包含核酸的水包油乳液的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一般涉及陽離子水包油乳液，其可用于遞送核酸分子如RNA分子。所述乳液顆粒包括油核心和陽離子脂質(zhì)。所述乳液粒子的平均直徑為約80nm～約180nm，并且所述乳液的N/P比例為至少1.1∶1。
【專利說明】包含核酸的水包油乳液
[0001]相關(guān)申請
[0002]本申請要求2011年7月6日提交的美國臨時申請?zhí)?1/505，091，和2012年I月11日提交的美國臨時申請?zhí)?1/585，639的權(quán)益，各前述專利申請通過引用全文納入本文。
[0003]序列表
[0004]本申請包含通過EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并通過引用全文納入本文。所述ASCII副本創(chuàng)建于2012年7月5日，命名為PAT054719.txt，大小為32，421字節(jié)。
[0005]發(fā)明背景
[0006]核酸治療在治療從遺傳紊亂到獲得性病癥的疾病中具有前景，所述疾病如癌癥、感染性紊亂(AIDS)、心臟病、關(guān)節(jié)炎、和神經(jīng)變性疾病(如帕金森病和阿爾茨海默病)。不僅可遞送功能基因來修復(fù)遺傳缺陷或誘導(dǎo)外源基因產(chǎn)物表達，而且還可遞送核酸來抑制內(nèi)源基因表達以提供治療效果?；虮磉_的抑制可通過例如反義寡核苷酸、雙鏈RNA(如siRNAs、miRNAs)或核酶來介導(dǎo)。
[0007]此類治療的關(guān)鍵步驟是體內(nèi)遞送核酸分子到細胞中。然而，體內(nèi)遞送核酸分子，尤其是RNA分子，面臨許多技術(shù)障礙。首先，由于細胞和血清核酸酶，體內(nèi)注入的RNA的半衰期僅約70秒(參見例如Kurreck, Eur.J.Bioch.270:1628-44(2003))。已試圖通過使用化學(xué)修飾來提高注射RNA的穩(wěn)定性；然而，數(shù)個化學(xué)變化的例子導(dǎo)致細胞毒性效果增強或功能喪失或降低。在一個具體示例中，細胞不耐受RNAi雙鏈的劑量，該雙鏈中每個第二憐酸被替換為硫代憐酸酯(Harborth等，Antisense Nucleic Acid DrugRev.13(2):83-105(2003)) 0因此，需要開發(fā)能體內(nèi)遞送足量核酸分子(尤其是RNA分子)以引起治療響應(yīng)，但對宿主沒有毒性的遞送系統(tǒng)。
[0008]基于核酸的疫苗是疫苗的誘人替代方案。例如，肌肉內(nèi)(IM)免疫接種編碼抗原的質(zhì)粒DNA可誘導(dǎo)細胞和體液免疫應(yīng)答并保護抵御攻擊。DNA疫苗比使用蛋白抗原或減毒病原體的傳統(tǒng)疫苗具有一些優(yōu)勢。例如，與蛋白疫苗相比，DNA疫苗可更有效地產(chǎn)生以天然構(gòu)型正確折疊的抗原和產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答。DNA疫苗還不具有滅活或減毒病原體相關(guān)的一些安全問題。例如，滅活的病毒制劑可包含殘留的活病毒，且減毒病毒可變異并回復(fù)為致病表型。
[0009]基于核酸的疫苗的另一限制是在非人靈長類和人中通常需要大劑量的核酸以獲得有效的免疫應(yīng)答。因此，需要遞送系統(tǒng)和佐劑來提高基于核酸的疫苗的效力。已開發(fā)各種方法用于將核酸分子導(dǎo)入細胞，如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、聚戊二烯轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、微注射和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染。
[0010]陽離子脂質(zhì)已被廣泛配置為脂質(zhì)體來遞送基因到細胞中。然而，由于血清含陰離子材料，即使少量血清(~10%)也可顯著降低脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染活性。近期，開發(fā)了陽離子脂質(zhì)乳液來遞送DNA分子到細胞中。參見例如，Kim等，International Journalof Pharmaceutics, 295, 35-45(2005)。
[0011]美國專利號6，753，015和6，855，492描述了用陽離子微粒遞送核酸分子到脊椎動物對象中的方法。所述微粒包括聚合物如聚(α-羥基酸)、聚羥基丁酸、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酐等，并用陽離子表面活性劑來形成。核酸分子吸附在所述微粒的表面。
[0012]Kim 等(Pharmaceutical Research, 18 卷，54-60 頁，2001)和 Chung 等(Journalof Controlled Release, 71卷，339-350頁，2001)描述了用于提高DNA分子體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染效力的各種水包油乳液制劑。
[0013]Ott 等(Journal of Controlled Release, 79 卷，1-5 頁，2002)描述了用陽離子亞微米乳液作為DNA的遞送系統(tǒng)/佐劑的方案。所述亞微米乳液方案基于MF59，一種有效的
