用于治療病毒性疾病的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于通過使用阻止獨特的病毒結(jié)構(gòu)蛋白基序與來自網(wǎng)格蛋白銜接蛋白家族的宿主蛋白質(zhì)結(jié)合并隨后阻止病毒復(fù)制的抑制劑來治療病毒感染和同時感染的方法。
【專利說明】用于治療病毒性疾病的方法和組合物
[〇〇〇1] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2011年12月6日提交的美國臨時申請序列號61/567, 491的優(yōu)先 權(quán)，其全部公開內(nèi)容通過引用并入本文。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦資助研究的聲明
[0004] 本發(fā)明得到國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health)授予的合同 AI079406的政府支持。政府對本發(fā)明享有某些權(quán)利。 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 本發(fā)明涉及病毒學。更具體地，本發(fā)明涉及通過抑制宿主細胞網(wǎng)格蛋白銜接蛋白 (clathrin adaptor protein)與病毒 ΥΧΧΦ 或二亮氨酸基序（dileucine motif)之間的相 互作用或者其調(diào)節(jié)來治療病毒性疾病。 【背景技術(shù)】
[0006] 人感染慢病毒亞科（Lentiviridae)病毒（如HIV)和黃病毒科（Flaviviridae) 病毒（如HCV)對全球健康的造成了巨大挑戰(zhàn)。盡管強效抗HIV藥物處于臨床開發(fā)中并且 對于基于干擾素之方案的響應(yīng)率因包含蛋白酶抑制劑（PI)而改善，但是抗性、藥物-藥物 相互作用和累積的毒性延續(xù)了造成的挑戰(zhàn)。因此，依然需要更有效的抗病毒策略以對抗HCV 大流行。此外，為了治療因抗性病毒而無法進行高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（highly active antiretroviral therapy, HAART)的患者，需要在補救方案中包含新的抗病毒策略。
[〇〇〇7] 發(fā)明概述
[0008] 簡單地說，本公開內(nèi)容的實施方案包括治療具有病毒感染的宿主的化合物、組合 物、藥物組合物和方法。在一個實施方案中，根據(jù)本公開內(nèi)容易感染的病毒包括包含至少一 種包含ΥΧΧΦ基序或二亮氨酸基序的蛋白質(zhì)的病毒，其在本文中被稱為"網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合 病毒"，黃病毒科病毒、慢病毒亞科病毒、HCV、HIV、同時感染（co-infection)(如HCV/HIV同 時感染）、除HCV以外的黃病毒科病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒或除 HCV以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒，治療宿主中此類病毒的復(fù)制的方法，抑制包含ΥΧΧΦ或 二亮氨酸基序的病毒結(jié)構(gòu)蛋白與宿主網(wǎng)格蛋白AP1-AP4復(fù)合物μ亞基（如AP2MUAP1M1、 ΑΡ3Μ1或ΑΡ4Μ1)結(jié)合的方法，治療宿主中與病毒性肝炎有關(guān)的肝纖維化的方法等。
[0009] 治療具有來自網(wǎng)格蛋白ΑΡ結(jié)合病毒、黃病毒科病毒、慢病毒亞科病毒、HCV、HIV、 同時感染如（HCV/HIV同時感染）、除HCV以外的黃病毒科病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格 蛋白ΑΡ結(jié)合病毒或除HCV以外的網(wǎng)格蛋白ΑΡ結(jié)合病毒等的病毒感染的宿主的一個示例性 方法可包括：向所述宿主施用治療有效量的抑制劑以降低所述宿主中的病毒載量。在一個 實施方案中，所述抑制劑選自：競爭性抑制包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白質(zhì)與選 自網(wǎng)格蛋白API至ΑΡ4的μ亞基的宿主蛋白質(zhì)之間結(jié)合的藥劑；以及抑制宿主蛋白激酶活 性的藥劑，所述蛋白激酶為調(diào)節(jié)選自網(wǎng)格蛋白API至ΑΡ4的μ亞基的宿主蛋白質(zhì)的活性的 激酶。治療宿主中的網(wǎng)格蛋白ΑΡ結(jié)合病毒、黃病毒科病毒、慢病毒亞科病毒、HCV、HIV、同 時感染（如HCV/HIV同時感染）、除HCV以外的黃病毒科病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格 蛋白AP結(jié)合病毒或除HCV以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒等的病毒感染的一個示例性方法可 包括：向具有此類病毒感染的宿主施用抑制劑。在一個實施方案中，所述抑制劑選自：競爭 性抑制包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的病毒結(jié)構(gòu)蛋白與選自AP2M1的宿主蛋白質(zhì)之間結(jié)合的 藥劑，以及抑制宿主蛋白激酶活性的藥劑，所述蛋白激酶為調(diào)節(jié)選自AP2M1和網(wǎng)格蛋白AP 復(fù)合物的其他μ亞基的宿主蛋白質(zhì)的活性的激酶。在一些實施方案中，這些抑制劑抑制 GAK (環(huán)G相關(guān)激酶）或ΑΑΚ1 (銜接子相關(guān)激酶1)，包括例如厄洛替尼（erlotinib)、舒尼替 尼（sunitinib)或PKC-412的化合物。因此，有兩類抑制劑：（1)結(jié)合的競爭性抑制劑；和 ⑵抑制宿主蛋白激酶活性的藥劑，所述蛋白激酶為調(diào)節(jié)宿主蛋白質(zhì)（如AP2M1和/或網(wǎng)格 蛋白AP復(fù)合物的其他μ亞基）的活性的激酶。
[0010] 抑制ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序與宿主多肽等結(jié)合的一個示例性方法包括向具有病 毒感染的宿主施用抑制劑。在一個實施方案中，所述抑制劑選自：競爭性抑制包含ΥΧΧΦ或 二亮氨酸基序的病毒結(jié)構(gòu)蛋白與選自ΑΡ2Μ1或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基之間結(jié)合 的藥劑；以及抑制蛋白激酶活性的藥劑，所述蛋白激酶為調(diào)節(jié)選自ΑΡ2Μ1和/或網(wǎng)格蛋白 ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基的宿主蛋白質(zhì)的活性的激酶。
[〇〇11] 用于治療網(wǎng)格蛋白ΑΡ結(jié)合病毒、黃病毒科病毒、慢病毒亞科病毒、HCV、HIV、同時 感染（如HCV/HIV同時感染）、除HCV以外的黃病毒科病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋 白ΑΡ結(jié)合病毒或除HCV以外的網(wǎng)格蛋白ΑΡ結(jié)合病毒等的病毒感染的宿主的一種示例性藥 物組合物可包含抑制劑。在一個實施方案中，所述抑制劑選自：競爭性抑制包含ΥΧΧΦ或 二亮氨酸基序的病毒結(jié)構(gòu)蛋白與選自ΑΡ2Μ1和/或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基的宿 主蛋白質(zhì)之間結(jié)合的藥劑，以及抑制蛋白激酶活性的藥劑，所述蛋白激酶為調(diào)節(jié)選自ΑΡ2Μ1 和/或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基的宿主蛋白質(zhì)的活性的激酶。
[0012] 一種示例性組合物包含抑制劑等。在一個實施方案中，所述抑制劑選自：競爭性抑 制包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白質(zhì)與選自ΑΡ2Μ1和/或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其 他μ亞基的宿主蛋白質(zhì)之間結(jié)合的藥劑，以及抑制蛋白激酶活性的藥劑，所述蛋白激酶為 調(diào)節(jié)選自ΑΡ2Μ1和/或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基的宿主蛋白質(zhì)的活性的激酶。
[0013] 在一個方面，本發(fā)明提供了通過施用有效量的抑制HCV和HIV與選自ΑΡ2Μ1和網(wǎng) 格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基的宿主蛋白結(jié)合的藥劑來治療HCV-HIV同時感染的方法。 在一個實施方案中，所述抑制劑抑制ΑΑΚ1或GAK。在另一個實施方案中，所述藥劑選自厄洛 替尼、舒尼替尼和PKC-412。在另一個實施方案中，所述藥劑阻止包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基 序的慢病毒亞科病毒或黃病毒科病毒結(jié)構(gòu)蛋白與選自ΑΡ2Μ1和/或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的 其他μ亞基的宿主蛋白質(zhì)結(jié)合。在又一個實施方案中，所述藥劑抑制ΑΑΚ。
[0014] 在另一個方面，本發(fā)明提供了通過向需要的患者施用有效量的抑制包含ΥΧΧΦ或 二亮氨酸基序的病毒的結(jié)構(gòu)蛋白與選自ΑΡ2Μ1和/或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基的 宿主蛋白質(zhì)結(jié)合的藥劑來抑制除HCV以外的至少第一病毒、黃病毒科的另一種成員或慢病 毒亞科的成員或其組合的感染的方法。在一個實施方案中，所述藥劑抑制ΑΑΚ1或GAK。在 另一個實施方案中，所述藥劑選自厄洛替尼、舒尼替尼和PKC-412。
[0015] 在另一個方面，本發(fā)明提供了通過使本文所述易感性病毒或病毒蛋白質(zhì)與候選藥 劑和選自ΑΡ2Μ1和/或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基的蛋白質(zhì)接觸并確定所述候選藥 劑對病毒與宿主蛋白質(zhì)結(jié)合的影響來篩選抗病毒藥劑的方法。
[0016] 在另一個方面，本發(fā)明提供了通過使本文所述易感性病毒與候選藥劑和表達選自 AP2M1和/或網(wǎng)格蛋白AP復(fù)合物的其他μ亞基的蛋白質(zhì)的細胞接觸并確定所述候選藥劑 對病毒裝配或出芽的影響來篩選抗病毒藥劑的方法。在一個實施方案中，所述候選藥劑抑 制ΑΑΚ1或GAK的活性。
[0017] 在另一個方面，本發(fā)明提供了通過使宿主細胞與阻止包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序 的病毒結(jié)構(gòu)蛋白與選自ΑΡ2Μ1和/或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基的宿主蛋白質(zhì)結(jié) 合的藥劑接觸來抑制宿主細胞中網(wǎng)格蛋白ΑΡ結(jié)合病毒、黃病毒科病毒、慢病毒亞科病毒、 HCV、HIV、同時感染（如HCV/HIV同時感染）、除HCV以外的黃病毒科病毒、除黃病毒科病毒 以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒或除HCV以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒的裝配或出芽的方法。 在一個實施方案中，所述藥劑阻斷病毒結(jié)構(gòu)蛋白與宿主蛋白質(zhì)結(jié)合。在另一個實施方案中， 所述藥劑與病毒結(jié)構(gòu)蛋白競爭與宿主蛋白質(zhì)結(jié)合。在另一個實施方案中，所述藥劑與宿主 蛋白質(zhì)競爭與病毒結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合。在又一個實施方案中，所述方法包括篩選非黃病毒科病 毒的AAK1和GAK抑制劑。
[0018] 附圖簡述
[〇〇19] 以下附圖形成本發(fā)明說明書的一部分，其被包含以進一步證明本發(fā)明的某些方 面。參照一個或更多個這些附圖并結(jié)合對本文給出的具體實施方案的詳細描述，可更好地 理解本發(fā)明：
[0020] 圖1 :不出了具有結(jié)合AP2M1的ΥΧΧΦ基序的病毒核心。（A)核心的不意圖。指不 了被識別的基序的位置。（B)-(C)來自典型人（B)和病毒（C)蛋白質(zhì)的ΥΧΧΦ基序的共有 序列。（D)所有HCV隔離種、在本研究中使用的克隆和設(shè)計的核心突變體的共有序列。（E) 來自微流體芯片的熒光圖像和示意圖。左：AP2Ml-V5-his通過其與抗His抗體的相互作用 固定在裝置表面并用抗V5-FITC抗體標記。中：將T7標記的核心或NS3與表面結(jié)合AP2M1 一起孵育并用抗T7-Cy3抗體標記。通過ΜΙΤ0ΜΙ機械地捕獲相互作用。在清洗后顯示出表 不結(jié)合病毒蛋白質(zhì)的Cy3信號。右：Cy3和FITC信號重疊，表不結(jié)合病毒獵物（prey)與人 誘餌（bait)的比例。F.核心-T7和NS3-T7與表面結(jié)合AP2M1的體外結(jié)合曲線。Y軸表示 結(jié)合病毒蛋白質(zhì)與表面結(jié)合AP2M1的比值。
[0021] 圖2 :示出了在細胞中并且在HCV感染的背景下的病毒核心結(jié)合AP2M1。（A)PCA 形式的不意圖。A和B表不獵物蛋白質(zhì)和誘傅蛋白質(zhì)，GLuCl/2是Gaussia螢光素酶的片 段。（B)利用圖下方指示的質(zhì)粒的組合共轉(zhuǎn)染細胞，圖例中具有這些指示。Y軸表示相對于 核心-AP2M1信號的發(fā)光。右側(cè)帶狀條表示與宿主貨物蛋白（cargo protein)TFR結(jié)合的 AP2M1。（C)在游離AP2M1、核心或NESI的存在下的核心-AP2M1結(jié)合。Y軸表示相對于在空白 PUC19存在下核心-AP2M1結(jié)合的發(fā)光比值（在利用Glucl-AP2M1和Gluc2-核心感染的細胞 中檢測的平均發(fā)光信號除以在利用Glucl-AP2M1和空白Gluc2載體感染的對照孔中以及利 用Gluc2-核心和空白Glucl載體轉(zhuǎn)染的那些中測量的平均發(fā)光）。（D) HCV感染細胞的膜中 的免疫沉淀（IP)。左圖：使用抗AP2M1抗體或IgG用于IP。利用抗磷酸-AP2M1、抗AP2M1、抗 核心和抗肌動蛋白抗體對膜進行免疫印跡。Cal-A表示花萼海綿誘癌素-A(caly Culin-A)。 右圖：使用抗核心抗體或IgG用于IP。利用抗核心、抗AP2M1和抗肌動蛋白抗體進行免疫 印跡。（E)利用J6/JFH HCV RNA電穿孔后3天Huh-7. 5細胞中AP2M1和核心的代表性共聚 焦IF顯微圖像。數(shù)據(jù)表示來自三個獨立的一式三份實驗的平均值土s. d.(誤差條）（E中 η > 20)。*p < 0· 05, < 0· 01,女女女 p < 0· 001。
[0022] 圖3 :示出了介導AP2M1結(jié)合和病毒裝配的核心ΥΧΧΦ基序，在功能上可與其他 ΥΧΧΦ信號互換。㈧通過PCA的野生型（WT)和核心突變體與AP2M1結(jié)合。Y軸表示相對 于WT核心-AP2M1結(jié)合的發(fā)光比值（在利用Glucl-AP2M1和多種形式的Gluc2-核心轉(zhuǎn)染 的細胞中檢測的平均發(fā)光信號除以在利用Glucl-AP2M1和空白Gluc2載體轉(zhuǎn)染的對照細胞 以及利用各自Gluc2-核心和空白Glucl載體轉(zhuǎn)染的那些中測量的平均發(fā)光）。（B)在利用 具有相應(yīng)突變的J6/JFH(p7-Rluc2A)電穿孔后第6小時（白色）和72小時（黑色）通過 海腎螢光素酶測定的HCV RNA復(fù)制。ΛΕ1-Ε2是裝配缺陷對照。GNN是復(fù)制缺陷聚合酶突 變體。（C)在利用來自于電穿孔細胞的上清液感染的未經(jīng)處理的（naive)Huh-7. 5細胞中通 過螢光素酶測定的細胞外感染性。（D)在利用來自于電穿孔細胞的澄清細胞裂解物感染的 未經(jīng)處理的Huh-7. 5細胞中通過螢光素酶測定的細胞內(nèi)感染性。（E)通過有限稀釋測定測 量的細胞內(nèi)和細胞外感染性滴度。TCID5(I是50%組織培養(yǎng)物感染劑量。（F)在電穿孔后第 72小時通過qRT-PCR測量的釋放到培養(yǎng)物上清液中的病毒RNA。（G)相對于WT對照，在電 穿孔后第72小時通過ELISA確定的釋放到培養(yǎng)物上清液中的HCV核心蛋白。（H)在具有相 應(yīng)突變的病毒感染的細胞制備的裂解物中通過western分析的核心蛋白的水平。示出了來 自三個獨立的一式三份實驗的結(jié)果的平均值和s.d.(誤差條）。水平虛線表示螢光素酶活 性的背景水平。RLU是相對光單位。* p < (λ 05, * * p < (λ 01，* * * ρ < (λ 001。
[0023] 圖4 :示出了 ΑΡ2Μ1消耗對HCV裝配的抑制。（Α)在具有靶向ΑΡ2Μ1基因和非靶向 (NT)序列的shRNA慢病毒構(gòu)建體的穩(wěn)定克隆中通過定量western分析的AP2M1蛋白水平。 示出了代表性的膜和來自三個獨立測量值的組合數(shù)據(jù)。Y軸表示相對于NT對照的AP2M1與 肌動蛋白的比值。（B)相對于NT對照，在所選穩(wěn)定克隆中通過qRT-PCR的AP2M1/S18RNA比 值。（C)利用J6/JFH(p7-Rluc2A)對所指示的克隆電穿孔。在電穿孔后第9小時（白色） 和第72小時（黑色）通過螢光素酶測定的這些克隆中HCVRNA的復(fù)制。（D)在利用來自于 多個穩(wěn)定細胞克隆的上清液接種的未經(jīng)處理的細胞中通過螢光素酶測定測量的細胞外感 染性。（E)在利用來自于電穿孔細胞的澄清細胞裂解物感染的未經(jīng)處理的Huh-7. 5細胞中 通過螢光素酶測定的細胞內(nèi)感染性。（F)通過有限稀釋測定測量的細胞內(nèi)和細胞外感染性。 TCID5(I是50 %組織培養(yǎng)感染劑量。（G)在電穿孔后第72小時通過qRT-PCR測量的釋放到 培養(yǎng)物上清液中的病毒RNA。（H)在電穿孔后第72小時通過ELISA確定的釋放到培養(yǎng)物 上清液中的HCV核心。（I)在同時利用表達shAP2Ml和抗性WT AP2MlcDNA(AP2Ml-WT)的 shRNA的慢性病毒轉(zhuǎn)導的細胞中相對于NT對照的感染性病毒產(chǎn)生（上圖）和通過western 印跡分析的AP2M1蛋白的水平（下圖）。示出了來自至少三個獨立實驗的結(jié)果的平均值和 s. d.(誤差條）。RLU 是相對光單位。* p < 0· 05, * * p < 0· 01，* * * p < 0· 001。
[0024] 圖5 :表明破壞核心-AP2M1結(jié)合消除了向LD招募AP2M1并改變了核心的亞細胞 定位及其與E2的共定位。Huh-7. 5細胞中核心和AP2M1的亞細胞定位和核心-E2共定位 的定量共聚焦免疫熒光（IF)分析。（A)未經(jīng)處理的Huh-7. 5細胞中內(nèi)源AP2M1 (藍色）和 LD標記Bodipy (綠色）的代表性融合圖像。（B)-⑶對核心（紅色）、LD標記Bodipy (綠 色）和AP2M1 (藍色）染色的利用J6/JFH HCV感染的Huh-7. 5細胞的融合圖像。（E)通過 (A)_(D)的定量共定位分析的未經(jīng)處理的（白色）或被感染（黑色）細胞中所示信號的共 定位百分比。（F)四通道融合圖像。插圖中的黃色箭頭指示核心和AP2M1向LD的共定位。 (G)-(J)表示利用僅表達AP2Ml-mCherry(G)或AP2Ml-mCherry和WT核心⑶或核心Y136A 突變體（I)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Huh-7. 5細胞中AP2M1 (紅色）和脂質(zhì)標記LipidTOX (藍色）的 代表性融合圖像和定量共定位分析。圖（H)和（I)中示出的細胞中核心表達（綠色）在 各自下方的圖中展示。（K)-(P)核心（紅色）和（K)Bodipy (綠色）的代表性融合圖像和 定量共定位分析，表明與WT核心（左圖）相比，在利用具有Y136A核心突變體（右圖）的 J6/JFH HCV RNA電穿孔的Huh-7. 5細胞中核心向LD的定位提高。（L)對照（NT)細胞（左 圖）或者利用J6/JFH HCV RNA電穿孔的AP2M1消耗（右圖）的Huh-7. 5中的Bodipy (綠 色），表明在AP2M1消耗的細胞中核心大量定位在LD。（M). TGN46 (綠色），表明與WT核心 (左圖）相比，在利用具有Y136A核心突變（右圖）的J6/JFH RNA電穿孔的Huh-7. 5細胞 中核心向TGN的定位降低。（N)對照（NT)細胞（左圖）或者利用J6/JFH HCV RNA電穿孔 的AP2M1消耗（右圖）的Huh-7. 5中的TGN46 (綠色），表明在AP2M1消耗的細胞中核心 在TGN的定位降低。（0)E2(綠色），表明與WT核心（左圖）相比，在利用具有Y136A核心 突變（右圖）的J6/JFH RNA電穿孔的Huh-7. 5細胞中核心和E2的共定位降低。（P)對照 (NT)細胞（左圖）或者利用J6/JFH HCV RNA電穿孔的AP2M1消耗（右圖）的Huh-7. 5中 的E2(綠色），表明在AP2M1消耗的細胞中核心和E2的共定位降低。示出了 60X放大的代 表性圖。圖表示使用Manders系數(shù)的Z疊置的定量共定位分析。值指示表示為共定位百分 比（與紅色強度重合的綠色強度的分數(shù)，或者在圖（G)-(I)的情況下，與紅色強度重合的藍 色強度的分數(shù)）平均M2值土s.d.(誤差條）；n = 10至15。* ρ<0·05，** ρ<0·01， 女女女ρ < 0. 001。
