紅細胞的處理的制作方法
【專利摘要】本申請公開了處理紅細胞的組合物和方法。所述方法包括使紅細胞樣品活體外與，足以使得紅細胞樣品中存在的至少部分胞外亞鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白的量的、氧化氮或者釋放氧化氮的化合物接觸。在經(jīng)所述的活體外處理后將紅細胞施用于哺乳動物，降低了所施用的紅細胞對被施用的哺乳動物的副作用。
【專利說明】紅細胞的處理
[0001] 對相關(guān)申請的奪叉引用
[0002] 本申請要求2011年11月7日提交的美國臨時專利申請No. 61/556, 661的優(yōu)先權(quán)， 所述在先申請的全部內(nèi)容通過參考的形式全部并入本申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及在施用于哺乳動物之前處理紅細胞的組合物和方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 儲存長達兩周以上的紅細胞輸血與感染率提高、住院時間延長，以及重癥監(jiān)護 治療病房和正接受心血管手術(shù)的患者死亡率升高相關(guān)（Triulzi等人，Transfus Apher Sci2010 ;43:95-106)。延長的紅細胞儲存引起紅細胞中顯著的生化的，機械的以及功能性 的改變，總稱為"儲存性損傷（storage lesion)"。（Kim-Shapiro 等人，Transfusion2011; 51:844-51)。需要用于降低或去除用儲存紅細胞輸血的副作用的組合物和方法。
[0006] 發(fā)明概沭
[0007] 本發(fā)明至少部分地基于下述發(fā)現(xiàn)，即用氧化氮活體外（ex vivo)處理儲存的紅細 胞可使得胞外亞鐵血紅蛋白氧化成為高鐵血紅蛋白，此種處理防止儲存的紅細胞在被施用 于哺乳動物后誘導(dǎo)血管收縮。氧化氮或釋放氧化氮的化合物預(yù)處理儲存的紅細胞，可用作 減少或消除與用儲存的血液輸血相關(guān)的副作用的手段。在施用于哺乳動物之前對血液進行 處理，可免除為了解決由用儲存的血液輸血所導(dǎo)致的副作用，而對輸血后的哺乳動物進行 治療的需要。
[0008] 本申請公開了，通過使紅細胞樣品活體外與，足以使得紅細胞樣品中存在的至少 部分胞外亞鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白的量的、氧化氮或者釋放氧化氮的化合物接 觸，對紅細胞樣品進行處理的方法。胞外亞鐵血紅蛋白包括無細胞血紅蛋白和含胞外血紅 蛋白的微顆粒（參見 Donadee 等人，Circulation2011 ; 124:465-76)。
[0009] 本申請還公開了，通過對哺乳動物施用下述的紅細胞樣品以防止或減少在施用紅 細胞后哺乳動物中的血管收縮，所述的紅細胞樣品已活體外與，足以使得紅細胞樣品中存 在的至少部分胞外亞鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白的量的、氧化氮或者釋放氧化氮的化 合物接觸。
[0010] 在本申請所公開的方法的一些具體實施方案中，所述的方法并不顯著地氧化樣品 中的紅細胞或減弱它們的攜氧能力（例如，紅細胞中低于20%，低于15%，低于10%，或低 于5%的血紅蛋白被轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白）。
[0011] 本申請所公開的方法的一些具體實施方案中，所述的紅細胞樣品在與氧化氮或釋 放氧化氮的化合物接觸前，已經(jīng)歷過一種或以上活體外，泵（例如，負壓泵吸引），膜，和/或 氣泡（air bubbles)處理。在本申請所公開的方法的一些具體實施方案中，所述的紅細胞 樣品在與氧化氮或釋放氧化氮的化合物接觸前，已或活體外經(jīng)歷過，血液透析，術(shù)中血液 搶救，心切開吸引術(shù)。在這些方法中，所述的紅細胞在遭受使其需要經(jīng)本申請所公開的方法 進行處理的損傷之前，僅需要處于哺乳動物體外，一小段時間（例如，幾秒或幾分鐘）。
[0012] 紅細胞樣品包含紅細胞和上清液或血漿。所述的紅細胞樣品可以是，例如，全血或 濃縮紅細胞。
[0013] 所述紅細胞樣品可活體外儲存，例如，在從供體中移除后、與氧化氮或釋放氧化 氮的化合物接觸前，至少24小時。在一些具體實施方案中，所述紅細胞樣品從供體中移除 后、與氧化氮或釋放氧化氮的化合物接觸前，活體外儲存至少7天，至少14天，至少28天， 至少42天或更長時間。所述紅細胞樣品在儲存之前可任選地用儲存溶液稀釋。
[0014] 施用于哺乳動物之前，紅細胞可來源于自體或同種異型供體。因此，所述紅細胞樣 品可包含自體紅細胞或同種異型的紅細胞。所述紅細胞樣品可儲存于多種儲存介質(zhì)（例 如，Adsol)。在用氧化氮或釋放氧化氮的化合物處理之前，所述紅細胞樣品可任選地被凍 融。
[0015] 本申請所公開的方法的一些具體實施方案中，所述的處理使得所述紅細胞樣品中 至少20% (或至少50%，或至少80%)的胞外亞鐵血紅蛋白被轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白。
