腸道病毒71型的特異性抗體及其用途
【專利摘要】本申請?zhí)峁┲辽僖环N分離的抗體或其片段，其中，所述抗體或其片段能夠特異性地結(jié)合至少一種EV71衍生的肽。
【專利說明】腸道病毒71型的特異性抗體及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明主要涉及腸道病毒71型（EV71)的特異性單克隆抗體。特別是，但非專有 地，所述抗體可以是中和性單克隆抗體。

【背景技術(shù)】
[0002] 腸道病毒是造成廣譜的人類和非人類疾病的異種群病原體之一。腸道病毒屬于小 RNA病毒科內(nèi)的大屬；該科內(nèi)的其他屬包括鼻病毒屬、嗜肝病毒屬、心病毒屬和口蹄疫病毒 屬。腸道病毒屬包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇A病毒（CAV)、柯薩奇B病毒（CBV)、?？刹《?和腸道病毒68-71以及許多的從人類和其他靈長類分離的未特征化的腸道病毒。跟其他小 RNA病毒一樣，腸道病毒的病毒體包括一個無包膜的二十面體衣殼，其包圍含有感染性的單 鏈基因組正義RNA (ssRNA)(大小約為7-8. 5kb)的核。腸道病毒與其他小RNA病毒科成員 的區(qū)別在于它們在酸中的穩(wěn)定性和它們糞-口的傳播擴散途徑。病毒進入細胞被認為涉及 特定的細胞受體。病毒體蛋白包含四種衣殼蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4)的多個拷貝。小蛋 白VPg(分子量（Mr)約24x103)與基因組RNA的5'末端共價連接。腸道病毒的其他蛋白 包括主要非結(jié)構(gòu)蛋白P2和P3。
[0003] 腸道病毒71型（EV71)屬于腸道病毒屬的人腸道病毒A種。EV71不是動物傳染病 的因子，而是包括無菌性腦膜炎、腦炎、腦神經(jīng)麻痹、格林-巴利綜合征和脊髓灰質(zhì)炎樣綜 合征的許多神經(jīng)疾病的致病因子。
[0004] EV71還與包括其他腸道病毒（如CA16、CA5、CA9和Echo7)的人類手足口?。℉FMD) 的大爆發(fā)相關(guān)。然而，在與HFMD相關(guān)的全部腸道病毒中，EV71因其在過去的十年中在亞太 平洋地區(qū)的大規(guī)模爆發(fā)以及其引起嚴重的神經(jīng)并發(fā)癥且有時引起死亡的能力而受到公眾 最多關(guān)注。
[0005] 在臨床表現(xiàn)中EV71顯示出很大的變異。由于這種在臨床表現(xiàn)中的很大的變異以 及與EV71及其更大神經(jīng)毒力的潛力相關(guān)的日益增加的公共衛(wèi)生關(guān)注，能夠在HFMD爆發(fā)期 間快速識別EV71的特異性毒株以及能夠快速區(qū)分EV71和CA16 (另一種造成HFMD大爆發(fā)的 主要因素）是重要的。因為對于與EV71或CA16的不同毒株的感染相關(guān)的HFMD而言，早期 癥狀相似，所以常規(guī)的EV71診斷的"金標準"方法是通過使用體外微量中和試驗的組織培 養(yǎng)分離和血清分型。這不僅費時，而且靈敏性和特異性較小（J. L. 1996)。此外，中和試驗涉 及使用單特異抗血清，其可用性相當有限。此外，由于聚集，不可中和的病毒常常阻礙抗原 分型。通常還使用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)。重組蛋白捕獲ELISA(Shih，Li et al. 2000) 和IgM捕獲ELISA (Wang, Lin et al. 2004)(兩者都可以作為商業(yè)診斷試劑盒買到）由于缺 乏對于EV71的特異性而具有局限性（Hovi and Roivainenl993)，常常導致假陽性結(jié)果。
[0006] 市場上也有兩種診斷檢測試劑盒,一種基于實時RT-PCR，而另一種基于病人血清 中的抗EV71IgM檢測。這兩種方法都有嚴重缺點。例如，實時PCR需要良好維護的實驗室 和昂貴的設(shè)備，同時血清抗體的檢測僅可能發(fā)生在感染后的幾周，由于EV71的嚴重疾病具 有快速發(fā)病和發(fā)展的特點，這是一個缺點。
[0007] 靜脈內(nèi)免疫球蛋白（IVIG)是另一種已在病毒感染和炎性疾病的治療中通常使用 的方法，顯示出病毒的有效革除和修飾（Dwyerl992)。因此，在EV71治療中有潛在的IVIG 應用。然而，在本領(lǐng)域中沒有可用的能夠中和EV71感染的中和性單克隆抗體。
[0008] 由于迄今為止，對嗜神經(jīng)病毒EV71仍然缺乏有效的抗病毒療法或疫苗，因此迫切 需要開發(fā)EV71的有效療法和早期特異性診斷方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明致力于上述問題，特別是，提供了至少一種新的單克隆抗體，所述單克隆抗 體對至少一種EV71和/或EV71相關(guān)疾病具有特異性。所述單克隆抗體可以是中和性的。
[0011] 根據(jù)第一個方面，本發(fā)明提供了至少一種免疫球蛋白Μ亞類的分離的中和性單克 隆抗體或其片段，所述分離的中和性單克隆抗體或其片段能夠特異性地結(jié)合EV71的至少 一個表位。特別是，所述抗體可以選自：
[0012] (a)由雜交瘤細胞系CBA20110005或CBA20110007產(chǎn)生的抗體；
[0013] (b)具有由雜交瘤細胞系CBA20110005或CBA20110007產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特性的 抗體；和
[0014] (c)與能夠結(jié)合由雜交瘤細胞系CBA20110005或CBA20110007產(chǎn)生的抗體的抗原 結(jié)合的抗體。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的任一方面的表位可以包含氨基酸序列KQEKD(SEQ ID NO: 1)，由氨基 酸序列KQEKD(SEQ ID N0:1)組成，或者主要由氨基酸序列KQEKD(SEQ ID N0:1)組成，和/ 或可以是構(gòu)象表位。
[0016] 根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了至少一種分離的單克隆抗體或其片段，所述分離 的單克隆抗體或其片段能夠特異性地結(jié)合EV71的至少一個表位。特別是，所述抗體可以選 自：
[0017] (a)由雜交瘤細胞系CBA20110004或CBA20110006產(chǎn)生的抗體；
