一種負壓沸騰提取制備低酸型銀杏提取物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從銀杏葉負壓沸騰提取制備低酸型銀杏提取物的方法。以經(jīng)過粉碎后的銀杏鮮葉或干葉為原料，用含水乙醇為提取溶劑，采用負壓沸騰提取，提取液過濾后，先采用石英沙和微孔離心過濾進行預(yù)處理，濾過液用陶瓷膜和超濾膜分離純化，將過超濾膜的溶液用納濾膜濃縮，回收乙醇，濃縮液再經(jīng)過大孔樹脂純化和脫酸樹脂脫酚酸，通過負壓微波噴霧干燥或真空冷凍干燥制備得到低酸型銀杏提取物。采用該技術(shù)制得的銀杏提取物酸值低，純度高，銀杏黃酮含量＞28％，內(nèi)酯含量＞8％，銀杏酸≤1ppm，可以成為工業(yè)上生產(chǎn)低酸型銀杏提取物產(chǎn)品的一種新技術(shù)。
【專利說明】一種負壓沸騰提取制備低酸型銀杏提取物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物提取物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種從銀杏葉負壓沸騰提取制備低酸型銀杏提取物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]銀杏樹(Ginkgo Biloba L.)是活化石,是長壽的象征。銀杏葉富含抗病的生物活性因子，如黃酮、內(nèi)酯、聚戊烯醇、多糖、蛋白質(zhì)等等，備受國際的重視。德國Schwabe公司利用溶劑萃取技術(shù)生產(chǎn)標準銀杏葉提取物(GBE761)，主要活性物為黃酮和內(nèi)酯，是治療心腦血管疾病的暢銷植物藥。國際上銀杏葉提取物(GBE)及制劑年銷售額達65億美元，一直位居美國草藥市場銷售前三位。銀杏是我國重要的經(jīng)濟林樹種，面積40萬公頃，白果年產(chǎn)量3萬噸，干葉20萬噸，占世界資源70%以上，銀杏產(chǎn)業(yè)鏈200億元。其中EGB及其制劑EGB年產(chǎn)量1500噸，60 %產(chǎn)品出口，年銷售額達50億元。
[0003]國外銀杏葉提取物(EGB)的加工技術(shù)主要沿用德國Schwabe公司專利技術(shù)，采用丙酮提取、正己烷等非極性溶劑除脂，調(diào)PH沉淀離心，乙酸乙酸和正丁醇等有機溶劑反復(fù)萃取，生產(chǎn)標準銀杏葉提取物(EGb761)，其中銀杏黃酮> 24%，內(nèi)酯>6%，銀杏酸小于5ppm。該工藝步驟多，有機溶劑耗量大，產(chǎn)品收率低于1%，成本昂貴。國內(nèi)早期GBE生產(chǎn)大多采用50% -80%醇水熱回流提取，回收乙醇溶劑，再通過聚酰胺樹脂吸附黃酮，收率1%左右，黃酮含量在16 % -28 %，但產(chǎn)品中內(nèi)酯損失，銀杏酸> 200ppm。隨后國內(nèi)EGB的工藝作了創(chuàng)新，采用酸水提取或高濃度乙醇回流提取，再用大孔樹脂吸附，EGB收率提高2% -3%,成本明顯降低，但質(zhì)量明顯下降，黃酮含量在16%-22%，內(nèi)酯含量4% -6%，因此，一些企業(yè)用蘆丁摻假。在銀杏葉 脫烷基酚酸工藝上，國內(nèi)采用氯仿、正己烷等溶劑反復(fù)萃取，黃酮苷元有損失，并且有害溶劑殘留。
[0004]銀杏葉黃酮和萜內(nèi)酯為熱敏性活性物，在光、熱和酶作用下容易分解，產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物。國內(nèi)銀杏葉提取物生產(chǎn)企業(yè)大多采用傳統(tǒng)的熱回流提取，如浸熱式和滲漉式為主，生產(chǎn)工藝存在最突出的問題是:時間長，提取效率低；對于黃酮和萜內(nèi)酯產(chǎn)生破壞較多；提取液質(zhì)量不高，黃酮和內(nèi)酯含量低，雜質(zhì)多，造成后續(xù)工藝提純復(fù)雜，如濃縮、醇沉、水沉、過濾、離心、吸附等，從而造成了生產(chǎn)周期長，能耗和成本大大上升，且資源浪費嚴重。
