本發(fā)明涉及癌癥的治療和/或診斷。特別地，本發(fā)明涉及自然殺傷/T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)的治療和/或診斷。

背景技術(shù)：
自然殺傷(NK)細(xì)胞淋巴瘤是一類(lèi)非霍奇金淋巴瘤(NHL)。大多數(shù)的NHL(90％)是B細(xì)胞起源的。NK細(xì)胞淋巴瘤不是由B細(xì)胞形成的。然而，對(duì)于NK細(xì)胞淋巴瘤由正常細(xì)胞形成仍然存在爭(zhēng)論。尤其是，是否NK細(xì)胞淋巴瘤表征真正的NK細(xì)胞的存在或僅僅表征具有異常細(xì)胞標(biāo)記的T細(xì)胞的存在是有爭(zhēng)論的。在缺乏NK細(xì)胞淋巴瘤的確切血統(tǒng)的明確證明的情況下，分類(lèi)時(shí)許多研究者傾向于使用術(shù)語(yǔ)NK/T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)。自然殺傷T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)多見(jiàn)于亞洲國(guó)家和拉丁美洲的一些地區(qū)。在亞洲，它占所有成熟T細(xì)胞淋巴瘤病例的高達(dá)一半(1)。然而，相對(duì)于更常見(jiàn)的B細(xì)胞淋巴瘤，很少有人知道它的分子特征及發(fā)病機(jī)理。在這種亞型的淋巴瘤中，基礎(chǔ)科學(xué)和臨床研究幾乎沒(méi)有進(jìn)展，由于目前還沒(méi)有對(duì)于NKTCL公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)第一線治療，繼續(xù)構(gòu)成在治療這些患者中的重大挑戰(zhàn)。無(wú)論多藥化療和受累野放療，5年總生存率約為對(duì)非鼻NKTCL為9％和對(duì)鼻NKTCL為42％(2，3)。與相對(duì)多見(jiàn)的B細(xì)胞淋巴瘤相比，關(guān)于NKTCL的分子特征和發(fā)病機(jī)理知之甚少。這部分原因可能是西方的相對(duì)稀有性和難以獲取足夠的活檢。NKTCL的常規(guī)化療治療迄今取得效果差，其結(jié)果對(duì)III期或IV期的患者幾乎總是致命的。理想的是識(shí)別新的遺傳畸變，和NKTCL中的潛在的治療靶，以及NKTCL的潛在治療劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明涉及癌癥的治療和/或診斷，特別是自然殺傷/T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)的治療和/或診斷。根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及一種用于在受試者中預(yù)測(cè)自然殺傷T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)的易感性和/或診斷NKTCL的方法，其包括測(cè)試所述受試者至少一種JAK基因的基因型，其中，突變型JAK基因的存在表明受試者具有形成NKTCL的風(fēng)險(xiǎn)和/或具有NKTCL。本發(fā)明還涉及一種用于在受試者中預(yù)測(cè)自然殺傷T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)的易感性和/或診斷NKTCL的方法，其包括測(cè)試所述受試者是否表達(dá)野生型或突變型JAK蛋白，其中突變型JAK蛋白的表達(dá)表明該受試者面臨形成NKTCL的風(fēng)險(xiǎn)和/或具有NKTCL。根據(jù)第二方面，本發(fā)明涉及用于篩選能夠治療NKTCL的藥劑的方法，其包括：(i)提供包含至少一個(gè)突變型JAK基因的NKTCL細(xì)胞系；(ii)用所述藥劑接觸所述NKTCL細(xì)胞系；和(iii)確定藥劑對(duì)哺乳動(dòng)物NKTCL細(xì)胞系的效果；其中，所述藥劑的降低NKTCL細(xì)胞系的生活力、生長(zhǎng)和/或增殖和/或增加NKTCL細(xì)胞系凋亡的能力是藥劑治療NKTCL的能力的指示。根據(jù)第三方面，本發(fā)明涉及用于篩選能夠降低至少一種JAK蛋白的活性的藥劑的方法，該方法包括：(i)提供攜帶突變型JAK基因的NKTCL細(xì)胞系；(ii)用所述藥劑接觸所述NKTCL細(xì)胞系；和(iii)確定所述藥劑對(duì)于NKTCL細(xì)胞系的效果；其中，所述藥劑降低生活力、生長(zhǎng)和/或增殖和/或增加凋亡的能力是候選藥劑降低至少一種JAK蛋白的活性的能力的指示。根據(jù)第四方面，提供一種包含至少一個(gè)突變型JAK基因的NKTCL動(dòng)物模型。根據(jù)第五方面，本發(fā)明涉及一種治療自然殺傷T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)的方法，其包括給受試者施用JAK抑制劑。本發(fā)明還包括JAK抑制劑在制備用于治療自然殺傷T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)的藥物中的用途。本發(fā)明還包括用于治療自然殺傷T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)的JAK抑制劑。附圖說(shuō)明圖1示出了導(dǎo)致NKTCL樣品中JAK3A572V和A573V突變的識(shí)別的高分辨率熔解(HRM)和Sanger測(cè)序數(shù)據(jù)。圖1(a)表示在JAK3基因的JH2假性激酶結(jié)構(gòu)域上的A572V和A573V突變的位置。用于驗(yàn)證JAK3突變的高分辨率熔解(HRM)和Sanger測(cè)序數(shù)據(jù)示于圖1(b)到(h)。具體地：圖1(b)以餅圖示出了JAK3A572V和A573V突變的百分率(n＝65)。