水包鯊烯佐劑，其被大范圍加工且已用于市售批準(zhǔn)的產(chǎn)物中(Flmkl":), I, 2- 二油酰-3-三
甲基銨-丙烷(DOTAP)用于促進質(zhì)粒DNA的胞內(nèi)遞送。
[0014]盡管基于DNA的疫苗在預(yù)防和治療疾病中保持較高的前景，有關(guān)其安全性已被廣泛關(guān)注。引入的DNA分子可能整合到所述宿主基因組中或，由于其分布到各組織中而引起不需要的持續(xù)抗原表達。此外，某些DNA病毒還用作遞送DNA分子的載劑。由于其感染性質(zhì)，該病毒可實現(xiàn)非常高的轉(zhuǎn)染率。所用病毒被遺傳修飾使得在轉(zhuǎn)染細胞中不形成功能性感染顆粒。盡管采用這些預(yù)防措施，仍不可能排除引入基因和病毒基因不受控繁殖的風(fēng)險，例如，由于潛在的重組事件。這還產(chǎn)生了 DNA通過例如重組而被插入宿主細胞基因組的完整基因中的風(fēng)險，結(jié)果是該基因可能突變并因此完全或部分失活或可產(chǎn)生錯誤信息。換言之，對細胞重要的基因產(chǎn)物的合成可能被完全抑制，或者表達已改變或不正確的基因產(chǎn)物。此外，通常難以放大臨床級病毒載體的生產(chǎn)和純化。
[0015]具體風(fēng)險在DNA整合入涉及調(diào)節(jié)細胞生長的基因時發(fā)生。在該情況中，所述宿主細胞可能退化并引起癌癥或形成腫瘤。此外，若引入細胞的DNA待表達，需要對應(yīng)的DNA載劑包含強啟動子，如病毒CMV啟動子。此類啟動子整合到所處理細胞的基因組中可引起細胞中基因表達調(diào)節(jié)的不需要的改變。使用DNA作為試劑誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(如作為疫苗)的另一風(fēng)險是在已引入外源DNA的患者中引起致病的抗DNA抗體，從而會引起不需要的免疫應(yīng)答。`
[0016]編碼抗原或其衍生物的RNA分子也可用作疫苗。RNA疫苗比DNA疫苗具有某些優(yōu)勢。首先，RNA不能整合到宿主基因組中，因此消除了惡性化的風(fēng)險。第二，由于RNA的快速降解，外源基因的表達通常壽命短，避免了抗原不受控的長期表達。第三，RNA分子僅需要被遞送到胞質(zhì)以表達編碼的抗原，而DNA分子必需穿過核膜。
[0017]然而，與基于DNA的疫苗相比，對基于RNA的疫苗的關(guān)注相對較少。RNA和寡核苷酸是親水的負電荷分子，其作為治療劑或疫苗給予時很易受核酶影響而被降解。此外，RNA和寡核苷酸不能主動的運輸?shù)郊毎?。參見，例如Vajdy, M.等Mucosal adjuvants anddelivery systemsfor protein-, DNA-and RNA-based vaccines (基于蛋白、DNA 和 RNA 的疫苗的粘膜佐劑和遞送系統(tǒng))，Immunol Cell Biol, 2004.82 (6):ρ.617-27。
[0018]Ying 等(Nature Medicine, 5 卷，823-827 頁，1999)描述了自復(fù)制 RNA 疫苗，其中遞送編碼半乳糖苷酶的裸RNA，并報道了⑶8+細胞的引發(fā)。
[0019]Montana等(Bioconjugate Chem.2007, I8, 3O2-3O8 頁)描述了用陽離子固體-脂質(zhì)納米顆粒作為RNA載體用于基因轉(zhuǎn)移。顯示固體-脂質(zhì)納米顆粒保護RNA分子抵御降解，且在微注射RNA-顆粒復(fù)合物到海膽卵后檢測到報道蛋白(熒光素)的表達。
[0020]W02010/009277公開了納米脂質(zhì)肽顆粒(NLPP)，其包括(a)兩親性肽，(b)脂質(zhì)，和(c)至少一種免疫原性物質(zhì)。在某些實施方式中，NLPP還納入正電荷“捕獲劑”如陽離子脂質(zhì)。所述捕獲劑用于錨定負電荷免疫原性物質(zhì)(如DNA分子或RNA分子)。NLPP的制備需要兩性肽，其用于溶解所述脂質(zhì)組分并形成納米顆粒。
[0021]因此，需要提供用于核酸分子的遞送系統(tǒng)。所述遞送系統(tǒng)可用于基于核酸的疫苗，尤其是基于RNA的疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0022]本發(fā)明一 般涉及陽離子水包油乳液，其中核酸分子與所述乳液顆粒復(fù)合。所述乳液可用于遞送核酸分子(例如RNA分子)至細胞。所述乳液顆粒包括油核心和陽離子脂質(zhì)。所述陽離子脂質(zhì)可與帶負電分子相互作用，從而將所述分子錨定到所述乳液顆粒。所述乳液顆粒的平均直徑為約80nm~約180nm，并且所述乳液的N/P比為至少4:1。
[0023]在一些實施方式中，所述乳液顆粒的平均直徑為約80nm~約180nm，并且所述乳液的N/P比為至少1.1: 1、至少1.5: 1、至少2: 1、至少2.5: 1、至少3:1或至少3.5:1。
[0024]本發(fā)明提供免疫原性陽離子水包油乳液，所述乳液包含乳液顆粒和與所述乳液顆粒復(fù)合的核酸分子，所述乳液顆粒含有油核心和陽離子脂質(zhì)，并且其中所述乳液顆粒的平均直徑為約80nm~約180nm，并且所述乳液的N/P為至少4:1 ;前提是所述核酸分子不編碼分泌型堿性磷酸酶，并且進一步的前提是所述核酸分子不是由質(zhì)粒A317編碼的RNA (其序列示于美國專利申請?zhí)?1/361，892的圖7A)。在一些實施方式中，本發(fā)明包括進一步前提:所述核酸分子不編碼RSV F蛋白抗原，和/或進一步前提:所述核酸分子不編碼RSV蛋白。優(yōu)選地，所述核酸分子編碼抗原，并且是RNA分子，例如自復(fù)制RNA。
