一種動員骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的中藥有效部位組合的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及多種中藥混合化合物的用途，具體涉及一種中藥復(fù)方有效部位方的制備方法及醫(yī)藥領(lǐng)域的用途。這種中藥有效部位是從該方劑中提取出人參皂苷、丹參酮II?a、黃芪甲苷、丹參菲醌、復(fù)方苷類、復(fù)方苷元、復(fù)方蛋白、總生物堿、人參多糖、復(fù)方多糖、丹參芬酚酸B、羥基紅花黃色素A、黃酮苷、總揮發(fā)油等有效部位。通過對其中“起主要作用有效成分部位”、“主要與次要有效部位交互作用”及“各有效成分部位的有效劑量配伍”等抗心肌缺血的系列研究，進(jìn)而確定的“最佳有效成分部位”。經(jīng)研究顯示，這種中藥有效部位組合，可通過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞“增值”、“遷移”和“歸巢心肌”等不同環(huán)節(jié)起到修復(fù)缺血心肌的作用?！緦＠綀D】

【附圖說明】圖1誘導(dǎo)后4周免疫細(xì)胞化學(xué)圖片100倍(A：空白對照組；B：5-aza組α-Sarcomeric?Actine；C：5-aza組Desmin；D：有效部位配方組α-Sarcomeric?Actine；E：有效部位配方組Desmin)。
【專利說明】一種動員骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的中藥有效部位組合

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及多種中藥混合化合物的用途，具體涉及一種中藥 復(fù)方有效部位方的制備方法及醫(yī)藥領(lǐng)域的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 本中藥有效部位組合（本有效部位群）是運(yùn)用"扶養(yǎng)心氣，和通血脈"之法治療胸 痹心痛的有效方劑，是用人參、黃芪、桂枝補(bǔ)益心氣，溫通血脈；生地、五味子滋陰生津，和通 氣血；丹參、紅花活血養(yǎng)血、宣通經(jīng)脈，佐以澤瀉利水滲濕，化其痰濁而補(bǔ)陰、大棗補(bǔ)氣血調(diào) 和諸藥。諸藥合用，達(dá)到和通血脈、調(diào)養(yǎng)心氣之效。經(jīng)我們多年研究表明，該方劑對于缺血 性心臟病、高脂血癥、動脈粥樣硬化等均具有顯著的臨床療效。可改善冠狀循環(huán)，增加冠狀 微循環(huán)血流量；增強(qiáng)心血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗血栓性，抑制凝血活性；調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝；具有對抗 心肌缺血再灌注損傷，防止氧自由基的毒害和增加機(jī)體的胰島素敏感性等作用。
[0003] 這種中藥有效部位是從該方劑中提取出人參皂苷、丹參酮Ila、、黃芪甲苷、丹參菲 醌、復(fù)方苷類、復(fù)方苷元、復(fù)方蛋白、總生物堿、人參多糖、復(fù)方多糖、、丹參芬酚酸B、羥基紅 花黃色素 A、木脂素、黃酮苷、總揮發(fā)油等有效部位。通過對其中"起主要作用有效成分部 位"、"主要與次要有效部位交互作用"及"各有效成分部位的有效劑量配伍"等抗心肌缺血 的系列研究，進(jìn)而確定的"最佳有效成分部位"。"有效部位群"是從中藥復(fù)方中提取的有效 的一類化學(xué)物質(zhì)，它較之原方富集了有效成分。經(jīng)研究顯示，這種中藥有效部位組合，可通 過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞"增值"、"遷移"和"歸巢心肌"等不同環(huán)節(jié)起到修復(fù)缺血心肌的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的提供一種中藥復(fù)方有效部位組合的制備方法。該藥物可促進(jìn)骨髓間 充質(zhì)干細(xì)胞分化和誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成心肌樣細(xì)胞。
[0005] 其次要解決的技術(shù)問題：這種中藥有效部位組合在促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植于 心肌后向心肌樣細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化的醫(yī)藥用途。