[0025] 圖6 :表明ΑΑΚ1和GAK調(diào)節(jié)核心-ΑΡ2Μ1結(jié)合并參與HCV裝配。⑷ΑΡ2Μ1與具有 ΥΧΧΦ信號的宿主貨物蛋白結(jié)合的調(diào)節(jié)機制。（B)通過PCA(黑色）和微流體（白色），核心 與野生型和T156A AP2M1突變體的結(jié)合。（C)-(E)利用編碼WT和T156A AP2M1突變體的 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh-7. 5并在轉(zhuǎn)染后第48小時利用J6/JFH(p7-Rluc2A)電穿孔。（C)相對于WT AP2M1對照，在轉(zhuǎn)染后第48小時通過基于阿爾瑪藍（alamarBlue)測定的細胞存活力。（D) 在利用J6/JFH(p7-Rluc2A)電穿孔后第6小時（黑色）和第72小時（白色）通過螢光素酶 測定的過表達WT或T156AAP2M1突變體的細胞中HCV RNA的復(fù)制。（E)相對于WT對照，分 別為在利用來自于所示細胞的上清液或細胞裂解物感染的未經(jīng)處理的Huh-7. 5細胞中通 過螢光素酶測定的細胞外（黑色）和細胞內(nèi)（白色）感染性。（F)-(G)利用相應(yīng)siRNA轉(zhuǎn) 染Huh7. 5細胞。（F)相對于NT序列，通過qRT-PCR的這些細胞中AAK1 (左）或GAK(右）與 S18RNA的比值。（G)定量western分析。數(shù)值表示相對于NT對照AAK1 (上）或GAK (下） 與肌動蛋白的比值。（H)在通過siRNA消耗AAK1或GAK的Huh-7. 5細胞中通過PCA的核 心-AP2M1結(jié)合。Y軸表示相對于NT對照的發(fā)光比值（在利用Glucl-AP2M1和Gluc2-核 心轉(zhuǎn)染的細胞中檢測的平均發(fā)光信號除以利用Glucl-AP2M1和空白Gluc2載體轉(zhuǎn)染的NT 細胞以及利用Gluc2核心和空白Glucl載體轉(zhuǎn)染的那些中測量的平均發(fā)光）。（I)-(K)利 用J6/JFH(p7-Rluc2A)對ΑΑΚ1或GAK消耗的細胞電穿孔。（I)相對于NT對照，消耗的細胞 中通過基于阿爾瑪藍測定的細胞存活力。（J)在電穿孔后第6小時（黑色）和第72小時 (白色）通過螢光素酶測定的這些細胞中的HCV RNA復(fù)制。（K)相對于NT對照，分別為在 利用來自于所示細胞的上清液或細胞裂解物感染的未經(jīng)處理的Huh-7. 5細胞中通過螢光 素酶測定的細胞外（黑色）和細胞內(nèi)（白色）感染性。（L)通過PCA的核心與AAK1和GAK 結(jié)合。Y軸表示相對于核心-AP2M1結(jié)合的發(fā)光比值。數(shù)據(jù)表示來自至少兩個一式三份實 驗的平均值和s. d.(誤差條）。RLU是相對光單位。* p < 0. 05, * * p < 0. 01，* * * p < 0· 001。
[0026] 圖7 :核心-AP2M1結(jié)合和HCV裝配的藥理學抑制。（A) AP2M1調(diào)節(jié)劑和所發(fā)現(xiàn)的抑 制劑。（B)抑制劑與AAK1 或GAK結(jié)合的Kd(Karaman等，Nat Biotechnol26 :127-132,2008)。 這些化合物影響核心-AP2M1結(jié)合的IC50,以及其影響細胞外感染性、細胞內(nèi)感染性和利用 細胞培養(yǎng)物生長HCV(HCVcc)的病毒感染的EC50。（C)通過PCA測量的化合物對核心-AP2M1 結(jié)合的抑制。（D)-(G)利用厄洛替尼、舒尼替尼或PKC-412每日處理用J6/JFH(p7-Rluc2A) 電穿孔的Huh-7. 5細胞，處理3天。在第72小時收集上清液和細胞裂解物并用于接種未 經(jīng)處理的Huh-7. 5細胞。相對于未處理的對照，抑制劑對于細胞外（D)和細胞內(nèi)（E)感染 性的影響的劑量響應(yīng)曲線。分別通過螢光素酶測定和基于阿爾瑪藍的測定，這些化合物不 影響HCV RNA復(fù)制（F)或細胞存活力（G) (GNN是復(fù)制缺陷的聚合酶突變體）。（H)在利用 J6/JFH(p7-Rluc2A)電穿孔并在花萼海綿誘癌素 A(Cal-A)的存在下利用化合物處理后，通 過收集的細胞裂解物的western分析的抑制劑對于AP2M1磷酸化的影響。示出了利用抗磷 酸-AP2M1 (P-AP2M1)和抗肌動蛋白抗體印跡的典型膜以及來自3個實驗的定量分析。Y軸 表示相對于未處理的對照的PAP2M1/肌動蛋白比值。（I)在每天處理的72小時之后，相對 于未處理的對照，HCVcc感染的細胞中抑制劑對病毒感染性（黑色）和細胞存活力（灰色） 的影響。數(shù)據(jù)表示來自至少3個一式三份的實驗的平均值和s.d.(誤差條）。RLU是相對 光單位。* p < 0· 05, * * p < 0· 01，* * * p < 0· 001。
[0027] 圖8 :通過匯集的siRNA暫時消耗AP2M1抑制HCV裝配。（A)相對于NT對照，轉(zhuǎn)染后 48 小時在利用靶向 AP2M1 的四種 siRNA 的匯集物（ON-TARGETplusSMARTpool，Dharmacon) 或者非靶向（NT)序列的匯集物轉(zhuǎn)染的Huh-7. 5細胞中通過qRT-PCR測量的AP2M1/S18RNA 比值。⑶利用相應(yīng)匯集的siRNA轉(zhuǎn)染后48小時細胞中通過定量western分析的AP2M1蛋 白水平。數(shù)值表示相對于NT對照AP2M1與肌動蛋白的比值。（C)相對于NT對照，在siRNA 轉(zhuǎn)染48小時后通過阿爾瑪藍測定的細胞生存力。（D)在利用所示匯集的siRNA轉(zhuǎn)染48小 時后利用J6/JFH(p7-Rluc2A)對細胞進行電穿孔。在電穿孔后第6小時（黑色）和第72 小時（白色）通過螢光素酶測定的這些細胞中的HCV RNA復(fù)制。（E)分別為通過螢光素酶 測定在利用源于具有所指示siRNA的電穿孔細胞的上清液或澄清細胞裂解物感染的未經(jīng) 處理的Huh-7. 5細胞中測量的細胞外（黑色）和細胞內(nèi)（白色）感染性。（F)通過有限稀 釋測定測量的感染性病毒產(chǎn)生。（G)在用來自于被siRNA暫時消耗AP2M1的Huh-7. 5細胞 的上清液或澄清裂解物感染和用培養(yǎng)物生長J6/JH1病毒（滴度：1.2X105TCID5(l/ml)感染 的未經(jīng)處理的Huh-7. 5細胞中通過焦點形成測定（focus formation assay)測量的細胞外 (黑色）和細胞內(nèi)（白色）感染性。結(jié)果相對于NT對照。示出了來自至少兩個獨立實驗的 平均值±8.(1.(誤差條）。1?1^是相對光單位。1'(：10 5(|是50%組織培養(yǎng)物感染劑量。
[0028] 圖9 :示出AAK1和GAK的消耗或藥理學上的抑制消除了 TZM-bl細胞中的HIV-1復(fù) 制（表達⑶4和CCR5并且還包含完整的螢光素酶和大腸桿菌β -半乳糖苷酶的報道基因 的CXCR4陽性HeLa細胞，所述二者報道基因都處于HIV長末端重復(fù)序列（tat基因）的控 制之下）。（A)相對于NT對照，AAK1或GAK消耗的細胞中HIV的復(fù)制。（B)相對于未處理 的對照，AAK1和GAK抑制劑對于HIV復(fù)制的抗病毒作用。
[0029] 圖10 :示出了基于微流體的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合測定。在該方案中示出了三個獨 立單元小室（微流體裝置中幾百個中的）。
[0030] (A)隔室和微機械閥。在控制通道和流動通道交叉處產(chǎn)生閥。在兩個通道之間的 交叉點的所得薄膜可通過液壓驅(qū)動偏轉(zhuǎn)。使用多路復(fù)用閥系統(tǒng)使得能夠利用大量彈性體微 閥在這些裝置中執(zhí)行復(fù)雜的流體操作。
[0031] (B)實驗方案。*表示表面結(jié)合生物素化抗組氨酸抗體（B1和B2中所示）。_ 表示表面結(jié)合FITC標記的誘館人蛋白質(zhì)（B3中所示）。脅表示Cy3標記的獵物病毒蛋白質(zhì) (B4和B5中所示）。1)使微流體裝置與載玻片結(jié)合并對其進行了表面圖案化，導致在每個 單元小室中覆蓋有生物素化的抗組氨酸抗體的圓形區(qū)域（見c)。2)使用體外轉(zhuǎn)錄/翻譯 (TNT)混合物從芯片表達V5-his標記的誘餌人蛋白質(zhì)并且將其裝載在裝置中。3)這些蛋 白質(zhì)與表面抗his抗體結(jié)合。4)通過相同的哺乳動物體外TNT混合物在微粒體膜的存在 下從芯片表達T7標記的病毒蛋白質(zhì)并與FITC標記的抗V5和Cy3標記的抗T7抗體一起裝 載到裝置中。5)關(guān)閉"夾心閥"以允許孵育病毒蛋白質(zhì)和人蛋白質(zhì)以及利用各自熒光抗體 對其進行標記。6)然后通過"按鈕膜"的驅(qū)動執(zhí)行ΜΙΤ0ΜΙ，其有助于捕獲表面結(jié)合復(fù)合物 同時排出任何的溶液相分子。打開"夾心閥"，然后通過簡單清洗以除去未捕獲的未結(jié)合物 質(zhì)。7)通過陣列掃描儀掃描所述裝置。檢測捕獲的病毒蛋白質(zhì)和表面結(jié)合人蛋白質(zhì)。通過 測量Cy3的中值信號與FITC的中值信號來計算每一數(shù)據(jù)點結(jié)合的病毒蛋白質(zhì)與表達的人 蛋白質(zhì)的比值（用〇表示，圖B7中所示）。
[0032] (C)表面圖案化。1)通過穿過全部流動通道的生物素化BSA溶液（II >的流動來 衍生化可接近的表面區(qū)域。2)裝載親和素溶液?齡3)激活"按鈕"膜。4)利用生物素 化溶液i g >鈍化除了被按鈕掩蓋的60 μ m的圓形區(qū)域外的所有可接近的表面區(qū)域。5)打 開"按鈕"膜。6)裝載生物素化抗his抗體的溶液（^)，其允許特異性功能化之前掩蓋的 圓形區(qū)域。7)體外表達的人蛋白質(zhì)（*·)與覆蓋離散圓形區(qū)域的生物素化抗體結(jié)合。在每 一個所述步驟之后均通過PBS清洗。
[0033] 圖11 :通過qRT-PCR測定表明核心的ΥΧΧΦ突變不影響HCV RNA復(fù)制。相對于WT 對照，在利用具有相應(yīng)的核心ΥΧΧΦ突變的J6/JFH(p7-Rluc2A)電穿孔72小時后，Huh-7. 5 細胞中通過qRT-PCR的HCV RNA復(fù)制。ΛΕ1-Ε2是裝配缺陷對照。GNN是復(fù)制缺陷聚合酶 突變體。示出了來自兩個獨立的一式三份實驗的結(jié)果的平均值和s.d.(誤差條）。
[0034] 圖12 :通過qRT-PCR測定表明AP2M1消耗對于HCV RNA復(fù)制沒有影響。相對于NT 對照，在利用J6/JFH(p7-Rluc2A)進行電穿孔72小時后，具有相應(yīng)shRNA的Huh-7. 5細胞 中通過qRT-PCR的HCV RNA復(fù)制。示出了來自兩個獨立的一式三份實驗的結(jié)果的平均值和 s. d.(誤差條）。
[0035] 圖13 :表明通過匯集的siRNA暫時消耗AP2M1抑制HCV裝配。（A)相對于NT對照， 在利用靶向AP2M1的四種siRNA的匯集物（ON-TARGETplusSMARTpool)或者非靶向（NT)序 列的匯集物轉(zhuǎn)染的Huh-7. 5細胞中于轉(zhuǎn)染后48小時通過qRT-PCR測量的AP2M1/S18RNA比 值。（B)利用相應(yīng)的匯集的siRNA轉(zhuǎn)染后48小時在細胞中通過定量Western分析的AP2M1 蛋白水平。數(shù)值代表相對于NT對照AP2M1比肌動蛋白的蛋白質(zhì)比值。（C)相對于NT對照， 在siRNA轉(zhuǎn)染48小時后通過阿爾瑪藍分析的細胞存活力。（D)利用所示匯集的siRNA轉(zhuǎn)染 48小時后利用J6/JFH(p7-Rluc2A)對細胞進行電穿孔。電穿孔后第6小時（黑色）和72 小時（白色）通過螢光素酶測定的這些細胞中HCV RNA的復(fù)制。（E)分別為通過螢光素酶 測定在未經(jīng)處理的Huh-7. 5細胞中測量細胞外（黑色）和細胞內(nèi)（白色）感染性，所述細 胞被用來自于具有所示siRNA的電穿孔細胞的上清液或澄清細胞裂解物感染。（F)通過有 限稀釋測定測量的感染性病毒產(chǎn)生。（G)通過焦點形成測定在用來自于被siRNA暫時消耗 AP2M1的Huh-7. 5細胞的上清液或澄清細胞裂解液感染和用培養(yǎng)物生長的J6/JH1病毒（滴 度：1. 2X105TCID5(l/ml)感染的未經(jīng)處理的Huh-7. 5細胞中測量的細胞外（黑色）和細胞內(nèi) (白色）感染性。結(jié)果相對于NT對照。示出了來自至少兩個獨立實驗的平均值土s.d.(誤 差條）。RLU是相對光單位。TCID 5(I是50%組織培養(yǎng)感染劑量。
[0036] 圖14 :示出Y136A核心突變似乎不影響核心在HCV感染的細胞中ER膜上的定位。 (A)利用培養(yǎng)物生長HCV感染的Huh-7. 5細胞中核心在ER膜上的定位的定量共聚焦免疫熒 光（IF)分析。㈧和⑶表示核心（紅色）和ER標記物鈣網(wǎng)蛋白（綠色）的融合圖像， 表明了在利用WT病毒（A)或具有Y136A核心突變的病毒（B)感染的Huh-7. 5細胞中核心 在ER膜上的可比較的部分定位。示出了 60X放大的典型圖。（C)使用Manders系數(shù)的Z 疊置（Z stack)的共定位分析（更高的值代表更多共定位）。值指示表示為共定位百分比 (與紅色強度相符的綠色強度的分數(shù)）的平均M2值土s.d.(誤差條）；n= 10至15。
[0037] 發(fā)明詳述
[0038] 在極為詳細地描述本公開內(nèi)容之前，應(yīng)理解的是，本公開內(nèi)容不限于所描述的具 體實施方案，當然，本發(fā)明的實施方案本身可以改變。還應(yīng)理解的是，本文使用的術(shù)語僅為 了描述具體實施方案的目的，而不是旨在限制，因為本公開內(nèi)容的范圍僅由所附權(quán)利要求 限制。
[0039] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上將理解的，本文描述和舉例說明的 每一個獨立的實施方案具有離散的部分和特征，這些部分和特征可容易地分開或與任意其 他數(shù)個實施方案的特征組合，而不脫離本公開內(nèi)容的范圍和精神?？梢砸运枋鍪录拇?序或邏輯上合理的任何其他次序來實施任何所描述方法。
[0040] 在詳細描述本公開內(nèi)容的實施方案之前，應(yīng)理解的是，除非另外說明，否則本公開 內(nèi)容不限于特定的材料、試劑、反應(yīng)材料、制造過程等，因為其可以改變。還要理解，本文使 用的術(shù)語僅為了描述具體實施方案的目的，而不是旨在限制。在本公開內(nèi)容中還可能的是， 可以以邏輯上可能的不同順序來執(zhí)行步驟。如在本說明書和所述權(quán)利要求中使用的，除非 上下文清楚地另外指明，否則無數(shù)量詞修飾形式的名詞包括復(fù)數(shù)的指示物。因此，例如，提 及"化合物"包括多種化合物。在本說明書和所附權(quán)利要求書中將提及若干術(shù)語，其應(yīng)定義 為具有以下含義，除非明顯是相反含義。
[0041] 定義
[0042] 在所公開的主題的描述和權(quán)利要求中，將根據(jù)下文給出的定義來使用以下術(shù)語。
[〇〇43] "黃病毒科病毒"是指黃病毒科的任意病毒，包括感染人和非人動物的那些病毒。 編碼這些病毒的多核苷酸和多肽序列是本領(lǐng)域中公知的，并且可在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫 中找到，例如 Genbank 登記號 NC_004102、AB031663、D11355、D11168、AJ238800、NC_001809、 NC_001437、NC_004355、NC_004119、NC_003996、NC_003690、NC_003687、NC_003675、 NC_003676、NC_003218、NC_001563、NC_000943、NC_003679、NC-003678、NC_003677、 NC_002657、NC_002032和NC_001461，其數(shù)據(jù)庫條目的內(nèi)容通過引用整體并入本文。
[0044] 本文使用的術(shù)語"治療（treatment、treating和treat) "定義為利用藥劑對疾病、 紊亂或病癥所進行的旨在減輕或緩減所述疾病、紊亂或病癥和/或其癥狀的藥理學和/或 生理學作用的動作。本文使用的"治療"涵蓋對宿主（例如，哺乳動物，通常為人或獸醫(yī)感 興趣的非人動物）中疾病的任何治療，包括：(a)降低被確定為易感疾病但是尚未被診斷為 受所述疾病感染的對象中出現(xiàn)所述疾病的風險，（b)阻止疾病的發(fā)生，和（c)減輕疾?。?， 導致疾病消退）和/或減輕一種或更多種疾病癥狀。"治療"還旨涵蓋甚至在不存在疾病或 病癥的情況下遞送抑制劑以提供藥理學作用。例如，"治療"涵蓋遞送在對象中提供提高的 或期望的作用（例如，降低病原體載量、減輕疾病癥狀等）的疾病或病原體抑制劑。
[0045] 本文使用的術(shù)語"預(yù)防性治療"是指完全地或部分地預(yù)防疾病或其癥狀，和/或可 以是在部分地或完全地治愈疾病和/或疾病引起的不利影響方面的治療。
[0046] 本文使用的術(shù)語"宿主"、"對象"、"患者"或"生物體"包括人和哺乳動物（例如， 小鼠、大鼠、豬、貓、狗和馬）。可以施用本發(fā)明化合物的典型宿主將是哺乳動物，特別是靈長 類動物，尤其是人。對于獸醫(yī)應(yīng)用，很多種對象將是合適的，例如家畜，如牛、綿羊、山羊、牛、 豬等；家禽，如雞、鴨、鵝、火雞等；以及馴化的動物，特別是寵物，例如狗和貓。對于診斷或 研究應(yīng)用，很多種哺乳動物可能是合適的對象，包括嚙齒類動物（例如，小鼠、大鼠、倉鼠）、 兔、靈長類動物和豬，例如近交系豬等。術(shù)語"活宿主"是指活著的上述宿主或其他生物體。 術(shù)語"活宿主"是指整個宿主或生物體而不僅僅是來自活宿主離體的一部分（例如，肝或其 他器官）。
[0047] 術(shù)語"分離的化合物"是指與和其一起存在于自然界中的其他化合物基本分離或 相對于所述其他化合物富集的化合物。分離的化合按重量計通常為至少約80 %、至少90 % 純、至少98%純或至少約99%純。本公開內(nèi)容旨在包括非對映體，以及其外消旋的或拆分 的對映體純形式及其可藥用鹽。
[〇〇48] 本文使用的術(shù)語"單位劑型"是指適于作為單一劑量用于人和/或動物對象的物 理離散單位，每一個單位包含與可藥用稀釋劑、載體或載劑聯(lián)合的以足以產(chǎn)生預(yù)期效果的 量計算的預(yù)定量的化合物（例如，本文中描述的抗病毒化合物）。單位劑型的規(guī)格取決于所 使用的特定化合物、施用的途徑和頻率、待實現(xiàn)的效果、以及與宿主中每一種化合物相關(guān)的 藥物效應(yīng)動力學。
[〇〇49] "可藥用賦形劑"、"可藥用稀釋劑"、"可藥用載體"或"可藥用輔料"是指可用于制 備通常為安全、無毒性和生物學或其他方面期望的藥物組合物的賦形劑、稀釋劑、載體和/ 或輔料，包括獸醫(yī)用途和/或人用藥物用途可接受的賦形劑、稀釋劑、載體和輔料。本說明 書和權(quán)利要求書中使用的"可藥用賦形劑、稀釋劑、載體和/或輔料"包括一種或更多種這 樣的賦形劑、稀釋劑、載體和輔料。
[0050] 本文使用的術(shù)語"藥物組合物"旨在包括適于向有此需要的對象如哺乳動物特別 是人施用的組合物。通常來說，"藥物組合物"是無菌的，并且優(yōu)選不含能夠在對象中引起不 期望的響應(yīng)的污染物（例如，藥物組合物中的化合物是藥用級）?？梢詫⑺幬锝M合物設(shè)計成 通過多種不同施用途徑向?qū)ο蠡蚧颊呤┯?，所述施用途徑包括?jīng)口、靜脈內(nèi)、口腔、直腸、腸 胃外、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、吸入等。
[0051] 本文使用的術(shù)語"治療有效量"是指將在一定程度上減輕被治療疾?。?，感染） 的一種或更多種癥狀和/或?qū)⒃谝欢ǔ潭壬项A(yù)防被治療的已經(jīng)發(fā)生或處于發(fā)生的危險之 下的宿主的疾?。?，感染）的一種或更多種癥狀的被施用的藥劑（其可被稱為化合物、抑 制劑和/或藥物）的實施方案的量。
[0052] 病毒是小的細胞內(nèi)感染劑，其通過使用宿主細胞的機構(gòu)進行復(fù)制。對于黃病毒科 病毒的裝配和出芽依然了解的不多，但是最近的數(shù)據(jù)表明可能包括胞內(nèi)吞途徑，例如丙型 肝炎病毒（HCV)。宿主蛋白質(zhì)參與這些過程，然而在本公開內(nèi)容之前，未將參與介導晚期裝 配和出芽的宿主蛋白質(zhì)作為抗病毒劑目標。但是，本公開內(nèi)容提供了以用于晚期裝配和出 芽的宿主蛋白質(zhì)為目標的抗病毒方法和組合物。具體地，參與內(nèi)吞或分泌途徑的宿主網(wǎng)格 蛋白銜接蛋白及其調(diào)節(jié)劑是有效的靶標。以前并不知道網(wǎng)格蛋白銜接蛋白及其調(diào)節(jié)物在 感染性黃病毒科病毒的產(chǎn)生中的作用。本公開內(nèi)容證明宿主網(wǎng)格蛋白銜接蛋白如AP2M1、 AP1M1、AP3M1和AP4M1及其調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)（例如，但不限于AAK1和GAK)是抗病毒治療的合 適的靶標。此外，本公開內(nèi)容提供了介導與宿主蛋白質(zhì)的相互作用的新的病毒氨基酸基序。
[0053] 在HCV的核心蛋白形成病毒衣殼的191個氨基酸的膜蛋白內(nèi)發(fā)現(xiàn)了保守的ΥΧΧΦ 基序（圖1)。該ΥΧΧΦ基序在迄今數(shù)據(jù)庫中可得的全部HCV隔離種中都是保守的。該 基序也被發(fā)現(xiàn)于來自其他黃病毒科病毒和其他病毒的結(jié)構(gòu)蛋白中。該ΥΧΧΦ基序與膜 宿主貨物蛋白內(nèi)的ΥΧΧΦ序列分選信號一致，被網(wǎng)格蛋白銜接蛋白（AP)復(fù)合物的μ亞 基識別（圖la)。ΑΡ2Μ1介導網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用，通過該過程，貨物蛋白被分選到 網(wǎng)格蛋白包被的小窩中轉(zhuǎn)運以與早期內(nèi)體融合。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AP2M1或AP1M1對逆轉(zhuǎn)錄病 毒蛋白質(zhì)中的ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的識別參與介導逆轉(zhuǎn)錄病毒的裝配和出芽（圖lb) (Batonick 等，Virology342 :190-200,2005 ;Camus 等，Molec Biol Celll8 :3193-3203, 2007 ;Berlioz-Torrent 等，J Virol73 :1350-1361,1999 ;Byland 等，Molec Biol Celll8 : 414-425,2007 ;Wyss 等，J Virol75 :2982-2992,2001 ;0hno 等，Virology238 :305-315, 1997 ;Boge 等，J Bior Chem273 :15773-15778,1998 ;Egan 等，J Virol70 :6547-6556, 1996 ;Rowell 等，J Immunoll55 :473-488,1995 ;Lodge 等，ΕΜΒ0 J16 :695-705,1997 ; Deschambeault 等，J Virol73 :5010-5017,1999)。但是，未研究 AAK1 和 GAK 在 HIV 感染中 的作用，這些機制未被用作藥理學靶標。因此，本公開內(nèi)容提供了用于治療或預(yù)防來自HCV、 黃病毒科病毒、除HCV以外的黃病毒科病毒、HIV、除HIV以外的慢病毒亞科病毒、網(wǎng)格蛋白 AP結(jié)合病毒、除黃病毒科病毒以外網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒、除HCV以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病 毒的病毒感染或同時感染（如HCV/HIV同時感染）的方法和組合物。
