml 的重組人胰島素-DiPEG-DaCH 的溶液，于 0,15, 30,60,90,120,180, 240, 300, 360， 480min時自尾靜脈取血20μ 1加入180μ 10. 129mol/l枸櫞酸鈉抗凝劑溶液中，立即混勻， 3000rpm離心20min，精密量取20μ 1上清，按葡萄糖氧化酶法（G0D-PAP)測定血糖值。結(jié) 果，胰島素給藥后30min左右血糖降至低谷，為初始值的25%左右；給藥后3h，血糖回復(fù)到 初始值的90%以上。重組人胰島素-DiPEG-DaCH給藥后260min左右血糖降至低谷，為初 始值的65%左右；給藥后10h，血糖回復(fù)到初始值的90%以上。用梯形法計算曲線上面積 (area above curve，AAC)，以胰島素的面積為基準(zhǔn)，計算重組人胰島素-DiPEG-DaCH相對天 然胰島素的生物活性百分比。相對重組胰島素組，重組胰島-diPEG-DaCH的生物活性百分 比 82%。
[0062] 大鼠尾靜脈注射給藥降血糖試驗：取12只健康雄性SD大鼠，隨機分為3組。 實驗前禁食12h，可自由飲水。稱重，尾靜脈分別注射（0. 5U/kg)胰島素和重組人胰島 素-DiPEG-DaCH 溶液，于 0,15, 30,45,60,90,120,180, 240, 300, 360,480min 時自尾靜脈 取血200μ 1加入180μ 1 0. 129mol/l枸櫞酸鈉抗凝劑溶液中，立即混勻，3000rpm離心 201^11，精密量取20(^1上清，按葡萄糖氧化酶法（600^^?)測定血糖值。重組胰島素給藥 后20min左右血糖值降至低谷，為初始值的50%左右，90min左右血糖回復(fù)到初始水平。重 組人胰島素-DiPEG-DaCH給藥后130min左右血糖降至低谷，為初始值的60%左右；給藥后 6h，血糖回復(fù)到初始值的90 %左右。相對重組胰島素組，重組人胰島素-DiPEG-DaCH的生物 活性百分比83%。
[0063] 實施例12 α干擾素的diPEG-ABZMZ制劑
[0064] α干擾素的diPEG-ABZMZ溶液配置：用0· 01mol/l ρΗ7· 4磷酸鹽緩沖液配制 80yg/ml的α干擾素，用〇. 〇lmol/l ρΗ7. 4磷酸鹽緩沖液配制1.0mg/ml的α干擾素和 160 μ g/ml的實施例4制備的diPEG-ABZMZ溶液混合制成80 μ g/ml的α干擾素-15mg/ mldiPEG-ABZMZ 的 α 干擾素-DiPEG-ABZMZ 溶液。
[0065] 試驗設(shè)三個劑量組：S卩α干擾素-DiPEG-ABZMZ低、中和高三個劑量組，10 μ g/ kg(2 早/2 ? )，40yg/kg(3 早/3 ? )和80yg/kg(2 早/2 ? )，于頸背部皮下注射（s.c·)， 給藥體積均為〇.2mL/kg。食蟹猴皮下注射α干擾素-DiPEG-ABZMZ注射液后，分別于不同 時間從猴前肢隱靜脈采血約1. OmL，具體采血時間點為：Oh (藥前），4,8,16, 24,48, 72,96， 120和144h (藥后）；采全血后立即用9ml 0. 129mol/l枸櫞酸鈉抗凝劑溶液稀釋混勻抗凝， 3000rpm離心20min，收集血清樣品，-70°C保存直至測定。
[0066] 采用細胞病變效應(yīng)法（CPE)測定α干擾素-DiPEG-ABZMZ在食蟹猴體內(nèi)的抗病毒 活性，即干擾素保護Wish細胞免受VSV病毒攻擊的能力。具體操作方法為：
[0067] (1)將干擾素標(biāo)準(zhǔn)品用測定培養(yǎng)液稀釋至1000IU/mL，再用測定培養(yǎng)液4倍系列稀 釋（1 : 1，1 : 4，1 : 16，1 : 64，1 : 256，1 : 1024，1 : 4096，1 : 16384)，其終濃度分別 為 1000、250、62·5、15·625、3· 906、0· 977、0· 244 和 0· 061IU/mL ;
