專利名稱：GFE-1與rmhTNFα的融合蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種肺小血管內(nèi)皮特異性結(jié)合多肽GFE-1與重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子rmhTNFa的融合蛋白及其制備方法，以及該融合蛋白的表達、純化及鑒定、體外活性檢測及體內(nèi)分布測定，以及對人腫瘤壞死因子的基因克隆、基因突變或重組改構(gòu)、表達、鑒定等方面，還涉及利用所述融合蛋白制備抗腫瘤藥物的方面。
背景技術(shù)：
1、腫瘤壞死因子相關(guān)研究腫瘤壞死因子a (TNFa )是一種由活化的單核細胞/巨噬細胞產(chǎn)生的具有多功能的炎癥因子，一種多功能的細胞因子。腫瘤壞死因子α參與機體的免疫和代謝調(diào)節(jié)，對某些癌細胞具有增殖抑制和細胞毒作用，是迄今為止人們所知道的抗腫瘤活性最強的細胞因子。1.1腫瘤壞死因子α的生物學活性TNFa是一種具有多種功能的炎癥因子，在體內(nèi)外發(fā)揮抗瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種作用，以下主要介紹它抗腫瘤相關(guān)的生物學活性。TNFa體內(nèi)外均能殺傷某些腫瘤細胞或抑制其增殖作用。TNFa可通過誘導某些癌細胞凋亡來抑制腫瘤。TNFa具有細胞毒活性，多種腫瘤細胞對其敏感。TNFa在體內(nèi)外均能殺傷某些腫瘤細胞或抑制增殖作用。腫瘤細胞株對TNFa敏感性有很大的差異，某些因素可增加細胞對TNFa殺傷的敏感性，如IFN、高溫、轉(zhuǎn)錄或翻譯的抑制劑，有絲分裂的抑制劑，拓撲異構(gòu)酶II抑制劑，蛋白激酶抑制劑以及LiCl等。用放線菌素D、絲裂霉素C、放線菌酮等處理腫瘤細胞 (如小鼠成纖維細胞L929)可明顯增強TNFa殺傷腫瘤細胞活性，此系統(tǒng)現(xiàn)在已經(jīng)作為監(jiān)測TNFa生物學活性的方法。在體內(nèi)，TNFa還可以通過對機體免疫功能的調(diào)節(jié)作用，促進T細胞及其他殺傷細胞對腫瘤細胞的殺傷。TNFa作為激發(fā)性細胞因子，可啟動廣泛的免疫炎性反應(yīng)，介導天然細胞毒細胞、單核細胞和巨噬細胞，對癌細胞的殺傷和溶瘤作用。TNFa可作用于血管內(nèi)皮細胞，對其增殖進行負調(diào)控，進而調(diào)節(jié)血管生成。并能啟動血管損傷，引起腫瘤的血管內(nèi)皮細胞損傷，不能調(diào)控血栓形成，從而導致腫瘤組織的局部血流阻斷，發(fā)生出血性壞死或因營養(yǎng)缺乏而消退。TNFa的最大耐受劑量很低，因此常伴隨發(fā)熱、肌肉酸痛、流感樣癥狀等副反應(yīng)，嚴重限制了其臨床應(yīng)用。但是人們并沒有停止對TNF α的研究，目前多通過構(gòu)建變構(gòu)體的形式以避免或減輕副作用、增加人體耐受性從而提高治療效果。1.2TNFa的變構(gòu)體TNF α活性三聚體的間溝是由近N端和近C端的極性基團及中部的疏水基團所組成的，而這些亞單位之間的溝是TNF與其受體結(jié)合的部位。實驗表明，C端上最后一個氨基酸Leul57改變成Phe，met或者Glu，能提高其活性18倍左右，因為這種改變使疏水性的TNF-a亞單位之間的結(jié)構(gòu)變得更緊湊，從而提高了 TNFa同受體結(jié)合的效率。另外，缺失1-7個N端的氨基酸，增加了 TNF-a的堿性度，提高了和受體的親和力，活性增加了 5倍。不僅如此，N端的8，9，10和17個氨基酸變成堿性氨基酸，使某些對野生型TNFa不敏感的細胞變得敏感了，擴大了 TNFa的療效范圍，而且還增強了其抗腫瘤的活性。細胞水平和動物試驗上的實驗數(shù)據(jù)顯示這些變構(gòu)體不僅提高了同受體的結(jié)合能力，還增加了其摧毀腫瘤周圍血管上皮組織的能力。另外，變構(gòu)體引起的毒副作用也要比野生型TNFa低18倍。國內(nèi)多家研究機構(gòu)對TNFa變構(gòu)體進行研究，已有多種TNF α變構(gòu)體進入了臨床研究階段。