[0054] 抑制病毒ΥΧΧΦ基序和宿主銜接蛋白（例如，但不限于AP2M1)的相互作用導致降 低HCV、黃病毒科病毒、除HCV以外的黃病毒科病毒、網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒、除黃病毒科病毒 以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒、除HCV以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒或同時感染（如HCV/HIV 同時感染）的感染性病毒的產(chǎn)生。此外，抑制調(diào)節(jié)網(wǎng)格蛋白銜接蛋白的蛋白質(zhì)活性可導致 降低HCV、黃病毒科病毒、除HCV以外的黃病毒科病毒、網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒、除黃病毒科病 毒以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒、除HCV以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒或同時感染（如HCV/ HIV同時感染）的感染性病毒的產(chǎn)生。因此，旨在破壞病毒ΥΧΧΦ基序與網(wǎng)格蛋白銜接蛋白 (如AP2M1等）的相互作用的方法可用于抑制感染性病毒的產(chǎn)生。
[0055] 許多蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)通過蛋白激酶和蛋白磷酸酶的作用進行。GAK和AAK1是 調(diào)節(jié)AP2M1和網(wǎng)格蛋白AP復(fù)合物的其他μ亞基的活性的兩種蛋白激酶，表明施用蛋白激 酶抑制劑（如厄洛替尼、舒尼替尼或PKC-412)可消除ΑΡ2Μ1和網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他 μ亞基與病毒ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序之間的相互作用，從而抑制來自HCV、黃病毒科病毒、 除HCV以外的黃病毒科病毒、網(wǎng)格蛋白ΑΡ結(jié)合病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白ΑΡ結(jié) 合病毒、除HCV以外的網(wǎng)格蛋白ΑΡ結(jié)合病毒、HIV、除HIV以外的慢病毒亞科病毒的病毒感 染或同時感染（如HCV/HIV同時感染），如下文詳細描述。
[0056] 因此，本公開內(nèi)容的實施方案提供了治療來自網(wǎng)格蛋白ΑΡ結(jié)合病毒、黃病毒科病 毒、慢病毒亞科病毒、HCV、HIV、同時感染（如HCV/HIV同時感染）、除HCV以外的黃病毒科 病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白ΑΡ結(jié)合病毒或除HCV以外的網(wǎng)格蛋白ΑΡ結(jié)合病毒 或者劫持ΑΡ2Μ1和網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基/AAK1/GAK的任意其他包膜病毒的病 毒感染的方法，用于治療這樣的病毒的感染的組合物（包含抑制劑和所述藥劑與其他抗病 毒治療劑的組合）等。特別地，本發(fā)明的實施方案提供了治療由網(wǎng)格蛋白ΑΡ結(jié)合病毒、黃 病毒科病毒、慢病毒亞科病毒、HCV、HIV、同時感染（如HCV/HIV同時感染）、除HCV以外的 黃病毒科病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒或除HCV以外的網(wǎng)格蛋白AP 結(jié)合病毒造成的感染的方法，以及用于治療這些感染或與網(wǎng)格蛋白銜接蛋白如AP2M1結(jié)合 或者由AAK1或GAK調(diào)節(jié)的任意其他包膜病毒的感染的組合物。
[0057] 本公開內(nèi)容的一些實施方案提供了預(yù)防性治療來自網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒、黃病 毒科病毒、慢病毒亞科病毒、HCV、HIV、同時感染（如HCV/HIV同時感染）、除HCV以外的黃 病毒科病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒或除HCV以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié) 合病毒的病毒感染的方法，用于預(yù)防性治療由這些病毒造成的感染的組合物（包含抑制劑 和所述藥劑與其他抗病毒治療劑的組合）等。特別地，本發(fā)明的實施方案提供了用于預(yù)防 性治療HCV和/或HIV的方法，以及用于治療HCV和/或HIV的組合物。在一個作為替代 的實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療HCV/HIV感染或除HCV以外的黃病毒科病毒的方法。 盡管本文的討論可能針對HCV來描述本發(fā)明，但是應(yīng)注意的是本公開內(nèi)容不僅涉及HCV，還 涉及網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒、黃病毒科病毒、慢病毒亞科病毒、HIV、同時感染（如HCV/HIV同 時感染）、除HCV以外的黃病毒科病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒或除 HCV以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒，以及用于治療這些感染的或者與AP2M1或網(wǎng)格蛋白AP復(fù) 合物的其他μ亞基結(jié)合或者由AAK1或GAK調(diào)節(jié)的任意其他包膜病毒或者與網(wǎng)格蛋白銜接 蛋白如ΑΡ2Μ1等或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基結(jié)合或者由AAK1/GAK調(diào)節(jié)這種相互 作用的任意其他包膜病毒的組合物。
[0058] 鑒于包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白質(zhì)可介導與宿主蛋白質(zhì)的相互作用 的認識，本發(fā)明的一些實施方案提供了包含可用于治療被黃病毒科的病毒感染的宿主的抑 制劑的組合物（包括藥物組合物）。特別地，所述抑制劑可用于治療具有來自網(wǎng)格蛋白ΑΡ 結(jié)合病毒、黃病毒科病毒、慢病毒亞科病毒、HCV、HIV、同時感染（如HCV/HIV同時感染）、除 HCV以外的黃病毒科病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒或除HCV以外的網(wǎng) 格蛋白AP結(jié)合病毒的病毒感染的宿主或者遭受同時感染特別是HCV和HIV或除HCV以外 的黃病毒科病毒的患者。因此，兩種抑制劑可用于本文：（1)抑制包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基 序的病毒蛋白質(zhì)與宿主網(wǎng)格蛋白銜接蛋白如AP2M1和網(wǎng)格蛋白AP復(fù)合物的其他μ亞基之 間的相互作用的那些；以及（2)抑制調(diào)節(jié)宿主蛋白質(zhì)的激酶活性的那些。在一些實施方案 中，所述抑制劑抑制AAK1或GAK。
[0059] 如在實施例中描述的，已觀察到結(jié)構(gòu)蛋白中的HCV ΥΧΧΦ基序與宿主蛋白質(zhì) AP2M1結(jié)合。這種相互作用已被用于鑒別干擾這種相互作用的抑制劑，因此可以是臨床開發(fā) 用于治療來自網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒、黃病毒科病毒、慢病毒亞科病毒、HCV、HIV、同時感染 (如HCV/HIV同時感染）、除HCV以外的黃病毒科病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白AP 結(jié)合病毒或除HCV以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒的病毒感染的藥物的候選物。
[0060] 本文中描述的抑制劑可用于治療病毒感染，其中所述病毒是包含ΥΧΧΦ基序的病 毒，Y是酪氨酸殘基，X是任意氨基酸，Φ是大體積疏水殘基。這些可包括但不限于：苯丙氨 酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸。本文中描述的抑制劑可用于治療病毒感染，其中 所述病毒包括含有二亮氨酸基序的病毒。二亮氨酸基序可包括但不限于：亮氨酸-亮氨酸、 異亮氨酸-亮氨酸、亮氨酸-異亮氨酸、[D/E]XXXL[L/I]或DXXLL (其中X是任意氨基酸）。 包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的病毒包括慢病毒亞科病毒如HIV和黃病毒科病毒等。示例性 黃病毒科病毒包括但不限于：黃病毒、瘟病毒和丙型肝炎病毒。其他包含ΥΧΧΦ或二亮氨 酸基序的病毒包括：黃熱病毒（YFV);登革熱病毒，包括1至4型登革熱病毒；日本腦炎病 毒；墨累溪谷腦炎病毒（Murray valley Encephalitis virus);圣路易腦炎病毒（St. Louis Encephalitis);西尼羅河病毒（West Nile virus);蝶傳腦炎病毒；丙型肝炎病毒（HCV); 昆津病毒（Kunjin virus);中歐腦炎病毒；俄羅斯春夏腦炎病毒（Russian spring-summer encephalitis virus);波瓦桑病毒（Powassan virus);庫阿撒魯爾森林病病毒（Kyasanur Forest disease virus);伊爾烏斯病毒（Ilheus virus) ;Apoi 病毒；A 型和 B 型 GB 病 毒；跳躍病病毒（Louping ill virus)和鄂木斯克出血熱病毒（Omsk hemorrhagic fever virus)〇
[0061] 在一個實施方案中，特別令人感興趣的是用于抑制HCV復(fù)制和治療HCV感染的抑 制劑（抗HCV劑）。除HCV以外的黃病毒科病毒和除黃病毒科病毒以外的包膜病毒也是令人 感興趣的。本公開內(nèi)容考慮的HCV可以是任何基因型（基因型1、2、3、4、5、6等）以及HCV 基因型的亞型（例如，1&、113、2&、213、3&等）。由于!1(^基因型1通常最難以治療，因此用于 治療HCV基因型1和基因型1亞型的感染的本發(fā)明方法和組合物是特別令人感興趣的。在 一個實施方案中，令人感興趣的是HCV同時感染。特別地，令人感興趣的是HCV/HIV同時感 染。
[0062] 盡管以下描述引用的是HCV，但是這樣的引用僅是為了清楚，而非旨在將下文更詳 細描述的本公開內(nèi)容局限于HCV。如上文提到的，本發(fā)明的方法和組合物可應(yīng)用于任何在結(jié) 構(gòu)蛋白中具有ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的任何病毒（例如，來自HCV、黃病毒科病毒、除HCV以 外的黃病毒科病毒、網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒、 除HCV以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒的病毒感染，同時感染（如HCV/HIV同時感染））、慢病 毒亞科病毒或HIV。所述組合物和方法還可應(yīng)用于同時感染以及除HCV以外的黃病毒科病 毒和除黃病毒科病毒以外的包膜病毒的感染。
[0063] 本公開內(nèi)容還描述了鑒別調(diào)節(jié)包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白質(zhì)和宿主 網(wǎng)格蛋白銜接蛋白如AP2M1或網(wǎng)格蛋白AP復(fù)合物的其他μ亞基之間結(jié)合的藥劑（抑制 齊U)的體外無細胞方法。還可在基于細胞的測定中進一步測試抑制包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸 基序的病毒蛋白質(zhì)與宿主蛋白質(zhì)包括網(wǎng)格蛋白銜接蛋白如ΑΡ2Μ1或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的 其他μ亞基結(jié)合的測試藥劑抑制病毒復(fù)制的能力。例如，可以使目標測試藥劑與具有全部 或一部分HCV基因組的哺乳動物細胞接觸，并可確定所述測試藥劑對HCV復(fù)制的影響。合 適的細胞包括允許HCV復(fù)制的哺乳動物肝細胞，例如，允許HCV的永生化人肝細胞系。例 如，合適的哺乳動物細胞是Huh7肝細胞或Huh7肝細胞的亞克隆，例如Huh-7. 5。合適的細 胞系描述在例如 Blight 等（J Virol76 :13001，2002)和 Zhang 等（J Virol78 :1448,2004) 中。在一個實施方案中，細胞中的HCV基因組包含報道基因，例如，編碼螢光素酶、熒光蛋白 或其他提供可檢測信號的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；并通過檢測來自報道基因的信號來確定測 試藥劑對HCV復(fù)制的影響（如果有的話）。其他病毒測定系統(tǒng)是本領(lǐng)域中已知的。
[〇〇64] 在一個實施方案中，測試藥劑是有機部分。在該實施方案中，如在被通過引用并入 本文的W094/24314中一般描述的，測試藥劑由一系列可進行化學修飾的底物合成。本文的 "化學修飾"包括常規(guī)化學反應(yīng)以及酶促反應(yīng)。這些底物通常包括但不限于：烷基（包括烷 烴、烯烴、炔烴和雜烷基）、芳基（包括芳烴和雜芳基）、醇、醚、胺、醛、酮、酸、酯、酰胺、環(huán)狀 化合物、雜環(huán)化合物（包括嘌呤、嘧啶、苯并二氮β-內(nèi)酰胺、四環(huán)素、頭孢菌素和碳水 化合物）、類固醇（包括雌激素、雄激素、可的松、蛻化素（ecodysone)等）、生物堿（包括麥 角、長春花、馬錢子（curare)、批咯里西陡（pyrollizdine)和絲裂霉素）、有機金屬化合物、 具有雜原子的化合物、氨基酸和核苷?？稍谒霾糠稚线M行化學（包括酶促）反應(yīng)以形成 新物質(zhì)或候選藥劑，其隨后可使用本發(fā)明方法測試。
[0065] 因此，在一些具體實施方案中，與不存在測試藥劑時HCV復(fù)制的水平相比，目標測 試藥劑（例如，本發(fā)明抑制劑）使病毒復(fù)制被抑制至少約5%、至少約10%、至少約15%、至 少約20 %、至少約25 %、至少約30 %、至少約35 %、至少約40 %、至少約45 %、至少約50 %、 至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%或者更多。
[〇〇66] 特別地，本發(fā)明的一些實施方案包括以下抑制劑，與不存在所述測試藥劑時包含 ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白質(zhì)與宿主網(wǎng)格蛋白銜接蛋白如AP2M或網(wǎng)格蛋白AP復(fù)合 物的其他μ亞基的結(jié)合相比，所述抑制劑使包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白質(zhì)與 宿主網(wǎng)格蛋白銜接蛋白如ΑΡ2Μ或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基的結(jié)合被抑制至少約 5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少 約40 %、至少約45 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %或至少約90 %或 更多。
[0067] 在又一個實施方案中，所述抑制劑是以下的一種，其抑制包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸 基序的病毒蛋白質(zhì)與宿主網(wǎng)格蛋白銜接蛋白如ΑΡ2Μ1或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基 結(jié)合，其50%抑制濃度（IC 5(I)為約100 μ Μ至50 μ Μ、約50 μ Μ至25 μ Μ、約25 μ Μ至10 μ Μ、 約 10 μ Μ 至 5 μ Μ、約 5 μ Μ 至 1 μ Μ、約 1 μ Μ 至 500ηΜ、約 500ηΜ 至 400ηΜ、約 400ηΜ 至 300ηΜ、 約 300ηΜ 至 250ηΜ、約 250ηΜ 至 200ηΜ、約 200ηΜ 至 150ηΜ、約 150ηΜ 至 ΙΟΟηΜ、約 ΙΟΟηΜ 至 50ηΜ、約 50ηΜ 至 30ηΜ、約 30ηΜ 至 25ηΜ、約 25ηΜ 至 20ηΜ、約 20ηΜ 至 15ηΜ、約 15ηΜ 至 10ηΜ、 約10ηΜ至5ηΜ或小于約5ηΜ。
[0068] 在又一個實施方案中，所述抑制劑抑制包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的至少一種病 毒蛋白質(zhì)與宿主網(wǎng)格蛋白銜接蛋白如ΑΡ2Μ1或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基結(jié)合。在 一個實施方案中，所述抑制劑抑制包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的至少一種病毒蛋白與宿主 蛋白質(zhì)（如ΑΡ2Μ1或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基）結(jié)合，其IC 5Q小于約500ηΜ，例如， 在一些實施方案中，所述抑制劑抑制包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的病毒蛋白質(zhì)的至少一種 病毒蛋白質(zhì)與宿主蛋白質(zhì)（如ΑΡ2Μ1或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基）結(jié)合，其IC5Q 為約 500nM 至 400nM、約 400nM 至 300nM、約 300nM 至 250nM、約 250nM 至 200nM、約 200nM 至 150nM、約 150nM 至 ΙΟΟηΜ、約 ΙΟΟηΜ 至 50nM、約 50nM 至 30nM、約 30nM 至 25nM、約 25nM 至 20nM、約 20nM 至 15nM、約 15nM 至 ΙΟηΜ、約 ΙΟηΜ 至 5nM 或小于約 5nM。
[0069] 在又一個實施方案中，當所述抑制劑與病毒感染的細胞（例如，HCV感染的肝細 胞）接觸時，和不與所述抑制劑接觸時病毒感染細胞中病毒復(fù)制的水平相比，所述抑制劑 使細胞中病毒的復(fù)制被抑制至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約 25 %、至少約30 %、至少約35 %、至少約40 %、至少約45 %、至少約50 %、至少約60 %、至少 約70%、至少約80%或至少約90%或更多。
[0070] 在又一個實施方案中，當所述抑制劑與病毒感染的細胞（例如，HCV感染的肝細 胞）接觸時，和不與所述抑制劑接觸時細胞產(chǎn)生的感染性病毒顆粒的數(shù)量相比，所述抑制 劑使被感染細胞產(chǎn)生的感染性病毒顆粒的數(shù)量降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、 至少約20%、至少約25%、至少約30 %、至少約35 %、至少約40%、至少約45%、至少約 50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%或更多。
[0071] 在又一個實施方案中，除了確定測試藥劑對抑制包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的病 毒蛋白質(zhì)與宿主網(wǎng)格蛋白銜接蛋白如AP2M1或網(wǎng)格蛋白AP復(fù)合物的其他μ亞基的結(jié)合的 影響外，還使用公知的測定如臺盼藍染料排除、ΜΤΤ (3- (4, 5-二甲基噻唑-2-基）-2, 5-二 苯基-2Η-四唑偷溴化物）測定等評估測試藥劑可能對活真核細胞表現(xiàn)出的任何細胞毒活 性。不表現(xiàn)出顯著的細胞毒活性的藥劑可被認為是優(yōu)選藥劑用于進一步作為藥物的開發(fā)。
[0072] 在又一個實施方案中，當將所述抑制劑以一個或更多個劑量向本文所述受病毒感 染的個體（例如，人）施用時，與不利用所述抑制劑進行治療的個體中的病毒載量相比， 所述抑制劑使所述個體中的病毒載量下降至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約 20 %、至少約25 %、至少約30 %、至少約35 %、至少約40 %、至少約45 %、至少約50 %、至少 約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%或更多。
[0073] 抑制劑
[0074] 本公開內(nèi)容的一些實施方案提供了可用于治療受黃病毒科病毒的病毒感染的宿 主的抑制劑。特別地，除HCV以外的黃病毒科病毒。特別地，所述抑制劑可用于治療受丙型 肝炎病毒感染或同時感染（特別是HCV+HIV同時感染）的宿主。所述抑制劑可以是以下組 中的一種或更多種：蛋白激酶ΑΑΚ1或GAK的抑制劑，其調(diào)節(jié)病毒蛋白質(zhì)-網(wǎng)格蛋白銜接子 如ΑΡ2Μ1(或者網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基）結(jié)合并介導病毒裝配和/或出芽。由 于ΑΡ2Μ1和網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基介導多種病毒的生命周期中的多個階段，所 以抑制ΑΡ2Μ1和網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基（例如通過抑制其調(diào)節(jié)蛋白激酶或磷酸 酶）可影響或抑制多種病毒。因此，調(diào)節(jié)這些宿主蛋白質(zhì)的蛋白激酶可在其他病毒科中功 能相關(guān)。盡管不排除特殊情況（如大部分化合物一樣），但是與其其他靶標相比，所發(fā)現(xiàn)的 蛋白激酶抑制劑與ΑΑΚ1或GAK高親和力地結(jié)合，并且對HCVRNA的復(fù)制沒有影響，證明了其 相對好的選擇性。