[0018] (b)具有由雜交瘤細胞系CBA20110004或CBA20110006產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特性的 抗體；和
[0019] (c)與能夠結(jié)合由雜交瘤細胞系CBA20110004或CBA20110006產(chǎn)生的抗體的抗原 結(jié)合的抗體。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的任一方面的表位可以包含氨基酸序列KQEKD (SEQ ID NO: 1)或Mab4 特異性結(jié)合的表位，由氨基酸序列KQEKD(SEQ ID N0:1)或Mab4特異性結(jié)合的表位組成，或 者主要由氨基酸序列KQEKD(SEQ ID N0:1)或Mab4特異性結(jié)合的表位組成。
[0021] 根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了至少一種分離的雜交瘤細胞系，其于2011年7 月27日由澳大利亞細胞庫（214Hawkesbury Road，Westmead NSW2145)保藏，保藏編號為 CBA20110004、CBA20110005、CBA20110006 或 CBA20110007。
[0022] 根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了檢測和/或定量EV71的存在的方法、治療和/或 預防EV71和/或至少一種EV71相關(guān)疾病的方法、用作醫(yī)藥的本發(fā)明的抗體或其片段、本發(fā) 明的抗體或其片段用于制備藥物的用途、試劑盒、核酸及其應用。
[0023] 由下列描述顯而易見的是，本發(fā)明的優(yōu)選實施方式允許最佳使用所述分離的抗體 來利用其對EV71的至少一個表位的準確性和特異性。從以下描述可以看出，這種優(yōu)點和其 他相關(guān)優(yōu)點對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是明顯的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1是在表征過程中由Mab51和Mab53的蛋白質(zhì)印跡雜交得到的結(jié)果的照片。泳 道1 :橫紋肌肉瘤RD細胞全細胞溶胞產(chǎn)物。泳道2 :濃縮的C4(Yamagata)病毒。泳道3 : GST-標記的VP1重組蛋白（?61kDa)。泳道4 :GST-標記的VP2重組蛋白（?56kDa)。泳 道5 :GST-標記的VP3重組蛋白（?50kDa)。
[0025] 圖2是在表位作圖過程中由Mab51和Mab53的蛋白質(zhì)印跡雜交得到的結(jié)果的 照片。泳道1 :GST-KQEK融合蛋白（?25kDa)，泳道2 :GST-HKQEKD融合蛋白，泳道3 : GST-HKQEK融合蛋白，泳道4 :GST-KQEKD融合蛋白，泳道5 :GST融合蛋白。
[0026] 圖3A、3B和3C是由Mab4表位作圖的蛋白質(zhì)印跡雜交得到的結(jié)果的照片。圖 3A :泳道 1 :VP1(1-66)GST 重組蛋白蛋白質(zhì)，泳道 2 :VP1(1-132)，泳道 3 :VP1(1-163)， 泳道 4 :VP1 (1-177)，泳道 5 :VP1 (1-208)，泳道 6: (1-222)，泳道 7 :VP1 (1-240)，泳道 8 :VP1 (1-260);圖 3B :泳道 1 :GST 蛋白（陰性對照），泳道 2 :A48 (48-297)，泳道 3 : A32 (32-297)，泳道 4 :A24 (24-297)，泳道 5 :A10 (10-297)。圖 3C :泳道 1 :GST 蛋白（陰 性對照），泳道 2 :A12 (12-297)，泳道 3 :A14 (14-297)，泳道 4 :A16 (16-297)，泳道 5 : A18 (18-297)，泳道 6 :A18 (20-297)，泳道 7 :A22 (22-297)和泳道 8 :A10 (10-297,陽性對 照）。
[0027] 圖4是由蛋白質(zhì)印跡雜交得到的結(jié)果的照片，顯示Mab51和Mab53與EV71亞基 因型的交叉反應性。泳道1 :A (BrCr)，泳道2 :B2 (7423/MS/87)，泳道3 :B4 (HFM41)，泳道4 : B5 (NUH0083)，泳道 5 :C1 (Y90-3761)，泳道 6 :C4 (75-Yamagata)，泳道 7 :C5 (3437/SIN/06)， 泳道 8 :RG-C2 (AF286504)。
[0028] 圖5是由CA16(在芬蘭分離的，1994, U05876)感染的Vero細胞與Mab抗3D、 Mab51、Mab53、Mab57和Mab4的免疫熒光測定（IFA)得到的結(jié)果的照片。A-E:明視野和熒 光顯微術(shù)的合并圖像。F-J:熒光顯微術(shù)。
[0029] 圖6是由Mab51的IFA得到的結(jié)果的照片，顯示與EV71亞基因型的交叉反應性。 如在每個圖像的左上角所描繪的，Vero細胞被EV71病毒毒株感染。
[0030] 圖7是由Mab53的IFA得到的結(jié)果的照片，顯示與EV71亞基因型的交叉反應性。 如在每個圖像的左上角所描繪的，Vero細胞被EV71病毒毒株感染。
[0031] 圖8是Mab4的IFA得到的結(jié)果的照片，顯示與EV71亞基因型的交叉反應性。如 在每個圖像的左上角所描繪的，Vero細胞被EV71病毒毒株感染Vero細胞。
[0032] 圖9是Mab57的IFA得到的結(jié)果的照片，顯示與EV71亞基因型的交叉反應性。如 在每個圖像的左上角所描繪的，Vero細胞被EV71病毒毒株感染。
[0033] 圖10A是對照小鼠（AG129 ;用EV71感染激發(fā)）脊髓的剖視圖，箭頭指示神經(jīng)纖維 網(wǎng)空泡形成和神經(jīng)元損傷（neuronal loss),前角中沒有炎癥（原始放大倍率ΙΟΟχ)。
[0034] 圖10B是圖10A的高倍視圖，顯示神經(jīng)纖維網(wǎng)空泡形成和神經(jīng)元損傷，沒有炎癥 (原始放大倍率400x)。
[0035] 圖11A是受保護小鼠（AG129 ;用EV71感染激發(fā)和用Mab51預防性保護）脊髓的 剖視圖，顯示無顯著病狀（原始放大倍率40x)。
[0036] 圖11B是脊髓的剖視圖，顯示無顯著病狀（原始放大倍率ΙΟΟχ).