圖1(c)示出了標(biāo)準(zhǔn)化為野生型樣品的三種基因型的HRM差異圖(在平行測(cè)定中)：野生型JAK3、雜合JAK3(c.1715C＞T，p.Ala572Val)和純合JAK3(c.1715C＞T，p.Ala572Val)。圖1(d)示出了測(cè)序且證實(shí)為雜合JAK3(c.1718C＞T，p.Ala573Val)突變的福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)NKTCL樣品的代表性HRM差異曲線。值得注意的是，由于相同的C＞T的轉(zhuǎn)換，具有JAK3A572V或A573V突變的樣品的HRM差異曲線是類(lèi)似的。JAK3野生型等位基因的代表性的測(cè)序圖譜示于圖1(e)中，A572V雜合突變的代表性的測(cè)序圖譜示于圖1(f)中，A573V雜合突變的代表性的測(cè)序圖譜示于圖1(g)中，A572V純合突變的代表性的測(cè)序圖譜示于圖1(h)中。圖2示出了證明IL-2對(duì)JAK3，以及STAT5磷酸化和CP-690，550對(duì)NKTCL細(xì)胞系治療作用的數(shù)據(jù)。圖2(a)示出了用或不用重組人IL-2(200IU/ml)培養(yǎng)，在48h后收集，并通過(guò)免疫印跡測(cè)定JAK3和STAT5磷酸化的NK-S1(JAK-突變)和KHYG-1(野生型)細(xì)胞的免疫印跡結(jié)果。用泛JAK抑制劑CP-690，550處理NK-S1、KHYG-1和K562(對(duì)照)細(xì)胞系，評(píng)價(jià)結(jié)果示于圖2(b)至圖2(d)。圖2(b)顯示了在48小時(shí)通過(guò)免疫印跡評(píng)估樣品中的STAT5磷酸化。圖2(c)顯示了在72小時(shí)通過(guò)MTS測(cè)定分析的細(xì)胞存活率。圖2(d)顯示了在72小時(shí)通過(guò)膜聯(lián)蛋白V-FITC染色進(jìn)行評(píng)估并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析的藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。c和d中的結(jié)果代表重復(fù)3次的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。*表示通過(guò)配對(duì)Student′s-t檢驗(yàn)p＜0.05。圖3提供顯示突變NKTCL細(xì)胞系NK-S1的細(xì)胞因子非依賴(lài)性生長(zhǎng)的數(shù)據(jù)。尤其是，用或不用重組人IL-2(0至200IU/ml)培養(yǎng)NK-S1(JAK3突變)和KHYG-1(JAK3野生型)。NK-S1的細(xì)胞生活力數(shù)據(jù)示于圖3(a)中和KHYG-1的細(xì)胞生活力數(shù)據(jù)示于圖3(b)中。用MTS測(cè)定每天監(jiān)測(cè)細(xì)胞生活力持續(xù)七天，細(xì)胞生長(zhǎng)表示為490nm處的吸光度減去在650nm處的參考。在a和b中的結(jié)果表示重復(fù)3次的平均±標(biāo)準(zhǔn)差圖4顯示了證明JAK3A572V突變導(dǎo)致NKTCL細(xì)胞的組成型JAK3活性和IL-2非依賴(lài)性增殖的數(shù)據(jù)。圖4A示出之前用100nM的JAK3siRNA(si-JAK3)或?qū)φ誷iRNA(si-Ctrl)處理24小時(shí)和進(jìn)行增殖測(cè)定直至72小時(shí)(右面板)的NK-S1細(xì)胞的數(shù)據(jù)。同時(shí)，收集這些細(xì)胞，以及用抗磷酸化JAK3(pJAK3)、磷酸化STAT5(pSTAT5)、JAK3、STAT5或β-肌動(dòng)蛋白的抗體作為正常化對(duì)照對(duì)蛋白質(zhì)提取液進(jìn)行Western印跡。圖4B顯示了用野生型JAK3(JAK3WT)或突變型JAK3的表達(dá)載體(即JAK3A572V)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的KHYG-1細(xì)胞的數(shù)據(jù)。通過(guò)Western印跡檢測(cè)這些細(xì)胞中相對(duì)的pJAK3、pSTAT5、JAK3和STAT5的水平(上面板)，用或不用IL-2進(jìn)行使用這些細(xì)胞的增殖測(cè)定48小時(shí)(下面板)。所有結(jié)果表示為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值SEM。*相對(duì)于載體對(duì)照(載體)p＜0.05。釋義如在本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“抑制劑”是指能夠降低蛋白質(zhì)的活性的任何物質(zhì)，例如JAK抑制劑能夠降低JAK蛋白的活性。特別地，JAK3抑制劑能降低JAK3蛋白的活性。降低蛋白質(zhì)的活性可以是直接或間接的，例如，通過(guò)干擾蛋白質(zhì)的表達(dá)或蛋白質(zhì)在生物背景中發(fā)揮功能的機(jī)制。例如，JAK3激酶可能需要ATP分子與ATP結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合，這樣，通過(guò)特異性結(jié)合并阻斷ATP結(jié)合位點(diǎn)，降低JAK3激酶的活性。JAK蛋白的活性也可能需要另一種蛋白的活性，例如細(xì)胞因子受體，因而這種蛋白的活性的干擾也可以降低JAK蛋白的活性?？蛇x擇地，少數(shù)的JAK3激酶蛋白可以通過(guò)干擾在相關(guān)核酸結(jié)構(gòu)域中的基因表達(dá)(例如相應(yīng)mRNA的翻譯)來(lái)表達(dá)，。按照WHO分類(lèi)(6)，NKTCL指的是NK/T細(xì)胞淋巴瘤。