[0075] 可用做GAK和ΑΑΚ1的抑制劑的其他藥劑包括但不限于：與厄洛替尼、舒尼替尼或 PKC-412競爭與GAK或ΑΑΚ1結(jié)合的RNAi、反義、核酶或小分子。此外，能夠與ΥΧΧΦ或二 亮氨酸基序競爭與宿主蛋白質(zhì)結(jié)合的抑制劑包括但不限于：針對ΥΧΧΦ或二亮氨酸或者抗 ΑΡ2Μ1或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基的結(jié)合劑，例如抗體。此外，顯性負結(jié)合蛋白質(zhì) 或適體可抑制GAK或ΑΑΚ1。在另一個實施方案中，符合ΑΡ2Μ1網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他 μ亞基的ΥΧΧΦ或二亮氨酸結(jié)合位點的誘餌受體或多肽可抑制GAK或ΑΑΚ1。
[0076] 本發(fā)明的一些實施方案包括抑制劑的鹽。本發(fā)明的一些實施方案包括抑制劑的前 藥。本發(fā)明的一些實施方案包括組合物、藥物組合物、液體組合物、凝膠組合物等，其每一種 都包含本文鑒定的抑制劑，并且在一個實施方案中，這些組合物中的每一種都可以是控制 釋放或持續(xù)釋放制劑的形式。在一個實施方案中，所述抑制劑可以與前述用于治療黃病毒 科病毒感染的其他藥劑組合使用，任一種藥劑（抑制劑和其他藥劑）或兩種藥劑都可以是 控制釋放或持續(xù)釋放制劑的形式。在某些情況下，術(shù)語"抑制劑"可指被稱為活性劑或藥物。
[0077] 藥物制劑和施用涂徑
[0078] 本公開內(nèi)容的一些實施方案包括本文中鑒定并且與一種或更多種可藥用賦形劑、 稀釋劑、載體和/或輔料一起配制的一種或更多種抑制劑。此外，本發(fā)明的一些實施方案包 括利用一種或更多種可藥用輔助物質(zhì)配制的抑制劑。特別地，可利用一種或更多種可藥用 賦形劑、稀釋劑、載體和/或輔料配制一種或更多種抑制劑以提供本發(fā)明組合物的一個實 施方案。
[0079] 在一個實施方案中，所述抑制劑可與另外的抗病毒劑組合以制備本發(fā)明組合物， 并且所述組合物可包含一種或更多種可藥用賦形劑、稀釋劑、載體和/或輔料。
[0080] 在一個實施方案中，可以利用一種或更多種可藥用賦形劑、稀釋劑、載體和/或輔 料配制抑制包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的蛋白質(zhì)與宿主網(wǎng)格蛋白銜接蛋白如ΑΡ2Μ1或網(wǎng)格 蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基結(jié)合的抑制劑（下文稱為"主題活性劑"或"藥物"）。
[0081] 很多種可藥用賦形劑在本領(lǐng)域中是已知的?？伤幱觅x形劑已經(jīng)在多個出版物 中被充分描述，包括例如：Gennaro(2000)/'Remington :The Science and Practice of Pharmacy，'；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)；和 Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000)〇
[0082] 可藥用賦形劑（例如載劑、輔料、載體或稀釋劑）是公眾容易獲得的。此外，可藥 用輔助物質(zhì)（如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑等）是公眾容易獲得的。
[0083] 在本公開內(nèi)容的一個實施方案中，使用能夠?qū)е骂A(yù)期效果（例如，降低病毒載量、 降低肝纖維化、提高肝功能等）的任何手段向宿主施用所述抑制劑。因此，可以將所述抑 制劑引入到多種制劑中用于治療性施用。例如，可以通過與合適的可藥用載體或稀釋劑組 合來將所述抑制劑配制成藥物組合物，以及可以配制成固體、半固體、液體或氣體形式的制 劑，例如片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、軟膏劑、溶液劑、栓劑、注射劑、吸人劑和氣霧劑。
[〇〇84] 在藥用劑型中，可以以其可藥用鹽的形式施用所述抑制劑，或者可以單獨使用或 與其他藥物活性化合物聯(lián)合以及組合使用所述主題活性劑。以下方法和賦形劑僅是示例性 的而絕不是限制性的。
[〇〇85] 對于口服制劑，可以將所述抑制劑單獨使用或與合適的添加劑組合使用以制備片 齊IJ、散劑、顆粒劑或膠囊劑，例如與常規(guī)添加劑如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；與 黏合劑如結(jié)晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；與崩解劑如玉米淀粉、 馬鈴薯淀粉或羧甲基纖維素鈉；與潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂；以及如需要，與稀釋劑、緩沖 齊u、濕潤劑、防腐劑和矯味劑組合使用。
[〇〇86] 通過將所述抑制劑的一些實施方案溶解、混懸或乳化在水性或非水溶劑（如植物 油或其他類似油、合成脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸的酯或丙二醇）中，并且若需要與常規(guī)添 加劑（如增溶劑、等張劑、助懸劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑）一起，可將所述抑制劑的一些 實施方案配制成用于注射的制劑。
[〇〇87] 可將所述抑制劑的一些實施方案應(yīng)用在氣霧劑制劑中以通過吸入施用?？蓪⑺?抑制劑的一些實施方案可配制到可加壓的拋射劑中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。
[〇〇88] 此外，通過與多種基質(zhì)（如乳化基質(zhì)或水溶性基質(zhì)）混合，可將所述抑制劑的一些 實施方案制備成栓劑?？蓪⑺鲆种苿┑囊恍嵤┓桨竿ㄟ^栓劑經(jīng)直腸施用。所述栓劑 可包含在體溫下熔化而在室溫下為固體的載劑，例如可可豆脂、碳蠟（carbowax)和聚乙二 醇。
[〇〇89] 可提供用于經(jīng)口或直腸施用的單位劑型，例如糖漿劑、酏劑和混懸劑，其中每個劑 量單位（例如茶匙、湯匙、片劑或栓劑）含有預(yù)定量的組合物，所述組合物含有一種或更多 種抑制劑。類似地，用于注射或靜脈內(nèi)施用的單位劑型可包含在作為無菌水、生理鹽水或另 外的可藥用載體中的溶液的組合物中的抑制劑。
[0090] 根據(jù)本發(fā)明，可將所述抑制劑的一些實施方案配制成可注射組合物。通常，將可注 射組合物制備成液體溶液或懸液；也可制備成適合于在注射前溶解或混懸在液體載劑中的 固體形式。根據(jù)本發(fā)明，所述制劑也可是乳化的或封裝在脂質(zhì)體載劑中的活性成分（抑制 劑）。
[0091] 在一個實施方案中，所述抑制劑被配制成用于通過持續(xù)遞送系統(tǒng)遞送。術(shù)語"持續(xù) 遞送系統(tǒng)"在本文中可與"受控遞送系統(tǒng)"互換使用，并且包括與導管、注射裝置等組合的持 續(xù)（例如，受控）遞送系統(tǒng)（例如，泵），其中很多種是本領(lǐng)域中已知的。
[0092] 機械或電動機械輸注泵也可適于本公開內(nèi)容使用。這樣的裝置的實例包括在 例如美國專利 No. 4, 692, 147、4, 360, 019、4, 487, 603、4, 360, 019、4, 725, 852、5, 820, 589、 5, 643, 207、6, 198, 966等中描述的那些。通常，可使用多種可再填充泵系統(tǒng)中的任意一種來 完成抑制劑的遞送。泵提供隨時間恒定受控的釋放。在一些實施方案中，抑制劑是在藥物 不可滲透的容器中的液體制劑，并且以持續(xù)方式向個體遞送。
[0093] 在一個實施方案中，藥物遞送系統(tǒng)是至少部分地可植入的裝置?？墒褂帽绢I(lǐng)域中 公知的方法和裝置將所述可植入裝置植入在任何合適的植入部位。植入部位是對象的身體 內(nèi)被引入和放置藥物遞送裝置的部位。植入部位包括但未必限于：真皮下（subdermal)、皮 下、肌內(nèi)或?qū)ο笊眢w內(nèi)的其他合適部位。在一些實施方案中，由于便于植入和移除藥物遞送 裝置，使用皮下植入部位。
[〇〇94] 適于在本公開內(nèi)容中使用的藥物釋放裝置可基于多種操作模式中的任一種。例 如，藥物釋放裝置可基于擴散系統(tǒng)、對流系統(tǒng)或可腐蝕系統(tǒng)（例如，基于腐蝕的系統(tǒng)）。例 如，所述藥物釋放裝置可以是電化學泵、滲透泵、電滲泵、蒸汽壓力泵或滲透破裂基質(zhì)，例 如，其中藥物被并入聚合物，伴隨著被藥物浸漬的聚合物材料（例如，生物可降解、藥物浸 染的聚合物材料）的降解，所述聚合物提供藥物制劑的釋放。在另一些實施方案中，所述藥 物釋放裝置基于電擴散系統(tǒng)、電解泵、泡騰泵、壓電泵、水解系統(tǒng)等。
[0095] 基于機械或電動機械輸注泵的藥物釋放裝置也可適于本公開內(nèi)容使用。這樣 的裝置的實例包括在例如美國專利No. 4, 692, 147、4, 360, 019、4, 487, 603、4, 360, 019、 4, 725, 852等中描述的那些。通常，可使用多種可再填充非交換泵系統(tǒng)中的任一種來完成主 題治療方法。通常優(yōu)選泵和其他對流系統(tǒng)，這是因為其通常隨時間更恒定受控的釋放。在 一些實施方案中使用滲透泵，這是因為其更恒定受控的釋放和相對小尺寸的組合優(yōu)點（參 見例如PCT公開申請no. W097/27840以及美國專利No. 5, 985, 305和5, 728, 396)。適于本 公開內(nèi)容使用的示例性滲透驅(qū)動的裝置包括但未必限于在以下專利中描述的那些：美國專 利 No. 3, 760, 984、3, 845, 770、3, 916, 899、3, 923, 426、3, 987, 790、3, 995, 631、3, 916, 899、 4, 016, 880、4, 036, 228、4, 111，202、4, 111，203、4, 203, 440、4, 203, 442、4, 210, 139、 4, 327, 725、4, 627, 850、4, 865, 845、5, 057, 318、5, 059, 423、5, 112, 614、5, 137, 727、 5, 234, 692、5, 234, 693、5, 728, 396 等。
[〇〇96] 在一些實施方案，藥物遞送裝置是可植入裝置?？墒褂帽绢I(lǐng)域中公知的方法和裝 置將所述藥物遞送裝置植入在任何合適的植入部位。如本文提到的，植入部位是對象的身 體內(nèi)被引入和放置藥物遞送裝置的部位。植入部位包括但未必限于：真皮下、皮下、肌內(nèi)或 對象身體內(nèi)的其他合適部位。
[〇〇97] 在一些實施方案中，使用可植入藥物遞送系統(tǒng)來遞送活性劑，如可編程以提供藥 劑的施用的系統(tǒng)。示例性可編程可植入系統(tǒng)包括可植入輸注泵。示例性可植入輸注泵或 可用于與這樣的泵連接的裝置描述在例如美國專利No. 4, 350, 155、5, 443, 450、5, 814, 019、 5, 976, 109、6, 017, 328、6, 171，276、6, 241，704、6, 464, 687、6, 475, 180 和 6, 512, 954 中?？?適于本公開內(nèi)容的進一步的示例性裝置是Synchromed輸注泵（Medtronic)。
[〇〇98] 用于所述抑制劑的合適的賦形劑載劑是例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其 組合。此外，若需要，所述載劑可包含少量輔助物質(zhì)，例如濕潤劑或乳化劑或者pH緩沖劑。 制備這樣的劑型的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或在考慮了本公開內(nèi)容后將是明顯的。參 見，例如 Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 17 版，1985。待施用的組合物或制 劑無論如何將包含足以在被治療對象中取得期望狀態(tài)的量的抑制劑。
[〇〇99] 本發(fā)明的組合物包括含有持續(xù)釋放或控制釋放基質(zhì)的那些。此外，可聯(lián)合使用持 續(xù)釋放制劑的其他治療來使用本發(fā)明的一些實施方案。本文中使用的持續(xù)釋放基質(zhì)是由可 通過酶或酸基水解或通過溶解來降解的材料（通常是聚合物）制備的基質(zhì)。一旦插入到體 內(nèi)，所述基質(zhì)通過酶或體液起作用。持續(xù)釋放基質(zhì)期望地選自生物相容性材料，例如脂質(zhì) 體、聚乳酸（聚合乳酸）、聚乙交酯（羥基乙酸的聚合物）、乳酸乙交酯共聚物（乳酸和羥基 乙酸的共聚物）、聚酸酐、聚原酸酯、多肽、透明質(zhì)酸、膠原、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂 質(zhì)、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸（如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸）、多核苷酸、聚乙烯基丙 烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅氧烷。舉例說明性的生物可降解基質(zhì)包括聚乳酸基質(zhì)、聚乙交酯基 質(zhì)和乳酸乙交酯共聚物（乳酸和羥基乙酸的共聚物）基質(zhì)。
[〇1〇〇] 在另一個實施方案中，在控制釋放的系統(tǒng)中遞送本公開內(nèi)容的藥物組合物（以及 組合的組合物）。例如，可使用靜脈內(nèi)輸注、可植入滲透泵、經(jīng)皮貼劑、脂質(zhì)體或其他施用 模式來施用所述抑制劑。在一個實施方案中，可使用泵（Seftonl987 ;Buchwald等1980 ; Saudek等.1989)。在另一個實施方案中，使用聚合物材料。在又一個實施方案中，將控制釋 放系統(tǒng)放置在治療靶（即，肝）附近，從而只需要全身劑量的一部分。在又一實施方案中， 將控制釋放系統(tǒng)放置在治療靶附近，從而只需要全身劑量的一部分。另一些控制釋放系統(tǒng) 在Langer的綜述（1990)中討論。
[〇1〇1] 在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物（以及組合的組合物分別或一起）包括通 過將本文中描述的抑制劑浸入吸收性材料（如縫合線、繃帶和紗布）或涂覆在固相材料 (如外科釘、拉鏈和導管）的表面上以遞送組合物所形成的那些。鑒于本公開內(nèi)容，其他的 此類遞送系統(tǒng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的。
[0102] 治療方法
[0103] 本發(fā)明的一些實施方案包括治療來自網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒、黃病毒科病毒、慢病 毒亞科病毒、HCV、HIV、同時感染（如HCV/HIV同時感染）、除HCV以外的黃病毒科病毒、除 黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒或除HCV以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒的病毒感 染的方法。特別地，本文中描述的抑制劑可用于治療黃病毒科病毒的病毒感染。在一個實 施方案中，本公開內(nèi)容提供了通過向宿主施用一個或多個劑量的治療有效量的抑制劑以降 低所述宿主中的病毒載量來治療受上述病毒感染的宿主的方法。
[0104] 本發(fā)明的一些實施方案包括預(yù)防性治療來自網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒、黃病毒科病 毒、慢病毒亞科病毒、HCV、HIV、同時感染（如HCV/HIV同時感染）、除HCV以外的黃病毒科 病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒或除HCV以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒 的病毒感染的方法。特別地，本文中描述的抑制劑可用于預(yù)防性治療黃病毒科病毒的病毒 感染。在一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供了通過向宿主施用一個或多個劑量的治療有效 量的抑制劑以降低所述宿主中的病毒載量來預(yù)防性治療來自黃病毒科病毒的病毒感染的 宿主的方法。在一個實施方案中，預(yù)防性治療受來自黃病毒科病毒的病毒感染的宿主的方 法，所述方法包括向所述宿主施用治療有效量的抑制劑以降低所述宿主中的病毒載量。上 文描述了對于克立咪唑（clemizole)和克立咪唑的劑量的其他細節(jié)。
[0105] 在一個實施方案中，本文中描述的抑制劑被與另一種藥劑（例如，抗病毒劑）組合 使用以治療來自網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒、黃病毒科病毒、慢病毒亞科病毒、HCV、HIV、同時感 染（如HCV/HIV同時感染）、除HCV以外的黃病毒科病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白 AP結(jié)合病毒或除HCV以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒的病毒感染。在一個實施方案中，本文中 描述的抑制劑被與另一種藥劑（例如，抗病毒劑）組合使用以預(yù)防性治療來自黃病毒科病 毒的病毒感染。所述方法的實施方案包括向有此需要的個體施用抑制包含ΥΧΧΦ或二亮氨 酸基序的病毒蛋白質(zhì)與宿主網(wǎng)格蛋白銜接蛋白如AP2M1或網(wǎng)格蛋白AP復(fù)合物的其他μ亞 基結(jié)合的一種或更多種抑制劑。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療黃病毒科病毒感染 如HCV感染的方法，以及降低可能作為HCV感染的后遺癥發(fā)生的肝纖維化的方法。
[0106] 在一個實施方案中，所述抑制劑包括上述一種或更多種抑制劑。在多個實施方案 中，所述抑制劑是調(diào)節(jié)病毒蛋白質(zhì)-ΑΡ2Μ1結(jié)合或者病毒蛋白質(zhì)與網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其 他μ亞基結(jié)合以及介導病毒裝配和/或出芽的蛋白激酶或者這些蛋白質(zhì)的變體的抑制劑， 例如ΑΑΚ1或GAK的抑制劑。
[0107] 在一個實施方案中，抑制劑的有效量是以下量：當以一個或更多個劑量中向有此 需要的宿主（例如，人）施用時，與不用所述抑制劑治療的個體中的病毒載量相比，其使所 述個體的病毒載量下降至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、 至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約 65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%或至少約90%或更多。
[0108] 病毒載量可通過測量血清中病毒的滴度或水平來測量。這些方法包括但不限于定 量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)和支化DNA (branched DNA，bDNA)測試。已經(jīng)開發(fā)了用于測量HCV RNA的病毒載量（滴度）的定量測定。許多這樣的測定是商業(yè)上可得的，包括定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR(qRT-PCR) (Amplicor HCV Monitor. TM.，Roche Molecular Systems，New Jersey);和支 化 DNA 信號擴增測定[Quantiplex? HCV RNA Assay (bDNA)，Chiron Corp.，Emeryville, 〇八.]。參見例如6代1：(311等.（1995)。令人感興趣的還有〇1；[1'〇11公司以商品名？1'〇(3161叉? 出售的核酸測試（NAT)，其NAT同時檢測HIV-1和HCV的存在（Vargo等.2002)。
[0109] 在一些實施方案中，抑制劑的有效量是以下量：當在一個或更多個劑量中向有此 需要的宿主（例如，人）施用時，與不用所述抑制劑治療的個體中的肝功能相比，其使所述 個體的肝功能提高至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少 約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至 少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%或至少約90%或更多。
[〇11〇] 在一些實施方案中，抑制劑的有效量是以下量：當在一個或更多個劑量中向有此 需要的宿主（例如，人）施用時，與不用所述抑制劑治療的個體中的肝纖維化的程度相比， 其使所述宿主中肝纖維化降低至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約 30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少 約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%或至少約90%或更多。
[0111] 本公開內(nèi)容的實施方案提供了可用于治療患有來自網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒、黃病 毒科病毒、慢病毒亞科病毒、HCV、HIV、同時感染（如HCV/HIV同時感染）、除HCV以外的黃 病毒科病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒或除HCV以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié) 合病毒的病毒感染的患者的方法、抑制劑和藥物制劑。在一個實施方案中，所述患者被除 HCV以外的黃病毒科病毒同時感染。在一個實施方案中，所述患者被HCV感染，但是未知是 否被另外的病毒感染，所述另外的病毒包括但不限于HIV。在另一個實施方案中，患者被 HCV和一種或更多種另外的病毒感染，所述另外的病毒包括但不限于HIV。在一個實施方 案中，僅通過施用單種本文中描述的可用作于治療HCV感染的抑制劑來治療患者的病毒感 染。在另一個實施方案中，通過施用本文中描述的可用作于治療HCV感染的抑制劑和已知 可用于治療病毒感染的一種或更多種另外的藥劑二者來治療患者的病毒感染，所述另外的 藥劑包括但不限于用于治療HIV的藥物，例如Atripla、Complera、雙汰芝（Combivir)、立妥 威（Retrovir)、特魯瓦達（Truvada)、奈非那韋（Viracept)、恩夫韋地（Fuzeon)、馬拉維若 (Selzentry)、拉替拉韋（Isentress)等。在一個實施方案中，所述一種或更多種另外的藥 劑不包括CCR-5拮抗劑。在另一個實施方案中，所述一種或更多種另外的藥劑不包括CCR-5 拮抗劑，所述患者被HCV感染，但是不知是否被HIV感染（或未感染）。