發(fā)明人通過基因工程方法，將氨基端7個氨基酸殘基去除，并將Pro8Ser9Aspw突變?yōu)锳rg、Lys和Arg，同時把Leu157突變?yōu)镻he，改構(gòu)后的TNF α比天然TNF α體外殺傷L929細胞的活性增加1000倍左右，在體內(nèi)腫瘤出血壞死效應(yīng)也明顯增加，比單獨缺失N端七個氨基酸或者單獨突變157位氨基酸的活性升高的都要大，且新型重組人腫瘤壞死因子毒性比天然腫瘤壞死因子降低三倍。原因是N端的氨基酸堿性增強可擴大抗瘤譜，而C端的最后一個氨基酸被替代，疏水性增強，使三聚體更為穩(wěn)定。較天然腫瘤壞死因子活性提高了 1000倍，而毒性卻為天然腫瘤壞死因子的1/3。臨床試驗結(jié)果表明，rmhTNFa對非小細胞肺癌、黑色素瘤和頭頸部腫瘤具有明顯的治療作用。已獲得國家食品藥品監(jiān)督局的新藥證書。2、特異性多肽研究現(xiàn)狀利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建的隨機肽庫可用于篩選與某個靶細胞特異性結(jié)合的多肽。即通過確定表達在不同腫瘤細胞或組織器官上特異性分子的結(jié)合肽，并以此結(jié)合肽為載體與藥物相連，這樣可以有效地提高定向傳遞治療藥物的能力。隨機肽 庫技術(shù)在抗腫瘤領(lǐng)域的研究主要集中于以下幾種方式:1.用于篩選已知腫瘤抗原的特異性結(jié)合肽，主要是針對腫瘤細胞膜分子常常出現(xiàn)的異常糖基化現(xiàn)象，這些特異性糖類可以作為腫瘤導向治療的目標受體。2.用于篩選與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的粘附分子的特異性結(jié)合肽，如RGD多肽通過識別整合素，已成為抑制腫瘤細胞遷移及粘附的新治療靶點。3.用于篩選組織特異性結(jié)合肽用特定的組織和細胞，對隨機肽庫進行多輪淘洗時，可以篩選出大量結(jié)合在細胞表面受體分子上的肽。再通過多種有效的方法減少一些噬菌體群的復雜性后，可以得到特異性結(jié)合于該組織的肽。4.用于篩選腫瘤附屬組織的特異性結(jié)合肽。特異性多肽分子量小，構(gòu)建簡單，免疫原性更低，應(yīng)用其作為導向載體是一個很好的研究策略。目前的研究結(jié)果顯示:將特異性多肽與抗腫瘤藥物聯(lián)合使用，可提高后者抗腫瘤效率并降低其全身的毒副作用。隨機肽庫技術(shù)在腫瘤導向治療中也漸漸發(fā)揮著重要的作用。GFE-1就是我們通過噬菌體隨機肽庫技術(shù)分離出的可與肺特異性結(jié)合的多肽，含有13個氨基酸(CGFECVRQCPERC)及2個潛在二硫鍵。實驗分離得到的GFE-1的受體經(jīng)蛋白序列鑒定與MDP (membrane dipeptidase)—致,且證實該受體在肺組織的分布遠高于其他組織。3、GFE-1 及其受體3.1GFE-1GFE-1顯示出比對照高35倍的特異性與肺結(jié)合的能力，含13個氨基酸及2個潛在二硫鍵，GFE-1的結(jié)合可被共軛多肽所阻斷。另一個與肺結(jié)合的多肽GFE-2與GFE-1有相同的三肽模序。呈現(xiàn)GFE-2多肽的噬菌體也可在肺的血管發(fā)現(xiàn)，它結(jié)合于肺并被GFE-1多肽抑制，GFE-1及GFE-2主要結(jié)合在毛細血管而不是更大血管。GFE-1及GFE-2多肽都可以結(jié)合于相同的受體，GFE-1的結(jié)合作用強于GFE-2。這個受體選擇性地表達在血管。3.2GFE-1 的受體Daniel Rajotte等分離出這個肺特異性多肽GFE-1的受體,蛋白序列鑒定了這個受體與MDP—致，MDP是一個多功能的蛋白，它可與脂蛋白，特別是高密度脂蛋白結(jié)合，通過參與維生素E的代謝而影響肺泡II型細胞功能，從而影響抗炎，細胞凋亡及肺泡表面活性劑合成等肺功能。它特異性的分解Cys-Gly鍵，有意義的是，GFE-1和GFE-2多肽的第1，2位氨基酸是Cys-Gly。它們可以結(jié)合到MDP的活性部位從而抑制MDP的酶解活性。它是MDP的競爭抑制劑。噬菌體顆粒呈現(xiàn)GFE-1肽段選擇性地結(jié)合在轉(zhuǎn)染鼠MDP cDNA的C0S-1細胞。