術(shù)語(yǔ)“自然殺傷T細(xì)胞淋巴瘤”、NKTCL和“NK/T細(xì)胞淋巴瘤”可互換使用，是指一類(lèi)非B-細(xì)胞來(lái)源的非霍奇金淋巴瘤(NHL)。NKTCL具有腫瘤壞死的典型形態(tài)，血管中心(angiocentricity)以及相應(yīng)的免疫表型，特別是CD56、胞質(zhì)CD3的存在以及EBER幾乎普遍的存在。NK/T細(xì)胞淋巴瘤不同于成熟T細(xì)胞白血病/淋巴瘤，它是T細(xì)胞譜系的疾病且與HTLV-1感染相關(guān)。術(shù)語(yǔ)“治療/處理”包括減輕、預(yù)防和/或消除一種或多種與疾病(例如自然殺傷/T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL))相關(guān)的癥狀。本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明涉及癌癥的治療和/或診斷，特別是自然殺傷/T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)的治療和/或診斷。根據(jù)第一方面，提供一種用于在受試者中預(yù)測(cè)自然殺傷T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)的易感性和/或診斷NKTCL的方法，其包括測(cè)試所述受試者至少一個(gè)JAK基因的基因型，其中，突變型JAK基因的存在表明受試者面臨形成NKTCL的風(fēng)險(xiǎn)和/或具有NKTCL。雜合或純合突變型JAK基因的存在表明受試者面臨形成NKTCL的風(fēng)險(xiǎn)和/或具有NKTCL?？梢詼y(cè)試任何JAK基因的任何一種或組合。受測(cè)試的JAK基因可以選自JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。例如，可以測(cè)試JAK3和/或JAK1基因。通常，SEQIDNO：1表示野生型JAK3基因。在一個(gè)實(shí)例中，包括在SEQIDNO：1的核苷酸15792位點(diǎn)由T置換C和/或在核苷酸15795位點(diǎn)由T置換C的突變型JAK3基因的存在表示受試者面臨形成NKTCL的風(fēng)險(xiǎn)和/或具有NKTCL。通常，SEQIDNO：3表示野生型JAK1基因。在另一實(shí)例中，包括在SEQIDNO：3的核苷酸124823位點(diǎn)由G置換T的突變型JAK1基因的存在表示受試者是易受感染的和/或具有NKTCL。突變型JAK1和JAK3基因的同時(shí)存在還表明受試者面臨形成NKTCL的風(fēng)險(xiǎn)和/或具有NKTCL。所述方法可以在來(lái)自受試者的分離的細(xì)胞樣品上進(jìn)行。分離的細(xì)胞樣品可以是來(lái)自血液和/或腫瘤的樣品。因此，該方法可以進(jìn)一步包括提供來(lái)自受試者的分離的細(xì)胞樣品用于測(cè)試。該方法可以進(jìn)一步包括從受試者、血液樣品和/或分離的細(xì)胞樣品中分離核酸分子用于所述測(cè)試。所述分離的核酸分子可以包括基因組DNA或mRNA。特別地，所述測(cè)試可以在基因組DNA、mRNA和/或cDNA中來(lái)進(jìn)行。任何合適的技術(shù)可以用于測(cè)試。例如，測(cè)試可以是通過(guò)序列分析、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和/或逆轉(zhuǎn)錄PCR。特別是，例如Sanger測(cè)序和高分辨率熔解(Highresolutionmelt)技術(shù)可以用于測(cè)試。在本發(fā)明的另一方面中，提供了一種用于在受試者中預(yù)測(cè)自然殺傷T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)的易感性和/或診斷NKTCL的方法，其包括測(cè)試所述受試者是否表達(dá)野生型或突變型JAK蛋白，其中，突變型JAK蛋白的表達(dá)表明該受試者面臨形成NKTCL的風(fēng)險(xiǎn)和/或具有NKTCL?？梢詼y(cè)試任何JAK蛋白的任何一種或組合。受測(cè)試的JAK蛋白可以選自JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。例如，可以測(cè)試JAK3和/或JAK1蛋白。通常，SEQIDNO：2表示野生型JAK3蛋白。在一個(gè)實(shí)例中，包括在SEQIDNO：2的氨基酸572位點(diǎn)由V置換A和/或在氨基酸573位點(diǎn)由V置換A的突變型JAK3基因的存在表明受試者面臨形成NKTCL的風(fēng)險(xiǎn)和/或具有NKTCL。通常，SEQIDNO：4表示野生型JAK1蛋白。在另一實(shí)例中，包括在SEQIDNO：4的氨基酸652位點(diǎn)由D置換Y的突變型JAK1蛋白的存在表明受試者面臨形成NKTCL的風(fēng)險(xiǎn)和/或具有NKTCL。突變型JAK3和JAK1蛋白的同時(shí)存在也表明受試者面臨形成NKTCL的風(fēng)險(xiǎn)和/或具有NKTCL。所述方法可以在來(lái)自受試者的分離的血液和/或細(xì)胞樣品中進(jìn)行。所述分離的細(xì)胞樣品可以是來(lái)自腫瘤。因此，所述方法可以進(jìn)一步包括提供來(lái)自受試者的分離的血液和/或細(xì)胞樣品用于測(cè)試。所述方法可以進(jìn)一步包括從受試者、血液樣品和/或分離的細(xì)胞樣品中分離蛋白分子用于所述測(cè)試。可以使用任何合適的方法以檢測(cè)相關(guān)的野生型和/或突變型JAK蛋白是否表達(dá)。例如，可以通過(guò)蛋白質(zhì)測(cè)序和/或抗體檢測(cè)來(lái)測(cè)試。