[0112] 劑量
[0113] 可以在一個或更多個劑量中向宿主施用抑制劑的一些實施方案。在一個實施方 案中，可以以每劑量約l〇mg至lOOOrng的量施用所述抑制劑，例如每劑量約10mg至20mg、 約 20mg 至 25mg、約 25mg 至 50mg、約 50mg 至 75mg、約 75mg 至 100mg、約 100mg 至 125mg、約 125mg 至 150mg、約 150mg 至 175mg、約 175mg 至 200mg、約 200mg 至 225mg、約 225mg 至 250mg、 約 250mg 至 300mg、約 300mg 至 350mg、約 350mg 至 400mg、約 400mg 至 450mg、約 450mg 至 500mg、約 500mg 至 750mg 或約 750mg 至 lOOOmg。
[0114] 在一個實施方案中，在每一體重基位確定每個劑量的抑制劑的量。例如，在一個實 施方案中，可以施用約〇. 5mg/kg至100mg/kg的量的抑制劑，例如約0. 5mg/kg至lmg/kg、約 lmg/kg 至 2mg/kg、約 2mg/kg 至 3mg/kg、約 3mg/kg 至 5mg/kg、約 5mg/kg 至 7mg/kg、約 7mg/ kg 至約 10mg/kg、約 10mg/kg 至 15mg/kg、約 15mg/kg 至 20mg/kg、約 20mg/kg 至 25mg/kg、約 25mg/kg 至 30mg/kg、約 30mg/kg 至 40mg/kg、約 40mg/kg 至 50mg/kg、約 50mg/kg 至 60mg/ kg、約 60mg/kg 至 70mg/kg、約 70mg/kg 至 80mg/kg、約 80mg/kg 至 90mg/kg、或約 90mg/kg 至 100mg/kg，或者超過約 100mg/kg。
[0115] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地理解，可作為根據(jù)所施用的特定抑制劑、癥狀的嚴重程 度和對象對副作用的敏感性的函數(shù)來改變劑量水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過多種方式容易 地確定給定化合物的優(yōu)選劑量。
[0116] 在一個實施方案中，施用多劑量抑制劑?？筛鶕?jù)多種因素（例如，癥狀的嚴重程度 等）中的任一種來改變抑制劑的施用頻率。例如，在一個實施方案中，每月一次、每月兩次、 每月三次、每隔一周（qow)、每周一次（qw)、每周兩次（biw)、每周三次（tiw)、每周四次、每 周五次、每周六次、每隔一天（qod)、每天一次（qd)、每天兩次（qid)或每天三次（tid)地使 用施用抑制劑。如上文討論的，在一個實施方案中，持續(xù)施用所述抑制劑。
[0117] 可根據(jù)多種因素（例如，患者響應(yīng)等）中的任一種改變施用抑制劑的持續(xù)時間 (例如，施用抑制劑的一段時間）。例如，可施用抑制劑約1天至1周、約2周至4周、約1個 月至2個月、約2個月至4個月、約4個月至6個月、約6個月至8個月、約8個月至1年、 約i年至2年、或約2年至4年或更久的一段時間。
[0118] 施用涂徑
[0119] 本發(fā)明的一些實施方案提供了用于使用任何可利用方法和適合于藥物遞送的途 徑來向宿主（例如，人）施用抑制劑的方法和組合物，包括體內(nèi)和離體方法以及系統(tǒng)的和局 部的施用途徑。
[0120] 施用途徑包括鼻內(nèi)、肌內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、局部施用、靜脈內(nèi)、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、經(jīng) 口以及其他經(jīng)腸和腸胃外施用途徑?？筛鶕?jù)藥劑和/或期望的效果組合（若需要）或調(diào)節(jié) 施用途徑?？梢詥蝿┝炕蚨鄤┝渴┯没钚詣?br> [0121] 可使用可利用的常規(guī)方法和適于遞送常規(guī)藥物的途徑（包括全身的或局部的途 徑）向宿主施用抑制劑的一些實施方案。通常，本公開內(nèi)容預(yù)期的施用途徑包括但不限于 經(jīng)腸、腸胃外或吸入途徑。
[0122] 吸入施用以外的腸胃外施用途徑包括但不限于：局部、經(jīng)皮、皮下、肌內(nèi)、眼眶內(nèi)、 囊內(nèi)、脊柱內(nèi)、胸骨內(nèi)和靜脈內(nèi)途徑，即，除了通過消化道以外的任何施用途徑?？蛇M行腸胃 外施用以有效地全身或局部遞送抑制劑。當需要全身遞送時，施用通常包括侵入性或系統(tǒng) 性吸收的局部或黏膜施用藥物制劑。
[0123] 也可以通過腸內(nèi)施用向?qū)ο筮f送抑制劑。腸內(nèi)施用途徑包括但不限于經(jīng)口和直腸 (例如，使用栓劑）遞送。
[0124] 通過皮膚或黏膜施用抑制劑的方法包括但不限于：局部施用適當?shù)乃幬镏苿?、?jīng) 皮傳遞、注射和表皮施用。對于經(jīng)皮傳遞，吸收促進劑或離子電滲療法（iontophoresis)是 合適的方法。離子電滲傳遞可使用市售"貼劑"完成，其通過在數(shù)天或更久的時期內(nèi)穿過未 破損皮膚的電脈沖遞送其產(chǎn)品。
[0125] 鉬合治療
[0126] 本發(fā)明的一些實施方案包括用于治療病毒感染的方法、抑制劑和藥物制劑?？捎?在本公開內(nèi)容的方法中的抑制劑和藥物制劑的一些實施方案可與其他抗病毒劑組合使用 以治療病毒感染。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法，將用于治療來自網(wǎng)格蛋白AP結(jié) 合病毒、黃病毒科病毒、慢病毒亞科病毒、HCV、HIV、同時感染（如HCV/HIV同時感染）、除 HCV以外的黃病毒科病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒或除HCV以外的網(wǎng) 格蛋白AP結(jié)合病毒的病毒感染的抑制劑與一種或更多種其他抗病毒劑組合使用以治療感 染。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法，也將阻止包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的至少一 種病毒蛋白質(zhì)與宿主蛋白質(zhì)（如AP2M1或網(wǎng)格蛋白AP復(fù)合物的其他μ亞基）結(jié)合的抑制 劑（本文也稱為"HCV ΥΧΧΦ或二亮氨酸拮抗劑"）與一種或更多種其他抗病毒劑組合使用 以治療感染。
[0127] 例如，當前治療HCV感染的醫(yī)療實踐通常使用與利巴韋林（Rebetol或Copegus) 或干擾素 _α (例如，干擾素 a 2b)或聚乙二醇化干擾素（例如，由Roche出售的Pegasys， 或由Schering Plough出售的PEG-Intron)和蛋白酶抑制劑的組合治療。根據(jù)本公開內(nèi)容 的方法，可將抑制性化合物與這些標準治療組合使用以治療HCV感染。
[0128] 若干HCV蛋白酶和聚合酶抑制劑被批準或正在開發(fā)用于治療HCV感染，并且根據(jù) 本公開內(nèi)容的方法，共施用阻止包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的至少一種病毒蛋白質(zhì)與宿主 蛋白質(zhì)（如AP2M1或網(wǎng)格蛋白AP復(fù)合物的其他 μ亞基）結(jié)合的抑制劑和HCV蛋白酶抑制 劑可有效治療HCV。在一個實施方案中，在這種組合治療中也使用干擾素 α和/或核苷類 似物如利巴韋林。合適的HCV蛋白酶抑制劑包括但不限于：特拉匹韋（VX-950, Vertex)、 BILN2061 和 BI12202 (Boehringer Ingelheim)、波西普韋（SCH503034, Schering Plough)、 ITMN191 (Roche/InterMune/Array BioPharma) > MK-7009 (Merck) > TMC435350 (Tibotec/ Medivir)、ACH-1095 和 ACH-806(Achillion/Gilead)以及 NS3/NS4A 蛋白酶的其他抑制劑， 包括但不限于由Presidio開發(fā)的化合物。
[0129] 根據(jù)本公開內(nèi)容的方法，共施用阻止包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的至少一種 病毒蛋白質(zhì)與宿主蛋白質(zhì)（如AP2M1或網(wǎng)格蛋白AP復(fù)合物的其他μ亞基）結(jié)合的 抑制劑和HCV RNA聚合酶抑制劑可有效治療HCV。在一個實施方案中，在這種組合治 療中也使用干擾素 α和/或核苷類似物如利巴韋林和/或HCV蛋白酶抑制劑。合適 的HCV RNA聚合酶抑制劑包括但不限于：瓦洛他濱（valopicitabine)(NM283，Idenix/ Novartis) > HCV-796(Wyeth/ViroPharma)> R1626(Roche)> R7128(Roche/Pharmasset)> GS-9190 (Gilead)、MK-0608 (Merck)、PSI-6130(Pharmasset)和 PFE-868, 554 (PFE)。在一個 實施方案中，所述方法提供了與抑制AAK1和GAK的藥劑的組合治療。
[0130] 正在開發(fā)若干toll樣受體（TLR)激動劑以治療HCV感染，并且根據(jù)本公開內(nèi)容 的方法，共施用阻止包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的至少一種病毒蛋白質(zhì)與宿主蛋白質(zhì)（如 AP2M1或網(wǎng)格蛋白AP復(fù)合物的其他μ亞基）結(jié)合的ΥΧΧΦ或二亮氨酸拮抗劑和TLR激動 劑可有效治療HCV。在一個實施方案中，在這種組合治療中也使用干擾素 α和/或核苷類 似物如利巴韋林和/或HCV蛋白酶抑制劑和/或HCV RNA聚合酶抑制劑。合適的TLR激動 劑包括但不限于：TLR7激動劑[即，ΑΝΑ245和ΑΝΑ975 (Anadys/Novartis)]和TLR9激動劑 [艮P, Actilon (Coley)和 IM0-2125 (Idera)]。
[0131] 正在開發(fā)若干噻唑烷（thiazolide)衍生物以治療HCV感染，并且根據(jù)本公開內(nèi)容 的方法，共施用阻止包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的至少一種病毒蛋白質(zhì)與宿主蛋白質(zhì)（如 AP2M1或網(wǎng)格蛋白AP復(fù)合物的其他μ亞基）結(jié)合的拮抗劑和噻唑烷可有效治療HCV，所述 噻唑燒包括但不限于硝唑尼特（Nitazoxanide，Alinia，或者硝唑尼特或其他噻唑燒的其他 持續(xù)釋放制劑，Romark Laboratories)。在一個實施方案中，在這種組合治療中也使用干擾 素 α和/或核苷類似物如利巴韋林和/或HCV蛋白酶抑制劑和/或HCV RNA聚合酶抑制 劑和/或TLR激動劑。
[0132] 在本公開內(nèi)容方法的另一個實施方案中，共施用阻止包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸 基序的至少一種病毒蛋白質(zhì)與宿主蛋白質(zhì)（如ΑΡ2Μ1或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ 亞基）結(jié)合的抑制劑和親環(huán)蛋白（cyclophilin)抑制劑[即，NIM-811 (Novartis)和 DEBI〇-〇25(Debiopharm)]和/或 α-葡萄糖苷酶抑制劑[即，Celgosivir(Migenix)]和 /或來自本文討論的一種或更多種其他類型的HCV治療劑的一種或更多種藥劑被用于治療 HCV感染。
[0133] 可與本公開內(nèi)容的阻止包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的至少一種病毒蛋白質(zhì)與 宿主蛋白質(zhì)（如AP2M1或網(wǎng)格蛋白AP復(fù)合物的其他μ亞基）結(jié)合的抑制劑組合使用 的其他藥劑包括：（i)祀向NS5A的藥劑，包括但不限于：A-831 (Arrow Therapeutics)、 AZD2836(Astra Zeneca)以及由XTL/Presidio或BMS正在開發(fā)的藥劑（參見PCT公開 W02006/133326 和 W02008/021928,其通過引用并入本文）；（ii)靶向 TBC1D20 和 / 或 NS5A 與TBC1D20的相互作用的藥劑（參見PCT公開W02007/018692和美國專利申請序列號 11/844,993，其通過引用并入本文）；（丨^)靶向呢48的6了？酶活性的藥劑（參見？(：1'公開 W02005/032329和美國專利申請公開2006/0199174,其通過引用并入本文）；（iv)抑制由 HCV兩親性螺旋介導的膜締合的藥劑，例如見于NS5A、NS4B和NS5B中的那些（參見PCT公 開TO2002/089731，同上）；(v)靶向HCV蛋白質(zhì)中的PIP2或BAAPP結(jié)構(gòu)域的藥劑，例如見 于呢48和呢54中的那些（參見美國臨時專利申請60/057，188，同上）；卜丨）靶向!1(^進 入、裝配或釋放的藥劑，包括共受體的抗體；(vii)祀向HCV NS3解鏈酶的藥劑；(viii)革巴 向HCV中的序列的siRNA、shRNA、逆轉(zhuǎn)錄RNA或其他RNA基分子；（ix)靶向微RNA122或其 他介導HCV復(fù)制的微RNA的藥劑；（X)靶向ro-1、PD-L1或TO-L2相互作用或途徑的藥劑 (參見美國專利申請公開2008/0118511、2007/0065427、2007/0122378，其通過引用并入本 文）；以及（xi)靶向HCV兩親性螺旋功能的藥劑，例如AH2抑制劑。
[0134] 在本公開內(nèi)容的另一個實施方案中，將阻止包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的至少一 種病毒蛋白質(zhì)與宿主蛋白質(zhì)（如AP2M1或網(wǎng)格蛋白AP復(fù)合物的其他μ亞基）結(jié)合的抑制 劑與能夠治療HIV感染的一種或更多種藥物組合使用以治療被HIV和HCV同時感染的患 者。在本公開內(nèi)容的另一個實施方案中，將阻止包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的至少一種病 毒蛋白質(zhì)與宿主蛋白質(zhì)（如ΑΡ2Μ1或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基）結(jié)合的抑制劑與 能夠治療HBV感染的一種或更多種藥物組合使用以治療被HBV和HCV同時感染的患者。在 一個實施方案中，將阻止包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的至少一種病毒蛋白質(zhì)與宿主蛋白質(zhì) (如ΑΡ2Μ1或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基）結(jié)合的抑制劑與H)-L1抑制劑組合使用 以治療病毒感染。
[0135] 如上所述，本發(fā)明的一些實施方案包括結(jié)合至少一種另外的治療劑來施用本文中 鑒定（或通過使用本發(fā)明的篩選的一個實施方案）的抑制劑以治療病毒感染。合適的另外 的治療劑包括但不限于：利巴韋林、核苷類似物（例如，levovirin、viramidine等）、NS3抑 制劑、NS5抑制劑、干擾素和副作用管理劑（side effect management agent)。
[0136] 在一個實施方案中，所述至少一種另外的合適的治療劑包括利巴韋林。利巴韋林 (Ι-β-D-呋喃核糖基-1H-1，2,4-三唑-3-甲醜胺）可得自 ICN Pharmaceuticals，Inc., Costa Mesa, Calif.，描述于Merck Index,化合物No. 8199,第11版。其制造和配制描述于 美國專利No. 4, 211，771中。本公開內(nèi)容還考慮使用利巴韋林的衍生物（參見，例如美國專 利 No. 6, 277, 830)。
[0137] 在一個實施方案中，所述至少一種另外的合適的治療劑包括Levovirin。 Levovirin是利巴韋林的L對映體，并且表現(xiàn)出增強Thl免疫應(yīng)答超過Th2免疫應(yīng)答的特 性。Levovirin 由 ICN Pharmaceuticals 制造。
[0138] 在一個實施方案中，所述至少一種另外的合適的治療劑包括viramidine。 Viramidine是利巴韋林的3-甲脒衍生物，并且用作利巴韋林的前藥。其通過腺苷脫氨酶有 效地轉(zhuǎn)變成利巴韋林。
[0139] 適于在組合治療中使用的核苷類似物包括但不限于：利巴韋林、levovirin、 viramidine、isatoribine、在美國專利 No. 5, 559, 101 中公開并被美國專利 No. 5, 559, 101 中的式I涵蓋的L-呋喃核糖基核苷（例如，l-β -L-呋喃核糖基尿嘧啶、l-β -L-呋喃核 糖基-5-氟尿嘧啶、l-β -L-呋喃核糖基胞嘧啶、9-β -L-呋喃核糖基腺嘌呤、9-β -L-呋 喃核糖基次黃嘌呤、9-β-L-呋喃核糖基鳥嘌呤、9-β-L-呋喃核糖基-6-硫代鳥嘌呤、 2-氨基-α-L-呋喃核糖基[Γ ,2' :4,5]喝唑啉、02, 02-脫水-Ι-α-L-呋喃核糖基 尿嘧啶、1- a -L-呋喃核糖基尿嘧啶、1_(2, 3, 5-三-0-苯甲酰-a -呋喃核糖基）-4-硫 代尿嘧啶、1-a -L-呋喃核糖基胞嘧啶、1-a -L-呋喃核糖基-4-硫代尿嘧啶、1-a -L-呋 喃核糖基-5-氟尿嘧陡、2-氨基-β-L-阿糖呋喃并[1' ,2' :4,5]噴唑啉、02, 02-脫 水-β-L-阿糖呋喃基脲嘧啶、2'-脫氧-β-L-尿苷、3' 5'-二-0-苯甲酰-2'脫 氧-4_硫代β-L-尿昔、2'-脫氧-β-L-胞昔、2'-脫氧-β-?_4-硫代尿昔、2'-脫 氧 -β _L_胸昔、2'-脫氧-β -L-5-氣尿昔、2' ,3'-雙脫氧-β -L-尿昔、2 '-脫 氧-0-1^-5-氟尿苷和2/-脫氧-0-1^-肌苷）；在美國專利此.6,423,695中公開并被美 國專利No. 6, 423, 695中的式I涵蓋的化合物；在美國專利公開No. 2002/0058635中公開并 被美國專利公開No. 2002/0058635中的式I涵蓋的化合物；在W001/90121A2(Idenix)中公 開的核苷類似物；在W002/069903A2(Biocryst Pharmaceuticals Inc.)中公開的核苷類似 物；在W002/057287A2或W002/057425A2 (二者均為Merck/Isis)中公開的核苷類似物等。
[0140] 在一個實施方案中，所述至少一種另外的合適的治療劑可包括HCV NS3抑制劑。合 適的HCV非結(jié)構(gòu)蛋白3 (NS3)抑制劑包括但不限于：在美國專利No. 6, 642, 204、6, 534, 523、 6,420,380、6,410,531、6,329,417、6,329,379 和 6,323，180(Boeh ringer-Ingelheim) 中公開的三肽；在美國專利No. 6,143, 715 (Boehringer-Ingelheim)中公開的化合物； 在美國專利No. 6, 608, 027 (Boehringer-Ingelheim)中公開的大環(huán)化合物；在美國專 利 No. 6,617,309、6,608,067 和 6,265,380 (Vertex Pharmaceuticals)中公開的 NS3 抑制劑；在美國專利N〇.6,624,290(Schering)中公開的氮雜肽化合物；在美國專利 No. 5, 990, 276 (Schering)中公開的化合物；在Pause等（2003)中公開的化合物；NS3抑制 劑 BILN2061(Boehringer-Ingelheim;Lama;rre 等（2002)和 Lamarre 等（2003) ;NS3 抑制 劑 VX-950 (Vertex Pharmaceuticals ;Kwong 等（2003) ;NS3 抑制劑 SCH6(Abib 等（2003)); 美國肝病研究協(xié)會第54屆年會的大綱和摘要（AASLD，2003);在W099/07733、W099/07734、 W000/09558、W000/09543、W000/59929 或 W002/060926 中公開的任何 NS3 蛋白酶抑制劑（例 如，在 TO02/060926 中第 224-226 頁的表中公開的化合物 2、3、5、6、8、10、11、18、19、29、30、 31、32、33、37、38、55、59、71、91、103、104、105、112、113、114、115、116、120、122、123、124、 125、126 和 127);在美國專利公開 No. 2003/019067、2003/0187018 和 2003/0186895 中任一 個專利中公開的NS3蛋白酶抑制劑等。
[0141] 在一個實施方案中，用在本發(fā)明的組合治療中的NS3抑制劑是一類特殊NS3抑制 劑中的成員，例如抑制NS3絲氨酸蛋白酶活性但是對于其他絲氨酸蛋白酶（如人白細胞彈 性蛋白酶、豬胰彈性蛋白酶或牛胰糜蛋白酶）或者半胱氨酸蛋白酶（如人肝組織蛋白酶） 不表現(xiàn)出顯著抑制活性的NS3抑制劑。