[0025]所述免疫原性陽離子水包油乳液可以有緩沖(例如，采用檸檬酸鹽緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液)并且PH為約6.0~約8.0，優(yōu)選為約6.2~約6.8?？扇芜x地，所述免疫原性陽離子水包油乳液還包含無機鹽，濃度優(yōu)選為不超過30mM。替代或補充地，所述免疫原性陽離子水包油乳液在水相中還包含非離子型等張劑，例如糖、糖醇或其組合，和或聚合物,例如泊洛沙姆(poloxamer)。若存在,所述聚合物可以約0.05%~約20%(w/v)存在。在一些實施方式中，免疫原性陽離子水包油乳液是等張的。在其它實施方式中，免疫原性陽離子水包油乳液是低滲或高滲的。
[0026]在一些實施方式中，所述乳液顆粒的油核心包含選自下組的油:蓖麻油、椰子油、玉米油、棉花籽油、月見草油、魚油、荷荷色油、豬油、亞麻籽油、橄欖油、花生油、紅花油、芝麻油、大豆油、鯊烯、角鯊?fù)?、葵花油、小麥胚芽油及其組合。在特定的實施方式中，所述油核心是鯊烯。所述陽離子脂質(zhì)可選自下組:1，2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(D0TAP)、3 3-[^況州’-二甲基氨基乙基)-氨甲?；鵠膽固醇(DC膽固醇)、二甲基雙十八烷基銨(DDA)、1，2-二肉豆蘧酰-3-三甲基銨丙烷(DMTAP)、二棕櫚酰(C16:Q)三甲基銨丙烷(DPTAP)、二硬脂酰三甲基銨丙烷(DSTAP)、Ν-[1-(2、3-二油烯氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)、N，N- 二油酰-N，N- 二甲基氯化銨(DODAC)、1，2- 二油酰-sn_甘油-3-乙基磷酸膽堿(DOEPC)、1，2- 二油酰-3- 二甲基銨-丙烷(DODAP)、1，2- 二亞油氧基-3- 二甲基氨丙烷(DLinDMA)、脂質(zhì)E0001-EO118及其組合。在一個優(yōu)選實施方式中，所述陽離子脂質(zhì)是DOTAP。
[0027]所述乳液顆粒還可包含表面活性劑，例如非離子表面活性劑。優(yōu)選所述表面活性劑不是聚乙二醇(PEG)-脂質(zhì)。表面活性劑存在量可為約0.01到約2.5%(w/v)。在一些實施方式中，所述表面活性劑是司盤(SPAN) 85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、吐溫80 (聚山梨酯80)、或其組合。在一些實施方式中，所述水包油乳液含有等量的司盤85(失水山梨糖醇三油酸酯)和吐溫80 (聚山梨酯80)，例如還包含表面活性劑的顆粒各含0.5%(w/v)。
[0028]本發(fā)明還涉及用于制備免疫原性陽離子水包油乳液的方法，所述乳液包含乳液顆粒和與所述乳液顆粒復(fù)合的核酸分子，所述乳液顆粒含有油核心和陽離子脂質(zhì)，并且其中所述乳液顆粒的平均直徑為約80nm~約180nm，并且所述乳液的N/P為至少4:1 ;前提是所述核酸分子不編碼分泌型堿性磷酸酶，并且進一步的前提是所述核酸分子不是由質(zhì)粒A317編碼的RNA(其序列示于美國專利申請?zhí)?1/361，892的圖7A)。所述方法包括:提供(i)陽離子水包油乳液，其包含本文所述的含有油核心和陽離子脂質(zhì)的乳液顆粒，和(ii)包含核酸的水性溶液，以及使(i)和(ii)合并從而制得所述免疫原性陽離子水包油乳液。本發(fā)明還涉及用于在對象內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予所述對象有效量的本文所述的免疫原性陽離子水包油乳液。
[0029]附圖簡述
[0030]圖1A顯示體內(nèi)SEAP試驗的結(jié)果,所述試驗使用I μ g的RNA復(fù)制子vA306，所述復(fù)制子與CNE17以10:1的N:P比例復(fù)合。圖1B顯示用RNA復(fù)制子A317免疫之后的2wp I和2wp2時間點的BALB/c小鼠中的總I gG效價，所述A317編碼RSV F蛋白，與CNE17復(fù)合。這些數(shù)據(jù)顯示，由于粒徑增加，SEAP表達降低，并且對RSV F蛋白的免疫應(yīng)答降低。
[0031]圖2A-2C顯示RNA復(fù)合和不同緩沖組合物對粒徑的影響。圖2A顯示，RNA復(fù)合使CNE17乳液中的粒徑增加，而糖和/或低鹽(NaCl，IOmM)使粒徑減小。普流羅尼克(Pluronic) F127的添加使粒徑減小至復(fù)合前的尺寸。圖2B顯示檸檬酸鹽緩沖液對粒徑的影響。圖2C顯示聚合物對粒徑的影響。發(fā)明詳述
[0032]1.概述
[0033]本發(fā)明一般涉及陽離子水包油乳液，其中將核酸分子與所述乳液顆粒復(fù)合，所述乳液顆粒的平均直徑為約80nm~約180nm，并且所述乳液的N/P比例為至少4:1。所述乳液顆粒包括油核心和陽離子脂質(zhì)。所述陽離子脂質(zhì)可與帶負電分子相互作用，從而將所述分子錨定到所述乳液顆粒。所述乳液可用于遞送核酸分子(例如RNA分子)至細胞。