特別地，可以利用使用對(duì)于相關(guān)的野生型和/或突變型JAK蛋白具有特異性的至少一種抗體的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種用于篩選能夠治療NKTCL的藥劑的方法，其包括：(a)提供包含至少一個(gè)突變型JAK基因的NKTCL細(xì)胞系；(b)使所述藥劑與NKTCL細(xì)胞系接觸；和(c)確定所述藥劑對(duì)NKTCL細(xì)胞系的效果；其中，所述藥劑的降低NKTCL細(xì)胞系的生活力、生長(zhǎng)和/或增殖和/或增加NKTCL細(xì)胞系凋亡的能力可以指示藥劑治療NKTCL的能力。在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種用于篩選能夠降低至少一種JAK蛋白的活性的藥劑的方法，其包括：(i)提供攜帶至少一個(gè)突變型JAK基因的NKTCL細(xì)胞系；(ii)用所述藥劑接觸所述NKTCL細(xì)胞系；和(iii)確定所述藥劑對(duì)NKTCL細(xì)胞系的效果；其中，所述藥劑降低細(xì)胞系的生活力、生長(zhǎng)和/或增殖和/或增加細(xì)胞系凋亡的能力是候選藥劑降低至少一種JAK蛋白的活性的能力的指示。所述NKTCL細(xì)胞系可以攜帶任何突變型JAK1、JAK2、JAK3或TYK2基因中的任何一種或組合。例如，NKTCL細(xì)胞系可以攜帶突變型JAK3基因和/或突變型JAK1基因。特別是，哺乳動(dòng)物NKTCL細(xì)胞系可攜帶下列突變中的至少一種：(i)在SEQIDNO：1的核苷酸15792位點(diǎn)由T置換C(在JAK3基因中)；(ii)在SEQIDNO：1的核苷酸15795位點(diǎn)由T置換C(在JAK3基因中)；和(iii)在SEQIDNO：3的核苷酸124823位點(diǎn)由G置換T(在JAK1基因中)。根據(jù)第四方面，本發(fā)明還涉及一種包含至少一種突變型JAK基因的NKTCL動(dòng)物模型。例如，所述NKTCL動(dòng)物模型可以包括選自突變型JAK1、JAK2、JAK3和TYK2基因中的至少一種突變。特別地，所述NKTCL動(dòng)物模型包含突變型JAK3基因和/或突變型JAK1基因。更特別地，所述NKTCL動(dòng)物模型包括下列突變中的至少一種：(i)在SEQIDNO：1的核苷酸15792位點(diǎn)由T置換C；(ii)在SEQIDNO：1的核苷酸15795位點(diǎn)由T置換C；和(iii)在SEQIDNO：3的核苷酸124823位點(diǎn)由G置換T。所述NKTCL動(dòng)物模型也可以用于篩選能夠治療NKTCL的候選藥劑。根據(jù)第五方面，提供了一種治療自然殺傷T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)的方法，其包括給受試者施用至少一種JAK抑制劑?？梢允褂萌魏魏线m的JAK抑制劑。在本發(fā)明的另一方面中，提供至少一種JAK抑制劑在制備用于治療自然殺傷T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)的藥物中的用途。在本發(fā)明的另一方面中提供了一種用于治療自然殺傷T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)的JAK抑制劑。所述JAK抑制劑能夠降低JAK3蛋白的活性。例如，所述JAK抑制劑可以抑制JAK1、JAK2、JAK3和/或TYK2中的至少一種。因此，所述抑制劑可以是泛JAK抑制劑(pan-JAKinhibitor)。在一個(gè)具體的實(shí)例中，所述JAK抑制劑可以抑制JAK3和/或JAK1。更特別地，所述JAK抑制劑可以抑制JAK3或所述JAK抑制劑還可以抑制JAK1。在第一具體實(shí)例中，所述JAK抑制劑可以包括3-[(3R，4R)-4-甲基-3-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]哌啶-1-基]-3-氧代丙腈(也稱(chēng)為CP-690，550)。在第二具體實(shí)例中，可以包括(E)-2-氰基-3-(4-硝基苯基)-N-((R)-1-苯基乙基)丙烯酰胺(也稱(chēng)為WP-1034)。施用JAK抑制劑的受試者可以包括哺乳動(dòng)物。所述受試者可以包括人類(lèi)。受試者可以在至少一種JAK基因/JAK蛋白中攜帶純合或雜合突變。例如，所述受試者可以在JAK1/JAK1、JAK2/JAK2、JAK3/JAK3和/或TYK2/TYK2中攜帶純合或雜合突變。特別地，受試者可以在JAK1/JAK1和/或JAK3/JAK3中攜帶純合或雜合突變。更特別地，受試者可以具有選自JAK3-A572V、JAK3-A573V和JAK1-Y652D中的至少一種突變。然而，所述受試者還可以包含純合野生型的表型。受試者可以具有JAK基因、其轉(zhuǎn)錄和/或翻譯產(chǎn)物(蛋白質(zhì))中任一種的增加的表達(dá)，無(wú)論其是否攜帶純合野生型、雜合或純合突變基因。CP-690，550是一種JAK抑制劑。它被稱(chēng)為托法替尼(Tofacitinib)、他索西替尼(Tasocitinib)，或者以其商品名XELJANZ。其化學(xué)名稱(chēng)為3-[(3R，4R)-4-甲基-3-[甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)氨基]哌啶-1-基]-3-氧代丙腈，其結(jié)構(gòu)式為：已經(jīng)記載了WP-1034在急性髓細(xì)胞樣白血病中具有促凋亡和抗白血病活性(Faderl等，AnticancerResearch25：1841-1850(2005))(8)。它是酪氨酸激酶抑制劑的酪氨酸磷酸化抑制劑家族的成員，其主要研究作為JAK-STAT通路的抑制劑。它的化學(xué)結(jié)構(gòu)和名稱(chēng)如下：WP1034-(E)-2-氰基-3-(4-硝基苯基)-N((R)-1-苯基乙基)丙烯酰胺現(xiàn)在已經(jīng)一般性地描述了本發(fā)明，通過(guò)參考通過(guò)舉例說(shuō)明，而不是試圖限制本發(fā)明的方式提供的下述實(shí)施例，可以更容易地理解本發(fā)明。實(shí)施例自然殺傷/T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)的分子發(fā)病機(jī)理還不是很清楚。