[0068] (2)取各劑量組各時間點血清樣品用測定培養(yǎng)液按一定稀釋倍數(shù)稀釋，加入96孔 細胞板中；
[0069] (3)細胞培養(yǎng)與接種，將Wish細胞在完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)呈單層，貼壁生長，每周3 次，1 : 3消化傳代，于完全培養(yǎng)液中生長。取生長良好的Wish細胞，棄培養(yǎng)液后，PBS洗滌 2次，消化和收集細胞后，用完全培養(yǎng)液調(diào)細胞懸浮液調(diào)至3. OX 105/mL，接種于96孔細胞 板中，每孔 1〇〇μ L，37°C，5% C02 培養(yǎng) 5h ;
[0070] (4)加標(biāo)準(zhǔn)品或血清樣品于細胞板中，100μ L/孔，37°C，5% C02培養(yǎng)24h ;
[0071] (5)攻毒，棄培養(yǎng)板上清液，用攻毒培養(yǎng)液稀釋VSV病毒至100TCID50,100 μ L/孔， 37°C，5% C02培養(yǎng)過夜至陽性對照孔中的細胞死亡為止；
[0072] (6)染色和脫色，棄培養(yǎng)板上清液，加入染色液50 μ L/孔，室溫放置30min,沖洗去 染色液，吸干水分，加入脫色液100 μ L/孔，室溫放置3-5min ;
[0073] (7)在酶標(biāo)儀上測定570nm處的吸光度（0D)，參考波長為630nm ;
[0074] (8)結(jié)果統(tǒng)計：每個樣品重復(fù)測定3次取其平均值，每細胞微孔板制備一條標(biāo)準(zhǔn)曲 線，同時設(shè)細胞對照和VSV對照。血清中干擾素活性單位被定義為保護半數(shù)Wish細胞免受 VSV病毒攻擊的滴度。采用四參數(shù)回歸計算，清除率（CL)、消除半衰期（tl/2i3);達峰時間 (Tmax)和峰濃度（Cmax)采用實測值。
[0075] 結(jié)果顯示，藥后體內(nèi)抗病毒活性逐漸升高，到達最高抗病毒活性時間Tmax為16h， 其后隨時間延長而逐漸降低，即低、中和高劑量在16h的最高生物活性（Cmax)分別為 35000,72000和150000叨/11^，逐漸下降至14411的1500,4000和9000叨/11^，藥時曲線下面 積 AUC(0-144h)分別為 1. 2χ106,3· 5xl06 和 7. 3xl06IU/mL.h ;平均清除率 CL 為 17mL/h/kg， 平均消除半衰期（tl/2)約為43h，平均滯留時間（MRT)為76h。
[0076] 實施例13重組人白介素-15的CS-Lig制劑
[0077] 重組人白介素-15的CS-Lig溶液配置：用0. 01mol/l pH7. 4磷酸鹽緩沖液配制 10 μ g/ml的1125標(biāo)記重組人白介素-15,用0. 01mol/l pH7. 4磷酸鹽緩沖液配制20 μ g/ml 的白介素-15和10mg/ml的實施例4制備的CS-Lig溶液混合制成10 μ g/ml的重組人白介 素-15-5mg/mlCS-Lig的重組人白介素-15-CS-Lig溶液。
[0078] 藥代動力學(xué)比較測定：大鼠12只，雌雄各半，分為2組，分別單次給予1125標(biāo) 記的10 μ g/kg的重組人白介素-15和含10 μ g/kg的重組人白介素-15的重組人白介 素-15-CS-Lig溶液，采用重組人白介素-15放射免疫（R1A)試劑盒測定皮下注射重組人白 介素-15和重組人白介素-15-CS-Lig后的血藥濃度；在時間點為Omin，30min，lhr、2h、4h， 811、1211、1611時自尾靜脈取血20(^1加入18(^10.129111〇1/1枸櫞酸鈉抗凝劑溶液中，立即 混勻，3000rpm離心20min，精密量取200μ 1上清，-20°C保存用于血藥濃度的測定。測定數(shù) 據(jù)表明重組人白介素-15的藥代符合一級消除動力學(xué)二房室模型，平均達峰時間T PMk (實測 值）為8. l±1.7min，平均消除半衰期（t1/2e)為21.2 士 1.3min;重組人白介素-15-CS-Lig 組平均達峰時間Tpeak(實測值）為12. 3±2. 7h，平均消除半衰期（t1/2e)為35. 3±3. 5h，t匕 重組人白介素-15的半衰期延長大近100倍。