[0034]本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn):對于由RNA編碼的抗原，在向個體給予含有編碼所述抗原的RNA分子的陽離子水包油乳液時，該抗原所引起的免疫應(yīng)答受到所述乳液性質(zhì)的影響，所述乳液性質(zhì)包括所述乳液顆粒的平均直徑和與所述乳液顆粒復(fù)合的RNA的量(即，N/P比例)。經(jīng)本發(fā)明人測定，當(dāng)RNA分子與所述乳液復(fù)合時，所述乳液顆粒的平均直徑增加，而較大直徑顆粒導(dǎo)致較低的中和效價。平均粒徑為約80nm~約180nm的乳液提供良好中和效價。即使在該范圍內(nèi)，也較不優(yōu)選平均粒徑在所述范圍高端(high end)乳液,而特別優(yōu)選約IOOnm的平均粒徑。還優(yōu)選平均粒徑在約IOOnm~約130nm。本發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)，所述免疫應(yīng)答與所述乳液復(fù)合的RNA的量之間不具有直接線性關(guān)系。4:1的N/P比例使得對所編碼的抗原產(chǎn)生良好免疫應(yīng)答，但更高的N/P比例并不一定導(dǎo)致更高的中和效價。當(dāng)RNA分子與所述乳液復(fù)合時，陽離子水包油乳液顆粒的平均直徑增加?？赏ㄟ^在所述乳液中納入無機鹽來減小該影響。然而，無機鹽會抑制核酸分子與所述乳液顆粒的結(jié)合，因此，一種或多種所述無機鹽應(yīng)僅以低濃度(例如，不超過約30mM)存在。必要時，可使用親水性聚合物來減小由核酸復(fù)合所致的粒徑增加。同樣地，親水性聚合物會抑制核酸分子與所述乳液顆粒的結(jié)合，因此，一種或多種親水性聚合物應(yīng)僅以低濃度(例如，約0.05%~約20%(w/V))存在。
[0035]可向個體給予包含編碼所述抗原的RNA分子的陽離子水包油乳液，以誘導(dǎo)針對所述編碼的抗原的免疫應(yīng)答。當(dāng)所述陽離子水包油乳液用于該目的時，優(yōu)選它們是等張的。然而，由于無機鹽會抑制核酸分子與所述乳液顆粒的結(jié)合，優(yōu)選用非離子型等張劑調(diào)節(jié)張性。在優(yōu)選的實施方式中，包含RNA分子的陽離子水包油乳液用糖、糖醇或其組合調(diào)節(jié)至250m0sm/kg 水~約 320m0sm/kg。
[0036]2.定義
[0037]如本文所用，單數(shù)形式的“一個”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代物，除非內(nèi)容中另
有明確規(guī)定。
[0038]本文所用的術(shù)語“約”指某數(shù)值的+/_10%。
[0039]術(shù)語“表面活性劑”是本領(lǐng)域術(shù)語并通常指同時具有親水基團(如極性基團)和疏水基團的任何分子，親水基團在能量上傾向于被水溶劑化，而疏水基團不能被水良好溶劑化。術(shù)語“非離子表面活性劑”是本領(lǐng)域已知術(shù)語并通常指其親水基團(如極性基團)不帶靜電荷的表面活性劑分子。
[0040]術(shù)語“聚合物”指由相同或不同的個體化學(xué)部分連接在一起所組成的分子。如本文所用，術(shù)語“聚合物”指那些首尾相連而形成線性分子的個體化學(xué)部分，以及以分支(如“多臂”或“星型”)結(jié)構(gòu)形式連接在一起的個體化學(xué)部分。示例性聚合物包括，例如，泊洛沙姆。泊洛沙姆是非離子三嵌段共聚物，其具有聚氧丙烯(聚(環(huán)氧丙烷))中央疏水鏈，側(cè)連兩條聚氧乙烯(聚(環(huán)氧乙烷))親水鏈。
[0041 ] “緩沖液”指抗拒溶液pH變化的`水性溶液。
[0042]本文中所用的“核苷酸類似物”或“修飾的核苷酸”指在核苷的含氮堿基(如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)，腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G))中或其上含一種或多種化學(xué)修飾(如取代)的核苷酸。核苷酸類似物還可在核苷的糖部分(如核糖、脫氧核糖、修飾的核糖、修飾的脫氧核醣、6元糖類似物或開鏈糖類似物)、或磷酸酯中或其上含化學(xué)修飾。
[0043]如本文所述，糖“(saccharide) ”涵蓋單糖、寡糖或以直鏈或環(huán)形或其組合的形式形成糖鏈的多糖。寡糖是具有2種或更多單糖殘基的糖。糖的示例包括葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、蔗糖和海藻糖。
[0044]術(shù)語〃自復(fù)制RNA"、〃RNA復(fù)制子〃或"RNA載體〃是本領(lǐng)域術(shù)語，通常指在體內(nèi)，通常在靶細胞內(nèi)，能指導(dǎo)其自身擴增或自體復(fù)制的RNA分子。所述RNA復(fù)制子直接使用，無需將DNA引入細胞并轉(zhuǎn)運到可發(fā)生轉(zhuǎn)錄的核中。通過使用RNA載體直接遞送入宿主細胞的胞質(zhì)，可有效發(fā)生異源核酸序列的自主復(fù)制和翻譯。α病毒衍生的自復(fù)制RNA可按序列順序包含下述元件:順式復(fù)制所需的5’病毒序列(背景中還稱為5’CSE)、表達時編碼生物活性α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白(如nsPl，nsP2，nsP3，nsP4)的序列，順式復(fù)制所需的3’病毒序列(背景中還稱為3’ CSE)，和多腺苷酸化尾。α病毒衍生的自復(fù)制RNA還可含病毒亞基因組“連接區(qū)域”啟動子、來自一種或多種結(jié)構(gòu)蛋白基因或其部分的序列、大小足夠產(chǎn)生重組α病毒顆粒的外源核酸分子、以及待表達的異源序列。