[0006] 所述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為心肌樣細(xì)胞。根據(jù)這種中藥有效部位組合在 誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的成功案例，可以利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為新的篩選治 療心肌梗死疾病藥物的細(xì)胞模型。
[0007] 本發(fā)明再一個所要解決的技術(shù)問題是提供促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向轉(zhuǎn)化 為心肌樣細(xì)胞。為此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：它采用一種有效中藥有效部位組合作為 促細(xì)胞分化劑，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為心肌樣細(xì)胞。
[0008] 本發(fā)明還提供了：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)用這種中藥有效部位組合定向分化成 的心肌樣細(xì)胞作為心臟組織工程的用途。用這種中藥有效部位組合誘導(dǎo)分化的種子細(xì)胞或 生物人工心臟進(jìn)行移植，可避免心臟移植出現(xiàn)的免疫排斥反應(yīng)及心臟供體來源少的問題。
[0009] 本發(fā)明還提供了： 一種中藥有效部位組合聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為促細(xì)胞分化 劑在制備治療心肌梗死疾病藥物中的用途，將這種中藥有效部位組合制備成治療心肌梗死 疾病的藥物，聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植來治療重大心臟疾病。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1藥物濃度和細(xì)胞損害率的二次回歸曲線和回歸方程（A藥物濃度和細(xì)胞損害 率的二次回歸曲線B藥物濃度和損害率的二次回歸方程）
[0011] 圖2誘導(dǎo)后4周免疫細(xì)胞化學(xué)圖片100倍（A :空白對照組；B :5_aza組 a -Sarcomeric Actine ;C :5-aza 組 Desmin ;D :有效部位配方組 a -Sarcomeric Actine ； E :有效部位配方組Desmin)

【具體實(shí)施方式】
[0012] 本發(fā)明通過實(shí)施例研究表明，這種中藥有效部位組合可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 在體外定向分化為心肌樣細(xì)胞。本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步說明。
[0013] 實(shí)施例1 :這種中藥有效部位組合動員骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的主要作用成分的臨床 研究
[0014] (1)實(shí)驗(yàn)動物及造模：選用wistar健康大鼠120只，體重在200±20g，雄性，據(jù)《中 藥新藥研制與申報(bào)》關(guān)于"治療胸痹心痛證中藥的藥效學(xué)研究"的要求，參照"垂體后葉素誘 發(fā)急性心肌缺血"方法造模，按0. 75u/kg的劑量，尾靜脈注射垂體后葉素，恒速10s內(nèi)推完。 挑選心電圖J點(diǎn)（J點(diǎn)為QRS波群的終了與ST段交接處）上升，或ST段抬高或壓低0. lmv 以上，T波先高聳后低平或倒置者；快速注射垂體后葉素后30秒出現(xiàn)大鼠心電圖S-T抬高 或2分鐘后T波低平為造模成功的標(biāo)志。
[0015] (2)實(shí)驗(yàn)藥品
[0016] ①受試藥品：藥物原方由人參、黃芪、桂枝、生地、五味子、丹參、紅花、澤瀉、大棗等 按一定比例組成，藥材購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，品種均經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥 制劑專家鑒定認(rèn)可。由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院中藥民族藥研發(fā)基地水煎后，按水蒸 氣蒸餾法，水醇法，陽離子樹脂吸附法等方法制備成包括人參皂苷、人參多糖、丹參酮IIA、 丹參菲醌、復(fù)方苷類、復(fù)方苷元、復(fù)方多糖、復(fù)方蛋白、總生物堿和總揮發(fā)油10個有效成分 部位，分別制成有效成分部位口服液。
[0017] ②對照藥品：生理鹽水。
[0018] ⑶分組實(shí)驗(yàn)