尚未完全確定導(dǎo)致NK/T細(xì)胞淋巴瘤的基因突變。在這項(xiàng)研究中，在四個(gè)NKTCL患者中的兩個(gè)中，通過(guò)全外顯子組測(cè)序鑒定了兩面神激酶3(JAK3)體細(xì)胞激活突變(A572V和A573V)。在額外的61個(gè)病例中，通過(guò)Sanger測(cè)序和高分辨率熔解(HRM)分析確定JAK3突變的發(fā)生率的進(jìn)一步驗(yàn)證。總體而言，65個(gè)病例中的23個(gè)(35.4％)包含JAK3突變。包含JAK3A572V突變的突變型NKTCL細(xì)胞系顯示IL-2非依賴(lài)性生長(zhǎng)和提示其致癌作用的組成的JAK3和STAT5磷酸化。JAK3突變的功能特性支持其涉及導(dǎo)致加速的細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子無(wú)關(guān)的JAK/STAT組成性活化。這些突變可能在NKTCL的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮顯著作用。此外，用新型泛JAK抑制劑CP-690，550，同時(shí)治療JAK3-突變體和野生型NKTCL細(xì)胞系，導(dǎo)致劑量依賴(lài)性磷酸化STAT5降低，降低細(xì)胞生活力和增加細(xì)胞凋亡。CP-690，550是一種泛JAK抑制劑，不僅對(duì)于JAK3而且對(duì)于JAK1具有抑制作用。這可能是重要的，因?yàn)樵贘AK-STAT信號(hào)通路系統(tǒng)中，JAK1和JAK3在它們的功能中相互干擾，可能一種抑制響應(yīng)于其它的抑制的一些補(bǔ)償性上調(diào)。例如，如果抑制JAK3，可能上調(diào)JAK1以補(bǔ)償JAK3的活性降低，這可能會(huì)保留JAK-STAT信號(hào)。反之亦然。進(jìn)一步舉例，使用不僅能夠降低JAK1活性而且還降低JAK3的活性的泛JAK抑制劑的NKTCL治療可能在抑制JAK-STAT信號(hào)中特別有效。因此，針對(duì)解除管制JAK/STAT通路可能是對(duì)于NKTCL患者有前景的治療。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于NKTCL患者的治療具有重要意義。材料和方法組織樣品從4位知情同意的NKTCL患者中獲得匹配的新鮮冷凍的組織和外周血樣品。本發(fā)明人進(jìn)一步鑒定來(lái)自61位證實(shí)的NKTCL患者的石蠟包埋的組織塊。NKTCL的診斷是根據(jù)2008年世界衛(wèi)生組織(WHO)造血和淋巴組織的腫瘤分類(lèi)(6)進(jìn)行。所有樣品均集中由新加坡保健服務(wù)集團(tuán)血液病理學(xué)者審查。這項(xiàng)研究由新加坡的新加坡保健服務(wù)集團(tuán)集中機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)(SingHealthCentralizedInstitutionalReviewBoard)批準(zhǔn)。DNA的分離根據(jù)制造商的用法說(shuō)明，分別使用DNeasy血液和組織微型試劑盒(Qiagen)和QIAmpDNA血液中型試劑盒(Qiagen)分離冷凍組織和配對(duì)的血液樣本的DNA。對(duì)于福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)樣品，從來(lái)自每個(gè)樣品中的一個(gè)或兩個(gè)10μm切片提取基因組DNA，用二甲苯除去石蠟，用100％乙醇將組織洗滌兩次，然后蛋白酶K消化過(guò)夜。然后使用DNeasy血液和組織微型試劑盒(Qiagen)提取DNA。在兩面神激酶中的體細(xì)胞突變的檢測(cè)使用REPLI-gWGA中型試劑盒(Qiagen)對(duì)從每個(gè)樣品中提取的基因組DNA進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。對(duì)JAK1、JAK2、JAK3和TYK2的編碼外顯子序列通過(guò)Sanger測(cè)序進(jìn)行測(cè)序以檢測(cè)突變。當(dāng)僅在腫瘤中而沒(méi)有在配對(duì)的血液樣品中檢測(cè)到所述突變時(shí)，確認(rèn)所述突變的體細(xì)胞來(lái)源。所述突變序列信息如在下表1中和在用以下序列的標(biāo)識(shí)符的附加的基因組DNA、蛋白質(zhì)和eDNA序列表(SEQIDNo.：1至SEQIDNo.：6)中所提供：SEQIDNO：1-JAK3野生型基因組DNASEQIDNO：2-JAK3野生型氨基酸序列SEQIDNO：3-JAK1野生型基因組DNASEQIDNO：4-JAK3野生型氨基酸序列SEQIDNO：5-JAK3野生型eDNASEQIDNO：6-JAK1野生型eDNA表1：JAK1和JAK3突變信息蛋白ORF1cDNA基因JAK1Y652D6T1954GT2203G2T124823G4JAK3A572V7C1715TC1815T3C15792T5JAK3A573V7C1718TC1818T3C15795T5表1的說(shuō)明：1ORF：開(kāi)放閱讀框，編碼區(qū)，從ATG開(kāi)始2NCBI參考序列：NM_002227.2(SEQIDNO：6)3NCBI參考序列：NM_000215.3(SEQIDNO：5)4NCBI參考序列：NG_023402.1(SEQIDNO：3)5NCBI參考序列：NG_007273.1(SEQIDNO：1)6NCBI參考序列：NP_002218.2(SEQIDNO：4)7GenBank：AAC50950.1(SEQIDNO：2)采用高分辨率熔解(HRM)和雙向Sanger測(cè)序分析的突變驗(yàn)證高分辨率熔解(HRM)和Sanger測(cè)序用于證實(shí)JAK1和JAK3突變和確認(rèn)其在NKTCL患者群體中的流行率。