[0005]CN200910154390.7公開了一種用乙醇水溶液熱回流提取和用大孔樹脂純化制備銀杏提取物的方法，以銀杏葉為原料，先以50-70%的乙醇溶液提取，提取液離心后進行兩次上大孔樹脂解析，解吸液回收酒精濃縮成稠膏，真空干燥即得銀杏提取物，所得銀杏提取物中總黃酮含量為25%，總內(nèi)酯為6%，銀杏酸小于5ppm。該方法所得的銀杏提取物純度相對較高，銀杏酸含量較低，但是采用兩次上柱解析，產(chǎn)品的得率相對較低，且生產(chǎn)成本會比較聞。
[0006]CN201110179948.4提出一種以硅膠柱分離純化制備低酚酸銀杏提取物的方法，該方法以粗銀杏提取物為原料，上硅膠柱，然后用甲醇-石油醚-乙酸乙酯溶液進行洗脫。該方法所用的甲醇和乙酸乙酯對人體傷害大，石油醚屬于易燃易爆品，安全性低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007]CN200710191922.5公開一種銀杏提取物的制備方法，以市售銀杏提取物為原料，先用石油醚脫酸，乙酸乙酯提內(nèi)酯，乙酸乙酯部位用丙酮溶解過氧化鋁柱精制處理得內(nèi)酯；不溶于乙酸乙酯部位分別用大孔樹脂和聚酰胺樹脂進行純化得到黃酮。該方法所得銀杏提取物純度高，總黃酮為29%，總內(nèi)酯為8%，銀杏酸小于lppm。但該方法耗時比較長，操作繁瑣，且使用大量有機溶劑，對人體傷害大，且生產(chǎn)成本太高。
[0008]CN03117443.4發(fā)明了一種用丙酮水溶液熱回流提取和用離子交換樹脂純化制備高含量銀杏提取物的方法，以銀杏葉為原料，先以60%的丙酮溶液提取，提取液離心后上離子交換樹脂，然后用丙酮和乙酸乙酯等有機溶劑進行解析，解吸液回收有機溶劑后干燥即得銀杏提取物，所得銀杏提取物純度高，總黃酮含量為30%，總內(nèi)酯為12%。但該方法生產(chǎn)成本高，產(chǎn)品得率低，且使用大量有毒的有機溶劑，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0009]針對以上發(fā)明的不足，本發(fā)明提出采用負壓沸騰法提取銀杏葉中有效成分，提取液先用石英沙和微孔離心過濾進行預(yù)處理，然后再通過陶瓷膜、有機超濾膜、大孔樹脂純化和脫酸樹脂脫酚酸得到低酸值的銀杏提取物。減壓提取技術(shù)提取銀杏葉中熱敏性成分，在負壓狀態(tài)下使得提取溶劑在較低的溫度下沸騰，使有效成分得以較快的溶出，不僅提取溫度低、提取效率高，而且節(jié)約能源；采用石英沙和微孔離心過濾對提取液進行預(yù)處理，可有效保護膜和樹脂，延長其使用壽命；膜和樹脂集成分離純化銀杏葉中有效成分，使用溶劑少，安全無毒，工藝操作簡單，所使用的溶劑和大孔樹脂均可重復(fù)利用，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)的銀杏提取物純度高，銀杏黃酮> 28%，內(nèi)酯> 8%，且銀杏酸含量低，銀杏酸< lppm?？梢猿蔀楣I(yè)上生產(chǎn)低酸值銀杏提取物產(chǎn)品的一種新技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的在于提供一種從銀杏葉負壓沸騰提取制備低酸型銀杏提取物的方法，該方法操作簡單，生產(chǎn)成本低，所得的銀杏提取物產(chǎn)品純度高，酸值低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0011]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
