一種絲素軟骨復(fù)合體義耳及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬組織工程和醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種絲素軟骨復(fù)合體義耳及其制備方法和在耳廓再造中應(yīng)用。本發(fā)明采用絲素軟骨復(fù)合體作為支撐材料，以絲素蛋白為涂層，制成絲素軟骨復(fù)合體義耳。本發(fā)明的絲素軟骨復(fù)合體義耳可進(jìn)一步用于在小耳畸形的耳廓再造。本發(fā)明利用絲素的良好生物相容性和促進(jìn)成細(xì)胞生長的作用，能避免自體取肋骨的傷害，減少并發(fā)癥，又可以長期或永久有效存活，本發(fā)明絲的素軟骨復(fù)合體義耳解決了在耳廓再造方面其他生物材料造成的排斥問題，同時可以避免自體取肋骨造成的損傷，為臨床耳廓再造及應(yīng)用提供有意義的參考。
【專利說明】—種絲素軟骨復(fù)合體義耳及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬組織工程和醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種絲素軟骨復(fù)合體義耳及其制備方法和在耳廓再造中應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]研究顯示，先天性小耳畸形是較為常見的頭面部畸形，據(jù)統(tǒng)計，其發(fā)病率為0.4~
5.5/10000，其臨床主要表現(xiàn)為外耳形態(tài)改變，外耳的基本結(jié)構(gòu)消失或部分消失，僅有殘余耳軟骨及部分耳垂，甚至沒有上述結(jié)構(gòu)，而且常伴有外耳道閉鎖、中耳畸形和頜面部畸形等癥狀。耳廓的畸形或缺少嚴(yán)重影響患者的容貌和心理健康。面對小耳畸形造成的壓力，很多患者不能較好的適應(yīng)社會，研究顯示，小耳畸形患者的心理問題檢出率明顯高于健康正常人，因此，治療小耳畸形的首選方案是進(jìn)行早期治療。目前，較好的治療先天性小耳畸形的方法是耳再造術(shù)。耳郭具有復(fù)雜的三維解剖結(jié)構(gòu)，理想的耳再造需再現(xiàn)出清晰的耳郭三維立體結(jié)構(gòu)，因此耳再造術(shù)成為面部整形外科最困難和最富挑戰(zhàn)性的手術(shù)之一。
[0003]耳支架的選取在耳廓再造術(shù)中起著至關(guān)重要的作用。自1920年Gilliesz開創(chuàng)全耳再造以來，先后有多種組織材料充當(dāng)耳支架，如金屬支架、硅橡膠支架、聚四氟乙烯支架、同種異體肋軟骨、異種軟骨、自體軟骨、骨以及人造組織代用品等。就目前來看，硅橡膠支架、金屬支架因為覆蓋組織薄，易出現(xiàn)排斥反應(yīng)等弊端，已經(jīng)被淘汰；聚四氟乙烯支架較柔軟，僅適合于部分耳缺損少的病例；同種異體肋軟骨易吸收變形，致使手術(shù)成功率降低，異種肋軟骨更易導(dǎo)致手術(shù)失??；自體肋軟骨仍是目前應(yīng)用最廣泛、最為安全的支架材料，但存在取材痛苦，并發(fā)癥多等弊端。因此選用更合適的耳廓支架進(jìn)行耳廓再造是尤為需要的。
[0004]在眾多的生物材料中，絲素有良好的生物相容性,無毒,無刺激性,在生物醫(yī)用領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用，如醫(yī)用絲素皮膚再生膜、隱形眼鏡、細(xì)胞培養(yǎng)基及人工腦膜的實驗研究等等。但迄今為止，國內(nèi)外尚無絲素在耳廓再造方面應(yīng)用的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種絲素軟骨復(fù)合體及其在耳廓再造中的應(yīng)用，尤其涉及提供一種絲素軟骨復(fù)合體義耳及其制備方法；進(jìn)一步的，提供絲素蛋白復(fù)合體義耳在臨床耳廓再造中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明采用絲素軟骨復(fù)合體作為支撐材料，以絲素蛋白為涂層，制成絲素軟骨復(fù)合體義耳。本發(fā)明利用絲素的良好生物相容性和促進(jìn)成細(xì)胞生長的作用，能避免自體取肋骨的傷害，減少并發(fā)癥，又可以長期或永久有效存活。
[0007]本發(fā)明絲素軟骨復(fù)合體可用作臨床小耳畸形耳廓再造，能為探討絲素軟骨復(fù)合體在臨床重建耳廊提供有意義的參考。 [0008]更具體的，本發(fā)明的一種絲素軟骨復(fù)合體義耳，其特征在于，采用絲素復(fù)合物作支撐材料，以軟骨細(xì)胞作為外層，制成絲素軟骨復(fù)合體義耳，所述的絲素蛋白重量/體積濃度為6-20%;本發(fā)明的實施例中，優(yōu)選所述的絲素蛋白重量/體積濃度為6-12%，更優(yōu)選的絲素蛋白重量/體積濃度為10%。