MDP在肺，腎等幾種器官表達，主要表達在肺和腎。MDP在肺部主要表達在支氣管及肺泡上皮、毛細血管、肺泡及終末細支氣管的基膜。在腎分布于近球小管刷狀緣區(qū)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種肺小血管內(nèi)皮特異性結(jié)合多肽GFE-1與重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子rmhTNFa的融合蛋白及其制備方法和用途。本發(fā)明所制備的融合蛋白GFE-1-rmhTNF α能在肺組織特異性富集，從而提高腫瘤壞死因子的治療特異性，減少全身用量，降低毒副反應(yīng)，可作為肺部疾病的治療候選藥物，特別是腫瘤、免疫等方面。本發(fā)明的目的之一是提供一種重組的、分離的或合成的融合蛋白GFE-1-rmhTNFa，該融合蛋白包括以下部分:I)肺小血管內(nèi)皮特異性結(jié)合多肽(GFE-1 )，或具有GFE-1活性的片段或變體；2)經(jīng)過重組改構(gòu)而獲得的人腫瘤壞死因子(rmhTNFa )或其片段或變體，所述重組改構(gòu)改善其蛋白活性。更佳的，該融合蛋白由肺小血管內(nèi)皮特異性結(jié)合多肽和經(jīng)過重組改 構(gòu)而獲得的人腫瘤壞死因子通過連接而獲得，其中連接方式為通過連接肽連接。其中，更好的，所述肺小血管內(nèi)皮特異性結(jié)合多肽(GFE-1)的基因序列為為⑴ (6)中任一種:(1) SEQ ID NO: I所不的序列；(2) DNA分子，其編碼與SEQ ID NO:1所不序列所編碼的多肽相比，具有一個或多個氨基酸殘基的保守替代的多肽；⑶與SEQ ID N0:1所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或編碼其活性片段的序列；⑷與SEQ ID NO:1所示序列互補的序列；(5)由于遺傳密碼的簡并性而衍生自SEQ ID NO:1所示序列的序列之一 ；(6)編碼SEQID NO:2所示氨基酸序列的基因序列。其中，更好的，所述人腫瘤壞死因子(rmhTNFa )的基因序列為① ⑥中任一種:①SEQ ID NO:3所示的序列德DNA分子，其編碼與SEQ ID NO:3所示序列所編碼的多肽相比，具有一個或多個氨基酸殘基的保守替代的多肽；③與SEQ ID NO:3所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或編碼其活性片段的序列；④與SEQ ID NO:3所示序列互補的序列；⑤由于遺傳密碼的簡并性而衍生自SEQ ID NO:3所示序列的序列之一；⑥編碼SEQ ID NO:4所不氣基酸序列的基因序列。其中，更好的，本發(fā)明所述的融合蛋白GFE-1-rmhTNFa的基因序列還可以為a)
f)中任一種:a) SEQ ID NO:5所示的序列；b) DNA分子，其編碼與SEQ ID NO:5所示序列所編碼的多肽相比，具有一個或多個氨基酸殘基的保守替代的多肽；c)與SEQ ID N0:5所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或編碼其活性片段的序列；d)與SEQ IDNO:5所示序列互補的序列；e)由于遺傳密碼的簡并性而衍生自SEQ ID NO:5所示序列的序列之一；f)編碼SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的基因序列。本發(fā)明所述的融合蛋白GFE-1-rmhTNF α的氨基酸序列為SEQ ID NO:6所示。含有所述融合蛋白GFE-1-rmhTNFa的表達載體、表達盒，含有所述融合蛋白GFE-1-rmhTNF α或所述表達載體或表達盒的轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌或重組病毒均屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還有一個目的是提供生產(chǎn)或制備本發(fā)明的融合蛋白的方法，該方法的步驟包括:1)提供DNA分子，所述DNA分子包含可在生物中表達的編碼所述融合蛋白GFE-1-rmhTNF α的核苷酸序列；2)在所述生物中表達所述DNA分子以形成所述融合蛋白GFE-1-rmhTNF α ;和3)分離或純化所述融合蛋白GFE-1-rmhTNF α。