[0012]一種負壓沸騰提取制備低酸型銀杏提取物的方法，具體步驟如下:
[0013]一種負壓沸騰提取制備低酸型銀杏提取物的方法，其特征在于，其步驟如下:
[0014](1)負壓提取
[0015]將銀杏鮮葉或銀杏干葉粉碎至0.5cm以下，用40~80%乙醇為提取溶劑，負壓沸騰提取30~90min，提取溶劑與銀杏葉的比例為1~30:1，提取溫度為20~70°C，提取壓力為0.01~0.09MPa，提取I~4次，過濾，合并提取液；
[0016](2)提取液預(yù)處理
[0017]提取液先進行石英沙過濾，粒度為100~300目，然后進行微孔離心過濾，孔徑為
1.0 μ m ~1.5 μ m,離心轉(zhuǎn)速為 3000 ~6000rpm ；
[0018]⑶膜分離
[0019]將上述濾液通過0.1 μ m~0.8 μ m孔徑的陶瓷膜，操作壓力為0.15~0.3MPa，將陶瓷膜透過液繼續(xù)通過截留相對分子質(zhì)量為5000~50000的超濾膜，將超濾膜透過液用截留相對分子質(zhì)量為100~300的納濾膜進行濃縮，濃縮液減壓回收乙醇，用酸調(diào)節(jié)濃縮液的PH值至4~6后得到上柱液；
[0020](4)大孔樹脂純化
[0021]上柱液用大孔樹脂吸附，先以水洗至無色，再以40%~90%乙醇溶液洗脫，洗脫劑用量為3~6倍的柱體積，收集乙醇洗脫部分；
[0022](5)脫酸樹脂脫酚酸
[0023]上述乙醇洗脫液再經(jīng)過脫酸樹脂吸附，流出液減壓回收乙醇濃縮得到濃縮液；
[0024](6)干燥
[0025]將上述濃縮液進行負壓微波噴霧干燥或真空冷凍干燥，真空度0.05~0.1Ompa,負壓微波噴霧干燥進口溫度160~195°C，出口溫度60~85°C，微波干燥溫度40~60°C，冷凍溫度小于_35°C，干燥后得到低酸型銀杏提取物，含水量小于5%，經(jīng)HPLC分析，銀杏黃酮> 28%，內(nèi)酯> 8%，銀杏酸≤lppm。
[0026]本專利以銀杏葉為原料，采用負壓沸騰法提取銀杏黃酮和內(nèi)酯，負壓沸騰提取為熱回熱、微波提取或超聲波提取中一種，將銀杏鮮葉或銀杏干葉粉碎至0.5cm以下，用40~80%乙醇為提取溶劑，負壓沸騰提取30~90min，優(yōu)選45~60min，提取溶劑與銀杏葉粉末的比例為I~30: I，優(yōu) 選5~15: 1，提取溫度為20~70°C，優(yōu)選40~60°C，提取壓力為0.01~0.09MPa,優(yōu)選0.06~0.09MPa,提取I~4次，優(yōu)選2~3次，提取液先進行石英沙過濾，粒度為100~300目，然后進行微孔離心過濾,孔徑為1.0 μ m~1.5 μ m,離心轉(zhuǎn)速為3000~6000rpm ;銀杏總黃酮的提取率大于90%，銀杏內(nèi)酯的提取率大于80%。
[0027]本專利采用膜分離純化提取濾液，將提取濾液先通過0.1 μ m~0.8 μ m孔徑的陶瓷膜，優(yōu)選陶瓷膜孔徑為0.5 μ m，操作壓力為0.15~0.3MPa，將陶瓷膜透過液繼續(xù)通過截留相對分子質(zhì)量為5000~50000的超濾膜，優(yōu)選超濾膜截留相對分子質(zhì)量為10000 ;結(jié)果表明，0.5μπι孔徑的膜通量、總黃酮和總內(nèi)酯的轉(zhuǎn)移率和除雜率都相對較高；隨著超濾膜截留相對分子質(zhì)量的增大，膜通量有不同程度的增大，但是除雜率會降低，結(jié)果表明，超濾膜截留相對分子質(zhì)量為10000時總黃酮和總內(nèi)酯的轉(zhuǎn)移率和除雜率都相對較高，故優(yōu)選截留相對分子質(zhì)量為10000的超濾膜進行純化。