[0016] 在本申請所公開的方法的一些具體實施方案中，所述紅細胞樣品與用惰性氣體稀 釋的、含氣態(tài)氧化氮的治療性氣體接觸。治療性氣體中所述氣態(tài)氧化氮的濃度可以是，例如 至少 20ppm，至少 40ppm，至少 50ppm，至少 80ppm，至少 lOOppm，至少 200ppm，至少 300ppm, 或至少500ppm。在一些具體實施方案中，所述治療性氣體中氣態(tài)氧化氮的濃度在50ppm到 800ppm(例如，40ppm 到 200ppm, 80ppm 到 200ppm, 80ppm 到 500ppm, lOOppm 到 800ppm,或 40ppm到3,000ppm)的范圍。所述紅細胞樣品可與治療性氣體在不同長度的時間段（例如， 至少1秒，低于5秒，低于30秒，至少1秒但低于5秒，至少1秒但低于30秒，至少1分鐘， 至少2分鐘，至少3分鐘，至少4分鐘，至少5分鐘，至少6分鐘，至少7分鐘，至少8分鐘， 至少9分鐘，至少10分鐘，至少1小時，至少2小時，或更長的時間）內(nèi)相接觸。
[0017] 在本申請所公開的方法的一些具體實施方案中，所述紅細胞樣品與釋放氧化氮的 化合物接觸。所述釋放氧化氮的化合物任選地包含亞硝酸鹽。所述釋放氧化氮的化合物 可以是超短作用（ultra-short-acting)釋放氧化氮的化合物（例如，1-[2-(羧基）批咯 烷-1-基]二氮烯-1-鎗-1，2-二氧化物（diolate)或（Z)-1-[N-甲基-N-[6-(N-甲基銨 基己基）氨基]]二氮烯-1-鎗-1，2-二氧化物）或釋放二醇二氮烯鎗（nonoate)的中間 物。
[0018] 本申請所公開的方法的一些具體實施方案中，所述方法在無菌條件下進行。所述 紅細胞樣品在其從供體獲得，乃至用氧化氮或釋放氧化氮的化合物進行處理的整個過程 中，均保持在無囷條件之下。
[0019] 在本申請所公開的方法的一些具體實施方案中，所述紅細胞樣品與作為順序 (in-line)輸注（infusion)系統(tǒng)的一部分的氧化氮接觸，其中，所述的紅細胞樣品從含所 述樣品的容器流出，和與惰性氣體中的氧化氮源相連的層流設(shè)備或第二流式氣體交換設(shè)備 中的透氣材料（例如微孔膜）接觸，使紅細胞樣品暴露于氧化氮，并在暴露于氧化氮之后遞 送至所述哺乳動物。所述的氧化氮源可以是例如，含壓縮的氧化氮氣體的罐或電動氧化氮 發(fā)生器（含或不含N0 2凈化劑）。
[0020] 經(jīng)本申請所描述的方法治療的哺乳動物可以是人，或非人靈長類，或另外的哺乳 動物，如狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠、兔或倉鼠。
[0021] 本申請所提及的全部的出版物，專利申請，專利，序列，數(shù)據(jù)條目以及其他參考文 獻，均以參考的形式全文并入本申請。除非另外定義，本申請所用的全部技術(shù)和科學術(shù)語具 有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的含義。存在分歧時，包括定義在內(nèi)，以本說明 書為準。下文中描述了用于本發(fā)明的材料和方法，但是類似或等價于本申請所描述的其他 合適的材料和方法也可以用于實施或檢驗本發(fā)明。所述的材料、方法和實施例僅作為示例， 并非旨在進行限定。
[0022] 本發(fā)明的其它特征和有益效果，在下述的詳細描述以及權(quán)利要求中顯而易見。
[0023] 附圖簡沭
[0024] 圖1A-1D提供，在體外鼠 RBC中儲存誘導(dǎo)的形態(tài)，生化和功能改變。㈧新鮮紅細 胞（FRBC，上部的圖）和儲存的紅細胞（SRBC，下部的圖）的染色涂片，下部圖中的箭頭 顯示儲存兩周后增多的異型RBC數(shù)量。（B)FRBC和SRBC的氧解離曲線（ODC)。P 5(l，定義 為Hb50%飽和時的氧分壓，由所述的0DC計算出來。所述SRBC的0DC向左偏移，其P5Q為 21±lmmHg,相比之下，F(xiàn)RBC 的 P5。是 43±0mmHg。（C)FRBC(n = 5)和 SRBC(n = 5)與 P5。的 FRBC(n = 3)和SRBC(n = 3)的2, 3-DPG水平變化比較。（D)通過WT小鼠中輸血后24小 時測定的、GFP-標記的RBC百分比除以在0時間GFP-標記的RBC的百分比，確定FRBC (η =6)或SRBC(n = 6)存活率。FRBC，新鮮紅細胞（< 24h) ;SRBC，儲存的紅細胞（2周）。 *Ρ〈0. 01，與FRBC相比的差異。
[0025] 圖2A-2C是顯示用FRBC或SRBC輸血2小時后，清醒的WT (A)，給予HFD的WT⑶ 以及db/db(C)小鼠中的血清鐵水平的圖表。對照，沒有輸血（n = 4/組）；FRBC，用FRBC(n =6/組）輸血；SRBC,用SRBC (η = 6/組）輸血。*Ρ〈0· 05,與對照和FRBC相比的差異。
[0026] 圖3A-3C是顯示用FRBC或SRBC輸血2小時后，清醒的WT (A)，給予HFD的WT⑶ 以及db/db(C)小鼠中，IL-6(A)，Hp(B)，和Hx(C)的血漿水平的圖表。對照，沒有輸血（η =4/組）；FRBC，用新鮮RBC(n = 6/組）輸血；SRBC，用儲存的RBC(n = 6/組）輸血。 *P〈0. 05，與對照相比的差異；fP <〇.〇1，與FRBC相比的差異。
[0027] 圖4A-4C是顯示用FRBC或SRBC輸血2小時后，清醒的WT (A)，給予HFD的WT⑶ 以及db/db(C)小鼠中，肝ΗΟ-lmRNA水平的圖表。對照，沒有輸血（n = 4/組）；FRBC，用新 鮮RBC(n = 6/組）輸血；SRBC，用儲存的RBC(n = 6/組）輸血。*Ρ〈0· 05,與對照和FRBC 相比的差異。