[0009]本發(fā)明中，所述的絲素軟骨復(fù)合體義耳制成正常耳廓結(jié)構(gòu)。
[0010]本發(fā)明的絲素軟骨復(fù)合體義耳通過下述方法制備，其包括步驟:
[0011]I)制備絲素蛋白
[0012]采用廢桑蠶生絲在NaHC03水溶液中脫膠，將脫膠絲溶于LiBr水溶液中，溶解，過濾，除去雜質(zhì)，得絲素蛋白鹽溶液，用去離子水透析除去溶液中的LiBr，得絲蛋白，再濃縮，PEG透析，絲素蛋白溶液離心去除雜質(zhì)，留上清液，得重量/體積濃度為6-20%的絲素蛋白，本發(fā)明的實施例中優(yōu)選所述的絲素蛋白重量/體積濃度為6-12%，更優(yōu)選的絲素蛋白重量/體積濃度為10% ；
[0013]2)制備絲素蛋白支架
[0014]用制得的絲素蛋白溶液與正丁醇混合，攪拌后，放入_20°C冰箱24小時，室溫條件下，制得絲素蛋白多孔支架；去離子水清洗去除殘存正丁醇，制得不同孔徑尺寸的多孔絲素蛋白多孔支架；
[0015]3)軟骨細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)
[0016]采用獲得的無菌成年雄性SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨(由復(fù)旦大學(xué)動物實驗中心提供)，先后采用胰蛋白酶EDTA消化(GIBC0，0.25% trypsin)，用II型膠原酶消化后，過濾，離心，重懸細(xì)胞，最后接種于懸浮瓶中培養(yǎng)(GIBC0，高糖DMEM+15%胎牛血清)，隔天換液；
[0017]4)軟骨細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)染
[0018]傳代軟骨細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染(6enechem公司，效價:2E+8TU/ml，PGC-FU-GFP-3FLAG)；
[0019]5)絲素蛋白膜和軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)
[0020]轉(zhuǎn)染后，軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，然后種植在多孔絲素蛋白上，將絲素蛋白膜與軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)4周；制得絲素軟骨復(fù)合體義耳材料。
[0021]經(jīng)檢測，結(jié)果顯示:
[0022]I)軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點
[0023]關(guān)節(jié)軟骨消化后，獲得的軟骨細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，6小時后，部分細(xì)胞附著；24小時后，大量細(xì)胞附著；5天后，細(xì)胞間相互接觸；平均爬滿時間為7天；附著軟骨細(xì)胞的形態(tài)特點是拉伸成偽足多邊形形狀、鵝卵石般均勻爬滿培養(yǎng)瓶底部(如圖2a所示)，由于軟骨細(xì)胞內(nèi)具有II型膠原蛋白，因此在特定的折射率材料中能被觀察到(如圖2b所示)；
[0024]通常情況下，根據(jù)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的II型膠原蛋白蛋白抗原特點，通過免疫熒光組織化學(xué)檢測可檢測到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的II型膠原蛋白蛋白(紅色熒光標(biāo)記II型膠原蛋白，如圖3所示)，通過甲苯胺藍(lán)染色，細(xì)胞漿也可著色(藍(lán)色)，此即II類型膠原著色(如圖4所示)；
[0025]2)檢測轉(zhuǎn)染效率
[0026]收集兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞，即80000細(xì)胞在24孔板，或者300000細(xì)胞在6孔板中，72小時后利用GFP (綠色熒光蛋白)檢測轉(zhuǎn)染情況，熒光倒置顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況，所述的GFP代表細(xì)胞在不同濃度的慢病毒中的轉(zhuǎn)染效率(如圖5所示)；
[0027]3)免疫熒光組織化學(xué)分析絲素軟骨復(fù)合體生物材料