[0028]本專利將超濾膜透過液用截留相對分子質(zhì)量為100~300的納濾膜進行濃縮，濃縮液減壓回收乙醇，用酸調(diào)節(jié)濃縮液的PH值至4~6后得到上柱液；所述酸為鹽酸、醋酸或檸檬酸中的一種。由于銀杏黃酮類化合物多為多羥基酚類化合物，具有一定的極性和酸性，因為酸性物質(zhì)更容易在酸性環(huán)境中吸附，所以在弱酸性條件下，銀杏黃酮類化合物在溶液中保持分子形式，容易被吸附，且在酸性條件下，銀杏內(nèi)酯以分子形式存在于溶液中，也容易被樹脂吸附，故將上柱液用酸調(diào)節(jié)PH值為4~6。
[0029]本專利采用大孔樹脂吸附純化銀杏內(nèi)酯和黃酮，先以水洗至無色，再以40 %~90%乙醇洗脫，洗脫用乙醇溶液的用量為3~6倍的柱體積，優(yōu)選為3~4倍的柱體積，收集乙醇洗脫部分，所述的所述的大孔樹脂類型為AB-8、D101、DM130、DM-2或ΗΡ20中的一種，本發(fā)明考察了不同大孔樹脂對銀杏總黃酮和總內(nèi)酯的靜態(tài)吸附容量試驗和靜態(tài)吸附-洗脫性能試驗，結(jié)果表明AB-8和HP20均有較大的吸附率，并且在解吸附試驗中，AB-8樹脂的解吸量和洗脫液中總黃酮和總內(nèi)酯的純度均高于HP20樹脂，故優(yōu)選使用AB-8樹脂分離純化銀杏總黃酮和總內(nèi)酯。
[0030]銀杏黃酮類化合物主要成分為槲皮素、山奈素、異鼠李素，分子中羥基數(shù)目較多，極性較大，內(nèi)酯的極性適中，因此選用極性較大的溶劑作為洗脫劑，考慮到試劑使用的安全性，故選用乙醇溶液為洗脫劑，并以水為極性調(diào)節(jié)劑。
[0031]本發(fā)明對大孔樹脂的洗脫溶劑進行了考察，取已充分吸附銀杏黃酮和內(nèi)酯的AB-8樹脂100mL裝柱，分別以蒸餾水及20 %、40 %、60 %、70 %、80 %、90 %乙醇各400ml恒速洗脫，每個濃度收集為I個流份，分別測定各洗脫液流份中總黃酮和總內(nèi)酯的洗脫率，結(jié)果表明，70%乙醇可將90%以上的銀杏黃酮和內(nèi)酯洗脫下來，故優(yōu)選70%乙醇為洗脫溶媒。
[0032]本專利采用脫酸樹脂脫除銀杏酚酸，將大孔樹脂乙醇洗脫液經(jīng)過脫酸樹脂吸附，收集流出液；所述的脫酸樹脂類型為D301、D360、TS-2或HPD500中的一種；本發(fā)明考察了不同脫酸樹脂對銀杏酚酸的去除效果，結(jié)果表明TS-2的脫除率最高，并且銀杏黃酮和內(nèi)酯的損失率最小，故優(yōu)選使用TS-2脫酸樹脂脫銀杏酚酸。
[0033]本發(fā)明茶皂素的干燥方式為負壓微波噴霧干燥或真空冷凍干燥，真空度0.05~0.lOmpa，負壓微波噴霧干燥進口溫度160~195°C，出口溫度60~85°C，微波干燥溫度40~60°C，冷凍溫度小于_35°C，干燥后得到低酸型銀杏提取物，含水量小于5%。經(jīng)HPLC分析，銀杏黃酮> 28%，內(nèi)酯> 8%，銀杏酸< lppm。所述負壓微波噴霧干燥所使用的負壓微波噴霧干燥器為自制，由真空系統(tǒng)、冷凝系統(tǒng)、旋風分離器、微波加熱、高速霧化器、溫控回路等構(gòu)成。
[0034]本發(fā)明采用HPLC測定銀杏提取物中總黃酮、總內(nèi)酯和銀杏酸的含量，其中銀杏黃酮色譜分析條件為:色譜柱(:18005(0 4.611111^200111111，5 4 111)，流動相:甲醇-水(含0.4%的磷酸)體積比50: 50，紫外(360nm)檢測器檢測，流速為lml/min ;銀杏內(nèi)酯色譜分析條件為:色譜柱C180DS(04.6mmX200mm，5ym)，流動相:正丙醇-四氫呋喃-水體積比I: 15: 84，示差或蒸發(fā)光散射檢測器檢測，流 速為lml/min;銀杏酸色譜分析條件為:色譜柱(:18005(0 4.611111^200111111，5 4 111)，流動相:甲醇-水(含0.4% 的乙酸)體積比 90: 10，紫外(3IOnm)檢測器檢測,流速為lml/min。