本發(fā)明還有一個目的是提供一種藥物組合物，其特征在于，包括藥學上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的上述融合蛋白GFE-1-rmhTNF α、或上述表達載體或表達盒、或上述轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或重組病毒。本發(fā)明還有一個目的是將本發(fā)明的融合蛋白、或表達載體或表達盒、或轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或重組病毒應(yīng)用于制備藥物，特別是制備預(yù)防或治療肺部疾病的藥物。其中所述肺部疾病為肺部腫瘤。本發(fā)明還有一個目的是提供一種重組改構(gòu)的人腫瘤壞死因子(rmhTNF a )，其中所述改構(gòu)過程為:分別用定位基因突變技術(shù)將野生型人腫瘤壞死因子氨基端7個氨基酸殘基去除，并將Pro8Ser9AsP10突變?yōu)锳rg、Lys和Arg，同時把Leu157突變?yōu)镻he，從而獲得重組改構(gòu)的人腫瘤壞死因子(rmhTNF a )。其中所述重組改構(gòu)改善所述人腫瘤壞死因子的蛋白活性，并降低其毒性。該rmhTNFa可用于制備藥物，所述藥物用于預(yù)防或治療腫瘤、炎癥或免疫調(diào)節(jié)。 通過上述過程獲得的人腫瘤壞死因子的基因序列還可以為I) 6)中任一種:1)SEQ ID NO:3所示的序列；2) DNA分子，其編碼與SEQ ID NO:3所示序列所編碼的多肽相t匕，具有一個或多個氨基酸殘基的保守替代的多肽；3)與SEQ ID NO:3所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或編碼其活性片段的序列；4)與SEQ ID NO:3所示序列互補的序列；5)由于遺傳密碼的簡并性而衍生自SEQ ID NO:3所示序列的序列之一；6)編碼SEQ ID NO:4所不氣基酸序列的基因序列。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:肺小血管內(nèi)皮特異性結(jié)合多肽GFE-1與重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子rmhTNF α融合蛋白，其特征在于，分別用定位基因突變技術(shù)將野生型人腫瘤壞死因子氨基端7個氨基酸殘基去除，并將Pr08Ser9AsPui突變?yōu)锳rg、Lys和Arg，同時把Leu157突變?yōu)镻he，構(gòu)建了高效低毒的重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子rmhTNF α。在此基礎(chǔ)上，選用通過隨機肽庫技術(shù)篩選分離出的與肺特異性結(jié)合的多肽GFE-1，利用基因工程方法制備肺小血管內(nèi)皮特異性結(jié)合多肽與rmhTNFa融合基因，并在大腸桿菌中獲得聞效表達。制備如上所述的肺小血管內(nèi)皮特異性結(jié)合多肽GFE-1與重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子rmhTNFa融合蛋白，按以下步驟制備:I)定位基因突變技術(shù)將野生型人腫瘤壞死因子氨基端7個氨基酸殘基去除，并將Pro8Ser9Asp10突變?yōu)锳rg、Lys和Arg，同時把Leu157突變?yōu)镻he，構(gòu)建了高效低毒的重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子rmhTNF α。