[0079] 對荷瘤Balb/c小鼠 NK細胞活性的影響：取60只Balb/c小鼠，分別在右側(cè)皮下接 種lxlO6個SP2/0細胞，約10d后形成皮下實體瘤，再隨機分為成6組，每組10只，分別為空 白模型組（腹腔注射等體積的生理鹽水）、重組人白介素-15組（腹腔注射0. 1 μ g/次）、 重組人白介素-15-CS-Lig組（腹腔注射0. 5 μ g/次）。給藥方式為：重組人白介素-15組 1次/天，每周連續(xù)5天停藥2天，連續(xù)給藥5周；重組人白介素-15-CS-Lig組，每周給藥一 次，連續(xù)給藥5周。給藥后第21、28、35、40天進行疆細胞殺傷活性檢測。生長24-4811的 YAC-1細胞離心洗兩次，計數(shù)后以10 %的FCS-1640 (完全1640)調(diào)整濃度為2xl05/mL作為 靶細胞；取小鼠血液用Tris-NH4C1稀釋，帶紅細胞溶解后，離心-洗滌3次，計數(shù)，用10%的 FCS-1640調(diào)整至8xl06/mL，作為效應(yīng)細胞；取效應(yīng)細胞100 μ 1分別加入細胞板各孔，每份 實驗樣品7Κ孔，其中的3孔中再各加100 μ 1祀細胞為實驗孔，另外3孔再各加完全1640液 100 μ 1效應(yīng)細胞對照孔。37°C、5% C02孵箱培養(yǎng)2h后加 ΜΤΤ，再培養(yǎng)2h加助溶劑，培養(yǎng)過 夜后，用酶標(biāo)儀測定吸光度Α57_值。用公式[1-(實驗孔Α 57_-效應(yīng)細胞對照孔、7(|11111)/靶 細胞對照孔A57(IJ Χ100%計算ΝΚ細胞活性用殺傷％表示。數(shù)據(jù)表明模型對照組ΝΚ細胞活 性平均為21 ±3. 7%，重組人白介素-15組治療后NK細胞活性提高至40% ±3. 3,第五周開 始快速下降，第六周結(jié)束時，與模型對照都相近為25±3. 3% ;重組人白介素-15-CS-Lig組 組治療后NK細胞活性提高并維持穩(wěn)定37% ±3. 1，第45天給藥結(jié)束后第10天，NK細胞仍 然維持較高活性性33% ±3. 5。
[0080] 實施例14重組人白介素-6的HP-Lig制劑
[0081] 重組人白介素_6的HP-Lig溶液配置：用0. 01mol/l pH7. 4磷酸鹽緩沖液配制 40 μ g/ml的重組人白介素 -6,用0. Olmol/1 pH7. 4磷酸鹽緩沖液配制80 μ g g/ml的重組 人白介素 -6和10mg/ml的實施例7制備的HP-Lig溶液混合制成40 μ g/ml的重組人白介 素 -6-5mg/mlCS-Lig的重組人白介素 -6-HP-Lig溶液。
[0082] 三氯乙酸（TCA)沉淀法測定血漿藥物濃度：取抗凝血將上清10 μ 1兩份各加入 Eppendorf離心管中，用190μl蒸餾水稀釋搖勻，靜置10分鐘，再加入200μl20%TCA，搖 勻靜置10分鐘，5000rpm離心30min，棄上清，使用FT-2008 γ放射性計數(shù)儀測定沉淀部分 的放射性（cpm)，雙管數(shù)值平均。根據(jù)每次樣品的放射性比活性、放射性衰變、放射測量時間 和儀器計數(shù)效率校正，計算成血漿中 1251_重組人白介素-6的濃度（ng/ml)。幾種劑量的曲 線走勢基本一致，符合線性過程，重組人白介素-6-HP-Lig半衰期。