[0035]本發(fā)明的有益效果:
[0036](I)本發(fā)明采用負壓沸騰法提取銀杏葉中黃酮和內(nèi)酯，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酸水或醇溶劑高溫提取濃縮銀杏提取物，解決了目前高溫煎煮產(chǎn)生諸多弊病不合理且單一的操作條件。不僅保證銀杏葉熱敏性成分不被破壞，且提取時間大大縮短，提取率大大提高。
[0037](2)本發(fā)明采用石英沙和微孔離心過濾對提取液進行預(yù)處理，可有效去除提取液中的大顆粒雜質(zhì)，減少膜和樹脂的污染，延長其使用壽命。
[0038](3)采用陶瓷膜、超濾膜和納濾膜分離藕合技術(shù)，不僅除去高分子蛋白、膠質(zhì)、葉綠素、高分子單寧等雜質(zhì)，而且膜分離過程無相變，確保了銀杏葉活性成分理化性質(zhì)的穩(wěn)定性，富集銀杏黃酮、內(nèi)酯等非常均衡的混合物成分，提高了產(chǎn)品的活性。
[0039](4)本發(fā)明采用對銀杏黃酮、內(nèi)酯有選擇性吸附的大孔樹脂，可有效的提高產(chǎn)品純度，獲得高純度的銀杏提取物產(chǎn)品(銀杏黃酮> 28%，內(nèi)酯> 8% )
[0040](5)本發(fā)明采用脫酸樹脂脫酚酸，可有效解決銀杏脫酚酸的問題，獲得的銀杏提取物中銀杏酸< lppm，該技術(shù)能耗和生產(chǎn)成本低，清潔環(huán)保，技術(shù)通用性好，應(yīng)用范圍廣。
[0041](6)本發(fā)明工藝操作簡單，生產(chǎn)成本低，安全性高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】[0042]圖1低酸值銀杏提取物的制備方法流程圖
[0043]圖2負壓微波噴霧干燥器結(jié)構(gòu)示意圖
[0044]圖3銀杏葉提取物中總黃酮的HPLC圖譜
[0045]圖4銀杏葉提取物中總內(nèi)酯的HPLC(示差檢測器)圖譜
[0046]圖5銀杏葉提取物中總內(nèi)酯的HPLC(蒸發(fā)光散射檢測器)圖譜
[0047]圖6銀杏葉提取物中銀杏酸的HPLC圖譜
[0048]圖7不同陶瓷膜孔徑下膜通量隨時間的變化
[0049]圖8不同陶瓷膜孔徑對銀杏總黃酮和內(nèi)酯轉(zhuǎn)移率及除雜率的影響
[0050]圖9不同截留分子量的超濾膜通量隨時間的變化
[0051]圖10不同截留分子量的超濾膜對銀杏總黃酮和內(nèi)酯轉(zhuǎn)移率及除雜率的影響【具體實施方式】
[0052]以下實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，本發(fā)明不受此限制。
[0053]實施例1
[0054]1.銀杏提取物中總 黃酮的HPLC分析方法
[0055]采用紫外檢測方法
[0056](I)色譜條件:色譜柱C18ODS (Φ4.6_X 200_，5 μ m)，流動相:甲醇-水(含0.4%的磷酸)體積比50: 50,檢測波長360nm,流速為lml/min。
[0057](2)標準曲線繪制:分別精密稱取槲皮素、山奈酚、異鼠李素對照品適量，置于IOmL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為0.854，0.562，0.259mg/mL的混合對照品溶液；依次精密量取混合對照品溶液0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.40,0.50mL置于5mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻后分別取10 μ L進樣，進行色譜分析。槲皮素標準曲線方程為I = 51908x+63760, r = 0.9996 ;山奈酚標準曲線方程為y =40870x+52295, r = 0.9998 ;異鼠李素標準曲線方程為 y = 28656x+17124, r = 0.9996。