2) PBV-GT融合基因表達載體的構(gòu)建根據(jù)GFE-1多肽序列按大腸桿菌慣用碼設(shè)計核酸序列，在多肽的氨基端引入EcoR I酶切位點，羧基端引入BamH I酶切位點，序列如下:S1:5’-AATTCATGTGCGGTTTCGAATGCGTTCGTCAGTGCCCGGAACGTTGCG-3’(SEQ ID NO:
7)S2:5’-GATCCGCAACGTTCCGGGCACTGACGAACGCATTCGAAACCGCACATG-3’(SEQ ID NO:
8)將合成的GFE-1多肽核苷酸片段變性，退火，pGEM3zf(-)克隆載體連接。用BamH I 和 Pst I 雙酶切 pGEM3zf (-) /GFE-1 和 pGEM3zf (-) /rmhTNF- α，分別回收前者大片段和后者小片段進行連接，鑒定正確后命名為pGEM3zf (-)-GT。用EcoR I和Pst I雙酶切pGEM3zf(-)-GT和表達載體PBV220，分別回收前者小片段和后者大片段進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α，挑取單克隆提取質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Pst I雙酶切鑒定正確后得到目的菌株，命名為PBV-GT。3)融合蛋白的誘導表達與純化 將PBV-GT/DH5 α接種于含100 μ g/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，30 V振搖培養(yǎng)過夜，再以1:100比例轉(zhuǎn)接到含Amp的培養(yǎng)基中，繼續(xù)30°C振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期(A_為0.4-0.6)，迅速升溫至42°C誘導4h誘導表達。收集菌體，溶菌酶裂菌后離心收集上清，用40%及65%飽和硫酸銨于0°C分段鹽析，離心，以透析外液(20mM Tris-HCl，pH=8.5，ImM EDTA) 30mL溶解該段沉淀蛋白，透析后過 Q-Sepharose FF,收集 0.07-0.lmol/L NaCl 洗脫峰,再透析后過 SP-Sepharose FF,收集0.4-0.5mol/L NaCl洗脫峰即為純化產(chǎn)物。4)純化后融合蛋白的Western印跡將純化后的融合蛋白用SDS-PAGE分離后，用半干轉(zhuǎn)膜儀電轉(zhuǎn)至NC膜上，洗滌，2%BSA的TBST于37°C封閉lh，洗滌，依次加入鼠抗人TNF單克隆抗體和堿性磷酸酶標記的羊抗鼠抗體孵育，用ECL顯影。5)重組蛋白的體外活性測定按照經(jīng)典的L929細胞毒法進行測定。6)體內(nèi)分布實驗將30只昆明小鼠隨機分組，設(shè)空白對照120min組(注射生理鹽水)、rmhTNF- α 40 μ g/kg60min 組、GFE-l-rmhTNF40 μ g/kg30min、60min、120min 組。各組小鼠尾靜脈給藥(0.05mL/10g)，給藥后眼眶靜脈采血并分離血清。小鼠處死取肺、肝、腎組織并分離勻漿上清。使用夾心ELISA檢測小鼠血清和勻漿上清中TNF-α濃度。另取肺、肝、腎組織固定，石蠟包埋后切片，按SP試劑盒所示步驟進行免疫組織化學染色。以PBS替代一抗作陰性對照。


圖1是重組克隆 載體pGEM3zf(_)/GT的酶切鑒定圖，其中1:DNA marker ;2，3:EcoR I 和 Pst I 雙酶切 pGEM3zf (-) /GT0圖2是PBV-GT質(zhì)粒DNA測序結(jié)果圖3是融合蛋白GFE-1-rmhTNF誘導表達的SDS-PAGE圖譜，其中1:蛋白質(zhì)分子量標準；2:未誘導菌體總蛋白；3:42°C誘導表達4h后菌體總蛋白；4:裂解上清總蛋白；5:包涵體。圖4是融合蛋白GFE-1-rmhTNF純化后的SDS-PAGE圖譜，其中1:蛋白質(zhì)分子量標準；2:未誘導菌體總蛋白；3:裂解上清總蛋白；4:通過Q-S^harose FF后的總蛋白；5:通過SP-Sepharose FF后的總蛋白。圖5是純化后融合蛋白的Western印跡,其中1:未誘導菌體總蛋白的Western印跡；2:誘導純化后菌體總蛋白的Western印跡。圖6是小鼠血清與組織中TNF濃度ELISA檢測結(jié)果；圖7是免疫組織化學染色顯示融合蛋白的體內(nèi)分布。免疫組化顯示GFE-1-rmhTNF在小鼠肺(A)Jf(B)J^(C)及rmhTNF-α在小鼠肺(D)組織的分布，生理鹽水組為空白對照(Ε)。