[0083] 靜脈注射（iV)給藥測定：SD大鼠20只，隨機分為4組，每組3雄2雌，分別給予 1 125標(biāo)記的重組人白介素-6組20μ g/kg和1125標(biāo)記的重組人白介素-6-HP-Lig高（40μ g/ kg)、中（20 μ g/kg)、低（3 μ g/kg)劑量組。通過頸靜脈插管注射給藥，注射體積為0· 4ml/ 只。將注射器針頭插入留在大鼠體外的PE管的管腔內(nèi)，以注射器輕推將藥物緩緩注入大 鼠頸靜脈，再注入少量生理鹽水將PE管腔內(nèi)藥物全部推入大鼠體內(nèi)。注射后2, 5,10, 20， 40min，l，2,4,6,8,24,48h剪尾，流出的血液迅速滴入肝素化的Eppendorf離心管中，收集 約1〇〇μ1，然后離心8000rpm，5min，吸取上清，保存4°C。樣品收集完畢后立即檢測。測 定數(shù)據(jù)表明重組人白介素-6的藥代符合一級消除模型，平均消除半衰期（t 1/2e)為5. 2 士 1. 7min ;重組人白介素-6-HP-Lig組平均消除半衰期（t1/2e)為50. 3±2. 3min，比白介素-6 的半衰期延長大近9倍。
[0084] 皮下注射（sc)給藥測定：SD大鼠20只，隨機分為4組，每組3雄2雌，分別給予1125 標(biāo)記的重組人白介素-6組20μ g/kg和1125標(biāo)記的重組人白介素-6-HP-Lig高（40μ g/kg)、 中（20 μ g/kg)、低（3 μ g/kg)劑量通過背部皮下注射給藥，注射體積為0. 4ml/只。注射后 2, 5,10, 20,40min，l，2,4,6,8, 24,48, 72h剪尾，流出的血液迅速滴入肝素化的Eppendorf 離心管中，收集約100 μ 1，然后離心8000rpm，5min，吸取上清，保存4°C。樣品收集完畢后立 即檢測。測定數(shù)據(jù)表明重組人白介素-6-15的藥代符合一級消除動力學(xué)二房室模型，平均 達峰時間T peak(實測值）為9. 2±1. 5min，平均消除半衰期（t1/2e)為23. 5 士 1. 7min ;重組 人白介素-6-HP-Lig組平均達峰時間Tpeak(實測值）為15. 7±2. 3h，平均消除半衰期（t1/2e) 為37. 3±2. 5h，比重組人白介素-6的半衰期延長大近95倍。
[0085] 實施例15重組人生長激素的diPEG-APn制劑
[0086] 重組人生長激素（rhGH)的diPEG-APn溶液配置：用0. 01mol/l pH7. 4磷酸鹽緩沖 液配制0. 5mg/ml的重組人生長激素，用0. 01mol/l pH7. 4磷酸鹽緩沖液配制1. 0mg/ml的重 組人生長激素和20mg/ml的實施例3制備的diPEG-APn混合制成0. 5mg/ml的rhGH-10mg/ ml diPEG-APn 的 rhGH-diPEG-APn 溶液。
[0087] 測量rhGH和rhGH-diPEG-APn活性：取無血清、無 hGH培養(yǎng)基100 μ 1分別加入96 孔平底微量滴定板各孔中；再分別取〇. 5mg/ml的rhGH和rhGH-diPEG-APn溶液樣品100 μ 1 加入96孔平底微量滴定板第一排孔中，每種樣品3孔，用排槍將第一排孔中樣品混勻，吸 取100 μ 1加入第二排孔，混勻再吸取100 μ 1加入第三排孔，依次稀釋到最后一排孔，混勻 再吸取100 μ 1棄去。取ΝΒ2-11細胞2xl05/mL的細胞懸浮液用無血清，無 hGH的培養(yǎng)基洗 滌兩次，重新懸浮后取50 μ 1 (含104個細胞）分別加入96孔平底微量滴定板孔中，溫育48 小時再加入細胞增殖試劑WST-1，再溫育2. 5小時。在酶標(biāo)儀中測定各孔光密度，作為濃度 的函數(shù)制圖確定NB2-11增殖50%的rhGH和rhGH-diPEG-APn濃度值（EC50)。結(jié)果顯示 rhGH-diPEG-APn相對于rhGH的體外生物活性性65%。
[0088] 體內(nèi)半衰期測定：Wistar大鼠（200_250g) 10只，隨機分為2組，每組3雄2雌，每 只大鼠分別靜脈注射 〇· 25mg hGH 或 0· 25mg rhGH-diPEG-APn，在 0· 5、3、24、48、72 和 96 小 時舌下采集血1〇〇 U 1加入肝素化的Eppendorf離心管中，然后離心8000rpm，5min，吸取上 清，保存_8〇°C，用hGH ELISA試劑盒（DSL)測定各樣品rhGH濃度。對時間繪制的曲線計 算，rhGH 半衰期 22min，rhGH-diPEG-APn 半衰期 llh，是 rhGH 的 30 倍。