[0028]選用免疫熒光組織化學(xué)分析絲素軟骨復(fù)合體生物材料，細(xì)胞表面均勻分布在絲素支架上，軟骨細(xì)胞優(yōu)先種植在絲素支架的表面區(qū)域，然后才是中心區(qū)域(如圖6所示)，4周后，支架的毛孔內(nèi)布滿結(jié)締組織及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，經(jīng)免疫熒光組織化學(xué)分析表明，II型膠原蛋白在各組均有表示，GFP表達(dá)于部分軟骨細(xì)胞(圖7顯示了軟骨細(xì)胞與周圍組織聯(lián)系緊密)，大量的軟骨細(xì)胞滲透并存活于絲素材料中(如圖7A，B, C，D所示)；
[0029]4)激光共聚焦顯微鏡檢測絲素軟骨復(fù)合體材料
[0030]激光共聚焦顯微鏡立體顯示生物材料復(fù)合體，即絲素軟骨復(fù)合體，細(xì)胞表面均勻分布在絲素支架上，軟骨細(xì)胞優(yōu)先種植在絲素支架的表面區(qū)域，然后才是中心區(qū)域(如圖6所示)，4周后，支架的毛孔內(nèi)布滿結(jié)締組織及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，GFP表達(dá)于部分軟骨細(xì)胞(如圖8，9所示)，不同的激光共聚焦可以部分顯示軟骨細(xì)胞附著與絲素支架上(如圖10所示)。
[0031]本發(fā)明的絲素軟骨復(fù)合體義耳材料經(jīng)檢測，結(jié)果顯示，軟骨細(xì)胞可以在絲素支架上附著、生長，其中，絲素表面生長的軟骨細(xì)胞優(yōu)先種植在絲素支架的表面區(qū)域，然后才是中心區(qū)域，且具有一定的極性、層次和厚度，但是在不同部位和不同面積的絲素表面厚度完全不同。
[0032]本發(fā)明采用絲素復(fù)合體義耳材料作為支撐材料，既可以利用絲素的良好生物相容性和促進(jìn)細(xì)胞生長的作用，能避免自體取肋骨的傷害，減少并發(fā)癥，又可以長期或永久有效存活。
[0033]本發(fā)明的絲素軟骨復(fù)合體義耳可進(jìn)一步用于在小耳畸形的耳廓再造。
[0034]本發(fā)明采用 絲素軟骨復(fù)合體義耳用于耳廓再造，解決了在耳廓再造方面其他生物材料造成的排斥問題，同時可以避免自體取肋骨造成的損傷；其中的絲素尤其具有如下優(yōu)點:可以促進(jìn)上皮爬行，避免術(shù)后植入體排除，預(yù)期可獲得滿意的效果，具有理想氣管替代物的五個標(biāo)準(zhǔn)，包括:具有高度生物相容性的合成材料；血管適宜在移植物內(nèi)生長；具上皮組織或適宜于上皮組織生長；有充分的長度以滿足不同程度的缺損修復(fù)；具有足夠硬度以對抗負(fù)壓。
[0035]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明的一種絲素軟骨復(fù)合體義耳及其制備方法進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1:不同孔隙大小的多孔絲素膜，
[0037]其中的A，B, C，D，分別顯示不同孔隙大小的多孔絲素膜，標(biāo)度為100 μ m。
[0038]圖2:顯示了經(jīng)過7天的培養(yǎng)，軟骨細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中形成偽多邊形的形狀，徑向拉伸，鵝卵石均勻地分布在底部的(A，B)，可以看出在細(xì)胞內(nèi)某些具有折光性的物質(zhì)(B)，熒光倒置顯微照相表明部分軟骨細(xì)胞表達(dá)GFP (C，D)。
[0039]圖3:顯示了免疫組織化學(xué)檢測細(xì)胞質(zhì)內(nèi)II型膠原蛋白表達(dá)陽性(熒光標(biāo)記的II型膠原蛋白)，部分軟骨細(xì)胞表達(dá)GFP。
[0040]圖4:顯示了甲苯胺藍(lán)染色，細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中被染色，即是II型膠原蛋白的著色。
[0041]圖5:顯示了在多孔絲素膜內(nèi)的活細(xì)胞GFP表達(dá)。
[0042]圖6:免疫組織化學(xué)分析顯示，在細(xì)胞接種4周后，軟骨細(xì)胞上在表面區(qū)域比中心區(qū)域更豐富，DAPI染色結(jié)果顯示多孔絲素蛋白支架(在一個不規(guī)則的網(wǎng)狀淺色)，核仁(圓形或橢圓形，A圖)，大多數(shù)毛孔都充滿了組織，孔隙內(nèi)填充細(xì)胞外基質(zhì)，II型膠原蛋白表達(dá)(C圖)，部分的軟骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)GFP的表達(dá)(B圖)，圖A，B，C合并為D。