具體實施例方式下面將通過具體實施例對本發(fā)明作詳細的描述。按照本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:使用定位基因突變技術(shù)構(gòu)建了高效低毒的重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子rmhTNFa。然后根據(jù)GFE-1多肽序列按大腸桿菌慣用碼設(shè)計核酸序列，在多肽兩端引入酶切位點，連接入pGEM3zf(_)克隆載體。用BamH I和Pst I雙酶切pGEM3zf (-) /GFE-1和pGEM3zf (-) /rmhTNF- α，分別回收前者大片段和后者小片段進行連接，構(gòu)建PBV-GT融合基因表達載體。轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞，升溫誘導表達后，經(jīng)硫酸銨分段鹽析及離子交換作用層析純化重組蛋白，最終獲得了高純度的融合蛋白，并采用SDS-PAGE和Western blot對其進行鑒定。通過經(jīng)典的L929殺傷試驗測定其生物學活性，并檢測其體內(nèi)分布。結(jié)果表明，融合蛋白GFE-1-rmhTNF，可顯著殺傷L929細胞并特異性富集于小鼠肺組織。實現(xiàn)上述GFE-1-rmhTNF融合蛋白的制備方法，按照以下步驟進行:1.PBV-GT融合基因表達載體的構(gòu)建使用定位基因突變技術(shù)將野生型人腫瘤壞死因子氨基端7個氨基酸殘基去除，并將Pro8Ser9Asp10突變?yōu)锳rg、Lys和Arg，同時把Leu157突變?yōu)镻he，構(gòu)建了高效低毒的重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子rmhTNF α。根據(jù)GFE-1多肽序列按大腸桿菌慣用碼設(shè)計核酸序列，在多肽的氨基端引入EcoR I酶切位點，羧基端引入BamH I酶切位點，序列如下:S1: 5’ -AATTCATGTGCGGTTTCGAATGCGTTCGTCAGTGCCCGGAACGTTGCG-3’ (SEQ IDNO:7)；S2:5’-GATCCGCAACGTTCCGGGCACTGACGAACGCATTCGAAACCGCACATG-3’(SEQ ID NO:
8)將合成的GFE-1多肽核苷酸片段變性，退火，與EcoR I和BamH I消化過的pGEM3zf (-)克隆載體連接。用 BamH I 和 Pst I 雙酶切 pGEM3zf (-)/GFE-1 和 pGEM3zf (-) /rmhTNF-α，分別回收前者大片段和后者小片段進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α，挑取單克隆提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確后命名為pGEM3zf(-)-GT(圖1)。用EcoR I和Pst I雙酶切pGEM3zf(-)-GT和表達載體pBV220，分別回收前者小片段和后者大片段進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α，挑取單克隆提取質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定正確后得到目的菌株，命名為 PBV-GT (圖 2)。2.GFE-1-rmhTNF融合蛋白的誘導表達與純化將PBV-GT/DH5 α接種于含100 μ g/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，30 V振搖培養(yǎng)過夜，再以1:100比例轉(zhuǎn)接到含Amp的培養(yǎng)基中，繼續(xù)30°C振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期(A_為