[0058](3)樣品純度測定:精密稱取銀杏提取物粉末適量(約0.1g)，置于50mL圓底燒瓶中，加入30mL甲醇-25%鹽酸(4: I)混合液，搖勻溶解，置于水浴(85°C )中加熱回流30min,然后迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得樣品溶液。照上述方法HPLC測定，結(jié)果銀杏提取物中總黃酮含量為28.76%。HPLC色譜見圖2。
[0059]2.銀杏提取物中總內(nèi)酯的HPLC分析方法
[0060]方法一:采用示差檢測方法
[0061](I)色譜條件:色譜柱C18ODS(04.6mmX200mm，5ym)，流動相:正丙醇-四氫呋喃-水體積比1: 15: 84,流速為lml/min。
[0062](2)標準曲線繪制:分別稱取白果內(nèi)酯及銀杏內(nèi)酯A、B、C對照品0.82、0.85、0.86、0.76mg，用50%甲醇溶解定容在IOmL容量瓶中，制成銀杏內(nèi)酯的對照品溶液。分別精密吸取上述銀杏內(nèi)酯對照品溶液2.5、10、25、40、60yL進樣，進行色譜分析。白果內(nèi)酯標準曲線方程為y = 8.704X+11.348, r = 0.9998 ;銀杏內(nèi)酯A標準曲線方程為y =
11.610x+295.543，r = 0.9999 ;銀杏內(nèi)酯 B 標準曲線方程為 y = 8.867x+22.302，r =
0.9998 ;銀杏內(nèi)酯 C 標準曲線方程為 y = 5.365x+135.128，r = 0.9998。
[0063](3)樣品純度測定:取銀杏葉提取物50mg，加水2ml置水浴中溫熱使溶散，加2%鹽酸溶液I滴，用乙酸乙酯振搖提取4次(3ml、2ml、2ml ,2ml),合并提取液，用5 %醋酸鈉溶液4ml洗滌，分取醋酸鈉液，再用乙酸乙酯2ml洗滌，合并乙酸乙酯提取液及洗液，用水洗滌2次，每次4ml分取水液，用乙酸乙酯2ml洗滌，合并乙酸乙酯液，回收溶劑至干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻即得。照上述方法HPLC測定，結(jié)果銀杏提取物中總內(nèi)酯含量為7.14%。HPLC色譜見圖3。
[0064]方法二:采用蒸發(fā)光散射檢測方法
[0065](I)色譜條件:色譜柱C18ODS(04.6mmX200mm，5ym)，流動相:正丙醇-四氫呋喃-水體積比1: 15: 84，流速為0.8ml/min。蒸發(fā)光散射檢測條件:蒸發(fā)溫度100°C，氣體流量2.5L/min。
[0066](2)標準曲線繪制:精密稱取銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯對照品適量，用甲醇溶解并定容至5ml棕色容量瓶中，制成濃度分別為1.014，1.062，1.102，1.124mg/mL的混合對照品溶液。依次精密量取混合對照品溶液1，0.6,0.5,0.4,0.25，0.2,0.16mL置于2mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻后分別取10 μ L進樣，進行色譜分析。銀杏內(nèi)酯A標準曲線方程為y = 299487x-22158，r = 0.9995 ;銀杏內(nèi)酯B標準曲線方程為y = 247160x_20445，r = 0.9996 ;銀杏內(nèi)酯C標準曲線方程為y = 300035x_23162, r = 0.9995 ;白果內(nèi)酯標準曲線方程為 y = 314056x-28416, r = 0.9998。