[0089] 實施例16胸腺5肽的TiPEG-Lig制劑
[0090] 胸腺5肽（TP5)的TiPEG-Lig溶液配置：用0· 01mol/l ρΗ7· 4磷酸鹽緩沖液配制 100 μ g/ml的胸腺5肽（ΤΡ5)，用0. Olmol/1 ρΗ7. 4磷酸鹽緩沖液配制1. Omg/ml的胸腺5 肽（TP5)和200 μ g/ml的實施例9制備的TiPEG-Lig混合制成100 μ g/ml的TP5-10mg/ml TiPEG-Lig 的 TP5-TiPEG-Lig 溶液。
[0091] 將BALB/c小鼠隨機分為3組：TP5-TiPEG-Lig樣品組，TP5標(biāo)準(zhǔn)品組及空白對照 組。腹腔注射小鼠，每只〇. 6ml (60 μ g)，同時每只腹腔注射0. 5ml羊紅細胞（SRBC)?？?白對照組，每只腹腔注射0.6ml羊紅細胞及0.6ml PBS。4d后殺鼠取脾測溶血空斑活性， 淋巴細胞轉(zhuǎn)化活性，和免疫小鼠脾細胞分泌IL-2活性按照文獻[金伯泉.醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)免疫 學(xué)實驗指導(dǎo).第1版.北京：世界圖書出版社，1990]操作。結(jié)果，分別計算實驗組和對照 組每百萬脾細胞內(nèi)含空斑生成細胞數(shù)的平均值。經(jīng)組間t檢驗，TP5組及TP5-TiPEG-Lig 樣品組比較，差異均有顯著意義（t = 5. 1，5. 3和7. 3, P < 0.01)，空白對照組，TP5組及 TP5-TiPEG-Lig 樣品組溶血空斑活性分別為 30±8,78±15,352±37PFC/106Splenocytes， 與TP5相比，TP5-TiPEG-Lig活性高出近4倍；淋巴細胞轉(zhuǎn)化活性測定結(jié)果表明，TP5 組及TP5-TiPEG-Lig樣品組提高了小鼠的淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。經(jīng)組間檢驗，TP5組及 TP5-TiPEG-Lig樣品組與空白對照組比較差異均有顯著意義（t = 5. 5、4. 2, P < 0. 01)，空 白對照組，TP5組及TP5-TiPEG-Lig組小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化率分別為1. 05±0. 3,1. 7±0. 8， 7. 5±0. 7，TP5-TiPEG-Lig淋巴細胞轉(zhuǎn)化活性是TP5的4. 4倍；取淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗中的各 組小鼠脾細胞以適當(dāng)濃度加入24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)8h，取其上清5倍稀釋作為待測樣品，檢 測其分泌IL-2活性，數(shù)據(jù)表明，空白對照組，TP5組及TP5-TiPEG-Lig樣品組分泌IL-2的 活性分別為 〇· 25±0· 07,1. 6±0· 8,3. 7±L 2IL-2IU/ml，與 TP5 相比，TP5-TiPEG-Lig 分泌 IL-2活性高出近1. 3倍；
[0092] E-玫瑰花環(huán)測定：ABLB/c小鼠（體重22 ± 2)，雌雄各半，隨機法分組，1組免疫功 能低下小鼠，1組TP5對照小鼠，1組TP5-TiPEG-Lig實驗組小鼠，每組8只小鼠。