[0043] 圖7:高倍視野觀察免疫組織化學(xué)分析圖像，
[0044]DAPI染色結(jié)果顯示多孔絲素蛋白支架(在一個不規(guī)則的網(wǎng)狀淺色)，核仁(圓形或橢圓形，A圖)，孔隙內(nèi)填充細(xì)胞外基質(zhì)，II型膠原蛋白表達(dá)(C圖)，部分的軟骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)GFP的表達(dá)(B圖)，圖A，B，C合并為D。
[0045]圖8:激光共聚焦掃描三維成像顯示共培養(yǎng)軟骨細(xì)胞緊緊地與周圍組織相連(前視圖)，
[0046]DAPI染色結(jié)果顯示多孔絲素蛋白支架(不規(guī)則的網(wǎng)格狀淡色)和核仁(圓形或橢圓形，A圖)，軟骨細(xì)胞滲透生長入材料中并且存活(圖C，D)，在絲素支架上所有軟骨細(xì)胞表達(dá)功能性蛋白II型膠原。
[0047]圖9:激光共聚焦掃描三維成像顯示共培養(yǎng)軟骨細(xì)胞緊緊地與周圍材料組織(絲素支架)相連(斜側(cè)視圖)。
[0048]圖10:共焦激光掃描部分顯示軟骨細(xì)胞的功能性蛋白(膠原II型)的表達(dá)，和與絲素蛋白細(xì)胞支架的關(guān)系，部分軟骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)GFP表達(dá)(B圖)，圖A，B，C合并為D。
[0049]圖11:用人耳廓取模制得的耳廓型絲素義耳。
【具體實施方式】
[0050]實施例1
[0051]I)制備絲素蛋白
[0052]采用廢桑蠶生絲在NaHC03 (0.5wt% )水溶液中脫膠，將脫膠絲溶于9.3mol/L的LiBr水溶液中，攪拌至蠶絲完全溶解，過濾，除去未溶解的蠶絲及雜質(zhì)，得絲素蛋白鹽溶液，用去離子水透析除去溶液中的LiBr，得濃度為4%的絲蛋白，再濃縮，PEG透析，所得絲素蛋白溶液離心去除雜質(zhì)，留上清液，所得的絲素蛋白濃度為10%，置4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0053]2)制備絲素蛋白支架
[0054]用制得的絲素蛋白溶液與正丁醇1:1混合，攪拌5分鐘(25°C )，放入一個5cmX 5cm聚苯乙烯磁盤,然后放入_20°C冰箱24小時,室溫條件下,絲素蛋白多孔支架制備完成；然后用去離子水清洗去除殘存正丁醇，最后絲素蛋白多孔支架被切割成所需的大小(IcmX IcmX Imm),圖1A, B, C, D顯示了本發(fā)明構(gòu)建的不同孔徑尺寸的多孔絲素蛋白膜；
[0055]3)軟骨細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)
[0056]采用成年雄性SD大鼠(200-250克)(由復(fù)旦大學(xué)動物實驗中心提供)，常規(guī)處理獲得無菌關(guān)節(jié)軟骨，先用胰蛋白酶EDTA消化30分鐘(GIBC0，0.25% trypsin)，接著用II型膠原酶消化8小時(Invitrogen)，然后過濾，離心，重懸細(xì)胞，最后接種于懸浮瓶中培養(yǎng)(GIBC0,高糖DMEM+15%胎牛血清)，隔天換液；
[0057]4)軟骨細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)染
[0058]當(dāng)軟骨細(xì)胞爬滿瓶底，添加5毫升PBS，輕搖，吸出PBS。添加2ml胰蛋白酶EDTA，消化5分鐘，終止消化，再次接種于懸浮瓶中培養(yǎng)，傳代軟骨細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染(Genechem公司，效價:2E+8TU/ml，pGC-FU-GFP-3FLAG);具體轉(zhuǎn)染方法即用轉(zhuǎn)染80000細(xì)胞放入24孔版或300000細(xì)胞放入6孔板，慢病毒加入高糖有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，72小時后用GFP熒光評價轉(zhuǎn)染效率；
[0059]5)絲素蛋白膜和軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)
[0060]轉(zhuǎn)染后，軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，然后被種植在多孔絲素蛋白上，將絲素蛋白膜與軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)4周；制得絲素軟 骨復(fù)合體義耳材料。