[0037] 圖11C是圖11A的高倍視圖，顯示無顯著病狀（原始放大倍率400x)。

【具體實施方式】
[0038] 為了方便，在本說明書中提到的參考文獻以文獻列表的形式列出并加在實施例的 結(jié)尾。這些參考文獻的全部內(nèi)容在此通過引用的方式并入。
[0039] 定義
[0040] 為了方便，在本說明書、實施例和所附權(quán)利要求書中使用的某些術(shù)語集中于此。
[0041] 在此使用的術(shù)語"抗體"指的是與特異性表位結(jié)合的任何免疫球蛋白或完整分子 以及其片段。這些抗體包括，但不限于，多克隆抗體，單克隆抗體，嵌合抗體，人源化抗體，單 鏈抗體，整個抗體的Fab、Fab'、F(ab)'片段和/或F(v)部分。術(shù)語"單克隆抗體"可被稱 為"Mab"。例如，抗體"單克隆抗體51"可以與"Mab51"可互換使用，并且其能夠特異性地 結(jié)合包括但不限于SEQ ID NO: 1的表位的EV71。所述抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、 單鏈抗體及其保持母源抗體的抗原結(jié)合功能的片段。同樣地，抗體"Mab57"能夠特異性地 結(jié)合包括但不限于含有EV71的至少一種衣殼蛋白的構(gòu)象表位的EV71，并且所述抗體包括 單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體及其保持母源抗體的抗原結(jié)合功能的片段。同樣，抗體 "Mab53"能夠特異性地結(jié)合包括但不限于SEQ ID NO: 1的至少一個表位的EV71，并且所述 抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體及其保持母源抗體的抗原結(jié)合功能的片段?？?體"Mab4"能夠特異性地結(jié)合包括但不限于至少一個表位的EV71，并且包括單克隆抗體、多 克隆抗體、單鏈抗體及其保持母源抗體的抗原結(jié)合功能的片段。
[0042] 在此所用的術(shù)語"抗體片段"指的是抗體全序列的保持母源抗體的抗原結(jié)合功能 的不完全的或分離的部分?？贵w片段的實例包括：Fab、Fab'、F(ab'）2和Fv片段；雙特異 抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。本發(fā)明包括Mab51、 Mab57、Mab53和Mab4的片段，只要它們保持全長抗體的所需親和力即可。特別是，其可以短 至少一個氨基酸。例如，Mab51的片段包含使其能夠結(jié)合EV71的衣殼蛋白的SEQ ID N0:1 的表位的抗原結(jié)合功能，Mab57的片段包含使其能夠結(jié)合EV71的衣殼蛋白的構(gòu)象表位的抗 原結(jié)合功能，Mab53的片段包含使其能夠結(jié)合EV71的衣殼蛋白的SEQ ID N0:1的表位的抗 原結(jié)合功能，以及Mab4的片段包含使其能夠結(jié)合EV71中的特異性表位的抗原結(jié)合功能。 [0043] 在此所用的術(shù)語〃抗原〃指的是促使抗體產(chǎn)生并能引起免疫反應的物質(zhì)。其在本 發(fā)明中可以與術(shù)語"免疫原"可互換使用。在嚴格意義上，免疫原是從免疫系統(tǒng)中誘出應答 的那些物質(zhì)，而抗原被定義為與特異性抗體結(jié)合的物質(zhì)?？乖蚱淦慰梢允呛吞囟贵w 接觸的分子（即，表位）。當使用蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的片段來使宿主動物免疫時，蛋白質(zhì)的許 多區(qū)域可以誘發(fā)抗體的生成（即，誘出免疫應答），所述抗體特異性地結(jié)合抗原（該蛋白質(zhì) 上的特定區(qū)域或三維結(jié)構(gòu)）。抗原可以包括，但不限于，EV71的衣殼蛋白和/或非結(jié)構(gòu)蛋 白。特別是，術(shù)語"表位"指的是形成抗體結(jié)合位點的約5個至約13個氨基酸的連續(xù)序列。 以與Mab或結(jié)合蛋白結(jié)合的形式的表位可為基本上缺乏三級結(jié)構(gòu)的變性蛋白質(zhì)。所述表位 可以是構(gòu)象表位。"構(gòu)象表位"在此被定義為組成與免疫系統(tǒng)的受體直接接觸的抗原的亞單 位（通常，氨基酸）的序列。每當受體與未經(jīng)消化的抗原相互作用的時候，如果蛋白質(zhì)是未 卷繞的，則接觸的表面氨基酸會是彼此不連續(xù)的。這些在三維構(gòu)象中集合在一起并與受體 的互補位相互作用的不連續(xù)的氨基酸被稱為構(gòu)象表位。相反，如果抗原被消化，則形成稱作 肽的小段，其與主要組織相容性復合物分子結(jié)合而后隨后通過連成線的氨基酸與T細胞受 體結(jié)合。這些被認為是線性表位。線性表位的非限定性實例是SEQ ID N0:1和/或Mab4 結(jié)合的表位。
[0044] 術(shù)語〃包含〃在此被定義為當在實踐本發(fā)明中可以結(jié)合地利用各種組分、成分或 步驟時的情況。因此，術(shù)語〃包含〃涵蓋更加限制性的術(shù)語〃主要由...組成〃和〃由...組 成"。
[0045] 如在此使用的，術(shù)語〃衍生〃指的是至少一種EV71表位的化學修飾。多核苷酸序 列的化學修飾可以包括，例如，用烷基、?；虬被〈鷼?。衍生多核苷酸編碼保持天然分 子的至少一種生物學功能或免疫功能的多肽。衍生多肽是通過糖基化、聚乙二醇化或任何 類似方法修飾的多肽，所述修飾的多肽保持衍生該修飾的多肽的多肽的至少一種生物學功 能或免疫功能。
[0046] 在此使用的術(shù)語〃人源化抗體〃指的是至少一種抗體分子，在該抗體分子中，在非 抗原結(jié)合區(qū)中的氨基酸序列被改變成使得所述抗體更加類似于人類抗體，并且仍然保持其 原有的結(jié)合能力。
[0047] 在此使用的術(shù)語〃雜交瘤〃指的是已被工程化來大量產(chǎn)生所需抗體的細胞。例如， 為了產(chǎn)生至少一種雜交瘤，從已用有關(guān)抗原激發(fā)的動物的脾中取出B細胞并使其與至少一 種無限增殖化細胞融合。通過使細胞膜更容易透過進行這種融合。融合的雜交細胞（稱作 雜交瘤）將快速地且無限地繁殖，并且將產(chǎn)生至少一種抗體。雜交瘤的實例是保藏編號為 CBA20110004、CBA20110005、CBA20110006 或 CBA20110007 的細胞系。
[0048] 在此所用的"無限增殖化細胞"也被稱為轉(zhuǎn)化細胞-即，生長性質(zhì)已被改變的細 胞。這并不必然意味著這些細胞是〃癌〃細胞或〃腫瘤〃細胞(即，如果被引入到實驗動物 中則能夠形成腫瘤)，盡管在一些情況下它們可以做到。無限增殖化細胞系包括，但不限于， NS1，Jurkat，HeLa，Η印G2, SP2/0, Η印-3b 等。
[0049] 術(shù)語Mab或相關(guān)結(jié)合蛋白的〃免疫結(jié)合特性"，在全部其語法形式中，指的是Mab 或結(jié)合蛋白對其抗原的特異性、親和力和交叉反應性。
[0050] 術(shù)語〃分離的〃在此被定義為這樣的生物組分（如核酸、肽或蛋白質(zhì)），該生物組 分已基本上與在天然產(chǎn)生該組分的生物體的細胞中的其他生物組分（即，其他的染色體的 和染色體外的DNA和RNA以及蛋白質(zhì)）分離生產(chǎn)出來或純化出來。已由此分離的核酸、肽 或蛋白質(zhì)包括通過標準純化方法純化的核酸和蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包含通過在宿主細胞中的 重組體表達制備的核酸、肽和蛋白質(zhì)以及以化學方法合成的核酸。