[0142] 在一個實施方案中，所述至少一種另外的合適的治療劑包括NS5B抑制劑。合 適的HCV非結(jié)構(gòu)蛋白5(NS5 ;RNA依賴型RNA聚合酶）抑制劑包括但不限于：在美國專 利No. 6, 479, 508 (Boehringer-Ingelheim)中公開的化合物；在國際專利申請No. PCT/ CA02/01127、PCT/CA02/01128和PCT/CA02/01129中任一個中公開的化合物，其全部由 Boehringer Ingelheim 在 2002 年 7 月 18 日提交；在美國專利 No.6,440,985(ViroPharma) 中公開的化合物；在W001/47883 (Japan Tobacco)中公開的化合物，例如JTK-003 ;在 Zhong等（2003)中共公開的二核苷酸類似物；在Dhanak等（2002)中公開的苯并噻二 嗪化合物；在W002/100846A1或W002/100851A2(二者均為Shire)中公開的NS5B抑制 齊[J ;在 W001/85172A1 或 W002/098424A1 (二者均為 Glaxo SmithKline)中公開的 NS5B 抑制劑；在W000/06529或W002/06246A1 (二者均為Merck)中公開的NS5B抑制劑； 在 W003/000254 (Japan Tobacco)中公開的 NS5B 抑制劑；在 EP1256, 628A2 (Agouron)、 JTK-002 (Japan Tobacco)、JTK_109 (Japan Tobacco)中公開的呢513抑制劑等。
[0143] 在一個實施方案中，用在本發(fā)明的組合治療中的NS5抑制劑是一類特殊NS5抑制 劑中的成員，例如抑制NS5RNA依賴型RNA聚合酶但是對其他RNA依賴型RNA聚合酶和DNA 依賴型RNA聚合酶沒有顯著的抑制作用的NS5抑制劑。
[0144] 在一個實施方案中，所述至少一種另外的治療劑是干擾素，例如干擾 素-a(IFN-a)?？稍诒景l(fā)明治療方法中使用任何已知的IFN-α。本文使用的術(shù)語"擾 素 -a "是指抑制病毒復(fù)制和細胞增殖并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的相關(guān)多肽的家族。術(shù)語"IFN-a " 包括天然的IFN- a ;合成的IFN- a ;衍生化的IFN- a (例如，PEG化IFN- a、糖基化IFN- a 等）；以及天然的或合成的IFN-a的類似物；基本上任何具有抗病毒性質(zhì)的IFN-a，如對 于天然的IFN-a所描述的。
[0145] 合適的a干擾素包括但不限于：天然的IFN-a (包括但不限于天然的IFN-a 2a、 IFN-α 2b);重組干擾素 a-2b，例如可得自 Schering Corporation，Kenilworth，N.J.的 Intron-A干擾素；重組干擾素 a-2a，例如可得自Hoffmann-La Roch，Nutley，N. J.的 Roferon 干擾素；重組干擾素 a-2C，例如可得自 Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc.，Ridgefield, Conn.的Berofor α 2干擾素；干擾素 a -nl，其為天然α干擾素純的共 混物，例如可得自 Sumitomo, Japan 的 Sumiferon 或可得自 Glaxo-Wellcome Ltd.，London， Great Britain 的 Wellferon 干擾素 α-η? (INS);以及干擾素 α-η3,其為由 Interferon Sciences 制備并且以 Alferon 商品名得自 Purdue Frederick Co.，Norwalk，Conn.的天然 α干擾素的混合物。
[0146] 術(shù)語"IFN-α " 還包括復(fù)合 IFN-α。復(fù)合 IFN-α (也稱為 "CIFN" 和 "IFN-con" 以及"復(fù)合干擾素 （consensus interferon)"）包括但不限于：標記為IFN-conp IFN_con2 和IFN-con3的氨基酸序列，其公開于美國專利No. 4, 695, 623和4, 897, 471 ;以及通過確 定天然的干擾素 ct的復(fù)合限定的復(fù)合干擾素（例如，Infergen. RTM.，InterMune，Inc.， Brisbane，CA.)。正1')-(3〇111是11^6找611? alfacon-1 產(chǎn)品中的復(fù)合干擾素劑。The Infergen? 復(fù)合干擾素產(chǎn)品在本文中通過其商品名（Infergen?)或其通用名（干擾素 alfacon-1)提 及。編碼IFN-con的DNA序列如前述專利中的描述或其他標準方法合成。在一個實施方案 中，所述至少一種另外的治療劑是CIFN。
[0147] 在一個實施方案中，也可在本發(fā)明的組合治療中使用包含IFN-α和異源多肽的 融合多肽。合適的IFN-a融合多肽包括但不限于Albuferon-a?[人白蛋白和IFN-a的 融合產(chǎn)物；Human Genome Sciences ;參見例如Osborn等（2002)]。同樣適合于在本公開內(nèi) 容中使用的是基因改組形式（gene-shuffled form)的IFN-α。參見例如Masci等（2003)。 其他合適的干擾素包括 Multiferon(Viragen)、Medusa 干擾素 （Flamel Technology)、 Locteron (Octopus)和 Omega 干擾素（Intarcia/Boehringer Ingelheim) 〇
[0148] 術(shù)語"IFN-α "還涵蓋IFN-α的衍生物，其被衍生（例如，相對與天然的肽進行 化學改性）以改變某些性質(zhì)，例如血清半衰期。因此，術(shù)語"IFN-a "包括糖基化IFN-a ; 利用聚乙二醇衍生化的IFN-a ( "PEG化IFN-a "，）等。PEG化IFN-a及其制備方法在 例如美國專利 No. 5, 382, 657、5, 981，709 和 5, 951，974 中討論。PEG 化 IFN-a 包括 PEG 與任意上述IFN-a分子的綴合物，包括但不限于：PEG與干擾素 a -2a(Roferon，Hoffman La-Roche，Nutley，N. J.)、干擾素 a 2b (Intron，Schering-Plough，Madison，N. J.)、干擾 素 a -2c (Berofor A, Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Germany)和復(fù)合干擾素綴合， 如通過確定天然的干擾素的共有序列定義的復(fù)合干擾素（Infergen?，InterMune，Inc.， Brisbane, CA) 〇
[0149] 在一個實施方案中，可利用一種或更多種聚乙二醇部分對IFN-α多肽進行修飾， 即PEG化。PEG化IFN- α多肽的PEG分子與IFN- α多肽的一個或更多個氨基酸側(cè)鏈綴合。 在一個實施方案中，PEG化IFN-α僅在一個氨基酸上含有PEG部分。在另一個實施方案中， PEG化IFN-a在兩個或更多個氨基酸上含有PEG部分，例如，IFN-a含有附接于2、3、、4、 5、6、7、8、9或10個不同的案基酸殘基的PEG部分。IFN-a可通過氨基、巰基、羥基或羧基 直接與PEG偶聯(lián)（S卩，沒有連接基團）。
[0150] 為了確定抑制劑如PKC-412、厄洛替尼、舒尼替尼等與其他抗HCV劑的最優(yōu)組合， 可在多種抗HCV劑的不同組合的存在下進行HCV復(fù)制試驗和/或動物研究。在另外的藥劑 的存在下對復(fù)制的抑制提高（高于在單一療法中觀察到的）證明組合治療的潛在益處。
[0151] 例如，HCV復(fù)制測定在PKC-412、厄洛替尼、舒尼替尼等的不同組合的存在下使用 與螢光素酶報道基因連接的HCV基因。在這樣的試驗中，螢光素酶活性與HCV RNA基因組 的復(fù)制成正比。
[0152] 在一個實施方案中，可在本發(fā)明的治療方法中使用副作用管理劑，這些包括：對疼 痛管理有效的藥劑；改善胃腸道不適的藥劑；止痛劑、抗炎劑、抗精神病劑、抗神經(jīng)過敏劑、 抗焦慮劑和造血劑。此外，本發(fā)明的一些實施方案考慮使用任何化合物用于遭受疼痛或在 利用主題療法治療的過程中的其他任何副作用的患者的姑息療法。示例性姑息劑包括對乙 酰氨基酚、布洛芬、其他NSAID、H2阻斷劑和抗酸劑。在一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供了 利用抑制GAK的藥劑和抑制AAK1的藥劑治療的方法。在一個實施方案中，這樣的共治療提 供協(xié)同作用，例如抗病毒作用。
[0153] 話合于治療的宿豐
[0154] 適合于利用所述抑制劑的一個實施方案或所述方法的一個實施方案治療的宿主 包括具有來自網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒、黃病毒科病毒、慢病毒亞科病毒、HCV、HIV、同時感染 (如HCV/HIV同時感染）、除HCV以外的黃病毒科病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白AP 結(jié)合病毒或除HCV以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒的病毒感染的宿主。如本文使用的，術(shù)語黃 病毒科病毒包括黃病毒科的任何成員，包括但不限于：登革熱病毒，包括登革熱病毒1、登 革熱病毒2、登革熱病毒3、登革熱病毒（參見例如GenBank登記號M23027、M19197、A34774 和M14931);黃熱病毒；西尼羅河病毒；日本腦炎病毒；圣路易腦炎病毒；牛病毒性腹瀉病 毒（BVDV);和丙型肝炎病毒（HCV);以及任意前述病毒的任意血清型、毒株、基因型、亞型、 準種（quasispecies)或隔離種。當黃病毒科病毒是HCV時，所述HCV是若干基因型、亞型 或準種中的任一種，包括例如基因型1(包括la和lb)、2、3、4、6等以及亞型（例如，2a、2b、 3a、4a、4c等）和準種。
[0155] 適合于利用本發(fā)明的一些實施方案治療的宿主包括治療失敗患者。本文使用的術(shù) 語"治療失敗患者"（或"治療失敗者"）通常是指對之前對于HCV的治療無應(yīng)答的HCV感 染患者（稱為"無應(yīng)答者"）或者對于之前的治療初始應(yīng)答但是治療應(yīng)答不持續(xù)的HCV感染 患者（稱為"復(fù)發(fā)者"）。之前的治療通?？砂ɡ贸吮竟_內(nèi)容的抑制劑以外的任意 抗病毒劑進行的治療。
[0156] 適合于利用本公開內(nèi)容的一些實施方案治療的宿主包括已經(jīng)被臨床診斷為感染 了 HCV的個體?？赏ㄟ^檢測其血液中的HCV RNA和/或其血清中具有抗HCV抗體來識別感 染了 HCV的個體。
[0157] 被臨床診斷為感染了 HCV的個體包括未經(jīng)治療的個體（例如，之前未進行HCV治 療的個體）。
[0158] 適合于利用本公開內(nèi)容的一些實施方案治療的宿主包括具有任何可檢測HCV滴 度的個體。所述患者可感染了任何HCV基因型（基因型1(包括la和lb)、2、3、4、6等和亞 型（例如，2a、2b、3a等）），特別是難以治療的基因型，例如HCV基因型1以及特定的HCV亞 型和準種。
[0159] 同樣適合于治療的是因慢性HCV感染表現(xiàn)出嚴重的纖維化或早期肝硬化（非失代 償性，ChilcT s-Pugh類型A或更低）或者更晚期的肝硬化（失代償性，ChilcT s-Pugh類 型B或C)的HCV陽性宿主（如上所述），以及盡管之前進行了抗病毒治療的病毒攜帶者或 者無法利用已知的抗病毒劑治療的宿主。
[0160] 在一個實施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域中已知的METAVIR評分系統(tǒng)為階段3或4的肝纖 維化的HCV陽性宿主適合于利用本公開內(nèi)容的方法進行治療。在另一個實施方案中，適合 于利用本公開內(nèi)容的一些實施方案治療的宿主是具有失代償期肝硬化的患者，其臨床表現(xiàn) 包括患者具有重度肝硬化，包括等待肝移植的那些。在另一個實施方案中，適合于利用本公 開內(nèi)容的一些實施方案治療的宿主包括具有輕度纖維化的患者，包括具有早期纖維化的那 些（METAVIR、Ludwig和Scheuer評分系統(tǒng)中階段1和2 ;或者在Ishak評分系統(tǒng)中的階段 1、2或3,其全部是本領(lǐng)域中已知的）。在一個實施方案中，所述方法可用于治療肝移植后 HCV，HCV誘發(fā)的肝細胞癌。在一個實施方案中，這用于預(yù)防移植物再感染。
[0161] 在本公開內(nèi)容的一個實施方案中，為了幫助優(yōu)化選擇最有可能從治療受益的患者 以及監(jiān)控治療的有效性（尤其是面對潛在的抗藥性突變病毒），使用本發(fā)明提供的合適的 診斷測試可能很有益處。例如，評價在給定患者中發(fā)現(xiàn)的特定病毒對于預(yù)期治療的敏感性 可有助于確定候選患者和相應(yīng)的合適的治療之間的最佳匹配。
[0162] 在一個實施方案中，所述方法提供了對感染本文所述病毒的患者的治療，特別是 患有癌癥（如肝癌）的感染HCV的患者。
[0163]
[0164] 本公開內(nèi)容還提供了篩選抗病毒劑的體外和基于細胞的方法。在一個實施方案 中，本公開內(nèi)容提供了用于檢測ΥΧΧΦ模體與宿主蛋白質(zhì)之間的相互作用的方法。在一個 實施方案中，本公開內(nèi)容提供結(jié)合測定以檢測抑制ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序與AP2M1或網(wǎng)格 蛋白AP復(fù)合物的其他μ亞基結(jié)合的蛋白質(zhì)或藥劑。例如，本公開內(nèi)容提供了以下方法，在 所述方法中，本文所述候選藥劑與黃病毒科病毒和ΑΡ2Μ1或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ 亞基接觸。如本領(lǐng)域中已知的，檢測黃病毒科病毒與蛋白質(zhì)的結(jié)合。相對于對照在候選藥劑 的存在下活性降低表明確認為結(jié)合抑制劑。在另一個實施方案中，使用基于細胞的結(jié)合測 定。在另一個實施方案中，使用細胞測定來篩選對病毒裝配或出芽的作用。在該實施方案 中，使候選藥劑與黃病毒科病毒和表達ΑΡ2Μ1或網(wǎng)格蛋白ΑΡ復(fù)合物的其他μ亞基的細胞 接觸?？赏ㄟ^本領(lǐng)域中的已知方法檢測細胞效應(yīng)，例如病毒出芽或裝配，或者黃病毒科病毒 與細胞之間的結(jié)合。在一個實施方案中，使用復(fù)制測定。美國專利申請公開201Ι/0052536Α1 概括了復(fù)制測定的一個實例，其明確地通過引用并入本文。相對于對照，在候選藥劑的存在 下病毒的結(jié)合、出芽或裝配的降低表明確定為結(jié)合抑制劑或抗病毒劑。在一些實施方案中， 使用本領(lǐng)域中已知的體外微流體親和測定來檢測弱的和瞬時的蛋白質(zhì)相互作用。
[0165] 在一個實施方案中，使用如本文描述并且本領(lǐng)域中已知的蛋白質(zhì)片段互補測定來 驗證核心與ΑΡ2Μ1之間的相互作用。在另一個實施方案中，使用免疫共沉淀來確定蛋白質(zhì) 之間的相互作用。 實施例
[0166] 包括以下實施例以說明本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案并給出對本公開內(nèi)容原理的 清楚理解。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，在本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的代表性技術(shù)之后，由實施例中公 開的技術(shù)在本發(fā)明的實踐中運行良好，因此被認為是用于其實踐的優(yōu)選模式。但是，根據(jù)本 公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，可以對公開的具體實施方案進行許多改變，其依然 獲得相同或相似的結(jié)果，并且不脫離本發(fā)明的理念、精神和范圍。更具體地，應(yīng)理解，可以使 用某些在化學上和生理上均相關(guān)的藥劑替代本文中描述的藥劑，同時可獲得相同或相似的 結(jié)果。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，所有這些類似替代和修改被認為在由所附權(quán)利要求 限定的本發(fā)明的精神、范圍和理念內(nèi)。
[0167] 可對本公開內(nèi)容的上述實施方案進行許多改變和修改，而基本不脫離本公開內(nèi)容 的精神和原理。所有的這些修改和改變旨在包含在本文的本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。
[0168] 實施例1 :HCV核心中ΥΧΧΦ基序的鑒定
[0169] 對HCV核心蛋白的一級序列的檢查揭示了蛋白質(zhì)的第二結(jié)構(gòu)域（D2)內(nèi)的保守 ?Ρ(ν/υ基序（圖1A，D)。該基序符合由AP2M1識別的ΥΧΧΦ分選信號共有序列（Ohno， J Cell Scill9 :3719-3721,2006;Nakatsu 等，Cell Struct Funct28 :419-429,2003 ;0wen 等，Ann Rev Cell Devel Biol20 :153-191,2004)。
[0170] 核心結(jié)合AP2M1
[0171] 利用網(wǎng)格蛋白銜接子和內(nèi)吞組分的分選信號的相互作用通常較弱（結(jié)合Kd在 μΜ 范圍）、瞬時（Nakatsu 等，Cell Struct 卩1111(^28:419-429,2003;六811；[131'等，貝;[〇1 Chem276 :13145-13152, 2001)并且包括膜蛋白，因此難以通過標準技術(shù)研究（Cusick等， Hum Mol Genet2005;Bailer Curr Opin Microbioll2:453-459,2009)。為了檢測HCV核心 是否結(jié)合AP2M1，使用克服了這些挑戰(zhàn)的蛋白質(zhì)組學平臺。體外微流體親和測定以分子間相 互作用的機械捕獲（ΜΙΤ0ΜΙ)為基礎(chǔ)，其消除了當前平臺面臨的解離率（off-rate)問題，從 而允許以納升蛋白質(zhì)消耗研究弱的且瞬時的相互作用（Maerkl等，Scien ce315 :233-237， 2007 ;Einav 等，Nat Biotech26 :1019-1027,2008 ;Gerber 等，Nat Meth6 :71-74,2009)。 使用能夠高保真度分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（P-PI)的微流體形式（Gerber等，Nat Meth6 :71-74,2009)?；救缑枋觯∕aerkl 等，Science315 :233-237,2007 ;Einav 等，Nat Biotech26 :1019-1027,2008 ;Gerber 等，Nat Meth6 :71-74,2009)進行在微粒體膜的存在 下的體外蛋白質(zhì)表達以及利用ΜΙΤ0ΜΙ的結(jié)合實驗（圖9)。這些測定檢測AP2M1與核心的 結(jié)合。結(jié)合的程度與核心濃度的提高相關(guān)（圖1F)。AP2M1與對照HCV蛋白質(zhì)NS3的背景 結(jié)合低4-20倍，并且不隨著蛋白質(zhì)濃度的提高而顯著提高。
[0172] 為了確定在細胞中是否發(fā)生核心-AP2M1相互作用，使用基于Gaussia princeps 螢光素酶報道子的可逆重構(gòu)的蛋白質(zhì)片段互補測定（protein-fragment complementation assay，PCA)(圖2A)。當前形式對于改善的信號是最佳的，因此提供了用于測量挑戰(zhàn)性P-PI 的高靈敏度方法（Cassonnet等，Nat Meth8 :990-992, 2011)。在利用編碼與獵物和誘餌蛋 白質(zhì)融合的兩個報道基因片段（GLucl-AP2Ml和GLuc2-核心）的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的Huh-7. 5 細胞中檢測到顯著的螢光素酶信號。在利用GLucl-AP2Ml或GLuc2-核心構(gòu)建體和空白互 補（reciprocal)載體（兩個空白GLuc載體或者與三個無關(guān)蛋白質(zhì)（SPIRE、RAC1和ARPC) 融合的GLucl)共轉(zhuǎn)染的細胞中檢測結(jié)合的背景水平。AP2M1與核心的表觀親和力比運鐵 蛋白受體（TFR)高，其為被AP2M1識別的具有ΥΧΧΦ信號的宿主貨物蛋白（Gminard等， Traffic5，181-193,2004)(圖2B)。結(jié)合不是基因型特異性的，因為來自于2a(Lindenbach 等，Science309 :623-626,2005)或 lb (Lohmann 等，Science285 :110-113,1999)基因型的 核心蛋白被證明具有比得上AP2M1結(jié)合的水平。此外，在與兩種亞型的AP2Ml(a/b)結(jié)合的 核心之間沒有顯著差異（圖2B)。在Huh-7. 5 (人肝腫瘤來源的）細胞（代表最相關(guān)的細胞 模式（圖2B))和293T細胞（數(shù)據(jù)未示出）中證明了相當?shù)慕Y(jié)果。結(jié)合表現(xiàn)出特異性，因 為游離核心或AP2M1的濃度升高，但是沒有核輸出信號相互作用蛋白質(zhì)（nuclear export signal-interacting protein, NESI)，對照蛋白質(zhì)參與介導丁型肝炎病毒裝配（Wang等，J Virol79 :8113-8120,2005)，核心-AP2M1 結(jié)合逐漸降低（圖 2C)。
[0173] 為了確定在真實HCV感染的情況下核心是否與AP2M1結(jié)合，在利用細胞培養(yǎng)物生 長HCV(J6/JFH)感染的Huh-7. 5細胞制備的膜級分中進行免疫共沉淀測定（Lindenbach 等，Science309 :623-626, 2005)。當向膜裂解物中添加抗AP2M1抗體而非IgG對照時，AP2M1 使核心拉下。通過花萼海綿誘癌素 A[AP2M1脫磷酸作用的抑制劑，其將AP2M1 "鎖定"在其 ΥΧΧΦ 結(jié)合活性構(gòu)象（Ricotta 等，J Biol Chem283 :5510-5517,2008)]，結(jié)合顯著提高（圖 2D)。類似地證明了在相反條件下的結(jié)合（圖2D)。在利用J6/JFH HCV RNA電穿孔后72小 時，還研究了核心和AP2M1在Huh-7. 5細胞中的共定位。定量共聚焦免疫熒光（IF)分析揭 示了核心和AP2M1在這些細胞中的廣泛的共定位（67±6%共定位的AP2M1被核心斑點著 色）（圖2E)。
[0174] AP2M1結(jié)合和HCV裝配中核心的YXX基序