[0028] 圖5A-5E是顯示經(jīng)歷不同類型的輸血（10%估算血容量）后，清醒的WT，給予HFD 的WT，或db/db小鼠中的體循環(huán)血壓（SBP，mmHg)的圖表。（A)清醒的WT小鼠中以FRBC(n =5)或SRBC (η = 6)輸血。（B)清醒的給予HFD的WT小鼠中以FRBC (η = 6)或SRBC (η =6)輸血。（C)清醒的db/db小鼠中，以呼吸了（η = 12)、或沒有呼吸（η = 9)氧化氮 (iNO, 80ppm)的 FRBC (η = 9)或 SRBC 輸血。（D)清醒的 db/db 小鼠中，以來自 FRBC (SFRBC，η =11)的上清液，來自SRBC(SSRBC，n = 7)的上清液，或氧化的SSRBC(n = 6)輸血。（Ε)清 醒的db/db小鼠中以洗過的FRBC (η = 9)或洗過的SRBC (η = 6)輸血。FRBC，新鮮紅細胞； SRBC，儲存的紅細胞。*Ρ〈0. 05,與FRBC和SRBC+iNO相比的差異。
[0029] 圖 6A-6B 是顯示比較用 FRBC (SFRBC，η = 6)上清液，SRBC (SSRBC，η = 6)上清液， FRBC (η = 7)或SRBC (η = 7)輸血之前之后，經(jīng)麻醉的db/db小鼠中體循環(huán)血流動力測定 結(jié)果的變化的圖表。（A)輸血前和輸血10分鐘后LVESP(mmHg)的變化。（B)輸血前和輸 血10分鐘后SVRI(%)的變化。LVESP，左心室收縮期末壓力；SVRI，體循環(huán)血管阻力指標， *P〈0. 05,與FRBC上清液或FRBC組相比的差異。
[0030] 圖7是顯示在添加溶液-1 (additive solution-ι)中儲存的、白細胞減少的 (leukoreduced)羊PRBC的體內(nèi)存活率的圖表。y-軸顯示循環(huán)中的生物素化的PRBC。輸血 后第一個24小時96 ± 4%的生物素化的新鮮PRBC存活，而76 ± 7 %的生物素化的儲存PRBC 在輸血后24小時在循環(huán)中。*P = 0. 001，與新鮮PRBC相比的差異值，tP=〇.〇〇2,與新鮮 PRBC相比的差異值，#P〈0. 001，與新鮮PRBC相比的差異值，§P = 0. 002,新鮮PRBC與儲存 PRBC相比的差異值。PRBC=濃縮的紅細胞。所有數(shù)據(jù)平均值土SD。
[0031] 圖8A-8B是顯示用新鮮的和儲存的PRBC輸血過程中和之后，在清醒的小羊羔中 測定的（A)肺動脈平均壓，和（B)肺血管阻力指標的圖表。一些小羊羔在用儲存的PRBC 輸血過程中和之后接受了吸入的氧化氮。*P〈〇. 05,儲存的PRBC值與新鮮PRBC和儲存的 PRBC+iN0，AN0VA的差異。iNO =吸入的氧化氮；PAP =肺動脈平均壓；PRBC =濃縮的紅細 胞；PVRI =肺血管阻力指標。全部數(shù)據(jù)平均值土SD。
[0032] 圖9A-9C是顯示用新鮮的和儲存的PRBC輸血過程中和之后測定的⑷肺動脈平 均壓，（B)肺毛細血管楔壓，和（C)肺血管阻力指標的圖表。一些小羊羔在用儲存的PRBC 輸血過程中和之后接受了吸入的氧化氮。*P〈〇. 05,儲存的PRBC值與新鮮PRBC和儲存的 PRBC+iNO, AN0VA的差異。L-NAME在輸血前施用以誘導(dǎo)內(nèi)皮功能不良（?·Ρ<0.05,各組中， 在第-60分鐘（L-NAME之前）的測定值，與第-50分鐘和第-10分鐘之間的測定值的差 異）.iNO =吸入的氧化氮；L-NAME = NG-硝基-L-精氨酸甲基-酯；ΡΑΡ =肺動脈平均壓； PCWP =肺毛細血管楔壓；PRBC =濃縮的紅細胞；PVRI =肺血管阻力指標。全部數(shù)據(jù)平均值 土SD。
[0033] 圖10是顯示用新鮮的和儲存的PRBC輸血之前和之后，在健康的清醒的小羊羔中 測定的血漿血紅蛋白水平的圖表。一些小羊羔在用儲存的PRBC輸血過程中和之后接受了 吸入的氧化氮。*P〈〇. 05,新鮮PRBC值與儲存的PRBC和儲存的PRBC+iNO, AN0VA的差異。 iNO =吸入的氧化氮；PRBC =濃縮的紅細胞。全部數(shù)據(jù)平均值土 SD。
[0034] 圖11A-11B是顯示用新鮮的和儲存的PRBC輸血之前和之后，在清醒的小羊羔中 測定的血漿（A)硝酸鹽和（B)亞硝酸鹽水平的圖表。*P〈0.05,儲存的PRBC+iNO值與新鮮 PRBC和儲存的PRBC，AN0VA的差異。iNO =吸入的氧化氮；PRBC =濃縮的紅細胞。全部數(shù) 據(jù)平均值土 SD。
[0035] 圖12是顯示紅細胞上清液中血紅蛋白種類的相對濃度的圖表，所述的紅細胞上 清液，經(jīng)由微孔氣體交換器，用氮氣中的氣態(tài)氧化氮處理過。
[0036] 圖13是顯示紅細胞中高鐵血紅蛋白相對濃度的圖表，所述的紅細胞，經(jīng)由微孔氣 體交換器，用氮氣中的氣態(tài)氧化氮處理過。
[0037] 圖14A-14B是顯示ΜΑΗΜΑ/Ν0處理對人和鼠儲存的紅細胞的作用的圖表。A)無細 胞上清液血紅蛋白與胞內(nèi)高鐵血紅蛋白紅細胞水平的氧化比較，B)上清液（[Hb]，μ M)和 紅細胞（Hct，％ )中的血紅蛋白濃度。
[0038] 圖15是顯示在將儲存的紅細胞（儲存2周）和經(jīng)ImM ΜΑΗΜΑ/Ν0, 5% v/v，預(yù)處理 的儲存的紅細胞輸注到清醒的db/db小鼠之前和之后，通過非侵入性的尾部套囊測定的收 縮壓（mmHg)，*P〈0. 05,與用ΜΑΗΜΑ/Ν0預(yù)處理的SRBC相比的差異。
[0039] 圖16顯示用于氣體-氣體轉(zhuǎn)移實驗的含膜設(shè)備。