[0061]制得絲素軟骨復(fù)合體義耳材料進(jìn)行檢測，結(jié)果顯色，細(xì)胞表面均勻分布在絲素支架上，軟骨細(xì)胞優(yōu)先種植在絲素支架的表面區(qū)域，然后才是中心區(qū)域(如圖6所示)，4周后，支架的毛孔內(nèi)布滿結(jié)締組織及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，免疫熒光組織化學(xué)分析表明，II型膠原蛋白在各組均有表示，GFP表達(dá)于部分軟骨細(xì)胞軟骨細(xì)胞與周圍組織聯(lián)系緊密(如圖7所示)，大量的軟骨細(xì)胞滲透并存活于絲素材料中；進(jìn)一步，本發(fā)明中使用人耳廓取模制備得到耳廓型絲素義耳(如圖11所示)。
【權(quán)利要求】
1.一種絲素軟骨復(fù)合體義耳，其特征在于，采用絲素復(fù)合物作支撐材料，以軟骨細(xì)胞作為外層，制成絲素軟骨復(fù)合體義耳，所述的絲素蛋白重量/體積濃度為6-20%。
2.按權(quán)利要求1所述的絲素軟骨復(fù)合體義耳，其特征在于，所述的絲素蛋白重量/體積濃度為6-12%。
3.按權(quán)利要求1所述的絲素軟骨復(fù)合體義耳，其特征在于，所述的絲素蛋白重量/體積濃度為10%。
4.按權(quán)利要求1所述的絲素軟骨復(fù)合體義耳，其特征在于，所述的絲素軟骨復(fù)合體義耳是正常耳廓結(jié)構(gòu)。
5.權(quán)利要求1所述的絲素軟骨復(fù)合體義耳的制備方法，其特征在于，其包括步驟: 1)制備絲素蛋白 采用廢桑蠶生絲在NaHC03水溶液中脫膠，將脫膠絲溶于LiBr水溶液中，溶解，過濾，除去雜質(zhì)，得絲素蛋白鹽溶液，用去離子水透析除去溶液中的LiBr，得絲蛋白，再濃縮，PEG透析，絲素蛋白溶液離心去除雜質(zhì)，留上清液，得重量/體積濃度為6-20%的絲素蛋白； 2)制備絲素蛋白支架 用制得的絲素蛋白溶液與正丁醇混合，攪拌后，放入_20°C冰箱24小時，室溫條件下，制得絲素蛋白多孔支架；去離子水清洗去除殘存正丁醇，制得不同孔徑尺寸的多孔絲素蛋白多孔支架； 3)軟骨細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng) 采用獲得的無菌成年雄性SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨，先后采用胰蛋白酶EDTA消化(GIBCO，0.25% trypsin),用II型膠原酶消化后,過濾,離心,重懸細(xì)胞,最后接種于懸浮瓶中培養(yǎng)，隔天換液； 4)軟骨細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)染 傳代軟骨細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染； 5)絲素蛋白膜和軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng) 轉(zhuǎn)染后，軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，然后種植在多孔絲素蛋白上，將絲素蛋白膜與軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)4周；制得絲素軟骨復(fù)合體義耳材料。
6.按權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所屬步驟I)的NaHC03為0.5wt%;所述LiBr水溶液為9.3mol/L。
7.按權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所屬步驟2)的絲素蛋白溶液與正丁醇以I: I混合。
8.按權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所屬步驟3)的懸浮瓶中培養(yǎng)成分含有高糖DMEM+15%胎牛血清。
9.權(quán)利要求1所述的絲素軟骨復(fù)合體義耳在制備小耳畸形的耳廓再造材料中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61L27/22GK103933613SQ201310021352
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月18日
【發(fā)明者】倪玉蘇, 江毅, 文建川, 陳新, 邵正中, 于慧前, 孫珊, 李雯, 李華偉 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院