0.4-0.6)，迅速升溫至42°C誘導4h，離心收集菌體，溶菌酶法裂菌，SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物及表達形式(圖3)。收集菌體，按每克菌體懸浮于7mL STE中并加入20mg溶菌酶裂菌，4°C攪拌20min，加入脫氧膽酸鈉至菌液呈粘稠拉絲狀，加入IM MgCl2 (0.2mL/g)及DNAase I ,攪拌至無拉絲現(xiàn)象，離心收集上清，用40%及65%飽和硫酸銨于0°C分段鹽析，離心，以透析外液(20mMTris-HCl，pH=8.5，ImM EDTA) 30mL溶解該段沉淀蛋白，以50倍體積透析外液透析24h，過Q-Sepharose FF, IM NaCl連續(xù)梯度洗脫7-8個柱體積后，收集0.07-0.lmol/L NaCl洗脫峰，再以50倍體積透析外液透析24h，過SP-S^harose FF, IM NaCl連續(xù)梯度洗脫5個柱體積后，收集0.4-0.5mol/L NaCl洗脫峰，SDS-PAGE分析純化產(chǎn)物(圖4)。將其對30倍體積PBS透析，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，分裝后_20°C保存?zhèn)溆谩?.純化后的GFE-l-rmhTNF融合蛋白Western印跡檢測將純化后的融合蛋白用SDS-PAGE分離后，用半干轉(zhuǎn)膜儀電轉(zhuǎn)至NC膜上，洗滌，2%BSA的TBST于37°C封閉lh，洗滌，依次加入鼠抗人TNF單克隆抗體和堿性磷酸酶標記的羊抗鼠抗體孵育，用ECL顯影(圖5)。4.重組蛋白 的體外活性測定將L929細胞調(diào)整濃度為lX105/mL，以每孔100 μ L接種于96孔板，37 °C，5%C02培養(yǎng)至細胞貼滿板壁80%以上。將凍干粉狀待測樣品與標準品梯度稀釋后，吸去培養(yǎng)板中細胞培養(yǎng)上清，每孔依次加樣100 μ L，37°C，5%C02培養(yǎng)過夜，鏡檢在半數(shù)死亡孔到達D或E后，吸棄上清，每孔加入30 μ I MTT溶液(5mg/mL)，37°C繼續(xù)孵育4h，吸棄上清，每孔加入100 μ I DMSO,充分振蕩后于酶標儀490nm波長下測定各孔OD值。以490nm波長下OD值對稀釋倍數(shù)作圖。效價按下式計算:hTNFa成品活性(IU/mL)=標準品效價X (樣品預(yù)稀釋倍數(shù)/標準品預(yù)稀釋倍數(shù))X (標準品半效量稀釋度/樣品相當于標準品半效量的稀釋度)結(jié)果如表I所示。表I融合蛋白GFE-1-rmhTNF在純化過程中的活性和蛋白回收率
權(quán)利要求
1.重組的、分離的或合成的融合蛋白GFE-1-rmhTNFα，其特征在于，該融合蛋白包括: 1)肺小血管內(nèi)皮特異性結(jié)合多肽(GFE-1)，或具有GFE-1活性的片段或變體； 2)經(jīng)過重組改構(gòu)而獲得的人腫瘤壞死因子(rmhTNFa)或其片段或變體，所述重組改構(gòu)改善其蛋白活性。
2.權(quán)利要求1所述的融合蛋白GFE-1-rmhTNFa，其中所述肺小血管內(nèi)皮特異性結(jié)合多肽(GFE-1)的基因序列為⑴ (6)中任一種: (I)SEQ ID NO:1所示的序列； ⑵DNA分子，其編碼與SEQ ID NO:1所示序列所編碼的多肽相比，具有一個或多個氨基酸殘基的保守替代的多肽； ⑶與SEQ ID NO:1所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或編碼其活性片段的序列； (4)與SEQID NO:1所示序列互補的序列； (5)由于遺傳密碼的簡并性而衍生自SEQID NO:1所示序列的序列之一； (6)編碼SEQID NO:2所示氨基酸序列的基因序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白GFE-1-rmhTNFα，其中所述人腫瘤壞死因子CrmhTNFa )的基因序列為① ⑥中任一種: ①SEQID NO:3所不的序列； ②DNA分子，其編碼與SEQID NO:3所示序列所編碼的多肽相比，具有一個或多個氨基酸殘基的保守替代的多肽； ③與SEQID NO:3所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或編碼其活性片段的序列； ④與SEQID NO:3所示序列互補的序列； ⑤由于遺傳密碼的簡并性而衍生自SEQID NO:3所示序列的序列之一； ⑥編碼SEQID NO:4所不氣基酸序列的基因序列。