[0040] 圖17是顯示不同的氣流比例（數(shù)據(jù)以平均值土 SD表示，η = 6 ;G1/G27:1，氣流 比例7:1 ;G1/G214:1，氣流比例14:1)通過微孔的（MP)和聚甲基戊烯（PMP)膜的氧化氮濃 度的圖表。
[0041] 發(fā)明詳沭
[0042] 將儲存的紅細胞施用于哺乳動物引起血管收縮以及其他的副作用。本發(fā)明提供用 于減少和消除施用儲存的紅細胞后所出現(xiàn)的副作用的組合物和方法。如所附的實施例中詳 細描述的，通過將其暴露于氧化氮，氧化儲存的紅細胞上清液，將胞外活性的亞鐵血紅蛋白 轉(zhuǎn)化成無活性的高鐵血紅蛋白，消除由于施用儲存的紅細胞所出現(xiàn)的血管收縮。
[0043] 紅細朐
[0044] 紅細胞可來源于自體或同種異型的供體，接下來，將其施用于受體。紅細胞的儲存 導(dǎo)致在將儲存所血液施用于受體后誘導(dǎo)血管收縮（Reynolds等人（2007) Proc. Natl. Acad. Sci. 104:17058-62 ;Bennett-Guerrero 等人（2007)Proc. Natl. Acad. Sci. 104:17063-68)。 根據(jù)本申請所描述的方法，在向供體輸注前，可在多種時間段（例如，至少1，2, 3, 4, 5, 6,或 12小時，或至少1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21，28, 42天，或更長時間）內(nèi)儲存人紅細胞。紅細胞可 以，例如全血或濃縮紅細胞的形式施用。
[0045] 氣化氮
[0046] 根據(jù)諸如所述紅細胞樣品的大小，流速，暴露于氧化氮的時間長度，相對于微 孔氣體滲析膜中的混合的層流程度之類的因素，和/或治療醫(yī)師認為相關(guān)的其他因素， 合適用于處理紅細胞樣品的氧化氮濃度不盡相同，例如，從20ppm到80ppm, 200ppm到 500ppm, 500ppm到800ppm, 2, 800ppm, 3, OOOppm,或更高。藥品級的氧化氮是可商購的（ΙΝ0 max?, Ikaria, Inc. , Clinton, NJ) 〇
[0047] 用于處理紅細胞樣品的氣態(tài)氧化氮可由儲存的、壓縮氧化氮氣體源施用。所述的 氧化氮源可以是100%氧化氮，或是用n 2或任何其他惰性氣體（例如氦）稀釋的。所述的 氧化氮可以，以不含〇2或氮氣的高價氧化物的混合物形式獲得并儲存。需要時，可通過化學 發(fā)光分析證明氧化氮的純度。化學發(fā)光Ν0-Ν0 χ分析儀是可商購的（例如Modell4A, Thermo Environmental Instruments, Franklin, ΜΑ)?；旌衔镏醒趸淖罱K濃度可通過化學的或 化學發(fā)光技術(shù)（參見例如，F(xiàn)ontijin等人，Anal. Chem. 42:575(1970))證明。另外，Ν0和 N02濃度可通過電化學分析儀方式監(jiān)控。任何雜質(zhì)，如N02，可通過暴露于NaOH溶液，二氧化 碳吸收劑（baralyme)或者堿石灰（sodalime)洗去。作為額外的對照，還可以評估最終氣 體混合物中的Fi0 2。
[0048] 將氧化氮氣體施用于紅細胞樣品可通過，例如，N2(或惰性氣體）中的壓縮的氧 化氮氣體的罐和第二氮氣（或另一種惰性氣體）罐附加在設(shè)計用于將兩種來源的氣體混 合的設(shè)備來實現(xiàn)。通過控制每一來源的氣體的流速，可將最終施用于所述紅細胞樣品的氧 化氮濃度保持在最佳水平。也可以利用標準的低流量混合器（例如，Bird Blender, Palm Springs, CA)使氧化氮氣體與室內(nèi)空氣（room air)混合。
[0049] 氧化氮可由隊和02(即空氣）通過電動氧化氮發(fā)生器生成。此種發(fā)生器如 Zapol，U. S. Patent No. 5, 396, 882中所描述。由此類設(shè)備形成的N02可在將血液樣品暴露 于N02之前，通過凈化所述的氣體混合物來減少。
[0050] 用于將氧化氮遞送到紅細胞樣品的氣體遞送設(shè)備可包含氧化氮計量器，以監(jiān)控暴 露于樣品的氧化氮的總劑量。通過使用計量器，即可確定樣品已經(jīng)接受了所需量的氧化氮， 由此可以逐漸停止或終止氧化氮的施用。計量器可將治療性氣體中的氧化氮濃度（由氧化 氮濃度計測定）與氣體流速（由氣體流量計測定）整合，以確定暴露于所述紅細胞樣品的 氧化氮的總量。
[0051] 可使用透氣材料使得氣態(tài)氧化氮擴散通過，與所述紅細胞樣品接觸。此類材 料的示例包括透氣膜，如在血液氧合器中所使用的那些（例如，二甲聚硅氧烷或聚烷基 砜），和微孔性材料，如Gore-tex?或Celgard?，其允許氧化氮之類的氣體分子通過其微 孔，溶解在液體中。一種示例性的氧合器（Living Systems Instrumentation Inc.，St. Albans, Vermont)的使用在后附的實施例中有描述。所述透氣材料的部件可被設(shè)置成，一面 與所述紅細胞樣品接觸，另一面與氧化氮源接觸，使紅細胞和氧化氮源相分離，但允許氧化 氮氣體的單個分子通過并擴散到所述的樣品中。在輸注過程中，氧化氮可任選地與紅細胞 樣品接觸，由此，使從包含所述紅細胞樣品的容器流出的紅細胞樣品暴露于通過所述透氣 材料（其允許氧化氮擴散到紅細胞樣品中）的氧化氮，并最終施用于所述的受體。也可以使 用具有第二流量（secondary flows)的氣體交換器（參見，例如，Zapol和Qvist, Artificial Lungs for Acute Respiratory Failure, New York, Academic Press, 1976)〇