[0045]術(shù)語“佐劑”指協(xié)助或改良藥物作用的任何物質(zhì)，包括但不限于免疫佐劑，其能使對抗原的免疫應(yīng)答增強和/或多樣化。因此，免疫佐劑包括能增強對抗原免疫應(yīng)答的化合物。免疫佐劑可增強體液和/或細胞免疫。刺激先天免疫應(yīng)答的物質(zhì)包括在本文免疫佐劑的定義中。免疫佐劑還可稱為“免疫增強劑”。
[0046]本文中所用的“抗原”指含一個或多個表位(例如，線性、構(gòu)象或兼有)的分子。本文中所用的“表位”是給定物質(zhì)(例如，抗原性分子或抗原性復(fù)合物)中確定其免疫學(xué)特異性的部分。表位包含在所述抗原的定義范圍內(nèi)。本文中所用的術(shù)語“抗原”包括亞基抗原，即自該抗原天然相關(guān)聯(lián)的全生物體中分離且離散的抗原。
[0047]“免疫學(xué)應(yīng)答”或“免疫應(yīng)答”是對象中發(fā)生對抗原或免疫原性佐劑的體液和/或細胞免疫應(yīng)答。
[0048]免疫應(yīng)答包括先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。先天免疫應(yīng)答是為免疫系統(tǒng)提供一線防御的快速作用應(yīng)答。相反，適應(yīng)性免疫采用選擇和克隆擴增含體細胞重排受體基因的免疫細胞(例如T-和B-細胞受體)來提供特異性和免疫記憶，所述受體基因識別給定病原或疾病(例如腫瘤)的抗原。先天免疫應(yīng)答有很多效應(yīng)，包括引起炎性細胞因子的快速突釋并活化抗原呈遞細胞(APC)如巨噬細胞和樹突細胞。為區(qū)分病原體和自身組分，先天免疫系統(tǒng)利用多種相對不變的受體檢測病原體的特征物，這些特征物稱為病原體相關(guān)分子模式或PAMP。已知實驗性疫苗中添加微生物組分導(dǎo)致發(fā)生強烈且持續(xù)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。據(jù)報道，這種免疫應(yīng)答增強的機理涉及模式識別受體(PRR)，其在包括嗜中性粒細胞、巨噬細胞、樹突細胞、自然殺傷細胞、B細胞和一些非免疫細胞如上皮和內(nèi)皮細胞在內(nèi)的多種免疫細胞上差異表達。PRR的參與導(dǎo)致這類細胞中一些被活化并分泌細胞因子和趨化因子，以及其它細胞成熟并遷移。這以串聯(lián)方式產(chǎn)生炎性環(huán)境導(dǎo)致適應(yīng)性免疫應(yīng)答的確立。PRR包括非吞噬細胞受體，如Toll樣受體(TLR)和核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域(NOD)蛋白，和誘發(fā)吞噬作用的受體如清除受體、甘露糖受體和β_葡聚糖受體。已報道的TLR(伴以一些已報道配體的示例，這些配體可在本發(fā)明的不同實施方式中用作免疫原性分子)包括如下:TLR1(來自分枝桿菌(Mycobacteria)、奈瑟菌(Neisseria)的細菌脂蛋白)，TLR2 (酵母聚糖酵母顆粒、肽聚糖、脂蛋白、脂肽、糖脂、脂多糖)，TLR3(病毒雙鏈RNA、聚IC)，TLR4(細菌脂多糖、植物產(chǎn)物紫杉醇)，TLR5 (細菌鞭毛)，TLR6 (酵母聚糖顆粒、脂磷壁質(zhì)酸、支原體的脂肽)，TLR7(單鏈RNA、咪喹莫特、雷索咪喹莫特(resimiquimod)和其它合成化合物如洛索立賓和溴匹立明)，TLR8 (單鏈RNA、雷索咪喹莫特)和TLR9 (CpG寡核苷酸)等。樹突細胞被視為在啟動初免初始CD4+輔助T (TH)細胞和誘導(dǎo)CD8+T細胞分化成殺傷細胞中最重要的細胞類型。據(jù)報道，TLR信號傳遞在確定這些輔助T細胞應(yīng)答的特性中起重要作用，例如TLR信號的特性決定所觀察到Th應(yīng)答的具體類型(例如，ThI與Th2應(yīng)答)。產(chǎn)生抗體(體液)與細胞免疫的組合作為ThI型應(yīng)答的部分，而Th2型應(yīng)答主要是抗體應(yīng)答。已記錄不同TLR配體如CpG DNA(TLR9)和咪唑喹啉(TLR7，TLR8)在體外刺激免疫細胞產(chǎn)生細胞因子。咪唑喹啉是顯示為TLR激動劑的第一種類似藥物的小化合物。進一步的信息參見例如A.Pashine, N.M.Valiante 和 J.B.Ulmer, Nature Medicine, 11, S63-S68(2005) , K.S.Rosenthal 和D.H.Zimmerman, Clinical and Vaccine Immunology, 13 (8)，821-829 (2006)及其所引文獻。
[0049]出于本發(fā)明的目的，體液免疫應(yīng)答指由抗體分子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而細胞免疫應(yīng)答是T-淋巴細胞和/或其它白細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。細胞免疫的一個重要方面涉及細胞溶解T細胞(CTL)的抗原特異性應(yīng)答。CTL有針對肽抗原的特異性，所述肽抗原與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)編碼并在細胞表面表達的蛋白關(guān)聯(lián)呈遞。CTL幫助誘導(dǎo)并促進胞內(nèi)微生物的胞內(nèi)破壞，或感染此類微生物的細胞的裂解。細胞免疫的另一方面涉及輔助T細胞的抗原特異性反應(yīng)。輔助T細胞作用于幫助刺激非特異性效應(yīng)細胞的功能并集中其活性，所述細胞針對在其表面展示MHC分子相關(guān)肽抗原的細胞。"細胞免疫應(yīng)答"也指由活化的T細胞和/或包括CD4+和CD8+T細胞衍生細胞在內(nèi)的其它白細胞產(chǎn)生細胞因子、趨化因子和其它此類分子。