[0093] 免疫功能低下小鼠的制備：給小鼠皮下注射氫化可的松，每日劑量為20mg/kg， 連續(xù)用藥6天。給藥方法：第7天，陰性對照組小鼠每日予0。1%CMC-Na溶液灌胃；陽 性對照組每日腹腔注射TP5,每日劑量為3. Omg/kg，連續(xù)給藥7天；實驗組注射21mg/kg TP5-TiPEG-Lig溶液一次；4兔紅細胞懸液制備：無菌條件下，于耳緣動脈抽取兔血lml，以 肝素鈉溶液抗凝，加 D-Hanks液5ml洗滌，離心（5000rpm，5分鐘），棄上清液，同法再洗滌 兩次，最后將紅細胞懸于D-Hanks液中，最后得到濃度為1 %的兔紅細胞懸液。小鼠淋巴細 胞懸液制備：通過摘小鼠眼球取血約3ml，肝素鈉溶液作為抗凝，加入3ml D-Hanks液。在 玻璃離心管中加入淋巴細胞分離液，將小鼠血沿離心管壁緩慢加至分離液上，用水平離心 機以2000rpm離心20分鐘。小心吸取分離液與紅細胞中間乳白色單個核細胞層，移入另 一離心管中，用5ml D-Hanks液洗滌3次，每次1500rpm離心10分鐘。將淋巴細胞重新懸 于D-Hanks液，先用血細胞計數(shù)板計數(shù)，用D-Hanks液調(diào)淋巴細胞濃度調(diào)整至2xl0 8個/ml。 E-玫瑰花環(huán)實驗：取兔紅細胞懸液和小鼠淋巴細胞懸液各0. lml，混合均勻。放入37°C孵 育10分鐘，500rpm離心6分鐘后，放入4°C冰箱保存2-4小時。從冰箱取出后先吸去部分 上清液，加〇. lm 0. 8%戊二醛溶液，4°C固定20分鐘后，輕輕吹吸混勻沉淀細胞。然后取細 胞懸液涂片，自然干燥，95%乙醇固定，水洗后用蘇木素-伊紅染液染色，鏡檢計數(shù)。T細胞 吸附三個以上兔紅細胞的為E花環(huán)形成淋巴細胞，通過計數(shù)200個淋巴細胞來計算E-玫瑰 花環(huán)形成率。
[0094] E-玫瑰花環(huán)形成率（％ )= E-玫瑰花環(huán)數(shù)/計數(shù)淋巴細胞總數(shù)X 100%
[0095] 數(shù)據(jù)表明免疫功能低下組6. 5±1.3, TP5組12±3, TP5-TiPEG-Lig組30±5,與 TP5 組相比，TP5-TiPEG-Lig 組提高了 1. 5 倍；
[0096] 實施例17 L-天冬氨酸酶的TiPEG-Lig制劑
[0097] 歐文氏菌（Erwinia)L-天冬氨酰胺酶（Laps)溶液配置：用0· 01mol/l ρΗ7· 4磷酸 鹽緩沖液配制100 μ g/ml的Laps ;用0· 01mol/l ρΗ7· 4磷酸鹽緩沖液配制1. Omg/ml的Laps 和 200 μ g/ml 的實施例 9 制備的 TiPEG-Lig混合制成 100 μ g/ml 的 TP5-10mg/ml TiPEG-Lig 的 Laps-TiPEG-Lig 溶液。
[0098] 體外酶促活性測定：用奈氏比色法來測定L-天冬酰胺酶催化L 一天冬酰胺所釋 放的氨量測定L-天冬酰胺酶的氨基水解酶活性。將50 μ L酶溶液與50mM硼酸納緩沖液 (pH8. 6)中的20mML-天冬酰胺混合并在37°C下溫育lOmin。加入200 μ L的Nessler試劑 終止反應(yīng)。然后測量吸光度Α45_，從硫酸銨濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所述活性。結(jié)果Laps比活性 650U/mg蛋白，Laps-TiPEG-Lig比活性623U/mg蛋白，為L-天冬氨酰胺酶（Laps)比活性的 95.8% ;可以認(rèn)為基本沒有活性損失。
[0099] 體內(nèi)酶促活性測定：酶將L 一天冬氨酰-β-異羥異羥肟酸（AHA)底物水解為 L-ASP和羥胺，再用8-羥基喹啉縮合氧化為indooxine，測定吸光度A710nm定量，計算酶活 力（Analytical Biochem. 309(2002) :117-126)。