[0067](3)樣品純度測定:取銀杏葉提取物50mg，加水2ml置水浴中溫熱使溶散，加2%鹽酸溶液I滴，用乙酸乙 酯振搖提取4次(3ml、2ml、2ml、2ml)，合并提取液，用5%醋酸鈉溶液4ml洗滌，分取醋酸鈉液，再用乙酸乙酯2ml洗滌，合并乙酸乙酯提取液及洗液，用水洗滌2次，每次4ml分取水液，用乙酸乙酯2ml洗滌，合并乙酸乙酯液，回收溶劑至干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻即得。照上述方法HPLC測定，結(jié)果銀杏提取物中總內(nèi)酯含量為8.32%。HPLC色譜見圖4。
[0068]3.銀杏提取物中總酚酸的HPLC分析方法
[0069]采用紫外檢測方法
[0070](I)色譜條件:色譜柱C18ODS (Φ4.6_Χ200_，5μπι)，流動相:甲醇-水(含0.4%的乙酸)體積比90: 10,檢測波長310nm,流速為lml/min。
[0071](2)標準曲線繪制:精密稱取一定量的銀杏酸標準品，加流動相溶解，配制成300mg/L的貯備液，分別定量移取此貯備液，用流動相稀釋成濃度分別為150，90，60，30，9，
0.9mg/L的系列對照液，分別取20 μ L進樣，進行色譜分析。銀杏酸的標準曲線方程為y =
8.85x+12.40，r = 0.9998。
[0072](3)樣品純度測定:準確稱取銀杏提取物30g，置于500ml燒瓶中，然后用90%甲醇定容，在50°C水浴鍋內(nèi)加熱溶解，過濾，準確吸取濾液2ml于試管中，加入正己烷6ml，適量HCl-NaCl溶液(pH = 2.5)振蕩，靜置，待分層后，準確吸取上層有機相3ml于另一干燥試管中，測試前真空揮干萃取劑，殘渣溶于甲醇5ml。照上述方法HPLC測定，結(jié)果銀杏提取物中銀杏酸含量為0.86ppm。HPLC色譜見圖5。
[0073]實施例2
[0074]負壓提取和提取液預(yù)處理
[0075]將銀杏鮮葉或銀杏干葉粉碎至0.5cm以下，用40~80%乙醇為提取溶劑，負壓沸騰提取30~90min，優(yōu)選45~60min，提取溶劑與銀杏葉粉末的比例為I~30: 1，優(yōu)選5~15: 1，提取溫度為20~70°C，優(yōu)選40~60°C，提取壓力為0.01~0.09MPa，優(yōu)選
0.06~0.09MPa，提取I~4次，優(yōu)選2~3次，提取液先進行石英沙過濾，粒度為100~300目，然后進行微孔離心過濾，孔徑為1.0 μ m~1.5 μ m，離心轉(zhuǎn)速為3000~6000rpm ;銀杏總黃酮的提取率大于90%，銀杏內(nèi)酯的提取率大于80%。
[0076]本發(fā)明研究了提取壓力、醇濃度、料液比和提取時間對荼皂素提取率的影響，設(shè)計了 4因素4水平[L16(44)]正交試驗，以銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯的提取率為指標考察減壓沸騰提取工藝，試驗結(jié)果見表1，表2，表3。