結(jié)合這兩種方法將大大提高FFPE樣品中突變檢測(cè)的精度。所述JAK2V617F突變也用上述兩種方法測(cè)序。用于驗(yàn)證的引物組的序列列于表2(見(jiàn)下文)，并包括在相應(yīng)的標(biāo)識(shí)符下的所附序列表中。表2：用于Sanger測(cè)序和HRM分析的驗(yàn)證引物組HRM曲線分析用于辨別點(diǎn)突變的存在。SsoFastTMEvaGreen(BioRad，產(chǎn)品編號(hào)172-5200)用于擴(kuò)增包括來(lái)自基因組DNA樣品的相關(guān)突變的靶DNA片段。以600nM的終濃度使用HRM引物，用BioRad公司的CFX96實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)重復(fù)進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)和熔化條件如下：98℃2分鐘一個(gè)循環(huán)；98℃5秒、58℃10秒39個(gè)循環(huán)；95℃30分鐘一個(gè)循環(huán)，以0.2℃/秒從72℃至95℃升溫熔化。用BioradPrecisionMeltAnalysisTM軟件分析HRM曲線。偏離野生型曲線的HRM差異曲線被認(rèn)為是包含突變。對(duì)于Sanger測(cè)序，用Invitrogen公司的PlatinumTaq聚合酶(產(chǎn)品編號(hào)10966-083)進(jìn)行PCR，循環(huán)為：在95℃，10分鐘；95℃30秒39個(gè)循環(huán)；60℃30秒，72℃1分鐘以及72℃最終延伸10分鐘。用ABI的BigDyeTerminatorV3.1(產(chǎn)品編號(hào)4337457)進(jìn)行測(cè)序PCR，循環(huán)為：在96℃1分鐘；96℃10秒29個(gè)循環(huán)；50℃5秒和60℃4分鐘。由此產(chǎn)生的產(chǎn)物在ABI3730DNA分析儀上運(yùn)行。細(xì)胞系、細(xì)胞生活力和細(xì)胞凋亡檢測(cè)NK-S1是來(lái)自先前描述的NKTCL異種移植(7)建立的細(xì)胞系。所述異種移植來(lái)源于來(lái)自發(fā)現(xiàn)有JAK1(Y652D)和JAK3(A572V)突變的同一患者的睪丸的轉(zhuǎn)移性腫瘤。NK-S1在添加抗生素、熱滅活的胎牛血清(10％)和馬血清(ES)(10％)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)超過(guò)60代。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)染色，表型分析顯示表面CD3-CD56+、粒酶B+。對(duì)NK-S1NKTCL細(xì)胞系進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)攜帶JAK3A572V的純合突變，以及在JAK1密碼子652上的突變。KHYG-1是從JapaneseCollectionofResearchBioresources得到的IL-2依賴(lài)的侵略性NK白血病細(xì)胞株，它培養(yǎng)在補(bǔ)充有抗生素、熱滅活FBS(10％)、ES(10％)和200IU/ml的重組人IL-2(阿地白介素，諾華)7的RPMI培養(yǎng)基中。對(duì)KHYG-1進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)為JAK3密碼子572和573、JAK1密碼子652和658野生型。K562(CCL-234，ATCC)是對(duì)BCR-ABL融合基因呈陽(yáng)性的慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)細(xì)胞系。為了研究NKTCL細(xì)胞系對(duì)泛JAK抑制劑：CP-690，550(塞萊克化學(xué)，產(chǎn)品編號(hào)S5001)的敏感性，在96孔板中以2x104細(xì)胞/100μL/孔接種細(xì)胞，并用CP-690，550以各種濃度或用載體對(duì)照處理。使用CellTiter含水非放射性細(xì)胞增殖測(cè)定試劑盒(普洛麥格)通過(guò)MTS法評(píng)估生活力，讀取在490nm和650nm(作為參考)的吸光度。藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的程度是通過(guò)膜聯(lián)蛋白V-FITC(BD生物科學(xué)公司)染色進(jìn)行評(píng)價(jià)。在FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD生物科學(xué)公司)中進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集。免疫印跡使用或不使用重組人IL-2(阿地白介素，諾華)，或存在或不存在CP-690，550孵育后，在指定的時(shí)間間隔采集細(xì)胞。用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞，并溶解在50μl冰冷的RIPA緩沖液[25mMTris-HCl，pH值7.6，150mMNaCl，1％諾乃洗滌劑P-40，1％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，1X磷酸酶抑制劑(產(chǎn)品編號(hào)78420，賽默飛世爾科技公司)，1X蛋白酶抑制劑(產(chǎn)品編號(hào)12978000，羅氏診斷公司)和1mM原釩酸鈉]中。此后，細(xì)胞裂解液在冰上進(jìn)行兩次10秒、20Amp超聲處理，在冰上攪拌另外15分鐘。于4℃下在14,000g下離心15分鐘后，除去上清液，使用Bio-Rad蛋白測(cè)定(產(chǎn)品編號(hào)500-0006，Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。