[0100] 藥代動力學(xué)性質(zhì)：小鼠（B6D2F1)(雌性具免疫活性），每組8只動物，按照5, 25 或50U/kg Laps-TiPEG-Lig和250U/kg的Laps單次靜脈注射給藥，在給藥前l(fā)h和給藥后 90min、2h、4h、6h、8h、24h、48h、96h、144h、192h、240h 和 288h，分別從眼框收集血漿樣品，測 定血漿殘留酶活性和L 一天冬酰胺水平；通過甲醇沉淀去除樣品血漿蛋白，上清液用異硫 氰酸苯酯衍生其中自由氨基酸，再用RP-HPLC進行走量。計算半衰期時間=-In (2*時間）/ In (所述時間點血漿酶活力/初始血漿酶活力）；曲線下面積（AUC)表示血漿殘留酶活性的 時間積分，表示總效應(yīng)。結(jié)果L-天冬氨酰胺酶（250U/kg)最高血漿濃度出現(xiàn)在6h為75U/ L，AUC1200,酶活力最長持續(xù)時間18h，在48h內(nèi)可維持血漿中L 一天冬酰胺水平低于5μΜ 濃度；Laps-TiPEG-Lig (50U/kg)最高血漿濃度出現(xiàn)在7h為230U/L，AUC35374,酶活力最長 持續(xù)時間288h，在144h內(nèi)可維持血漿中L 一天冬酰胺水平低于5 μ Μ濃度。
【權(quán)利要求】
1. 一種藥物-高分子聚合物的非共價聚合物，其特征在于： (1) 高分子聚合物分子上含共價連接的親和配體； (2) 高分子聚合物與藥物混勻后形成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物-高分子聚合物的非共價聚合物，其特征是，所述的藥物 包括但不限于重組生物藥、提取生物藥和合成生物藥。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組生物藥包括但不限于促紅細胞生成素（EPO)、人粒細胞 集落刺激因子（G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)、疫苗、干擾素（INF)、白 介素（IL)、生長激素（GH)、胰島素（Insulin)、表皮生長因子（EGF)、成纖維細胞生長因子 (FGF)、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-B)、胰島素樣生長因子（IGF)、血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF)、 血小板生長因子（PDGF)、內(nèi)皮生長因子（ECGF)、神經(jīng)生長因子（NGF)、骨衍生性生長因子 (BDGF)、骨形成蛋白（BNIP)、組織多肽抗原（TPA)、抗體（antibody)、凝血因子VIII (VIII) 及IX、遺傳因子、鏈激酶、和用于治療的蛋白質(zhì)或多肽、疫苗含重組乙型肝炎疫苗。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成生物藥包括但不限于反義核苷酸（anti-RNA)、小分子 RNA(RNAi)、基因（DNA)、桿菌肽、五肽胃泌素、丙胺瑞林、縮宮素、降鈣素、奧曲肽、胸腺肽、生 長抑素、谷胱甘肽、心房肽、抑氨肽酶B、抑胃蛋白酶肽、去氨加壓素、烏苯美司、氨肽素。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取生物藥指血液制品包括但不限于白蛋白、免疫球蛋白、 凝血因子、纖維蛋白原、凝血酶、抗胰蛋白酶Alpha-Ι。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取生物藥指動物臟器提取品包括但不限于胰激肽原酶、蚓 激酶、凝乳酶、胰酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、玻璃酸酶、玻璃糖醛酸酶、彈性酶、抑肽酶、門冬酰 胺酶I、門冬酰胺酶I，細胞色素 C、尿激酶、烏司他丁、激肽原酶、尿促性素、HMg，絨促性素、 菠蘿蛋白酶、菠蘿酶、超氧化物歧化酶（SOD)、舍雷肽酶、溶菌酶、降纖酶、蘄蛇酶、轉(zhuǎn)移因子。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物-高分子聚合物的非共價聚合物，其特征是，所述的藥物 包括但不限于人源、動物源包括豬、牛、羊、馬、雞、鴨、鴿、魚。