[0051] 術(shù)語"中和性抗體"在此被定義為能夠中和病原體在宿主中發(fā)起感染和/或使感 染永久延續(xù)的能力的抗體。本發(fā)明提供了 一種中和性的人單克隆抗體，其中，所述抗體識別 來自EV71的抗原。
[0052] 在此所用的術(shù)語〃樣本〃以其最廣泛的意義被使用。被懷疑含有編碼至少一種 EV71衍生的肽或其片段的核酸或者EV71自身的生物樣本可以包括體液、細胞提取物、染色 體、細胞器或從細胞分離的膜、細胞；基因組DNA、RNA或cDNA(在溶液中或被結(jié)合到固體載 體）、組織、組織印跡（tissue print)等。
[0053] 在此使用的術(shù)語〃特異性結(jié)合（specific binding) 〃或〃特異性地結(jié)合 (specifically binding) 〃指的是在蛋白質(zhì)或肽與激動劑、抗體或拮抗劑之間的相互作用。 特別是，所述的結(jié)合在抗原與抗體之間。所述的相互作用取決于是否存在通過結(jié)合分子 (即，抗原或表位）識別的蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)。例如，如果抗體對表位"A"具有特異性，則 在含有游離的標記的A和抗體的反應中，含有表位A的多肽的存在或者游離的未標記的A 的存在將減少與抗體結(jié)合的標記的A的數(shù)量。例如，Mab51和Mab53可以特異性地結(jié)合SEQ ID NO: 1的線性表位，Mab57可以特異性地結(jié)合衣殼上的構(gòu)象表位，以及Mab4可以特異性地 結(jié)合線性表位。
[0054] 術(shù)語〃對象〃在此被定義為脊椎動物，特別是哺乳動物，更特別是人。出于研究目 的，所述對象可以特別是至少一種動物模型，例如，小鼠、大鼠等。
[0055] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以根據(jù)本發(fā)明中給出的方法在沒有付出過多實驗的情 況下實現(xiàn)本發(fā)明。方法、技術(shù)和化學試劑與在給出的參考文獻中或者來自標準生物技術(shù)和 分子生物學教科書中的描述相同。
[0056] 根據(jù)第一個方面，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體和特異性地結(jié)合EV71的相關(guān) 結(jié)合蛋白，其。單克隆抗體還被稱為"Mabs"，可以是可由單一抗體產(chǎn)生細胞誘導出來的基本 上同種的抗體種群。因此，在該種群中的全部抗體可以是相同的并且可以具有針對特定表 位的相同特異性。Mab應答的特異性為有效的診斷劑提供了基礎(chǔ)。單克隆抗體和由其衍生 的結(jié)合蛋白還具有作為治療劑的效用。
[0057] 根據(jù)本申請的任一方面的抗體提供了至少一種抗EV71抗體，所述抗體能夠中和 EV71感染和抑制細胞間播散。這些根據(jù)本申請的任一方面的抗體可被用作用于治療EV71 和EV71相關(guān)疾病的預防劑和/或治療劑。
[0058] 特別是，免疫球蛋白Μ亞類的分離的單克隆抗體或其片段可以是能夠特異性地結(jié) 合EV71的至少一個表位的中和性單克隆抗體或其片段。所述表位可以是SEQ ID NO: 1的 線性表位，或者可以是構(gòu)象表位。所述構(gòu)象表位可以是完整病毒衣殼。更特別地，所述衣殼 蛋白可以是VP 1、VP2VP3、VP4和/或VP0前體。
[0059] 根據(jù)一個實施方式，所述抗體可以基本上具有單克隆抗體Mab51的免疫結(jié)合特 性。特別是，所述抗體可以選自：
[0060] (a)由雜交瘤細胞系CBA20110005產(chǎn)生的抗體；
[0061] (b)具有由雜交瘤細胞系CBA20110005產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特性的抗體；和
[0062] (c)與能夠結(jié)合由雜交瘤細胞系CBA20110005產(chǎn)生的抗體的抗原結(jié)合的抗體。
[0063] 根據(jù)另一個實施方式，所述抗體可以基本上具有單克隆抗體Mab57的免疫結(jié)合特 性。特別是，所述抗體可以選自：
[0064] (a)由雜交瘤細胞系CBA20110007產(chǎn)生的抗體；
[0065] (b)具有由雜交瘤細胞系CBA20110007產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特性的抗體；和
[0066] (c)與能夠結(jié)合由雜交瘤細胞系CBA20110007產(chǎn)生的抗體的抗原結(jié)合的抗體。
[0067] 這些抗體可以能夠阻斷病毒在宿主體內(nèi)傳播的機理。它們有效地中和無細胞的病 毒顆粒并抑制病毒的直接的細胞間播散。因為抗體特異性地結(jié)合對病毒存活是必要的EV71 的高度保守的表位（例如VP1的SEQ ID NO: 1和完整病毒衣殼的構(gòu)象表位），所以耐藥性的 發(fā)展是最不太可能的。本發(fā)明的這些抗體提供了多種優(yōu)點，包括能夠用作HFMD的藥物或疫 苗。
[0068] 特別是，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的抗體可以在雜交瘤上清液或腹水流體中大量得 至IJ、制備。使用根據(jù)本發(fā)明的任一方面的任一種雜交瘤細胞系，還可以得到單克隆抗體的恒 定且可再生的來源。所定義的根據(jù)本發(fā)明的任一方面的抗體的表位還使得其病毒中和能力 的機理研究容易進行。使用本領(lǐng)域中已知的任何方法，還可以容易地通過親合色譜法純化 這些抗體，例如，但不限于，可以使用在Li，Mao et al.，2009中公開的方案純化根據(jù)本發(fā)明 任一方面的抗體。
[0069] 在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的中和性抗體可以導致完全防止遭受 EV71的細胞病變效應（CPE)。這些抗體可以能夠有效地在體內(nèi)保護免受EV71感染。這些 抗體的效能和特異性示于實施例中。
[0070] 在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的中和性抗體結(jié)合SEQ ID NO: 1的EV71的VP1的 表位。所述表位的該區(qū)可以是高度保守的而因此很少出現(xiàn)突變。
[0071] 在另一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的中和性抗體結(jié)合EV71的至少一個構(gòu)象表位。 這是有利的，原因在于表位通常天然以三維構(gòu)象形式存在，并且所述抗體可以因此更高效 和有效地檢測EV71的存在和/或隨后中和EV71的作用。這些抗體可以因此能夠結(jié)合和及 識別病毒抗原，而無需進行在前的組織切片處理。所述構(gòu)象表位可以包含至少一種衣殼蛋 白和/或至少一種非結(jié)構(gòu)蛋白。所述衣殼蛋白可以是完整病毒衣殼蛋白。所述衣殼蛋白可 以包括選自VP1、VP2VP3、VP4和VP0前體中的一種或多種蛋白質(zhì)。