[0175] 使用一系列點突變（圖1D)，測試AP2M1結(jié)合是否由核心的ΥΧΧΦ基序介導。通 過PCA測量，Y136A核心突變使AP2M1結(jié)合比野生型（WT)核心下降?10倍，而ν(Φ)139Α 突變造成較少的結(jié)合抑制（圖3Α)。為了研究核心的ΥΧΧΦ基序在HCV感染中的作用，將 這些突變引入到J6/JFH(p7-Rluc2A)HCV基因組中，這是一種含有海腎螢光素酶（Renilla luciferase)報道基因的病毒，其在Huh-7. 5細胞中復(fù)制并產(chǎn)生高病毒滴度（Murray等， J Virol81:10220-10231，2007)。利用由每一種構(gòu)建體產(chǎn)生的體外轉(zhuǎn)錄RNA對細胞進行 電穿孔。如通過螢光素酶報道基因相關(guān)測定（圖3B)和qRT-PCR(圖11和12)測量的， 這些病毒突變體的HCV RNA復(fù)制與WT病毒的相當。相比之下，聚合酶缺陷的突變體J6/ JFH (p7-Rluc2A) -GNN不復(fù)制。在利用來自于用具有Y136A核心突變的病毒基因組電穿孔的 細胞的上清液接種的未經(jīng)處理的細胞中，螢光素酶測定測量了不可檢測水平的細胞外感染 性。與WT病毒相比，V139A突變使感染性下降?1.51og (圖3C)。在利用來自于裂解的電穿 孔細胞的澄清上清液感染的未經(jīng)處理的細胞中測量的細胞內(nèi)感染性反映了降低的細胞外 感染性（圖3D)，表明核心的ΥΧΧΦ基序介導病毒體裝配而不是釋放。通過裝配（Λ E1-E2) 或復(fù)制（GNN)缺陷對照，基本上未在細胞外或細胞內(nèi)產(chǎn)生感染性病毒。通過有限稀釋測定 測量的WT病毒的感染性滴度比得上之前利用該報告系統(tǒng)報告的那些（Κορρ等，J Virol 84 :1666-1673, 2010)。與上述螢光素酶測定一致，盡管V139A核心突變價使細胞外和細胞 內(nèi)感染性滴度比WT病毒降低了?1-1. 51og，但是具有Y136A核心突變或E1-E2缺失的病毒 測量到了不可檢測水平的感染性滴度（圖3E)。核心突變對感染性的作用與其對AP2M1結(jié) 合性的作用相關(guān)。為了排除核心的突變通過造成顆粒解裝配或產(chǎn)生缺陷的核心蛋白和含有 RNA的顆粒來影響感染性的可能性，檢測非感染性顆粒的產(chǎn)生。分別通過qRT-PCR和ELISA 測定，在具有復(fù)制基因組的細胞的上清液測量到了可檢測水平的HCV RNA和核心蛋白的釋 放（Murray 等，J Virol81 :10220-10231,2007 ;Kopp J Virol84 :1666-1673,2010)(圖 3F， 3G)。然而，由Y136A和V139A核心突變體釋放的水平未顯著高于由裝配缺陷的ΛΕ1-Ε2突 變體釋放的那些，表明未產(chǎn)生非感染性顆粒。核心的表達不受突變的影響，因為western分 析（圖3H)和熒光顯微鏡（數(shù)據(jù)未示出）證明蛋白質(zhì)表達處于WT水平。通過兩周以后，在 利用具有Y136A和V139A核心突變的HCV感染的Huh-7. 5細胞中，通過螢光素酶測定檢測 到了感染性表現(xiàn)型的逆轉(zhuǎn)。通過測序分析，該逆轉(zhuǎn)與出現(xiàn)一級位點回復(fù)體（revertant)相 符。這些結(jié)果提供了需要保持功能性ΥΧΧΦ基序以支持HCV復(fù)制的額外的證據(jù)?？傊?，這 些數(shù)據(jù)表明病毒的體外裝配需要核心中的AP2M1結(jié)合基序。
[0176] 核心的ΥΧΧΦ基序與其他ΥΧΧΦ分選信號在功能上是可互換的
[0177] 為了確定核心的ΥΧΧΦ基序是否與其他同類信號在功能上可互換，引入V139L突 變，因此引入使基因型2a核心的序列與基因型lb的"交換"。類似地，使用YTPL和YRRL 序列來代替核心的ΥΧΧΦ序列（圖1D)，已知YTPL和YRRL序列分別介導HLA-DM(0hno等， J Bioll Chem273:25915-25921，1998)和血小板生成素受體（Hitchcock 等，Bloodll2: 2222-2231,2008)與AP2M1的結(jié)合。具有這些序列的核心與AP2M1的結(jié)合比得上或大于WT 核心，如通過PCA確定的（圖3A)。這些突變對于HCV RNA復(fù)制沒有影響（圖3B)。與其 生物化學表現(xiàn)型相關(guān)，V139L和YTPL核心突變體的細胞內(nèi)和細胞外感染性比得上WT病毒 (圖3C，3D)。這種在功能上可相互交換支持核心的ΥΧΧΦ基序通過與宿主蛋白質(zhì)的相互作 用發(fā)揮其功能。盡管其與AP2M1有效結(jié)合（圖3A)并且通過western分析穩(wěn)定（圖3H)，但 是YRRL突變體不產(chǎn)生可檢測水平的感染性病毒（圖3C，3D)。有趣的是，該突變體以比得上 WT核心的水平釋放HCV RNA和核心蛋白到進電穿孔細胞的上清液中，很可能反映了產(chǎn)生了 非感染性顆粒（圖3F，3G)。因此，YRRL突變體可影響感染性病毒的產(chǎn)生（其不依賴于其與 AP2M1的結(jié)合）中核心的其他功能。
[0178] HCV 裝配中的 AP2M1
[0179] 確定AP2M1與HCV生命周期的功能相關(guān)性。建立具有靶向AP2M1基因中的不同 區(qū)域或非靶向（NT)序列的具有短發(fā)夾RNA(shRNA)慢病毒構(gòu)建體的穩(wěn)定Huh-7. 5克隆。 獲得對AP2M1水平的有效抑制（圖4A，4B)，而無明顯的細胞抑制或細胞毒作用。在利用 J6/JFH(p7-Rluc2A)RNA電穿孔之后，在這些克隆中研究AP2M1消耗對于感染性病毒的產(chǎn) 生的影響。如在這些穩(wěn)定的克隆中通過螢光素酶測定（圖4C)以及電穿孔后72小時的 qRT-PCR(數(shù)據(jù)未示出）測量的，AP2M1敲除對于HCV RNA復(fù)制沒有影響。使用在電穿孔后 72小時收集的上清液接種未經(jīng)處理的Huh-7. 5細胞，然后在接種后72小時進行螢光素酶測 定。如圖4D中所示，與NT對照相比，AP2M1消耗使細胞外感染力降低>21og。在利用來自 裂解的電穿孔細胞的澄清上清液感染的未經(jīng)處理的細胞中測量的細胞內(nèi)感染力反映了降 低的細胞外感染力（圖4E)以及與AP2M1消耗程度的相關(guān)性。通過有限稀釋試驗測量的細 胞內(nèi)或細胞外感染性滴度證明了一致的結(jié)果（圖4F)。如分別在通過qRT-PCR和ELISA測 定（圖4G，4H)在細胞的上清液中測量的釋放的HCV RNA和核心的水平所表明的，AP2M1消 耗不提高非感染性顆粒的產(chǎn)生。在通過siRNA瞬時消耗AP2M1和利用J6/JFH(p7-Rluc2A) RNA電穿孔或利用培養(yǎng)物生長J6/JH1病毒（滴度，1. 2X105TCID5(l/ml)感染的Huh-7. 5細胞 中證明了對感染性病毒的產(chǎn)生的類似的作用（Lindenbach et al.，Science309 :623-626, 2005)。沉默內(nèi)源AP2M1對感染性病毒的產(chǎn)生的作用被異位表達在被shRNA靶向的位點內(nèi) 具有搖擺突變的shRNA抗WT AP2M1所挽救，極大排除了脫靶效應(yīng)的可能性，導致所觀察的 表現(xiàn)型（圖41)。因此，穩(wěn)定并且瞬時的RNAi方式二者表明AP2M1對于有效的HCV裝配很 重要。
[0180] 破壞核心-AP2M1的結(jié)合消除了向LD招募AP2M1，改變了核心的亞細胞定位和核心 與E2的共定位
[0181] 為了測試HCV裝配的缺陷是由于ΥΧΧΦ核心突變以及與AP2M1和/或核心的亞細 胞定位的改變有關(guān)的AP2M1沉默所造成的假設(shè)，進行定量共聚焦免疫熒光（IF)測定。使 用測定 Image J (JACoP)軟件和 Manders' Colocalization Coefficients (MCC)分析 10 至 15個隨機選擇的細胞各自的每一種核心或AP2M1在不同細胞內(nèi)隔室的每一種定位程度。 選擇后者，因為其嚴格測量不依賴于共出現(xiàn)（co-occurrence)的信號比值（Dunn等，Am J Physiol-Cell Physiol300 :C723-C742, 2011)。內(nèi)源 AP2M1 最低程度地與 LD 標記物 Bodipy 在未經(jīng)處理的Huh-7. 5細胞中共定位，8. 2%的LD對于AP2M1著色陽性（圖5A，5E)。相比 之下，利用J6/JFH病毒感染看來顯著提高AP2M1向LD的定位，40±8%的LD是AP2M1陽 性（圖 5B，5E) (p 值=0· 0006)。類似地，如之前所述（Kopp 等，J. Virol. 84 :1666-1673， 2010 ;Boulant 等，Journal of General Virology88 :2204_2213,2007 ;Coller 等，PLoS pathogens8 :el002466-el002466,2012)，核心部分地定位于 LD(37±14% 的核心陽性 LD) (圖5C，5E)。此外，核心和AP2M1的局部共定位發(fā)生在LD局部（圖5F)。
[0182] 為了測試核心是否參與介導在HIV感染的細胞中測量的AP2M1向LD上定位的提 高，通過轉(zhuǎn)染Huh-7. 5細胞單獨過表達AP2Ml-mCherry或者與WT核心或Y136A核心突變 體組合過表達AP2Ml_mCherry。利用HCS LipidTOX(Invitrogen)標記LD。與未經(jīng)處理的 細胞類似，在單獨過表達AP2M1的Huh-7. 5細胞中，AP2M1在LD的定位最少（8±2% LD為 AP2M1陽性）（圖5G，5J)。相比之下，如在感染的細胞中，當與WT核心共表達時，AP2M1表現(xiàn) 為在0)顯著積累，51.8±20%的0)是六?2厘1陽性（？值=4.811〇- 5)。（圖5!1，5刀。但是， 當共表達AP2M1和具有Y136A突變的核心，未證明這樣的共定位提高（具有10% AP2M1陽 性LD) (p值=0. 001)時（圖5I，5J)，表明核心的ΥΧΧΦ基序可介導向LD招募AP2M1。
[0183] 測試在利用J6/JFH HCV RNA電穿孔的細胞中破壞核心-AP2M1相互作用對核心 在LD、ER和TGN的定位及其與E2薄膜蛋白的共定位的影響。如前所示，核心在所有這些細 胞內(nèi)隔室定位（Kopp 等，J. Virol. 84,1666-1673, 2010 ;Boulant 等，Journal of General Virology88,2204-2213,2007)(共定位百分比范圍為30%至45% )。有趣的是，具有Y136A 突變的核心向LD的定位顯著高于WT核心（分別為78± 13%對32± 16%，p值=2. 7 X 10_6) (圖5K)。類似地，核心與LD標記的共定位百分比由NT細胞中的25 ± 10 %急劇提高到沉默 AP2M1后的87±6. 6% (p值=1. 55X ΚΓ8)(圖5L)。盡管Y136A核心突變或AP2M1消耗均 對核心與ER標記物鈣網(wǎng)蛋白的共定位沒有明顯影響（圖14)，但是二者都與核心與TGN標 記TGN46(圖5M，5N)和E2包膜蛋白（圖50,5P)的共定位的顯著降低有關(guān)。
[0184] 總之，這些結(jié)果表明核心與AP2M1的相互作用有助于向LD招募AP2M1，并且在破壞 核心-AP2M1相互作用之后觀察到的HCV裝配缺陷和核心向LD上積累、核心與E2的共定位 降低以及與向TGN的運輸有關(guān)的損傷的核心。
[0185] AAK1和GAK調(diào)節(jié)核心-AP2M1結(jié)合并且參與HCV裝配
[0186] 通過絲氨酸/蘇氨酸激酶AAK1和GAK使AP2M1中的T156磷酸化（Ricotta等， Journal of Cell Biologyl56,791-795,2002 ;Korolchuk 等，Traffic3,428-439,2002; Zhang等，Traffic6,1103-1113,2005)刺激AP2M1與貨物蛋白酪氨酸信號的結(jié)合，并且因 PP2A 的脫憐酸而短暫（Ricotta 等，Journal of Biological Chemistry283,5510_5517, 2008)(圖6A)。實際上，花萼海綿誘癌素 A(PP2A抑制劑）放大核心與AP2M1的結(jié)合（圖 2D)而T156A AP2M1突變對其有損害（圖6B)。為了研究過表達具有T156A突變AP2M1的 對感染性HCV的產(chǎn)生的影響，利用編碼WT或AP2M1T156A突變體的質(zhì)粒感染Huh-7. 5細胞， 轉(zhuǎn)染后48小時如上所述利用J6/JFH(p7-Rluc2A)HCV RNA對細胞進行電穿孔并進行HCV RNA復(fù)制和感染性分析。T156A AP2M1突變體的過表達對于細胞生存力沒有影響并且對于 HCV RNA復(fù)制是非必要的，但是與WT AP2M1相比還是顯著降低細胞外感染性和細胞內(nèi)感染 性（圖6C-E)，與對于HCV裝配的顯性陰性作用相一致。
[0187] 為了研究AAK1和GAK參與調(diào)節(jié)AP2M1與核心的相互作用的假設(shè)，在通過siRNA消 耗AAK1或GAK的Huh-7. 5細胞中進行結(jié)合實驗（圖6F，6G)。如通過PCA測量的，相對于 NT，AAK1或GAK的消耗顯著降低了核心-AP2M1的結(jié)合（圖6H)，沒有顯著的細胞毒性（數(shù) 據(jù)未示出）。然后利用J6/JFH(p7-Rluc2A)HCV RNA對消耗了 AAK1和GAK的細胞進行電穿 孔。盡管AAK1或GAK的消耗沒有細胞毒性并且對于HCVRNA的復(fù)制不是必要的，但是其顯 著降低細胞內(nèi)和細胞外感染性（圖6I-K)。AAK1和GAK對于HCV裝配的作用不是由于其直 接與核心結(jié)合（圖6L)。這些結(jié)果提供了證據(jù)AAK1和GAK參與調(diào)節(jié)核心-AP2M1結(jié)合并且 介導HCV裝配。另外，其驗證了 AP2M1通過占主導地位的干擾的方式對于有效的HCV裝配 的重要性，因此支持RNAi數(shù)據(jù)。
[0188] AAK1和GAK的藥理學抑制劑破壞核心-AP2M1結(jié)合和HCV裝配
[0189] 激酶抑制劑的熱圖分析和親和力測定（Karaman等，Nat Biotech26,127-132, 2008)揭示化合物（例如舒尼替尼和PKC-412)以高親和力（nM范圍）結(jié)合AAK1并且厄洛 替尼結(jié)合 GAK(Karaman 等，Nat Biotech26，127-132,2008)(圖 7A，7B)。如通過 PCA 確定的 (圖7C)，這些化合物以劑量依賴的方式抑制核心-AP2M1結(jié)合，半數(shù)最大有效濃度（IC50) 為?0. 04-0-2 μ M。當用于處理利用J6/JFH(p7-Rluc2A)HCV基因組電穿孔的Huh-7. 5細胞 時，這些化合物在72小時對于細胞外感染性（圖7D)和細胞內(nèi)感染性（圖7E)具有強烈的 劑量依賴作用（半數(shù)最大有效濃度（EC50)為0. 15-1. 8 μ M)(圖7B)。對于HCV RNA復(fù)制沒 有作用，并且沒有明顯的細胞毒性（圖7F，7G)。實際上，通過western分析，ΑΡ2Μ1結(jié)合和 感染性的抑制作用與相關(guān)細胞中磷酸-AP2M1水平的降低有關(guān)（圖7H)。最后，這些化合物 顯著抑制被阻止培養(yǎng)物生長HCV (滴度：6. 3X 105TCID5(l/ml)感染的Huh-7. 5細胞中病毒的 感染（圖7I，7B)。這些結(jié)果提供了藥理學證據(jù)，AAK1和GAK參與調(diào)節(jié)核心-AP2M1相互作 用以及P2M1在HCV裝配中的作用。此外，其提供了靶向裝配的候選化合物。
[0190] 實施例2
[0191] AAK1和GAK消耗或者藥理學抑制消除HIV-1復(fù)制。
[0192] 有大量證據(jù)支持AP1M1和AP2M1與HIV Gag和Env(gp41)的相互作用介導裝配/ 釋放途徑中的多個關(guān)鍵步驟（Batonick 等，Virology342 :190_200,2005 ;Camus 等，Molec Biol Celll8 :3193-3203,2007;Berlioz-Torrent 等，J Virol73 :1350-1361,1999 ;Byland 等，Molec Biol Celll8 :414-425,2007 ;Wyss 等，J Virol75 :2982-2992,2001 ;0hno 等， Virology 238 :305-315,1997 ;Boge 等，J Biol Chem273 :15773-15778,1998 ;Egan 等，J Virol70 :6547-6556,1996 ;Rowell 等，J Immunoll55 :473-488,1995 ;Lodge等，ΕΜΒ0 J 16: 695-705,1997 ;Deschambeault 等，J Virol73 :5010-5017,1999)。最重要的是，Env 中的 酪氨酸基序介導細胞至細胞的傳播（Gminard等，Traffic5,181-193, 2004 ;Lindenbach等， Science309,623-626, 2005)，該機理被認為解釋了不論ART地不間斷的HJV復(fù)制（Sigal 等，Nature477，95-98，2011)，很可能通過被分類在基底膜的AP1M1。但是，尚未研究AAK1和 GAK在HIV感染中的作用，并且這些機理還未作為藥理學靶標。
[0193] 為了測試AAK1和GAK對于HIV感染很重要的假設(shè)，使用HeLa來源的TZM-bl細胞， 其表達⑶4、CCR5和CXCR4、以及響應(yīng)于HIV轉(zhuǎn)錄的β -半乳糖苷酶和螢火蟲螢光素酶報道 基因 （Wei 等，Antimicrobial agents and chemotherapy46 :1896-1905, 2002)。利用革巴向 AAK1、GAK或NT序列的siRNA轉(zhuǎn)染細胞，然后如描述的（Zhou等，Cell Host & Microbe4: 495-504,2008)利用感染性 HIV-1NL4-3 克?。ˋdachi 等，J Virol59 :284-291,1986)感染。 在感染后96小時測量螢光素酶活性。AAK1和GAK消耗顯著地抑制HIV復(fù)制（圖10)。為了 測試AAK1和GAK對于HIV的藥理學抑制劑作用，將HIV-1感染的HeLa來源的TZM-bl細胞每 日用系列稀釋的舒尼替尼、厄洛替尼或PKC-412處理4天，然后進行螢光素酶測定。觀察到 了顯著的劑量響應(yīng)抗病毒作用，對生存力沒有作用（圖10)。厄洛替尼的EC 5(I是1. 4±0. 3 (P 值0. 0058)，舒尼替尼的是0. 8±0. 4(P值0. 1)，PKC-412的是8. 5±4(P值0. 1)。由于這些 研究在感染后進行96小時，其評估了從進入到釋放和傳播的全部階段（Zhou等，Cell Host & Microbe4 :495-504, 2008)，因此，表明AAK1和GAK對于整個HIV復(fù)制很重要。
[0194] 方法
[0195] 質(zhì)粒。從人 cDNA 的 ORFeome 文庫克隆（Rual 等，Genome research 14, 2128-2135， 2004) (Open biosystems)中挑選編碼 AP2M1、GAK、AAK1、TFR、SPIRE、RAC1、ARPC 和 NESI 的0RF并且使用網(wǎng)關(guān)技術(shù)（Invitrogen)重組到pcDNA_Dest40(用于C末端V5_his標 記）、pGLuc (用于 Gaussia Princeps 螢光素酶片段（Glue)標記）（Cassonnet 等，Nat Methods8,990_992,2011)和/或pCherry(用于mCherry突光蛋白質(zhì)標記）載體中。從所 述載體中擴增編碼Π 標記的全長核心和NS3的0RF(Blight等，Science290,1972-1974， 2000)并與 pcDNA3. 1 (Invitrogen)連接。pFL_J6/JFH(p7_Rluc2A) (Murray 等，J Virol81， 10220-10231,2007)由 C.M. Rice 博士（Tscherne 等，J Virol80,1734-1741，2006)惠贈。 通過定點誘變（使用QuikChange試劑盒（Stratagene))向這些質(zhì)粒中引入ΥΧΧΦ核心突 變和ΑΡ2Μ1突變。
[0196] 抗體和化合物。見表1和表2
[0197] RNA i 和基因沉默的挽救。使用 silM P0RTER(Upstate，Millipore)將 40-100ηΜ 的單獨或匯集的siRNA(圖8)轉(zhuǎn)染到細胞中，48小時之后進行HCV RNA電穿孔。使用具有 靶向AP2M1RNA中的不同位點的RNA(shRNA)的5個單獨MISSION慢病毒轉(zhuǎn)導顆粒（Sigma) 和對照shRNA根據(jù)制造商的方案轉(zhuǎn)導Huh-7. 5細胞。本研究中使用的RNAi試劑總結(jié)在表 3中。在利用HCV基因組電穿孔之前48小時，通過利用表達shRNA抗AP2M1的慢病毒亞科 病毒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定消耗AP2M1的Huh-7. 5細胞來進行AP2M1挽救。
[0198] 微流體親和測定?；救纾∕aerkl等，Science315, 233-237, 2007)的描述進行 裝置制造和設(shè)計。通過哺乳動物體外轉(zhuǎn)錄/翻譯混合物（TNT)(Pr〇mega)(在微粒體膜的 存在下）在芯片外表達V5-his標記的人蛋白質(zhì)和T7標記的病毒蛋白質(zhì)。將裝置進行 表面圖案化，導致每個單元小室內(nèi)覆蓋有生物素化抗-his抗體的圓形區(qū)域（Einav等， Nature Biotechnology26,1019-1027,2008 ;Gerber 等，Nature methods6,71-74,2009)。 如（Gerber等，Nature methods6, 71-74,2009)所述進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合實驗。簡單 地說，將人誘餌蛋白質(zhì)裝載到元件中并與表面抗-his抗體結(jié)合。將病毒和人蛋白質(zhì)在芯片 中孵育并分別用抗-T7-Cy3和抗-V5-FITC抗體標記。通過ΜΙΤ0ΜΙ機械地捕獲相互作用 (Maerkl 等，Science315,233-237,2007 ;Einav 等，Nature Biotechnology26,1019-1027, 2008 ;Gerber等，Nature methods6, 71-74,2009)。在簡單清洗以除去未捕獲的未結(jié)合物質(zhì) 后，通過陣列掃描（Tecan)檢測捕獲的蛋白質(zhì)復(fù)合物。通過測量Cy3的中值信號與FITC的 中止信號的比值，計算每一數(shù)據(jù)點結(jié)合的病毒獵物和表達的人誘餌蛋白質(zhì)的比值。通過對 于T7標記蛋白質(zhì)的標準曲線的定量western分析，檢測溶解物中的蛋白質(zhì)濃度。實驗進行 至少三次，每次> 20個重復(fù)。見圖10的詳細方案。
[0199] 細胞培養(yǎng)物。將Huh-7. 5細胞和293T細胞保持在補充有1% L-谷氨酰胺 (6讓〇〇)、1%青霉素、1%鏈霉素（6讓(：〇)、1\非必需氨基酸（6讓(3 〇)和10%胎牛血清 (Omega Scientific)的Dulbecco改進型最低極限培養(yǎng)基（Gibco)中。在利用0.05%胰蛋 白酶-0. 02% EDTA處理1周后每周使細胞系傳代三次并以1 :4的稀釋度接種。