[0052] 可制備包含氧化氮的水溶液，用于將氧化氮遞送給紅細胞樣品。在引入到 所述紅細胞樣品之前，所述的氧化氮可溶解于藥品可接受的載液（carrier liquid) 中?？捎糜诖朔N目的的載液包括標準的鹽溶液和小份（aliquots)的所述紅細胞樣 品，以及液體，如氧化氮在其中展現(xiàn)高水平溶解度的碳氟化合物或有機的溶劑（Shaw和 Vosper J.Chem. Soc. Faraday Trans. 1.73:1239-1244, 1977 ；Young, Solubility Data Series8:336-351，1981)，由此大量聚集的氧化氮可以在小容量的載體中遞送。
[0053] 釋放氣化氮的化合物
[0054] 作為所使用的氧化氮的替代（或另外的選擇），根據(jù)本申請所描述的方法可將釋 放氧化氮的化合物暴露于紅細胞樣品。適用于本申請的方法的釋放氧化氮的化合物包括： 亞硝基或亞硝?；衔铮⊿-亞硝基-N-乙酰青霉胺，S-亞硝基-L-半胱氨酸，和亞硝基胍）， 其以氧化氮組分自發(fā)釋放、或在生理條件下由所述化合物轉(zhuǎn)移出來為特征；化合物，其中的 氧化氮是過渡金屬復(fù)合物上的配體，因此可以容易地釋放或在生理條件下由所述化合物轉(zhuǎn) 移出來（例如，硝普鹽，氧化氮-鐵氧還原蛋白或氧化氮-血紅素復(fù)合物）；和酶代謝產(chǎn)生 氧化氮自由基的含氮化合物（例如，精氨酸，三硝酸甘油，亞硝酸異戊酯，亞硝酸鈉，無機亞 硝酸鹽疊氮化物，和羥胺）。另外的釋放氧化氮的化合物包括硝酸甘油和SIN-1。
[0055] 釋放氧化氮的化合物可以是超短作用釋放氧化氮的化合物，例如1-[2_(羧基）吡 咯烷-1-基]二氮烯-1-鎗-1，2-二氧化物（"PR0LI/N0"），1-羥基-2-氧代-3-(N-甲 基-3-氨基丙基）-3-甲基-1-三氮烯（"N0C-7";Zhang 等人（1996)Circulation94:2235)， Ν，Ν' -二甲基乙二胺的氧化氮加合物（"DMHD/N0" ；Kaul等人（1997)1乂&^丨〇￥&8?！?Pharmacol. Ther. 19972(3) : 181)，或（Z)-1-[N-甲基-N-[6-(N-甲基銨基己基）氨基]二 氮烯-1-鎗-1,2-二氧化物（"MHMA/N0"）。在一些具體實施方案中，所述的超短作用釋 放氧化氮的化合物具有低于90分鐘（或低于60分鐘，低于30分鐘，低于20分鐘，低于10 分鐘，低于5分鐘，低于2分鐘，或低于1分鐘）的半壽期。
[0056] 已知的化合物或據(jù)信可以釋放氧化氮的化合物（例如，超短作用釋放氧化氮的化 合物）可使用本申請所述的動物模型直接試驗其效力。此外，此種化合物可首先根據(jù)其激 發(fā)鳥苷酸環(huán)化酶的能力進行篩選，在如Ishii等人（1991)Am. J.Physiol. 261:H598-H603所 描述的體外試驗中，氧化氮結(jié)合鳥苷酸環(huán)化酶并由此發(fā)揮其生物學活性。
[0057] 以下是實施本發(fā)明的實施例。所述實施例不以任何形式構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限 制。 實施例
[0058] 實施例1:小鼠中糖尿病力口?。ˋugments)以及氧化氮，防lh同基因的（Syngeneic) 儲存血液輸血后的不自血流動力影響
[0059] 動物
[0060] 所有的動物研究均得到位于 Massachusetts General Hospital, Boston, MA 的動物研究委員會的許可。對8-10周齡的雄性C57BL/6J野生型（WT)小鼠和 B6. Cg-m+/+L印rdb/J (C57BL/6J背景）糖尿?。╠b/db)小鼠進行了研究。另外的WT小 鼠飼喂高脂飲食（60kcal%脂肪；Research Diets, Inc.，New Brunswick，NJ)4_6 周（給 予HFD的WT)。8-10周齡的，在其紅細胞上表達GFP的、雄性、綠熒光蛋白（GFP)轉(zhuǎn)基因 C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J(C57BL/6J背景）小鼠用于測定RBC存活率。全部的小鼠均 由 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)獲得。
[0061] 鼠血液收集與儲存
[0062] 在無菌條件下，通過開胸心臟穿刺將C57BL/6J WT小鼠的血液（?1ml/小鼠） 收集到含 CPDA-1 的注射器（Sigma-Aldrich，St. Louis，M0)中。CPDA-1 的終濃度是 14%。 收集后，使血液通過新生兒白細胞減少濾器（neonatal leukoreduction filter) (Pall Biomedical Products Co·, East Hills, NY)，減少白細胞。減少了白細胞的血液600g離心 15min，去除血楽調(diào)節(jié)血細胞比容（Hct)7〇-75%，于4°C下儲存于Eppendorf管。利用當變 形細胞溶解物試驗（LAL)(參見Novitsky等人J Clin Microbioll985 ;21:211-6)測定新 鮮的白細胞減少的鼠 RBC(FRBC)或儲藏的白細胞減少的鼠 RBC(SRBC)樣品中脂多糖（LPS) 水平。
[0063] 儲存的RBC組分的制備
[0064] 將FRBC或SRBC在4°C，以400g離心10min后獲得上清液。為使得因洗滌導(dǎo)致的 溶血降至最低，用10倍體積的1. 5%氯化鈉輕柔洗滌FRBC和SRBC，并于4°C下400g離心 10min。輸血前，洗過的FRBC或SRBC重懸于新鮮的鼠血漿以獲得最終70-75%的Hct。