[0072] 特別是，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的抗體可以包含單克隆抗體Mab51或Mab57的免 疫結(jié)合特性。Mab51的這些免疫結(jié)合特性是由雜交瘤Mab51產(chǎn)生的，雜交瘤Mab51根據(jù)布達 佩斯條約的規(guī)定于2011年7月27日由澳大利亞細胞庫（214Hawkesbury Road, Westmead NSW2145,澳大利亞）保藏，分配的保藏編號為CBA20110005。Mab57的這些免疫結(jié)合特性是 由雜交瘤Mab57產(chǎn)生的，雜交瘤Mab57根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定于2011年7月27日由澳 大利亞細胞庫（214Hawkesbury Road, Westmead NSW2145,澳大利亞）保藏，分配的保藏編號 為CBA20110007。所述雜交瘤提供了本發(fā)明的mAbs和結(jié)合蛋白的連續(xù)來源。
[0073] 根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了一種分離的單克隆抗體或其片段，所述分離的單 克隆抗體或其片段可以能夠特異性地結(jié)合至少一個線性表位。特別是，所述表位可以為SEQ ID NO: 1或Mab4特異性地結(jié)合的表位或其片段。根據(jù)本發(fā)明的任一方面的抗體可以能夠識 別整個EV71病毒譜并且同時和/或可以能夠區(qū)分EV71感染和CA16感染。這些抗體可以 是高特異性和靈敏性的。
[0074] 特別是，根據(jù)本發(fā)明的一個方面的抗體可以包含單克隆抗體Mab53或Mab4的免疫 結(jié)合特性。Mab53的這些免疫結(jié)合特性是由雜交瘤Mab53產(chǎn)生的，雜交瘤Mab53根據(jù)布達 佩斯條約的規(guī)定于2011年7月27日由澳大利亞細胞庫（214Hawkesbury Road, Westmead NSW2145,澳大利亞）保藏，分配的保藏編號為CBA20110006。所述雜交瘤提供了本發(fā)明的 Mab53和結(jié)合蛋白的連續(xù)來源。Mab4的這些免疫結(jié)合特性是由雜交瘤Mab4產(chǎn)生的，雜交 瘤Mab4根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定于2011年7月27日由澳大利亞細胞庫（214Hawkesbury Road, Westmead NSW2145,澳大利亞）保藏，分配的保藏編號為CBA20110004。所述雜交瘤提 供了本發(fā)明的Mab4和結(jié)合蛋白的連續(xù)來源。
[0075] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面的抗體可以選自：
[0076] (a)由雜交瘤細胞系CBA20110006或CBA20110004產(chǎn)生的抗體；
[0077] (b)具有由雜交瘤細胞系CBA20110006或CBA20110004產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特性的 抗體；和
[0078] (c)與能夠結(jié)合由雜交瘤細胞系CBA20110006或CBA20110004產(chǎn)生的抗體的抗原 結(jié)合的抗體。
[0079] 根據(jù)本發(fā)明的任一方面的抗體可以能夠識別任何基因型的EV71。特別是，所述抗 體可以能夠識別選自A、Bl、B2、B3、B4、B5、Cl、C2、C3、C4和C5中的基因型的EV71。
[0080] 本發(fā)明的Mabs可以由任何通過培養(yǎng)連續(xù)細胞系生產(chǎn)抗體分子的技術(shù)生產(chǎn)。這 些方法包括，但不限于，Kohler和Milstein在1975年最初開發(fā)的雜交瘤技術(shù)，以及三源 雜交瘤技術(shù)、人B細胞雜交瘤技術(shù)和用于生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)（Cole等 人，1985)?？梢允褂萌丝贵w并且可以通過人雜交瘤得到人抗體（Cote等人，1983)。
[0081] 可以使用為通過將適當抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與適當生物學活性的 人抗體分子的基因剪接在一起生產(chǎn)〃嵌合抗體〃而開發(fā)的技術(shù)（Morrison, et al.，1984在 此通過引用的方式全部并入本文中）。例如，可以將小鼠抗體分子（如Mab51、Mab57、Mab53 或Mab4)的基因與適當生物學活性的人抗體分子的基因剪接在一起。嵌合抗體是一種分 子，其中，不同的部分是由不同的動物種類得到的，例如，具有從鼠科Mab得到的可變區(qū)和 人免疫球蛋白恒定區(qū)的那些嵌合抗體。嵌合抗體還是含有人Fc部分和鼠科（或其他非人） Fv部分的那些嵌合抗體。
[0082] 為了生產(chǎn)人源化抗體，已經(jīng)開發(fā)了一些技術(shù)（例如，US5, 585, 089和/或 US5, 225, 539,在此將其通過引用的方式全部并入本文中）。免疫球蛋白輕或重鏈可變區(qū)由 被三個高變區(qū)（稱為互補性決定區(qū)（CDR))中斷的"框架"區(qū)組成。簡言之，人源化抗體是 來自非人動物物種的抗體分子，其具有來自非人動物物種的一個或多個CDR和來自人免疫 球蛋白分子的框架區(qū)。嵌合抗體和人源化抗體兩者都可以是單克隆的。對于在人類疾病或 病癥的體內(nèi)診斷和治療中的用途，這些人或人源化嵌合抗體是優(yōu)選地。
[0083] 包含抗體分子的個體基因型的抗體片段可以通過已知技術(shù)產(chǎn)生。例如，該抗體片 段可以通過抗體分子的胃蛋白酶消化而產(chǎn)生；Fab片段可以通過還原F(ab) 2片段的二硫鍵 而產(chǎn)生，以及可以通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子而產(chǎn)生的Fab片段。該抗體片 段可以由任一本發(fā)明的多克隆或單克隆抗體中的任一種產(chǎn)生。
[0084] 在抗體生產(chǎn)過程中，可以通過本領(lǐng)域中已知的技術(shù)實現(xiàn)對所需的抗體的篩選。例 如，這些技術(shù)可以包括，但不限于，放射免疫測定、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)、〃夾心〃免 疫測定、免疫放射測定、凝膠擴散沉淀素反應，免疫擴散測定、原位免疫測定（使用膠態(tài)金、 酶、放射性同位素標記等）、蛋白質(zhì)印跡、沉淀反應、凝集測定（凝膠凝集測定、血細胞凝集 測定等）、免疫熒光測定、免疫電泳測定等。例如，可以通過檢測第一抗體上的標記來檢測抗 體結(jié)合。在另一個實施例中，可以通過檢測第二抗體或其他試劑與第一抗體的結(jié)合來檢測 第一抗體。第二抗體可以被標記。
[0085] 在至少一種診斷和/或治療能力中，為了提高體內(nèi)EV71的靶向，可以用至少一種 放射性核素和/或熒光染料標記所述抗體。例如，可以使用通過正電子發(fā)射斷層攝影（PET) 檢測EV71。用放射性核素標記的抗體可以確保更好地靶向EV71以進行檢測和/或治療。 所述抗體可以進一步用至少一種用于治療EV71的藥、抗病毒藥和/或毒素標記。特別是， 所述抗體可以以高度特異性被用于將藥遞送到受感染細胞以抑制病毒感染。所述的藥可以 包括，但不限于，利巴韋林和其他有效的EV71感染抑制劑（如牛或人乳鐵蛋白等）。連接有 至少一種抗病毒藥的本發(fā)明的抗體可以增加所述藥對EV71感染的細胞的可用性，其可以 提高所述藥的功效并且還可以減少通常由抗病毒藥引起的副作用。這樣可以導致可能減少 與EV71感染相關(guān)的其他并發(fā)癥的用于EV71的新療法。