[0077]表1銀杏葉負壓提取正交試驗結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種負壓沸騰提取制備低酸型銀杏提取物的方法，其特征在于，其步驟如下: (1)負壓提取 將銀杏鮮葉或銀杏干葉粉碎至0.5cm以下，用40~80%乙醇為提取溶劑，負壓沸騰提取30~90min，提取溶劑與銀杏葉的比例為1~30: 1，提取溫度為20~70°C，提取壓力為0.01~0.09MPa,提取I~4次，過濾，合并提取液； (2)提取液預(yù)處理 提取液先進行石英沙過濾，粒度為100~300目，然后進行微孔離心過濾，孔徑為1.0 μ m ~1.5 μ m,離心轉(zhuǎn)速為 3000 ~6000rpm ； (3)膜分離 將上述濾液通過0.1 μ m~0.8 μ m孔徑的陶瓷膜，操作壓力為0.15~0.3MPa，將陶瓷膜透過液繼續(xù)通過截留相對分子質(zhì)量為5000~50000的超濾膜，將超濾膜透過液用截留相對分子質(zhì)量為100~300的納濾膜進行濃縮，濃縮液減壓回收乙醇，用酸調(diào)節(jié)濃縮液的PH值至4~6后得到上柱液； (4)大孔樹脂純化 上柱液用大孔樹脂吸附，先以水洗至無色，再以40%~90%乙醇溶液洗脫，洗脫劑用量為3~6倍的柱體積，收集乙醇洗脫部分； (5)脫酸樹脂脫酚酸 上述乙醇洗脫液再經(jīng)過脫酸樹脂吸附，流出液減壓回收乙醇濃縮得到濃縮液； (6)干燥 將上述濃縮液進行負壓微波噴霧干燥或真空冷凍干燥，真空度0.05~0.1Ompa,負壓微波噴霧干燥進口溫度160~195°C，出口溫度60~85°C，微波干燥溫度40~60°C，冷凍溫度小于_35°C，干燥后得到低酸型銀杏提取物，含水量小于5%，經(jīng)HPLC分析，銀杏黃酮>28%，內(nèi)酯> 8%，銀杏酸≤1ppm0
2.如權(quán)利要求1所述的一種負壓沸騰提取制備低酸型銀杏提取物的方法，其特征在于:步驟(1)中所述負壓沸騰提取為熱回熱、微波提取或超聲波提取中的一種。
3.如權(quán)利要求1所述的一種負壓沸騰提取制備低酸型銀杏提取物的方法，其特征在于:步驟(3)中所述酸為鹽酸、醋酸或檸檬酸中的一種。
4.如權(quán)利要求1所述的一種負壓沸騰提取制備低酸型銀杏提取物的方法，其特征在于:步驟(4)中所述的大孔樹脂類型為AB-8、D101、DM130、DM-2或HP20中的一種。
5.如權(quán)利要求1所述的一種負壓沸騰提取制備低酸型銀杏提取物的方法，其特征在于:步驟(5)中所述的脫酸樹脂類型為D301、D360、TS-2或HPD500中的一種。
6.如權(quán)利要求1所述的一種負壓沸騰提取制備低酸型銀杏提取物的方法，其特征在于:步驟(6)中所述負壓微波噴霧干燥所使用的負壓微波噴霧干燥器為自制，由真空系統(tǒng)、冷凝系統(tǒng)、旋風分離器、微波加熱、高速霧化器、溫控回路等構(gòu)成。
7.如權(quán)利要求1所述的一種負壓沸騰提取制備低酸型銀杏提取物的方法，其特征在于:步驟(6)中所述的HPLC分析，其中銀杏黃酮色譜分析條件為:色譜柱:C180DS，Φ4.6mmX 200mm，5 μ m，流動相:體積比為50: 50的甲醇-含0.4%的磷酸水溶液，紫外檢測器檢測，檢測波長為360nm，流速為lml/min ;銀杏內(nèi)酯色譜分析條件為:色譜柱:C180DS，.04.6_^200111111，5 4 111，流動相:體積比為1: 15: 84的正丙醇-四氫呋喃-水溶液，示差或蒸發(fā)光散射檢測器檢測，流速為lml/min ;銀杏酸色譜分析條件為:色譜柱=C18ODS,Φ4.6mmX 200mm，5 μ m，流動相:體積比為90: 10的甲醇-含0.4%的乙酸水溶液，紫外檢測器檢測，檢測波長為3IOnm,流速為1ml/min。
【文檔編號】A61P9/00GK103961381SQ201310027647
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月24日
【發(fā)明者】王成章, 周昊 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所