4.權(quán)利要求1至3任一所述的融合蛋白GFE-l-rmhTNFa，其中所述融合蛋白GFE-1-rmhTNF α的基因序列為a) f)中任一種: a)SEQ ID NO:5所示的序列； b)DNA分子，其編碼與SEQ ID NO:5所示序列所編碼的多肽相比，具有一個或多個氨基酸殘基的保守替代的多肽； c)與SEQID NO:5所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或編碼其活性片段的序列； d)與SEQID NO:5所不序列互補的序列； e)由于遺傳密碼的簡并性而衍生自SEQID NO:5所示序列的序列之一； f)編碼SEQID NO:6所示氨基酸序列的基因序列。
5.權(quán)利要求1至4任一所述的融合蛋白GFE-1-rmhTNFα，其中所述融合蛋白GFE-1-rmhTNF α的氨基酸序列為SEQ ID NO:6所示。
6.含有權(quán)利要求1-5任一所述融合蛋白GFE-1-rmhTNFα的表達載體或表達盒。
7.權(quán)利要求1-5任一所述融合蛋白GFE-1-rmhTNFa的制備方法，該方法的步驟包括: O提供DNA分子，所述DNA分子包含可在生物中表達的編碼所述融合蛋白GFE-1-rmhTNF α的核苷酸序列； 2)在所述生物中表達所述DNA分子以形成所述融合蛋白GFE-1-rmhTNFα ;和 3)分離或純化所述融合蛋白GFE-1-rmhTNFα。
8.藥物組合物，其特征在于，包括藥學上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權(quán)利要求1-5任一項的融合蛋白GFE-1-rmhTNF α、或權(quán)利要求6的表達載體或表達盒。
9.權(quán)利要求1-5任一所述融合蛋白GFE-1-rmhTNFα、或權(quán)利要求6的表達載體或表達盒在制備預(yù)防或治療肺部疾病的藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其`中所述肺部疾病為肺部腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及了一種肺小血管內(nèi)皮特異性結(jié)合多肽GFE-1與重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子rmhTNFα的融合蛋白及其制備方法。將人腫瘤壞死因子氨基端7個氨基酸殘基去除，并將Pro8Ser9Asp10突變?yōu)锳rg、Lys和Arg，同時把Leu157突變?yōu)镻he，構(gòu)建了高效低毒的重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子rmhTNFα。在此基礎(chǔ)上，選用通過隨機肽庫技術(shù)篩選分離出的與肺特異性結(jié)合的多肽GFE-1，利用基因工程方法將其融合在rmhTNFα的氨基末端，制備的肺小血管內(nèi)皮特異性結(jié)合多肽與rmhTNFα融合蛋白，能在肺組織特異性富集，從而提高腫瘤壞死因子的治療特異性，減少全身用量，降低毒副反應(yīng)。
文檔編號A61K38/19GK103172753SQ201310095008
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月22日
發(fā)明者李維娜, 張闊, 薛曉暢, 李萌, 張存, 郝強, 王增祿, 張偉, 張英起 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學