[0050]因此，引起細胞免疫應(yīng)答的組合物如免疫原性組合物或疫苗可通過在細胞表面呈遞MHC分子相關(guān)抗原而使脊椎動物對象致敏。細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答針對在其表面呈遞抗原的細胞或其附近。此外，可產(chǎn)生抗原特異性T淋巴細胞用于經(jīng)免疫宿主此后的保護。特定抗原或組合物刺激細胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力可通過本領(lǐng)域已知的多種試驗確定，例如通過淋巴增殖(淋巴細胞活化)試驗、CTL細胞毒性細胞試驗，通過測定致敏對象中抗原特異性的T-淋巴細胞，或通過測量T細胞響應(yīng)抗原再刺激的細胞因子生成。這些試驗為本領(lǐng)域熟知。參見例如 Erickson 等，(1993) J.1mmunol.151:4189-4199 ；Doe 等，(1994) Eur.J.1mmunol.24:2369-2376。因此，本文所用的免疫學(xué)應(yīng)答可以是刺激CTL生成和/或輔助T細胞產(chǎn)生或激活。感興趣的抗原還可引發(fā)抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。因此，免疫學(xué)應(yīng)答可包括例如以下一種或多種效果:由例如B-細胞生產(chǎn)抗體；和/或特異性針對感興趣組合物或疫苗中的一種或多種抗原的抑制T-細胞和/或Y δ T-細胞的激活。例如，這些應(yīng)答可用以中和感染性和/或介導(dǎo)抗體-補體或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)來為經(jīng)免疫宿主提供保護。這些應(yīng)答可采用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)免疫試驗和中和試驗確定。
[0051]與不同組合物中等量抗原(如將抗原作為可溶蛋白給予)所引起的免疫應(yīng)答相t匕，本發(fā)明組合物具有的引發(fā)免疫應(yīng)答的能力更強時，該組合物對給定抗原顯示“增強的免疫原性”。因此，組合物可例如因為所述組合物產(chǎn)生更強的免疫應(yīng)答或因為在給予對象中實現(xiàn)免疫應(yīng)答所需抗原劑量更低或次數(shù)更少而顯示“增強的免疫原性”?？赏ㄟ^例如將本發(fā)明的組合物和抗原對照給予動物并比較二者的試驗結(jié)果來測定所述增強的免疫原性。
[0052]3.陽離子水包油乳液
`[0053]本文公開的陽離子水包油乳液一般以本領(lǐng)域常見方式，通過制備所述乳液所用的組分濃度來描述。本領(lǐng)域應(yīng)理解在包括滅菌和其它下游過程在內(nèi)的乳液生產(chǎn)工藝中，可能損失少量油(如鯊烯)、陽離子脂質(zhì)(如D0TAP)、或其它組分，且這些組分在最終產(chǎn)物(如待給予的包裝滅菌乳液)中的實際濃度可稍低于起始含量，有時相差最多約10%或最多約20%。
[0054]所述陽離子水包油乳液顆粒包含油核心和陽離子脂質(zhì)。所述陽離子脂質(zhì)可與所述核酸分子，例如通過靜電力和疏水性/親水性相互作用來相互作用，從而使所述核酸分子錨定至所述乳液顆粒。本文所述的陽離子乳液特別適合于體內(nèi)遞送核酸分子(例如編碼抗原的RNA分子或小干擾RNA)至細胞。例如，本文所述的陽離子乳液提供遞送編碼抗原的RNA作為疫苗的優(yōu)勢，所述RNA包括自復(fù)制RNA。
[0055]所述水包油乳液的顆?？赡茴愃凭哂杏椭醒牒诵牡哪z束。所述油核心包被有陽離子脂質(zhì)，其將所述油滴作為膠束樣液滴分散在水(連續(xù))相中。所述乳液中可存在一種或多種任選組分，如下述表面活性劑和/或磷脂。例如，一種或多種表面活性劑可用于促進顆粒形成和/或穩(wěn)定乳液顆粒。在該情況中，所述油核心包被有陽離子脂質(zhì)以及表面活性劑以形成膠束樣液滴。類似地，若一種或多種脂質(zhì)(如中性脂質(zhì)、醇脂或磷脂)用作分散油滴的乳化劑，所述脂質(zhì)也可存在于所述乳液顆粒的表面。
[0056]所述水包油乳液顆粒具有約80nm~約180nm、約80nm~150nm、約80nm~130nm或約SOnm~120nm的平均直徑(即，直徑平均數(shù))。特別優(yōu)選的平均粒徑是約lOOnm。
[0057]所述乳液顆粒的大小可通過改變表面活性劑與油的比例(提高比例則降低液滴大小)、均質(zhì)化的操作壓力(增加均質(zhì)化的操作壓力通常降低液滴大小)、溫度(升高溫度則減小液滴大小)、改變油的類型、增加通過微流化器的次數(shù)，以及其它工藝參數(shù)而變化，如本文所述。水相中包括某些類型緩沖液也可影響顆粒大小。
[0058]本文所述的乳液顆?？膳c核酸分子復(fù)合，這在本文中有更詳細的描述。一般而言，使陽離子水包油乳液與包含一種或多種核酸分子的水性溶液合并以形成包含與所述乳液顆粒復(fù)合的核酸分子的乳液。包含一種或多種所述核酸分子的水性溶液含有將導(dǎo)致N/P比例為至少4:1的復(fù)合乳液的核酸濃度，例如所述復(fù)合乳液的N/P比例為4:1~20:1或4:1~15:1。這可容易地被實現(xiàn)，因為所述乳液中的氮(N)的量可采用任何合適的方法(例如本文所述用于定量DOTAP的HPLC法)來定量。然后，可制備核酸分子的水性溶液，所述溶液包含的核酸的量足以提供達到所需N/P比例需要的磷酸酯(P)的量。