[0200] 蛋白質(zhì)-片段互補測定?；旧先纾–assonnet 等，Nat Methods. 8,990-992, 2011) 所述進行結(jié)合測定。將編碼獵物（A)和誘餌（B)蛋白質(zhì)的質(zhì)粒的組合（各自與Gaussia Princeps螢光素酶蛋白質(zhì)的片段（Glucl和Gluc2)或?qū)φ蛰d體融合）共轉(zhuǎn)染到一式三份 地平板接種在96孔平板的293T或Huh-7. 5細胞中。轉(zhuǎn)染后24小時，使細胞裂解并使用海 腎螢光素酶測定系統(tǒng)（Promega)檢測標準螢光素酶報道基因。結(jié)果表示為發(fā)光或發(fā)光比 值。后者表示在利用Glucl-A和Gluc2-B轉(zhuǎn)染的細胞中檢測的平均發(fā)光信號除以在利用 Glucl-A和空白Gluc2載體轉(zhuǎn)染的對照孔或利用Gluc2-B和空白Glucl載體轉(zhuǎn)染的那些中 測量的發(fā)光平均值。如上進行競爭性測定以及被設(shè)計成確定化合物或siRNA的抑制作用的 研究，只是分別在過量游離蛋白質(zhì)、抑制劑或siRNA的存在下測量結(jié)合性。試驗一式三份地 進行至少三次。
[0201] 免疫共沉淀。如（Einav等，J Virol78,11288-11295, 2004)先前所述，由感染 有 HCV(J6/JFH) (Lindenbach，等，Science309,623-626,2005)的?20xl06Huh-7. 5 細胞制 備膜。簡單地說，通過胰蛋白酶收集細胞，利用PBS清洗一次并重懸在HME緩沖液（20mM HEPES[pH7.4]，lmM EDTA，2mM MgC12)中，所述緩沖液增補有ImM的終濃度的苯甲基磺酰 氟和蛋白酶抑制劑混合物（Sigma)。通過在無水冰乙醇中的兩個凍融循環(huán)裂解細胞，然后 使其通過27. 5號針10次。通過在250Xg離心10分鐘除去核，并且將去核的上清液在 100, 000Xg超速離心30分鐘，獲得膜制劑。所有步驟在4°C進行。將全部膜蛋白質(zhì)在lml TDB 緩沖液（2.5% Triton X-100,25mM 三乙醇胺-Cl[pH8.6]，20mM NaCl，5mM EDTA，0.2% NaN3)( Einav 等，J Virol78，11288-11295,2004)中稀釋，并與 100nM 花萼海綿誘癌素 A 或 DMS0在37°C孵育30分鐘。由于相互作用弱的和瞬時的性質(zhì)，添加25mM二硫代雙-琥珀酰 亞胺基-丙酸（DSP)交聯(lián)劑（Pierce)以允許已結(jié)合的相互作用的蛋白質(zhì)共價結(jié)合。將樣品 在冰上孵育2小時。添加1M Tris以終止DSP活性。然后通過在1000Xg離心10分鐘，接 著在100, 000 Xg將上清液超速離心30分鐘來使裂解物澄清。將膜沉淀重懸在1001 HME緩 沖液（20mM NaHEpes (PH7. 4)，ImM EDTA (Ph8)，2mM MgC12)中，添加 TDB 緩沖液至 lml 的最終 體積。將樣品與抗-AP2M1抗體、抗-核心抗體或IgG對照以及蛋白質(zhì)G磁珠（Millipore) 一起孵育過夜。通過western印跡測定免疫沉淀物。將實驗一式兩份地進行兩次。
[0202] 病毒 RNA 的體外轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)染。如（Lindenbach 等，Science309,623-626, 2005 ; Murray 等，J Virol81，10220-10231，2007)先前的描述產(chǎn)生HCV RNA并遞送到Huh-7. 5 細胞 中。簡單地說，使用HMEGAscript試劑盒根據(jù)制造商的方案（Ambion)由Xbal線性化J6/ JFH (p7-Rluc2A)模板合成RNA。將反應(yīng)混合物在37 °C孵育3小時，然后在37 °C用DNA酶處理 15分鐘。使用RNeasy試劑盒（Qiagen)純化病毒RNA。通過260nm吸光度量化RNA，并通過瓊 脂糖凝膠電泳檢驗其質(zhì)量。將亞匯合的（Subconfluent)Huh-7. 5細胞用胰蛋白酶消化，并 通過在700g離心5分鐘來收集。然后將細胞在冰冷的無 RNA酶PBS(BioWhittaker)中清洗 3次并以1. 5 X 107細胞/ml重懸在PBS中。將5 μ g體外轉(zhuǎn)錄的野生型或6/JFH (p7-Rluc2A) 突變體RNA與400 μ 1經(jīng)清洗的Huh-7. 5細胞在2mm間歇小池 （gap cuvette) (BTX)中混合 并立即用BTX-830電穿孔儀脈沖（0. 82kV，5個99μ 8脈沖）。在25°C恢復(fù)15分鐘后，將細 胞在30ml預(yù)熱的生長培養(yǎng)基中稀釋并在96、24、6_孔和P100組織培養(yǎng)板中平板接種。
[0203] 通過螢光素酶檢驗的 HCV RNA 復(fù)制。如（Murray 等，J Virol81，10220-10231， 2007)所述在電穿孔后6-9小時和72小時測量HCV RNA復(fù)制。將一式四份地平板接種在 96孔平板中的電穿孔細胞用PBS清洗兩次并用30 μ 1海腎裂解緩沖液（Promega)裂解。在 室溫搖動15分鐘后，使用海腎螢光素酶底物（Promega)和Tecan光度計（Tecan)根據(jù)制造 商的方案量化螢光素酶活性。
[0204] HIV復(fù)制試驗。在這些實驗中使用HeLa來源的TZM-bl細胞（其表達⑶4、 CCR5和CXCR4)和響應(yīng)HIV轉(zhuǎn)錄的β-半乳糖苷酶和螢火蟲螢光素酶報道基因（Wei等， Antimicrobial agents and chemotherapy46,1896-1905,2002)。如所描述的（Zhou 等， Cell Host & ]\^(^(*64,495-504,2008)，利用靶向441(1、641(或階'序列的8丨1?隱轉(zhuǎn)染細胞， 然后利用感染性HIV-I NL4-3克?。ˋdachi等，J Virol59,284-291，1986)感染。在感染 后第96小時測量螢光素酶活性。為了測試AAK1和GAK對于HIV的藥理學抑制劑作用，將 HIV-1感染的HeLa來源的TZM-b 1細胞每日利用系列稀釋的舒尼替尼、厄洛替尼或PKC-412 處理4天，然后進行螢光素酶測定。
[0205] 細胞外感染性。在電穿孔后第72小時收集利用J6/JFH(p7-Rluc2A)RNA電穿孔 并平板接種在P100皿中的Huh-7. 5細胞的培養(yǎng)物上清液、澄清化（利用0. 22 μ m孔徑過 濾器）并用于一式三份地感染未經(jīng)處理的Huh-7. 5細胞72小時，之后在海腎裂解緩沖液 (Promega)中裂解。如上所述量化20 μ 1細胞裂解物中的螢光素酶活性。為了確定厄洛替 尼、舒尼替尼和PKC-412對于感染性病毒的產(chǎn)生的作用，在抑制劑存在下利用每日更換的 培養(yǎng)基培養(yǎng)電穿孔細胞72小時，之后收集上清液或細胞裂解物。結(jié)果表示為每10cm組織 培養(yǎng)皿的loglORLU值。實驗重復(fù)三次，每次一式四份。
[0206] 細胞內(nèi)感染性測定。如Murray等（J Virol81，10220-10231,2007)所述，將利用 J6/JFH(p7-Rluc2A)RNA電穿孔后72小時的細胞用胰蛋白酶消化，通過離心收集，重懸在 500 μ 1培養(yǎng)基中，通過凍融循環(huán)裂解，并在3, 650 X g沉淀2次。使用在完全培養(yǎng)基中稀釋 的澄清上清液一式三份地接種未經(jīng)處理的Huh-7. 5細胞，然后裂解并在第72小時進行螢光 素酶測定。結(jié)果表示為每l〇cm組織培養(yǎng)皿的loglORLU值。實驗重復(fù)三次，每次一式四份。
[0207] 病毒滴度。通過基于對核心的免疫組織化學著色的有限稀釋測定來確定細胞外和 細胞內(nèi)滴度。如（Lindenbach等，Science309,623-626,2005)所述計算50%組織培養(yǎng)感染 劑量（TCID 5(I)。結(jié)果表示為TCID5(l/ml。將利用AE1-E2突變體測量的最小滴度用于背景減 除。
[0208] 核心ELISA。根據(jù)制造商的指示通過對于重組核心抗原的標準曲線的ELISA (Cell Biolabs)，測量在電穿孔后72小時收集的澄清細胞培養(yǎng)物上清液中釋放的核心蛋白的濃 度。
[0209] 生存力測定。在利用抑制性化合物處理或利用siRNA沉默后24、48和72小時， 如（Einav 等，Nature Biotechnology26,1019-1027,2008)所述將細胞在 10%阿爾瑪藍試 劑（TREK Diagnostic Systems)的存在下在37°C孵育2至4小時。然后使用FLEXstation II384(Molecular Devices，Inc.)掃描平板并檢測突光性。
[0210] 感染性研究。利用細胞培養(yǎng)物生長HCV J6/JFH(滴度：1.2X105TCID5(l/ml)感 染接種在96孔平板中的6X10 3個Huh-7. 5細胞。通過焦點形成測定（Lindenbach等， Science309,623-626, 2005)測量用來自于感染后72小時的感染細胞的上清液或澄清細胞 裂解物感染的未經(jīng)處理的Huh-7. 5細胞中的細胞外和細胞內(nèi)感染性。
[0211] 為了確定厄洛替尼、舒尼替尼和PKC-412的抗病毒作用，利用細胞培養(yǎng)生長的 HCV (J6/JFH(p7-Rluc2A))(滴度：6. 3 X 105TCID5Q/ml)以 0· 1M0I (感染復(fù)數(shù)）一式三份地感 染接種在96孔平板中的6 X 103個Huh-7. 5細胞。在感染后6小時以及以后的每一天，清 洗細胞并用含有系列稀釋的抑制化合物的培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。在第72小時，對樣品進行生 存力測定，然后進行標準螢光素酶測定（Promega)。
[0212] 回復(fù)體測定。繁殖利用具Y136A或V139A突變的J6/JFH(p7-Rluc2A)電穿孔的 Huh-7. 5細胞。每隔幾天收集培養(yǎng)物上清液并用于接種未經(jīng)處理的Huh-7. 5細胞，以在接 種后72小時通過螢光素酶測定確定細胞外感染性。使用TRIzol試劑（Invitrogen)由被 證明感染性表現(xiàn)型逆轉(zhuǎn)（對于Y136A克隆為電穿孔后第8天，對于V139A突變體克隆為 第14天）的克隆中提取總細胞RNA。使用Superscript One-Step逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 試劑盒（Invitrogen)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴增。擴增具有核心編碼序列的?1-kb片 段。通過Ultra CleanlOTNA純化試劑盒（MoBio)從瓊脂糖凝膠中純化PCR產(chǎn)物，并在ABI Prism377DNA測序儀（Sequetech)上進行自動測試。使用正向和逆向寡聚物（oligo)通過 兩個獨立的序列驗證一級位點回復(fù)的存在。
[0213] RNA 提取和 qRT-PCR。分別使用 TRIzol (Invitrogen (MoBio)或 QiaAmp UltraSens 試劑盒（Qiagen)從細胞或lml細胞培養(yǎng)物上清液分離總RNA。使用0. 5 μ g或4 μ 1RNA和 High-Capacity RNA-t〇-cDNA(Applied Biosystems) 一式三份地裝配 qRT-PCR 混合物。表 4 列出了 TaqMan 試劑。使用 StepOnePlus Real-Time-PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems)進 行擴增和分析。使用S18作為對照。
[0214] Western印跡。使用初級抗體然后HRP綴合的二級抗體對細胞裂解物進行western 分析。使用NIH Image對帶強度進行量化。
[0215] 定量免疫熒光共聚焦顯微鏡。利用J6/JFH HCV RNA對Huh-7. 5細胞進行電穿孔 或利用培養(yǎng)物生長的J6/JFH病毒進行感染，接種在蓋玻片上，并在37°C孵育72小時。用 PBS中的4%多聚甲醛固定細胞，用PBS清洗，用PBS中的0. 1 % Triton X-100透化5分鐘， 并在含有1% BSA的PBS中封閉1小時。將固定細胞利用核心蛋白AP2MUTGN46、鈣網(wǎng)蛋白 (calreticulin)或E2的初級抗體在室溫孵育1小時（見表1)。二級抗體（山羊抗-兔Alexa Fluor488,山羊抗-小鼠 Alexa Fluor594,雞抗-山羊IgG Alexa Fluor647和山羊抗-人 Alexa Fluor647) (Invitrogen)在室溫孵育 1 小時。如（Kopp 等，J Virol84,1666-1673， 2010)所述利用Bodipy-488/503 (Invitrogen)進行LD染色。然后將蓋玻片在PBS中清洗 三次，并利用ProLong Gold抗褪色試劑（Invitrogen)固定。或者，利用表達AP2M1-YFP和 / 或 Core-mCherry 的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 Huh-7. 5 細胞。利用 HCS LipidTOX(Invitrogen)對 LD 染 色。使用Zeiss LSM510共聚焦顯微鏡分析全部玻片。使用ImageJ(JACoP)共定位軟件和 Manders 共定位系數(shù)（Manders'Colocalization Coefficient，MCC)量化由每一種樣品隨機 選擇的10至15個細胞中的共定位。使用auto_threshold(插件，ImageJ)確定閾值。僅紅 色和綠色強度值二者都高于其各自閾值的像素被認為是具有共定位探針的像素。然后作為 總熒光在"共定位"像素中發(fā)生的目標區(qū)域中的分數(shù)計算MCC (更高的值代表更多共定位）。 示出了表示為平均共定位百分比的M2系數(shù)值。
[0216] 統(tǒng)計分析。如（Einav 等，Nature Biotechnology26,1019-1027, 2008)所述，通過 將數(shù)據(jù)擬合于三參數(shù)邏輯曲線（logistic curve)來測量IC50和ECS0。使用單尾不成對t 檢驗計算P值。
[0217] 實施例3
[0218] 厄洛替尼、舒尼替尼和PKC-412對AP2M1磷酸化的作用
[0219] 為了確定抑制化合物對AP2M1磷酸化的作用，每日用不同濃度的化合物或DMS0處 理具有J6/JFH(p7-Rluc2A) RNA的Huh-7. 5細胞。由于磷酸酶PP2A的活性，AP2M1磷酸化是 暫時的（Ricotta 等，JBiol Chem283 :5510-5517,2008)，為了允許獲得磷酸化 AP2M1 狀態(tài)， 在利用ΙΟΟηΜ PP2A抑制劑、花萼海綿誘癌素 A(Cal-A)或DMS0對照孵育細胞30分鐘之后， 在第72小時制備裂解物。然后對樣品進行SDS-PAGE并利用靶向磷酸化AP2M1形式或激動 蛋白的抗體進行印跡。實際上，與DMS0對照相比，在利用舒尼替尼、厄洛替尼和PKC-412處 理的細胞制備的裂解物中，測量到磷酸化AP2M1與肌動蛋白的比值顯著更低（圖6H)。磷酸 化AP2M1和肌動蛋白的比值隨著舒尼替尼、厄洛替尼濃度的提高以劑量依賴的形式逐漸價 低。這些結(jié)果表明在具有感染性HCV的Huh-7. 5細胞中，AAK1或GAK被這些化合物強效抑 制。
[0220] 所述化合物對HCV RNA復(fù)制、細胞內(nèi)感染性、細胞外感染性和HCV復(fù)制的作用
[0221] 為了確定厄洛替尼、舒尼替尼和PKC-412對感染性病毒的產(chǎn)生的作用，利用 J6/JFH(p7-Rluc2A)HCV 基因組對 Huh-7. 5 細胞進行電穿孔（Murray 等，J Virol81 : 10220-10231，2007)，在6孔平板上平板接種，每日用系列稀釋的化合物或DMS0進行處理。 在電穿孔72小時，通過基于阿爾瑪藍試驗測量細胞生存力，然后通過螢光素酶測定確定 HCV RNA復(fù)制。在第72小時從平行樣品中收集細胞培養(yǎng)物上清液和裂解物并用于孵育未經(jīng) 處理的Huh-7. 5細胞，以分別確定細胞外和細胞內(nèi)感染性。在孵育后72小時在這些細胞中 進行螢光素酶測定。
[0222] 為了確定這些化合物對HCV復(fù)制的作用，利用滴度為6. 3X 103TCID5Q/ml的細胞培 養(yǎng)物生長HCV (J6/JFH (p7-Rluc2A)以0. 1的Μ0Ι (感染復(fù)數(shù)）一式三份地感染接種在96孔 平板中的6X 103Huh-7. 5細胞。在電穿孔后6小時，清洗細胞并將培養(yǎng)基替換成系列稀釋 的抑制化合物。每日處理細胞72天，然后進行生存力測定，隨后進行標準螢光素酶測定。
[0223] 或者，利用細胞培養(yǎng)物生長HCV J6/JFH(滴度：1. 2 X 105TCID5Q/ml)以0. 1的 Μ0Ι (感染復(fù)數(shù)）一式三份地感染接種在96孔平板中的6 X 103Huh-7. 5細胞，并且進行焦點 形成測定，如（Lindenbach等，Science309 :623-626,2005)所述。在利用化合物每日處理 72小時后，利用4%甲醛固定細胞并利用皂苷進行通透化。利用第一抗核心單克隆抗體和 第二抗小鼠 Alexa594綴合抗體檢測HCV核心蛋白。在倒置顯微鏡下對焦點計數(shù)。
[0224] 將實驗重復(fù)兩次，每次進行4個重復(fù)。利用在相應(yīng)濃度的DMS0的存在下生長的 樣品對信號進行歸一化。通過使用式Y(jié) = a+(b-a)八1+10~ (X-c)) (a、b和c分別表示最小 結(jié)合、最大結(jié)合和logEC50)將數(shù)據(jù)擬合于三參數(shù)對數(shù)曲線來測量ECS0(BioDataFit，Chang Bioscience,Inc)〇
[0225] 表1.本研究中使用的抗體
[0226]
【權(quán)利要求】
1. 治療HCV-HIV同時感染的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抑制所述 HCV和HIV病毒與宿主網(wǎng)格蛋白銜接蛋白（AP)復(fù)合物μ亞基結(jié)合的藥劑。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述μ亞基選自網(wǎng)格蛋白API、ΑΡ2、ΑΡ3和ΑΡ4復(fù)合 物μ亞基。
3. 權(quán)利要求2所述的方法，其中所述μ亞基選自ΑΡ2Μ1、ΑΡ1Μ1、ΑΡ3Μ1和ΑΡ4Μ1。
4. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述藥劑抑制ΑΑΚ1或GAK。
5. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述藥劑選自厄洛替尼、舒尼替尼和PKC-412。
6. 抑制慢病毒亞科病毒、HIV、HCV/HIV同時感染、除HCV以外的黃病毒科病毒、除黃病 毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒或除HCV以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒的感染的方 法，所述方法包括向有此需要的患者施用有效量的抑制來自所述病毒的包含ΥΧΧΦ或二亮 氨酸基序的結(jié)構(gòu)蛋白與宿主網(wǎng)格蛋白銜接蛋白（AP)復(fù)合物μ亞基結(jié)合的藥劑。
7. 權(quán)利要求6所述的方法，其中所述μ亞基選自網(wǎng)格蛋白API、ΑΡ2、ΑΡ3和ΑΡ4復(fù)合 物μ亞基。
8. 權(quán)利要求7所述的方法，其中所述μ亞基選自ΑΡ2Μ1、ΑΡ1Μ1、ΑΡ3Μ1和ΑΡ4Μ1。
9. 權(quán)利要求6所述的方法，其中所述藥劑抑制ΑΑΚ1或GAK。
10. 權(quán)利要求6所述的方法，其中所述藥劑選自厄洛替尼、舒尼替尼和PKC-412。
11. 篩選抗病毒劑的方法，其包括： 使網(wǎng)格蛋白ΑΡ結(jié)合病毒、黃病毒科病毒、慢病毒亞科病毒、HCV、HIV、除HCV以外的黃病 毒科病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合病毒或除HCV以外的網(wǎng)格蛋白AP結(jié)合 病毒或其蛋白質(zhì)與候選藥劑和宿主網(wǎng)格蛋白銜接蛋白（AP)復(fù)合物μ亞基接觸，并且確定 所述候選藥劑對所述網(wǎng)格蛋白ΑΡ結(jié)合病毒、黃病毒科病毒、慢病毒亞科病毒、HCV、HIV、除 HCV以外的黃病毒科病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白ΑΡ結(jié)合病毒或除HCV以外的網(wǎng) 格蛋白ΑΡ結(jié)合病毒與所述蛋白質(zhì)結(jié)合的影響。
12. 篩選抗病毒劑的方法，其包括： 使網(wǎng)格蛋白ΑΡ結(jié)合病毒、黃病毒科病毒、慢病毒亞科病毒、HCV、HIV、除HCV以外的黃 病毒科病毒、除黃病毒科病毒以外的網(wǎng)格蛋白ΑΡ結(jié)合病毒或除HCV病毒以外的網(wǎng)格蛋白ΑΡ 結(jié)合病毒與候選藥劑和表達宿主網(wǎng)格蛋白銜接蛋白（ΑΡ)復(fù)合物μ亞基的細胞接觸，并且 確定所述候選藥劑對病毒裝配或出芽的影響。
13. 權(quán)利要求11所述的方法，其中所述候選藥劑抑制ΑΑΚ1或GAK的活性。
14. 抑制宿主細胞中黃病毒科病毒、除黃病毒科病毒以外的病毒或除HCV以外的病毒 的裝配或出芽的方法，其包括使所述宿主細胞與阻止包含ΥΧΧΦ或二亮氨酸基序的病毒結(jié) 構(gòu)蛋白與宿主網(wǎng)格蛋白銜接蛋白（ΑΡ)復(fù)合物μ亞基結(jié)合的藥劑接觸，從而抑制所述裝配 或出芽。
15. 權(quán)利要求14所述的方法，其中所述藥劑阻斷所述結(jié)構(gòu)蛋白與所述宿主蛋白質(zhì)的結(jié) 合。
16. 權(quán)利要求14所述的方法，其中所述藥劑與所述結(jié)構(gòu)蛋白競爭與所述宿主蛋白質(zhì)結(jié) 合。
17. 權(quán)利要求14所述的方法，其中所述藥劑與所述宿主蛋白質(zhì)競爭與所述結(jié)構(gòu)蛋白結(jié) 合。
【文檔編號】A61K31/517GK104066432SQ201280066275
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月6日
【發(fā)明者】希里特·埃伊納夫, 里娜·巴魯什-本托夫, 格里戈里·內(nèi)沃, 阿莫茨·齊瓦夫 申請人:小利蘭·斯坦福大學董事會