[0086] Mab51、Mab57、Mab53或Mab4可以連接有至少一種可追蹤劑并且可以潛在地用于 在體外或在體內(nèi)定量EV71感染的細胞。所述的可追蹤劑可以是任何可追蹤的生物或化學 組分。所述的可追蹤劑可以包括，但不限于，環(huán)境因子，血液標記，抗原，殺蟲劑，藥，化學品， 毒素，PCBS，PBBS，鉛，神經(jīng)毒素，血液電解液，代謝物，分析物，NA+，K+，CA+，尿素氮，肌酸酐， 生化血液標記和組分，ChE，AChE，BuChe，腫瘤標記，PSA，PAP，CA125, CEA，AFP，HCG，CA19-9， CA15-3, CA27-29, NSE，羥基丁酸鹽，乙酰乙酸鹽，抗瘧藥（如阿莫地喹、蒿甲醚、青蒿素、蒿 琥酯、阿托伐醌、辛可寧、辛可尼定、氯喹、多西環(huán)素、鹵泛群、甲氟喹、伯氨喹、乙胺嘧啶、奎 寧、奎尼丁和磺胺多辛）；抗生藥（如氨芐西林、阿奇霉素、多西環(huán)素、紅霉素、青霉素和四環(huán) 素）；抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥（如阿巴卡韋、阿德福韋、去羥肌苷、恩替卡韋、茚地那韋、拉米夫定、 奈韋拉平、瑞莫夫韋（remofovir)、利托那韋、沙奎那韋、替比夫定（telbivudine)、替諾福 韋、扎西他濱和齊多夫定）。
[0087] 根據(jù)本發(fā)明的任一方面的抗體可被用在本領(lǐng)域中已知的與檢測和定位EV71相關(guān) 的方法中。例如，這些方法可以包括，但不限于，蛋白質(zhì)印跡、ELISA、放射免疫測定、免疫熒 光測定、免疫組織化學測定等。根據(jù)本發(fā)明的任一方面的檢測和/或定量的方法可以是非 侵入的方法并且還可以用于研究EV71的幾個免疫方面。
[0088] 特別是，本發(fā)明提供了一種檢測和/或定量對象中至少一種EV71感染的細胞的存 在和分布的方法，所述方法包括：
[0089] a.使至少一種根據(jù)本發(fā)明的任一方面的抗體或其片段與從至少一個對象得到的 至少一個樣本接觸；和
[0090] b.檢測和定量所述抗體與EV71感染的細胞的結(jié)合。
[0091] 檢測步驟可以包括使所述樣本與包含或結(jié)合可檢測元素的結(jié)合蛋白接觸。特別 是，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的抗體可被固定到固體表面上。更特別地，所述結(jié)合蛋白可以包 含放射性原子，可以結(jié)合熒光分子，或者可以結(jié)合酶。
[0092] 本發(fā)明還包括用于定性和定量測定EV71的測定和測試試劑盒。根據(jù)所選方法，例 如，〃競爭〃、〃夾心〃、"DASP〃等，該試劑盒可以至少包含根據(jù)本發(fā)明的任一方面的Mab或 相關(guān)結(jié)合蛋白、用于檢測生物樣本中Mab或相關(guān)結(jié)合蛋白與EV71的免疫特異性結(jié)合的工具 以及使用說明書。所述試劑盒還可以包含陽性和陰性對照。它們可被配置用于與自動分析 器或自動免疫組織化學玻片染色儀器一起使用。
[0093] 特別是，本發(fā)明的測定試劑盒可以進一步包含可被標記或可被設(shè)置用于附著在固 體載體上（或者被附著到固體載體上）的第二抗體或結(jié)合蛋白。該抗體或結(jié)合蛋白可為， 例如，與EV71結(jié)合的抗體或結(jié)合蛋白。該第二抗體或結(jié)合蛋白可為多克隆或單克隆抗體。 [0094] 在檢測和/或中和EV71的作用中，]\&^51、]\&^57、]\&^53或1&^4是高度有效的?？?以將它們單獨和/或一起用于EV71的高效和有效的早期檢測。根據(jù)本發(fā)明的任一方面的 抗體為檢測EV71提供了方便、高特異性和靈敏性的工具。一種這樣的工具是ELISA形式。 Mab51、Mab57、Mab53或Mab4中的每一個都可被單獨或組合用作捕獲抗體。如果單獨使用， 則所選的抗體可被用作捕獲抗體，而結(jié)合有辣根過氧化物酶（HRP)的相同抗體可被用作檢 測抗體。
[0095] 其他的檢測EV71病毒的免疫方法包括，例如，斑點印跡和原位雜交。
[0096] 根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了至少一種治療和/或預防EV71和/或至少一種 EV71相關(guān)疾病的方法，所述方法包括向需要該治療和/或預防的對象施用至少一種根據(jù)本 發(fā)明的任一方面的抗體或其片段。本發(fā)明的抗體可以與靶向不同EV71表位的其他相似抗 體聯(lián)合施用。因此所述病毒會沒有機會適應該治療形式。
[0097] 根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了用于醫(yī)藥中的至少一種根據(jù)本發(fā)明的任一方面的 抗體或其片段。
[0098] 根據(jù)再一個方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的任一方面的抗體或其片段用于制備 治療EV71和/或至少一種EV71相關(guān)疾病的藥物的至少一種用途。述EV71相關(guān)疾病包括， 但不限于，無菌性腦膜炎、腦炎、腦神經(jīng)麻痹、格林-巴利綜合征、脊髓灰質(zhì)炎樣綜合征和手 足口病等。
[0099] 根據(jù)又一個方面，本發(fā)明提供了至少一種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據(jù) 本發(fā)明的任一方面的抗體和藥學上可接受的載體。
[0100] 根據(jù)本發(fā)明的任一方面的EV71mAbs作為診斷工具優(yōu)于其他當前方法。例如，所述 mAbs對EV71具有高度特異性，這在病毒學領(lǐng)域中仍然是沒有充分理解的。這種高度特異 性mAbs表現(xiàn)了在EV71診斷領(lǐng)域中的突破。根據(jù)本發(fā)明的任一方面的mAbs可以識別全部 或者基本上全部的EV71基因型。這些mAbs還提供了一種安全和方便地檢測EV71的診斷 方法。所述抗體可用于診斷以及用于制備用于治療的重組抗體，并且同樣地在抑制潛在的 EV71爆發(fā)中將是非常有用的工具。
[0101] 此外，雖然存在分型方法，但是仍然需要能夠用在診斷測定法中來快速和準確區(qū) 分EV71和CA16并且能夠用于特異性地識別EV71的毒株的試劑。根據(jù)本發(fā)明的任一方面 的mAbs可以快速和準確地識別EV71的毒株和/或區(qū)分EV71和CA16。這些試劑和方法將 允許臨床醫(yī)師提高處理大量臨床樣本的速度和精確度。這些試劑和方法還將幫助臨床醫(yī)師 進行病人管理，排除不必要的測試，提高診斷和預后的速度和精確度，幫助控制EV71感染， 以及減少不必要的抗生素的使用。根據(jù)本發(fā)明的任一方面的Mabs可以用于直接檢測水皰 或口腔拭子中的病毒顆粒。
[0102] 現(xiàn)已主要描述了本發(fā)明，通過參照下列實施例將更加容易理解本發(fā)明，下列實施 例以舉例說明的方式被提供，并不意欲限制本發(fā)明。
[0103] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以根據(jù)本發(fā)明中給出的方法在沒有付出過多實驗的情 況下實現(xiàn)本發(fā)明。方法、技術(shù)和化學試劑的描述在給出的參考文件中或者來自標準生物技 術(shù)和分子生物學教科書中。
[0104] 實施例
[0105] 在Sambrook和Russel的分子克?。簩嶒炛改希ɡ淙蹖嶒炇?，紐約（2001))中主 要描述了本領(lǐng)域中已知的標準生物學技術(shù)，在下文中不再具體描述。