[0059]本發(fā)明的示例性陽離子乳液為CNE17。CNE17的油核心是鯊烯(4.3%w/v)且陽離子脂質(zhì)是D0TAP(1.4mg/mL)。CNE17還包括表面活性劑司盤85 ((失水山梨糖醇三油酸酯)0.5%v/v)和吐溫80 ((聚山梨酯80;聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯)0.5%v/v)。因此，CNE17的顆粒包含包被有司盤85、Tween80和DOTAP的鯊烯核心。顯示RNA分子在4:1N/P比和10:1N/P比時有效復(fù)合CNE17顆粒。本發(fā)明的另一個示例性陽離子乳液在本文中稱為“CMF32”。CMF32的油是鯊烯(4.3%w/v)且陽離子脂質(zhì)是DOTAP (3.2mg/mL)。CMF32還包括表面活性劑司盤85 ((失水山梨糖醇三油酸酯)0.5%v/v)和吐溫80((聚山梨酯80 ;聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯)0.5%v/v)。因此，CMF32的乳液顆粒包含有鯊烯、司盤85、吐溫 80 和 DOTAP。RNA 分子顯示在 N/P 比 4:1、6:1、8:1、10:1、12:1 和 14:1 下與 CMF32 顆粒有效復(fù)合。其它示例性陽離子乳液包括，例如，本文稱為“CMF34” (4.3%w/v鯊烯、0.5%吐溫80、0.5% 司盤 85 和 4.4mg/mL D0TAP)，“CMF35”(4.3%w/v 鯊烯、0.5% 吐溫 80、0.5% 司盤 85、
5.0mg/mL D0TAP)的乳液和本文描述的其它乳液。
[0060]本發(fā)明的一種特定陽離子水包油乳液含有DOTAP和鯊烯，其濃度分別為2.lmg/ml到 2.84mg/ml (優(yōu)選 2.23mg/ml 到 2.71mg/ml)和 30.92mg/ml 到 41.92mg/ml (優(yōu)選 32.82mg/ml到約40.02mg/ml)，且還含有等量的司盤85和吐溫80 (例如，各約0.5%)。本發(fā)明的另一特定陽離子水包油乳液含有DOTAP和鯊烯，其濃度分別為2.78mg/ml到3.76mg/ml (優(yōu)選
2.94mg/ml 到 3.6mg/ml)和 18.6mg/ml 到 25.16mg/ml (優(yōu)選 19.69mg/ml 到約 24.07mg/ml)，且還含有等量的司盤85和吐溫80 (例如，各約0.5%)。優(yōu)選地，這些乳液的顆粒的平均直徑為約80nm~約180nm。
[0061]本發(fā)明水包油乳液的個體組分為本領(lǐng)域已知，盡管未以本文所述的方式組合出此類組合物。因此，盡管下面針對優(yōu)選實施方式一般述及并有些許詳述，但個體組分為本領(lǐng)域熟知，且本文所用術(shù)語如油核心、表面活性劑、磷脂等為本領(lǐng)域技術(shù)人員充分熟知而不需進一步描述。此外，雖然提 供了個體乳液組分的優(yōu)選含量范圍，具體乳液組分的實際比例可能需要調(diào)節(jié)，使得可正確地形成具有所需大小和物理性質(zhì)的乳液顆粒。例如，若使用具體含量的油(如5%v/v油)，則表面活性劑的含量應(yīng)為足以將油滴分散在水相中以形成穩(wěn)定乳液的水平。將油滴分散在水相中所需的表面活性劑的實際量取決于乳液所用的表面活性劑類型和油核心類型；且油的量還可根據(jù)液滴大小而變化(因為這會改變兩相之間的表面積)。所需乳液中組分的實際含量和相對比例可由技術(shù)人員容易地確定。
[0062]A.油核心
[0063]陽離子水包油乳液的顆粒包含油核心。
[0064]所述油優(yōu)選在1°C或以上為液相，并且與水不互溶。
[0065]優(yōu)選地，所述油是可代謝、無毒的油；更優(yōu)選一種約6~約30個碳原子的，包括但不限于烷烴、烯烴、炔烴及其相應(yīng)的酸和醇、其醚和酯、及其混合物。所述油可以是可被給予所述乳液的對象身體所代謝，且對所述對象無毒的任何植物油、魚油、動物油或合成制備油。所述對象可為動物，通常是哺乳動物，并優(yōu)選人。
[0066]在某些實施方式中，所述油核心25°C時為液相。所述油核心25°C時為液相，當(dāng)保存于25°C時其表現(xiàn)出液體特性(不同于固體和氣體；且具有確定體積但沒有確定形狀)。然而所述乳液可在任何合適溫度儲存和使用。優(yōu)選所述油核心4°C時為液相。
[0067]所述油可為任何長鏈烷烴、烯烴或炔烴，或其酸或醇衍生物，無論是游離酸、其鹽或酯如單或雙或三酯，例如1，2-丙二醇或類似的多羥基醇的甘油三酯和各種酯。醇可用單或多官能酸例如乙酸 、丙酸、檸檬酸等來酰化。還可使用是油并滿足本文所述其它標(biāo)準(zhǔn)的長鏈醇衍生醚。
[0068]個體烷烴、烯烴或炔烴部分及其酸或醇衍生物通常具有約6~約30個碳原子。所述部分可具有直鏈或支鏈結(jié)構(gòu)。其可完全飽和或具有一個或多個雙鍵或三鍵。在使用單或聚酯或醚基油時，約6~約30個碳的限制適用于個體脂肪酸或脂肪醇部分，并非所有碳計數(shù)。
[0069]特別理想的是所述油可被給予所述乳液的宿主代謝。
[0070]可使用來自動物、魚或植物來源的任何合適油。植物油的來源包括堅果、種子和谷物,和合適的油,例如花生油、大豆油、椰油和橄欖油等。其它合適的種籽油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物組中還可采用玉米油和其它谷類如小麥、燕麥、裸麥、稻、畫眉草、黑小麥等的油。獲取植物油的技術(shù)已充分開發(fā)且熟知。這些和其它相似油的組合物可參見例如《默克索引》(the Merck Index),以及食品、營養(yǎng)品和食品技術(shù)的原始資料。