[0065] 為氧化SRBC上清液中的亞鐵Hb，將所述的上清液暴露于經(jīng)由氧合器（Living Systems Instrumentation Inc.，St. Albans, Vermont)的、于氮氣中的 800ppm 氧化氮氣體 2 小時，以產(chǎn)生 metHb(Yu 等人，Circulation2008;117:1982-90)。將上清液（2ml)以 3L、 0· 9%鹽水透析 3 次（Spectra/Por 分子多孔膜 MWC0:12-14, 000, Spectrum Laboratories Inc.，Rancho Dominguez, CA)以減少低分子量的氧化氮代謝物。
[0066] 儲存的鼠RBC中的生化，血液學和形態(tài)改變
[0067] 測定（ABL800FLEX, Radiometer, Westlake, OH) FRBC 和 SRBC 中的血氣張力（PC02 和 P〇2)，pH,以及標準堿過剩（SBE)。FRBC和SRBC中的電介質(zhì)濃度（鈉，鉀，|丐，氯化物，HC0 3-) 和乳酸鹽也進行了測定（Critical Care Xpress, Nova Biomedical, Waltham, ΜΑ)。
[0068] 為確定上清液中的Hb水平，在4°C下，將FRBC或SRBC，以1700g離心8min，用 QuantiChromHb分析試劑盒（BioAssaySystems, Hayward, CA)測定上清液Hb水平。利用下述 標準公式計算溶血:溶血（％)=[上清液HbX (l-%Hct)]/總HbXlOO (參見Kamel 等人，Blood Transfus2010;8:260-6)。
[0069] 為研究儲存對于RBC形態(tài)的影響，將FRBC或SRBC涂片并用Hema3手工染色系 統(tǒng)（Fisher Diagnostics, Middletown, VA)染色，利用配 Plan Fluor60x 干物鏡的 Nikon EDIPSE80i 立式顯微鏡（Nikon Instruments Inc.，Melville, NY)獲得圖像。
[0070] 用 Hemox-分析儀（TCS Scientific Corp.，New Hope, PA)確定 FRBC 和 SRBC 的氧 解離曲線（〇DC)(向5ml含有20 μ 1添加劑-A(additive-A)和10 μ 1消泡劑的Hemox-溶 液中添加20 μ 1的RBC)。P50,定義為Hb為50%時的氧分壓，由0DC計算。FRBC和SRBC中 的 2, 3-DPG 水平利用 2, 3-DPG 試劑盒（RocheDiagnostics, Mannheim, Germany)測定。
[0071] 測定鼠 RBC存活率
[0072] Gilson 等人（Gilson 等人，Transfusion2009 ;49:1546-53)報道的 GFP-標記的 RBC法，用于測定經(jīng)輸血的鼠 RBC存活率。簡要地說，通過心臟穿刺由UBC-GFP和WT小鼠 收集血液到含CPDA-1的lml注射器中，制備含40%來自UBC-GFP小鼠的RBC和60%來 自WT小鼠的RBC的血液混合物，減少白細胞，離心，于4°C下儲存〈24小時（FRBC)，和2周 (SRBC)。用含有GFP-標記的RBC的100 μ L FRBC或SRBC，通過尾靜脈，向WT小鼠輸血。 在輸血10min，30min，1小時，24小時，和8天后，從后眼窩獲取血樣，收集到肝素化的玻 璃毛細管中。GFP-陽性RBC的百分比通過正向散射/側(cè)向散射（FSC/SSC)在5Laser LSR Fortessa(BD Biosciences，San Jose，CA)上確定。在不同的獲取天數(shù)通過Sphero彩虹突 光顆粒（Spherotech Inc.，Lake Forest, IL)將流式細胞儀校準到相同的設(shè)置。用輸血24 小時后測定的GFP-陽性RBC的百分數(shù)除以0時刻GFP-陽性RBC的百分數(shù)，計算輸血24小 時后的RBC存活率（％)。根據(jù)第10分鐘，第30分鐘和1小時的數(shù)據(jù)，由線性回歸外推0 時刻的熒光。
[0073] 輸血2小時后的生化分析
[0074] FRBC或SRBC輸血后，在第2小時腹膜內(nèi)注射戊巴比妥（200mg/kg)。通過心臟穿 刺由每只小鼠收集約lml血液到肝素化的注射器中，在4°C下，4000rpm離心8分鐘。獲得 肝素化的血漿，以進行血液化學、白介素-6 (IL-6)、觸珠蛋白（Hp)，和血紅素結(jié)合蛋白（Hx) 水平的測定。獲取血清以測定鐵水平。肝臟樣品在液氮中速凍，用于接下來確定血紅素加 氧酶-1 (H0-1)。
[0075] 為比較FRBC或SRBC輸血的急性生化影響，在輸血后10分鐘，腹膜內(nèi)注射戊巴比 妥（200mg/kg)，將12只WT和12只db/db小鼠處死。通過心臟穿刺獲得全血，以進行血液 化學測定。
[0076] 血清鐵水平測定
[0077] 利 用 Iron/Unsaturated Iron Binding Capacity Assay (Thermo Fisher Scientific, Middletown, VA)確定血清鐵水平。
[0078] 血漿IL-6, Hp,和Hx水平的測定