[0106] 實施例1
[0107] 由完整EV71病毒制備和純化Mab51、Mab57、Mab53或Mab4。
[0108] 分泌特異性Mabs的雜交瘤由已用在0. 1ml PBS中的純化EV71-B5毒株（經(jīng)等體 積的佐劑（SEPPIC，F(xiàn)rance)乳化）肌內(nèi)免疫兩次的BALB/c小鼠得到。在將脾細胞與SP2/0 脊髓瘤細胞（購自ATCC)融合前三天給予相同劑量病毒的腹膜內(nèi)輔助注射。通過有限稀釋 克隆經(jīng)鑒定產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤，并在75cm2燒瓶中擴充。一周后，收獲雜交瘤懸浮液 并通過以400g離心10分鐘而使細胞碎片沉淀，接著收集上清液并在-20°C貯藏。用分光光 度測量測定Mab濃度（Nanodrop, DE, USA)。
[0109] 抗原捕獲ELISA
[0110] 用在1〇〇 μ 1的碳酸鹽緩沖液（73mM碳酸氫鈉和30mM碳酸鈉，pH9. 7)中的 500ng< μ g/孔的捕獲抗體涂布96孔圓底微量滴定板（Nunc, Roskilde, Demark)在4°C過夜 或者在37°C 2小時。將該板用PBST沖洗兩次，接著在用抗體或抗原各自孵育之后用PBS沖 洗兩次。在室溫下用100 μ 1封閉緩沖液（含有5%奶的PBS)封閉涂有抗體的板1小時，而 后在37°C用在PBST中稀釋的100 μ 1的含病毒樣本孵育1小時。通過在37°C用100 μ 1的 結(jié)合有辣根過氧化物酶的檢測MAb (內(nèi)部（in-house)標記；Pierce)孵育1小時來檢測病 毒結(jié)合。通過加入100 μ 1的新鮮制備的底物溶液（鄰苯二胺二氫氯化物；Sigma)介導色 原體顯影。通過加入0.1N硫酸終止反應，并在490nm記錄光密度。檢出限被確定為給出3 的信噪比的光密度值。
[0111] 實施例2
[0112] Mab51和Mab53的特征描述
[0113] 如使用同種型分型試劑盒（GE)所鑒定的，Mab51和Mab53分別屬于IgM和IgG亞 類。如圖1所示，Mab51和Mab53能夠檢測如蛋白質(zhì)印跡所示的被感染的Vero細胞中的 EV71病毒蛋白質(zhì)表達。如圖1所示，C4毒株的蔗糖梯度純化的EV71病毒顆粒的蛋白質(zhì)印 跡顯示Mab51和Mab53對VP1具有特異性。
[0114] Mab51和Mab53的表位作圖
[0115] 為了描述Mab51和Mab53表位的特征，將VP1蛋白分段成GST-標記的連續(xù)重疊 的肽段并且克隆到pGex-4T-l載體中并在大腸桿菌（E. coli)BL21細胞中表達并分別使用 Mab51和Mab53在蛋白質(zhì)印跡中進行測試。片段長度的逐漸減小導致識別出Mab51和Mab53 的線性表位，其被繪制到VP1蛋白的第215-219位氨基酸。如圖2所示，最小表位由五個氨 基酸 KQEKD(SEQ ID N0:1)組成。
[0116] Mab4的表位作圖
[0117] 為了描述Mab4表位的特征，將VP1蛋白分段成GST-標記的連續(xù)重疊的肽段并且 克隆到pGex-4T-l載體并在大腸桿菌（E. coli)BL21細胞中表達并使用Mab4在蛋白質(zhì)印跡 中進行測試。結(jié)果示于圖3中。VP1衣殼蛋白被表達為八個C-末端截短的蛋白質(zhì)。全部八 個攜帶完整N-末端序列的片段被Mab4識別。因此，Mab4的表位被定位在VP1蛋白的N-末 端區(qū)域。特別是，如圖3所示，Mab4的表位被發(fā)現(xiàn)在第1-66位氨基酸內(nèi)。接著，如在圖3A 中所示的片段A蛋白質(zhì)被表達為用A10、A24、A32和A48表示的四個N-末端截短的蛋白質(zhì)。 從圖3B中顯示的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果可以看出，Mab4僅能夠識別包含第10-297位氨基酸殘基 的A10片段。這說明Mab4的表位在第10-24位氨基酸內(nèi)。
[0118] 表達另一組N-末端截短的蛋白質(zhì)，同時對于每個連續(xù)的蛋白質(zhì)缺失2個氨基酸。 如在圖3C中所示，從印跡中可以看出，只有A12能夠被識別。這說明所述表位應當開始于 第12或13位氨基酸，這是因為A14不能被Mab4識別。因此，Mab4的推定表位應當為第 12-17位氨基酸（I⑶SVS)或第13-18位氨基酸（⑶SVSR)。然而，為了確認Mab4的表位，這 些推定表位必須表達為帶有GST標簽以用Mab4測試其免疫反應性。
[0119] 實施例3
[0120] 通過蛋白質(zhì)印跡檢測Mab51和Mab53對EV71亞基因組（subgenogroup)的特異性
[0121] 為了證實病毒顆粒中SEQ ID NO: 1表位蛋白質(zhì)的存在，來自不同的EV71亞基因組 的病毒顆粒進行蔗糖純化。ECL試劑用于顯影。用病毒感染RD細胞，并且在48小時之后當 超過90%的細胞顯示細胞病變效應時，收集上清液。通過澄清旋轉(zhuǎn)和經(jīng)由0. 2 μ m截止過濾 器的微孔過濾移除細胞碎片，接著通過在l〇〇'〇〇〇g下超旋轉(zhuǎn)3小時進行濃縮。在27'000g 下于20%至60%蔗糖梯度中離心3小時來純化病毒顆粒。檢測幾個帶并且收集在40至60% 鹿糖彎月面（sucrose meniscus)中的病毒帶。如圖4所示，進行分別使用Mab51和Mab53 作為第一抗體的蛋白質(zhì)印跡并且在病毒部分中檢測SEQ ID NO: 1蛋白質(zhì)帶。
[0122] 實施例4
[0123] 進行使用 Mab 抗 3D、Mab51、Mab53、Mab57 和 Mab4 免疫熒光測定（IFA)CA16(在芬 蘭分離的，1994, U05876)受感染的非洲綠猴腎細胞（vero)細胞。結(jié)果示于圖5中?？梢?看出，所述抗體（Mab51、Mab53、Mab57和Mab4)都沒有識別CA16的存在。
[0124] 為了確證表位的突變分析中的發(fā)現(xiàn)，用來自不同的亞基因組的野生型EV71感染 (vero)并進行IFA。在表1中提供所選的毒株。
[0125]

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的中和性單克隆抗體或其片段，所述分離的中和性單克隆抗體或其片段能 夠特異性地結(jié)合腸道病毒71型（EV71)的至少一個表位，其中，所述抗體屬于免疫球蛋白Μ 亞類。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中，所述表位為SEQ ID NO: 1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體，其中，所述抗體基本上具有單克隆抗體Mab51的免 疫結(jié)合特性。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體，其中，所述抗體選自： (a) 由雜交瘤細胞系CBA20110005產(chǎn)生的抗體； (b) 具有由雜交瘤細胞系CBA20110005產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特性的抗體；和 (c) 與能夠結(jié)合由雜交瘤細胞系CBA20110005產(chǎn)生的抗體的抗原結(jié)合的抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中，所述表位是EV71的至少一個構(gòu)象表位。