在5％層積和8％分解SDS-聚丙烯酰胺凝膠上使用微型-變形蛋白四電泳系統(tǒng)(產(chǎn)品編號(hào)165-8006，Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室)分離蛋白樣品，并使用微型轉(zhuǎn)印跡電泳轉(zhuǎn)移細(xì)胞(產(chǎn)品編號(hào)170-3930EDU，Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室)在100V持續(xù)120分鐘轉(zhuǎn)移到0.45μM硝化纖維素膜(產(chǎn)品編號(hào)162-0115，Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室)。用在PBST中的5％牛奶封閉膜，接著是在PBST中的5％牛血清白蛋白以及5mM原釩酸鈉的兔抗-磷酸-jak1(Tyr1022/1023)(產(chǎn)品編號(hào)3331，CellSignaling)、兔抗磷酸-JAK3(Tyr980/981)(D44E3)(產(chǎn)品編號(hào)5031，CellSignaling)、鼠抗磷酸-Stat5(Tyr694)(產(chǎn)品編號(hào)9356，CellSignaling)和兔抗磷酸-Stat3(Tyr705)(D3A7)(產(chǎn)品編號(hào)9145，CellSignaling)的過(guò)夜孵育。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)(產(chǎn)品編號(hào)3407，賽默飛世爾科技公司，和產(chǎn)品編號(hào)RPN2132，Amersham)進(jìn)行可視化。使用Jak1(6G4)(產(chǎn)品編號(hào)3344，CellSignaling)、Jak3(產(chǎn)品編號(hào)3775，CellSignaling)、Stat5(產(chǎn)品編號(hào)9363，CellSignaling)和β-肌動(dòng)蛋白(產(chǎn)品編號(hào)A1978，Sigma)抗體以檢測(cè)未磷酸化的蛋白質(zhì)或作為負(fù)載對(duì)照。所有抗體在推薦的稀釋液中使用。結(jié)果Sanger測(cè)序法用于對(duì)來(lái)自具有額外節(jié)點(diǎn)NKTCL的四個(gè)患者的新鮮冰凍腫瘤和血液樣品中的JAK1、JAK2、JAK3和TYK2的外顯子區(qū)域測(cè)序。確定兩種JAK3突變：A572V(p.Ala572Val，c.1715C＞T)和A573V(p.Ala573Val，c.1718C＞T)，以及一種新JAK1突變：Y652D(p.Tyr652Asp，c.1954T＞G)。有趣的是，在相同的樣品中發(fā)現(xiàn)JAK3A572V和JAK1Y652D突變。兩種JAK3突變均位于JH2假性激酶結(jié)構(gòu)域上的外顯子12(圖1a)，已知其對(duì)JH1激酶結(jié)構(gòu)域具有自動(dòng)抑制效果。在JAK1和JAK3中確定的所有三個(gè)錯(cuò)義突變被證實(shí)是體細(xì)胞起源的且通過(guò)Polyphen預(yù)測(cè)是可能有害的。用ENKTCL在額外的61例患者的FFPE樣本中驗(yàn)證識(shí)別的突變，以確認(rèn)他們的流行率。由該驗(yàn)證研究，通過(guò)Sanger測(cè)序識(shí)別另外21例具有JAK3突變的患者?？傮w而言，發(fā)現(xiàn)65例NKTCL患者中的23例患者(35.4％)具有JAK3突變(圖1b)。對(duì)40個(gè)FFPE樣品進(jìn)行高分辨率熔解(HRM)分析和檢測(cè)到14例JAK3突變(35％)。在23例具有JAK3突變的患者當(dāng)中，有17例雜合A572V，兩例純合A572V，兩例雜合A573V突變，一例純合A573V突變和一例同時(shí)具有A572V和A573V雜合突變的患者(圖1c-h)。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)額外的JAK1Y652D突變。此外，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)具有JAK2V617F(p.Val617Phe或c.1849G＞T)突變的患者，最近發(fā)現(xiàn)JAK2V617F突變存在于大部分的具有典型BCR/ABL陰性的慢性骨髓增殖性疾病的患者中和若干具有其它純血液癌癥例如骨髓增生異常綜合征和急性髓細(xì)胞性白血病的患者中。討論JAK3A572V激活突變賦予細(xì)胞因子非依賴(lài)性增長(zhǎng)IL-2是NK細(xì)胞的增殖和活化必需的基本細(xì)胞因子(4)。JAK1和JAK3通過(guò)STAT轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化介導(dǎo)IL-2受體信號(hào)(5)。根據(jù)確定的激活JAK3突變的功能的重要性，我們測(cè)試JAK3突變是否能夠賦予IL-2相對(duì)于包含純合JAK3A572V突變的NKTCL細(xì)胞系(NK-S1)非依賴(lài)性生長(zhǎng)。JAK-突變(NK-S1)細(xì)胞顯示IL-2非依賴(lài)性生長(zhǎng)(圖3)和JAK3和STAT5的組成型磷酸化(圖2a)。與此相反，JAK3-野生型KHYG-1細(xì)胞為明確的IL-2依賴(lài)性(圖3和圖2a)。重要的是，與用對(duì)照siRNA處理的細(xì)胞相比，用JAK3siRNA處理的NK-S1細(xì)胞在細(xì)胞增殖中表現(xiàn)出顯著的降低，且減低的JAK3和STAT5的自磷酸化作用(圖4A)。相反地，瞬時(shí)過(guò)量表達(dá)突變的JAK3(JAK3A572V)cDNA的KHYG-1細(xì)胞顯示出IL-2非依賴(lài)性增殖和JAK3和STAT5的自磷酸化(圖4B)。