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物-高分子聚合物的非共價聚合物，其特征是所述的高分 子聚合物包括但不限于聚酯、聚酸酐、或骨架非肽鍵的聚氨基酸，其中包括：聚乳酸、聚乳酸 一聚羥基乙酸及其組合；還包括卡波母、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、肝素、明膠、膠原蛋白、纖維 蛋白原、纖維蛋白、、葡聚糖、烯丙基葡聚糖、瓊脂糖、纖維素、聚乙二醇、聚乙二醇一聚乳酸 嵌合高分子、聚乙二醇一聚羥基乙酸嵌合高分子、聚羥基乙酸一聚乙二醇一聚羥基乙酸嵌 合高分子、聚乳酸一聚乙二醇一聚乳酸嵌合高分子、糖敏型凝膠和酸敏型凝膠高分子、聚氰 基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物-高分子聚合物的非共價聚合物，其特征是所述的親和 配體包括但不限于由化學(xué)基團乙二胺、三乙烯四胺、3-二乙基氨基丙胺、1，2_二氨基環(huán)己 烷、5-氨基-2, 2,4_三甲基環(huán)戊甲胺、庚胺、辛胺、任胺、葵胺、環(huán)戊胺、環(huán)庚胺、環(huán)辛胺、環(huán)任 胺、環(huán)葵胺、組胺、色胺、酪胺、苯胺、3-氨基苯酚、對-氨基苯酚、苯甲胺、3-氨基批陡、2-胺 甲基吡咯、3, 5-二氨基苯甲酸、2-氨基苯并咪唑、5-氨基苯并咪唑、4,4'-二氨基二苯醚、3， 3' -二甲基聯(lián)苯胺及其組合。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的親和配體，其特征是用常規(guī)化學(xué)方法在聚合物分子上直接 共價連接單個配基分子。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的親和配體，其特征是在聚合物上通過多活性基團骨架分步 組合固定多種化合物合成復(fù)雜結(jié)構(gòu)配體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的親和配體組合的合成方法，其特征是多活性基團骨架包括 但不限于三氯三氮嗪、多肽固相合成。
13. 藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物-高分子聚合物的非共價聚合物體內(nèi) 注射后在血漿中的治療有效水平維持至少2小時以上。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于可以添加賦形劑與制劑的其它組 分一起產(chǎn)生穩(wěn)權(quán)利1所述物藥-高分子聚合物非共價結(jié)合物制劑。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的賦形劑，其特征在于包括但不限于多元醇含甘露醇、山梨 醇、海藻糖醇、麥芽糖醇，木糖醇和麥芽糖醇。優(yōu)選的多元醇賦形劑是甘露醇。
16. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于可以添加表面活性劑與制劑的其 它組分一起產(chǎn)生穩(wěn)權(quán)利1所述物藥-高分子聚合物非共價結(jié)合物制劑。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的表面活性劑，其特征在于包括但不限于多元醇衍生物、丙 二醇二乙酸酯、聚氧乙烯酯和醚、壬基苯基醚、聚乙烯醇、泊洛沙姆（泊洛沙姆188)、鏈烷醇 酰胺。
【文檔編號】A61K38/48GK104147596SQ201310178008
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月14日
【發(fā)明者】李榮秀, 劉玥 申請人:李榮秀