6. 根據(jù)權(quán)利要求所述的抗體，其中，所述構(gòu)象表位是完整的病毒衣殼。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗體，其中，所述衣殼蛋白是VP1、VP2VP3、VP4和/或VP0前 體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1和5至7中任一項所述的抗體，其中，所述抗體基本上具有單克隆抗 體Mab57的免疫結(jié)合特性。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1和5至8中任一項所述的抗體，其中，所述抗體選自： (a) 由雜交瘤細胞系CBA20110007產(chǎn)生的抗體； (b) 具有由雜交瘤細胞系CBA20110007產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特性的抗體；和 (c) 與能夠結(jié)合由雜交瘤細胞系CBA20110007產(chǎn)生的抗體的抗原結(jié)合的抗體。
10. -種分離的單克隆抗體或其片段，其中，所述抗體能夠特異性地結(jié)合SEQ ID NO: 1 的腸道病毒71型（EV71)的至少一個表位。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體，其中，所述抗體基本上具有單克隆抗體Mab53的免疫 結(jié)合特性。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的抗體，其中，所述抗體屬于免疫球蛋白G亞類。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10至12中任一項所述的抗體，其中，所述抗體選自： (a) 由雜交瘤細胞系CBA20110006產(chǎn)生的抗體； (b) 具有由雜交瘤細胞系CBA20110006產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特性的抗體；和 (c) 與能夠結(jié)合由雜交瘤細胞系CBA20110006產(chǎn)生的抗體的抗原結(jié)合的抗體。
14. 一種分離的單克隆抗體或其片段，所述分離的單克隆抗體或其片段能夠特異性地 結(jié)合具有序列I⑶SVS或⑶SVSR的腸道病毒71型（EV71)的至少一個表位。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的抗體，其中，所述抗體基本上具有單克隆抗體Mab4的免疫 結(jié)合特性。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的抗體，其中，所述抗體選自： (a) 由雜交瘤細胞系CBA20110004產(chǎn)生的抗體； (b) 具有由雜交瘤細胞系CBA20110004產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特性的抗體；和 (c) 與能夠結(jié)合由雜交瘤細胞系CBA20110004產(chǎn)生的抗體的抗原結(jié)合的抗體。
17. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體，其中，所述抗體是至少一種人抗體、人源 化抗體或嵌合抗體。
18. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體，其中，EV71具有選自A、B2、B4、B5、C1、C2、 C4和C5中的基因型。
19. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體，其中，所述抗體是用至少一種放射性核素 和/或熒光染料標記的。
20. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的抗體，其中，所述抗體連接有至少一種藥、抗病 毒藥和/或毒素。
21. -種分離的雜交瘤細胞系，其由美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)保藏，保藏編號 為 CBA20110004、CBA20110005、CBA20110006 和 / 或 CBA20110007。
22. -種檢測和/或定量對象中至少一種EV71感染的細胞的存在和分布的方法，所述 包括： a. 使至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項所述的抗體或其片段與從至少一個對象 得到的至少一個樣本接觸；和 b. 檢測和定量所述抗體與EV71感染的細胞的結(jié)合。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，檢測步驟包括使所述樣本與包含或結(jié)合至可 檢測元素的結(jié)合蛋白接觸。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的方法，其中，所述抗體被固定到固體表面上。
25. 根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中，所述結(jié)合蛋白包含放射性原子，被結(jié)合至 熒光分子，或者被結(jié)合至酶。
26. -種用于診斷EV71和/或至少一種EV71相關(guān)疾病的試劑盒，所述試劑盒包括至少 一種根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項所述的抗體或其片段。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的試劑盒，其中，所述EV71相關(guān)疾病是選自無菌性腦膜炎、腦 炎、腦神經(jīng)麻痹、格林-巴利綜合征、脊髓灰質(zhì)炎樣綜合征和手足口病中的至少一種疾病。
28. -種治療和/或預防EV71和/或至少一種EV71相關(guān)疾病的方法，所述方法包括向 需要其治療的對象施用至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項所述的抗體或其片段。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述EV71相關(guān)疾病是選自無菌性腦膜炎、腦 炎、腦神經(jīng)麻痹、格林-巴利綜合征、脊髓灰質(zhì)炎樣綜合征和手足口病中的至少一種疾病。
30. 根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項所述的分離的抗體，其用于醫(yī)藥中。
31. 根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項所述的分離的抗體，其用于治療和/或預防EV71和 /或至少一種EV71相關(guān)疾病中。
32. 根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項所述的分離的抗體用于制備治療和/或預防EV71 和/或至少一種EV71相關(guān)疾病的藥物的用途。
33. -種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項所述的抗體和藥學上可接 受的載體。
【文檔編號】A61P25/00GK104220090SQ201280043224
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月20日
【發(fā)明者】賈強, 林曉芳, 況慧星 申請人:淡馬錫生命科學實驗室有限公司