[0079] 利用 Duoset 小鼠 IL_6Elisa 試劑盒（R&D Systems, Minneapolis, MN)確定血 楽 IL-6 水平。分別利用小鼠 Hp 和 Hx Elisa 試劑盒（Life Diagnostics, Inc.，West Chester, PA)測定血楽Hp和Hx水平。
[0080] 組織mRNA水平的定量
[0081] 利用 Trizol 試劑（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)從鼠肝臟提取 總 mRNA。通過反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)（MMLV-RT, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)合 成 cDNA。轉(zhuǎn)錄物的實時擴增，以 SYBR 法利用 Eppendorf Mastercycler Realplex(Eppendo rf, Hamburg, Germany)進行。祀轉(zhuǎn)錄物的相對表達歸一化至18S rRNA的水平，并利用相對 CT方法進行分析。
[0082] FRBC或SBRC輸血后在清醒的WT，給予HFD的WT，和db/db小鼠中進行非侵入性 血壓測定
[0083] FRBC, SRBC，洗過的FRBC和SRBC，來自FRBC和SRBC的上清液，和經(jīng)氧化 的來自SRBC的上清液，經(jīng)尾靜脈輸入（transfused)到（總輸入體積是預(yù)估血容量 的10 % ) WT，給予HFD的WT，或db/db小鼠。利用非侵入性血壓系統(tǒng)（XBP1000, Kent Scientific，Torrington，CT) (Yu 等人，Circulation2008;117:1982-90 ;Yu 等 人，Anesthesiology2010 ;112:586-94)測定收縮壓。全部的尾靜脈注射在1分多鐘（over one minute)的時間內(nèi)進行。一組db/db小鼠接受了 SRBC，并且從輸血前10分鐘到輸血后2 小時，利用Yu等人，Circulation2008 ;117:1982-90中所描述的方法，呼吸空氣中的80ppm 氧化氮（Medical-Technical Gases, Inc.，Medford, ΜΑ)。
[0084] 在經(jīng)麻醉的小鼠中侵入性的血流動力測定
[0085] 侵入性的血流動力測定，如Yu等人，Anesthesiology2010 ;112:586_94所描述的 進行。在基線，和用FRBC，SRBC，來自FRBC的上清液，或來自SRBC的上清液輸血5分鐘（預(yù) 估血容量的10%，以75 μ L/min的速度在3分多鐘（over3min)的時間內(nèi)通過置于右頸靜 脈中的單獨的導(dǎo)管輸入）后測定左心室壓力-容積環(huán)和心輸出量（C0)以及平均動脈血壓 (MAP)。
[0086] 統(tǒng)計分析
[0087] 所有的數(shù)值以平均值土SEM表示。數(shù)據(jù)通過帶有Tukey修正的單向 AN0VA(SigmaStat3.0.1;Systat Software，Inc.，San Jose，CA)進行分析。在清醒的小鼠 中的收縮壓測定通過重復(fù)測定帶有相互作用的雙向AN0VA進行分析。概率值低于0. 05被 認定為顯著。
[0088] 儲存的鼠血液的表征
[0089] 儲存彡24小時的FRBC與儲存2周的SRBC進行比較。在SRBC中，pH, P02, HCCV， 和SBE顯著降低，然而，SRBC中的PC02，和乳酸鹽比FRBC中的高（表1)。此外，SRBC中的 鈉水平較FRBC中的低，而SRBC中的鉀水平比FRBC中的高。SRBC中的溶血水平顯著高于 FRBC中的溶血水平。類似地，SRBC中的上清液Hb水平比FRBC中的高。在FRBC和SRBC的 上清液中測定的MetHb水平不到上清液Hb的1 %。
[0090] 表1. FRBC (彡24h)和SRBC (2周）中的血液化學比較
[0091]

【權(quán)利要求】
1. 處理紅細胞樣品的方法，所述方法包括使紅細胞樣品活體外與足以使得紅細胞樣品 中存在的至少部分胞外亞鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白的量的、氧化氮或者釋放氧化氮 的化合物接觸。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中，所述的紅細胞樣品在與氧化氮或釋放氧化氮的化合物接 觸前，已活體外經(jīng)歷過血液透析，術(shù)中血液搶救，或心切開吸引術(shù)。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中，所述的紅細胞樣品在與氧化氮或釋放氧化氮的化合物接 觸前，已活體外經(jīng)歷過一種或以上的泵、膜或氣泡。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中，從供體中移除后、與氧化氮或釋放氧化氮的化合物接觸 前，所述的紅細胞樣品已活體外保存了至少24小時。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中，從供體中移除后、與氧化氮或釋放氧化氮的化合物接觸 前，所述的紅細胞樣品已活體外保存了至少7天。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中，從供體中移除后、與氧化氮或釋放氧化氮的化合物接觸 前，所述的紅細胞樣品已活體外保存了至少14天。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中，從供體中移除后、與氧化氮或釋放氧化氮的化合物接觸 前，所述的紅細胞樣品已活體外保存了至少28天。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中，從供體中移除后、與氧化氮或釋放氧化氮的化合物接觸 前，所述的紅細胞樣品已活體外保存了至少42天。