[0019] 取上述造模大鼠，隨機(jī)分為15組，每組8只，包括人參皂苷、丹參酮Ila、、黃芪甲 苷、丹參菲醌、復(fù)方苷類、復(fù)方苷元、復(fù)方蛋白、總生物堿、人參多糖、復(fù)方多糖、、丹參芬酚酸 B、羥基紅花黃色素 A、木脂素、黃酮苷、總揮發(fā)油、空白模型組和健康對照組。其中15個有效 部位組均在喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料同時，灌服相應(yīng)的有效部位口服液，每次4毫升；模型對照組、健 康對照組給于灌服等量的生理鹽水。每天1次，連續(xù)10天，于第11天開始檢測外周血⑶34+ 細(xì)胞。
[0020] (3)給藥劑量：按本課題前期所作的各有效成分急性毒性試驗(yàn)確定的LD50或最大 耐受量確定給藥量，用蒸餾水稀釋至4ml，各有效成分組灌服相應(yīng)的有效成分口服液，健康 對照組和空白模型組給予4ml蒸餾水。
[0021] (4)血液CD34+細(xì)胞檢測
[0022] 抽靜脈血，100yL加入10yL CD34+FITC抗體，4°C暗箱中孵育30min ;陰性對照加 入10 μ L PBS液，4°C暗箱中孵育30min。每管加入2mL紅細(xì)胞裂解液充分混勻，室溫下避光 反應(yīng)10min，1500Xg離心5min。棄上清液，加入2mL PBS液，混勻，500Xg離心5min。重復(fù) 一遍。棄上清液，加入〇· 5mL PBS混勻，即用FACS calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）分 析外周血⑶34+細(xì)胞率。以外周血白細(xì)胞數(shù)乘以⑶34+細(xì)胞率得出外周血⑶34+細(xì)胞數(shù)。
[0023] 如表1顯示：①模型對照組的血液⑶34+細(xì)胞數(shù)與健康對照組比較，差異有顯著性 意義，P < 0. 01 ;②人參皂苷組與模型組比較（P < 0. 01)、丹參酚酸B組與模型組比較（P < 0. 05)、黃芪甲苷組與模型組（P < 0. 01)、黃酮苷組與模型組比較（P < 0. 05)、總揮發(fā)油 組與模型組比較（P < 〇. 01)均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故確認(rèn)這五種成分為發(fā)揮作用的主 要成分。
[0024] 表1各組血液⑶：34+的比較（又士s )
[0025]
[0026]

【權(quán)利要求】
1. 一種中藥復(fù)方有效部位組合含人參皂苷（3. 53g生藥/kg體重）、丹參酚酸B (2. 12g 生藥/kg體重）、黃苗甲苷（6. 58g生藥/kg體重）、黃酮苷（1. 87g生藥/kg體重）、總揮發(fā) 油（34. 35ml生藥/kg體重）。
2. 如權(quán)利要求1所述的這種中藥有效部位組合制備方法，其特征是：所述的一種中藥 有效部位組合的制備方法。
3. -種中藥有效部位組合治療和/或預(yù)防血管疾病的藥物、促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分 化的藥物和誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成心肌樣細(xì)胞的藥物用途。
4. 如權(quán)利要求3所述的這種中藥有效部位組合在促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外向心肌 樣細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化的醫(yī)藥用途，其特征是：所述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為心肌樣細(xì)胞。
5. 如權(quán)利3要求所述的這種中藥有效部位組合在動員進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞到外周血 的醫(yī)藥用途，其特征是：這種中藥有效部位組合能外周血中CD34+細(xì)胞數(shù)增多。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的這種中藥有效部位組合在促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植于心 肌后歸巢心肌組織的醫(yī)藥用途，其特征是：這種中藥有效部位組合具有促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干 細(xì)胞移植于心肌后歸巢心肌組織的作用。
7. 這種中藥有效部位組合聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植作為促細(xì)胞分化劑在制備治療 心肌梗死心血瘀阻證疾病藥物中的用途。
【文檔編號】A61K36/884GK104096014SQ201310122465
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月10日
【發(fā)明者】鄭景輝 申請人:鄭景輝