這些結(jié)果表明，JAK3激活突變是功能等位基因的增益，有助于在IL-2獨(dú)立性方式中JAK/STAT通路的組成性活性。這項(xiàng)研究表明，JAK突變賦予衍生自同時(shí)包含JAK3A572V和JAK1Y652D突變的患者樣品的異種移植建立的NKTCL細(xì)胞系細(xì)胞因子非依賴(lài)性生長(zhǎng)。與經(jīng)檢測(cè)不攜帶鑒定的JAK1和JAK3突變的野生型KHYG-1(圖2a)相比，NK-S1顯示IL-2非依賴(lài)性生長(zhǎng)(圖3)、組成型JAK3和STAT5磷酸化(圖2a)。CP-690，550對(duì)于NKTCL細(xì)胞系的影響對(duì)泛JAK抑制劑CP-690，550抑制JAK-STAT通路的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。由于活化的JAK蛋白直接使STAT蛋白磷酸化，用增加濃度的CP-690，550處理所述JAK突變細(xì)胞系(NK-S1)和野生型NKTCL細(xì)胞系(KHYG-1)，并通過(guò)免疫印跡分析pSTAT5(圖2b)。NK-S1和KHYG-1細(xì)胞系都顯示pSTAT5的劑量依賴(lài)性降低(圖2a)，以及對(duì)于所述抑制劑的處理后的降低的細(xì)胞生活力(圖2b)。由于其STAT5磷酸化與激活的JAK3無(wú)關(guān)，在對(duì)照K562細(xì)胞系中，CP-690，550并沒(méi)有抑制pSTAT5(圖2b)。如通過(guò)膜聯(lián)蛋白V(AnnexinV)染色顯示，NK-S1的生存力減小與增加的細(xì)胞凋亡相關(guān)(圖2c)。綜上所述，通過(guò)自然殺傷/T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)的兩面神激酶(JAK)的外顯子測(cè)序在NKTCL患者中識(shí)別JAK3A572和A573V和JAK1Y652D突變，證實(shí)JAK3突變的流行率為35.4％。包含JAK3A572V突變的突變NKTCL細(xì)胞系顯示IL-2非依賴(lài)性生長(zhǎng)和提示突變?cè)谙鄳?yīng)的核酸結(jié)構(gòu)域的致癌作用的組成性JAK3和STAT5磷酸化。體外研究表明，泛JAK抑制劑可能是一種對(duì)于NKTCL患者的新的治療劑。泛JAK抑制劑CP-690，550顯示降低細(xì)胞生活力并導(dǎo)致在JAK3野生型(KHYG-1)和突變型(NK-S1)細(xì)胞系中的細(xì)胞凋亡。KHYG-1是IL-2依賴(lài)性NKTCL細(xì)胞系，從而其對(duì)泛JAK抑制劑敏感。參考文獻(xiàn)：1.KwongYL，AndersonBO，AdvaniR，KimWS，LevineAM，LimST.ManagementofT-cellandnatural-killer-cellneoplasmsinAsia：consensusstatementfromtheAsianOncologySummit2009.Thelancetoncology2009；10(11)：1093-1101.2.AuWY，MaSY，ChimCS，ChoyC，LoongF，LieAKetal.ClinicopathologicfeaturesandtreatmentoutcomeofmatureT-cellandnaturalkiller-celllymphomasdiagnosedaccordingtotheWorldHealthOrganizationclassificationscheme：asinglecenterexperienceof10years.AnnOncol2005；16(2)：206-214.3.VoseJ，ArmitageJ，WeisenburgerD.InternationalperipheralT-cellandnaturalkiller/T-celllymphomastudy：pathologyfindingsandclinicaloutcomes.JClinOncol2008；26(25)：4124-4130.4.SuzukiR，HandaK，ItohK，KumagaiK.Naturalkiller(NK)cellsasarespondertointerleukin2(IL2).I.Proliferativeresponseandestablishmentofclonedcells.JImmunol1983；130(2)：981-987.5.LuL，ZhuJ，ZhengZ，YanM，XuW，SunLetal.Jak-STATpathwayisinvolvedintheinductionofTNF-betageneduringstimulationbyIL-2.Europeanjournalofimmunology1998；28(3)：805-810.6.CampoE，SwerdlowSH，HarrisNL，PileriS，SteinH，JaffeES.The2008WHOclassificationoflymphoidneoplasmsandbeyond：evolvingconceptsandpracticalapplications.Blood2008；117(19)：5019-5032.7.LoongSL，HwangJS，LimST，YapSP，TaoM，ChongTWetal.AnEpstein-Barrviruspositivenaturalkillerlymphomaxenograftderivedfordrugtesting.Leukemia&lymphoma2008；49(6)：1161-1167.8.Faderletal.，WP-1034，anovelJAK-STATinhibitor，withproapoptoticandantileukemicactivityinacutemyeloidleukemia(AML).AnticancerResearch25：1841-1850(2005)