9. 前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述紅細胞樣品中的至少20 %的胞外亞鐵血紅 蛋白轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白。
10. 前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述紅細胞樣品中的至少50%的胞外亞鐵血紅 蛋白轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白。
11. 前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述紅細胞樣品中的至少80%的胞外亞鐵血紅 蛋白轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白。
12. 前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述的紅細胞樣品與含氣態(tài)氧化氮的治療性氣 體接觸。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述的治療性氣體中氣態(tài)氧化氮的濃度是至少20ppm。
14. 權(quán)利要求12的方法，其中所述的治療性氣體中氣態(tài)氧化氮的濃度是至少40ppm。
15. 權(quán)利要求12的方法，其中所述的治療性氣體中氣態(tài)氧化氮的濃度是至少80ppm。
16. 權(quán)利要求12的方法，其中所述的治療性氣體中氣態(tài)氧化氮的濃度在lOOppm到 800ppm的范圍。
17. 權(quán)利要求12的方法，其中所述的治療性氣體中氣態(tài)氧化氮的濃度在40ppm到 200ppm的范圍。
18. 權(quán)利要求12的方法，其中所述的治療性氣體中氣態(tài)氧化氮的濃度在40ppm到 3, OOOppm的范圍。
19. 權(quán)利要求12到18任一項所述的方法，其中所述的紅細胞樣品與所述的治療性氣體 接觸不到5秒。
20. 權(quán)利要求12到18任一項所述的方法，其中所述的紅細胞樣品與所述的治療性氣體 接觸至少15分鐘。
21. 權(quán)利要求12到18任一項所述的方法，其中所述的紅細胞樣品與所述的治療性氣體 接觸至少1小時。
22. 權(quán)利要求12到18任一項所述的方法，其中所述的紅細胞樣品與所述的治療性氣體 接觸至少2小時。
23. 權(quán)利要求1到11任一項所述的方法，其中所述的紅細胞樣品與釋放氧化氮的化合 物接觸。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述的釋放氧化氮的化合物包括亞硝酸鹽。
25. 權(quán)利要求23的方法，其中所述的釋放氧化氮的化合物是超短作用的釋放氧化氮的 化合物。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中所述的超短作用的釋放氧化氮的化合物是1-[2-(羧基） 吡咯烷-1-基]二氮烯-1-鎗-1，2-二氧化物（diolate)或（Z)-1-[N-甲基-N-[6-(N-甲 基銨基己基）氨基]]二氮烯-1-鎗-1，2-二氧化物。
27. 前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述方法在無菌條件下進行。
28. 防止或降低施用紅細胞后哺乳動物中的血管收縮的方法，所述方法包括給哺乳動 物施用，已活體外與足以使得紅細胞樣品中存在的至少部分胞外亞鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)化成高鐵 血紅蛋白的量的、氧化氮或者釋放氧化氮的化合物接觸的紅細胞樣品。
29. 權(quán)利要求28的方法，其中所述的紅細胞樣品包含自體紅細胞。
30. 權(quán)利要求28的方法，其中所述的紅細胞樣品包含同種異型的紅細胞。
31. 權(quán)利要求28到30任一項所述的方法，其中所述的紅細胞樣品在用氧化氮或釋放氧 化氮的化合物處理之前經(jīng)凍融。
32. 權(quán)利要求28到31任一項所述的方法，其中所述的紅細胞樣品與作為順序輸注系統(tǒng) 的一部分的氧化氮接觸，其中所述的紅細胞樣品從含有所述紅細胞樣品的容器流出，和連 接著氧化氮源的透氣材料接觸，使紅細胞樣品暴露于氧化氮，并在暴露于氧化氮之后遞送 至所述哺乳動物。
33. 權(quán)利要求32的方法，其中所述的氧化氮源是含壓縮氧化氮氣體的罐。
34. 權(quán)利要求32的方法，其中所述的氧化氮是電動氧化氮發(fā)生器。
35. 前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述的哺乳動物是人。
【文檔編號】A61K35/18GK104159591SQ201280066237
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月7日
【發(fā)明者】W.M.扎波爾, B.于 申請人:通用醫(yī)療公司