[0071]甘油和1，2-丙二醇的約6~約10碳脂肪酸酯盡管不是種籽油中天然產(chǎn)生的，但可以從堅果和種籽油開始，通過對合適材料進行水解、分離和酯化而制得。這些產(chǎn)品市售可得，以名稱NE0BEES出自新澤西州Boongon迪威臣街416號的PVO國際公司(PV0International, Inc.)化學(xué)專業(yè)部,及其它產(chǎn)品。
[0072]動物油和脂肪通常由于以甘油三酯存在且比來自魚或植物的油有更高的飽和度而在生理溫度下為固相。然而，脂肪酸可獲自動物脂肪，通過部分或完全甘油三酯皂化提供游離脂肪酸。來自哺乳動物乳汁的脂肪和油類是可代謝的，因此可以用于實施本發(fā)明。獲得動物來源純油所必需的分離、純化、皂化和其它方法的過程為本領(lǐng)域熟知。
[0073]大多數(shù)魚類含有容易回收的可代謝油。例如，鱈魚肝油、鯊魚肝油和諸如鯨蠟的鯨油是本文可使用的幾種魚油的示例。通過生化途徑用5-碳異戊二烯單位合成許多支鏈油，其總稱為萜類。鯊烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯)是分
支不飽和萜類，為本文所特別優(yōu)選。鯊烯的主要來源是鯊魚肝油，盡管包括莧菜種籽、米糠、小麥胚芽和橄欖油在內(nèi)的植物油(主要是植物油)也是合適的來源。鯊烯也可獲自酵母或其它合適的微生物。在一些實施方式中，鯊烯優(yōu)選獲自非動物來源，例如橄欖、橄欖油或酵母。鯊烯的飽和類似物角鯊?fù)橐彩莾?yōu)選的。包括鯊烯和鯊?fù)樵趦?nèi)的魚油易于從市售來源獲得，或可以通過本領(lǐng)域已知的方法獲得。
[0074]在某些實施方式中，所述油核心包含選自下組的油:蓖麻油、椰子油、玉米油、棉籽油、月見草油、魚油、霍霍巴油、豬油、亞麻子油、橄欖油、花生油、紅花油、芝麻油、大豆油、鯊烯、角鯊?fù)?、葵花子油、小麥胚芽油和礦物油。在示例性實施方式中，所述油核心包含大豆油、葵花籽油、橄欖油、鯊烯、角鯊?fù)榛蚱浣M合。角鯊?fù)橐部勺鳛橛褪褂谩Ｔ谑纠詫嵤┓绞街?，所述油核心包括鯊烯、角鯊?fù)榛蚱浣M合。
[0075]所述乳液的油組分可以約0.2%~約20%(v/v)的含量存在。例如，陽離子水包油乳液可包含約0.2%~約20%(v/v)油、約0.2%~約15%(v/v)油、約0.2%~約10%(v/v)油、約0.2%~約9%(v/v)油、約0.2%~約8%(v/v)油、約0.2%~約7%(v/v)油、約0.2%~約6%(v/v)油、約 0.2% ~約 5%(v/v)油、約 0.2% ~約 4.3%(v/v)油、約 0.3% ~約 20%(v/v)油、約0.4%~約20%(v/v)油、約0.5%~約20%(v/v)油、約1%~約20%(v/v)油、約2%~約 20% (v/v)油、約 3% ~約 20% (v/v)油、約 4% ~約 20% (v/v)油、約 4.3% ~約 20% (v/v)油、約 5% ~約 20%(v/v)油、約 0.5%(v/v)油、約 1%(ν/ν)油、約 1.5%(v/v)油、約 2%(v/v)油、約 2.5%(v/v)油、約 3%(v/v)油、約 3.5%(v/v)油、約 4%(v/v)油、約 4.3%(v/v)油、約 5%(v/V)油、或約10% (v/v)油。
[0076]或者，陽離子水包油乳液可包含約0.2%~約10%(w/v)油、約0.2%~約9%(w/v)油、約0.2%~約8%(w/v)油、約0.2%~約7%(w/v)油、約0.2%~約6%(w/v)油、約0.2%~約 5%(w/v)油、約 0.2% ~約 4.3%(w/v)油、或約 4.3%(w/v)油。
[0077]在一個示例性實施方式中，所`述陽離子水包油乳液包含約0.5%(v/v)油。在另一個示例性實施方式中，所述陽離子水包油乳液包含約4.3%(v/v)油。在另一個示例性實施方式中，所述陽離子水包油乳液包含約5%(v/v)油。在另一個示例性實施方式中，所述陽離子水包油乳液包含約4.3%(w/v)鯊烯。
[0078]如上所述，上述油的百分比根據(jù)制備乳液所用油的起始含量確定。本領(lǐng)域應(yīng)理解終產(chǎn)物(如待給予的包裝滅菌乳液)中油的實際濃度可稍低，有時低最多約10%或約20%。
[0079]B.陽離子脂質(zhì)
[0080]本文所述乳液顆粒包含陽離子脂質(zhì)，其可與所述帶負電分子相互作用，從而將所述分子錨定到所述乳液顆粒。
[0081]所述陽離子脂質(zhì)可在pH約12、pH約11、pH約10、pH約9、pH約8、pH約7、或pH
約6下帶正電。
[0082]可以使用任意合適的陽離子脂質(zhì)。通常，陽離子脂質(zhì)含生理條件下帶正電的氮原子。合適的陽離子脂質(zhì)包括苯扎氯銨(BAK)、氯化芐乙銨、溴棕三甲銨(其含十四烷基三甲基溴化銨和可能的少量十二烷基三甲基溴化銨和十六烷基三甲基溴化銨)、十六烷基氯化吡啶鎗(CPC)、十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)、伯胺、仲胺、叔胺，包括但不限于N，N’，N’ -聚氧乙烯(IO)-N-牛油-1，3-二氨基丙烷、其它季胺鹽包括但不限于十二烷基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、混合的烷基-三甲基-溴化銨、芐基二甲基十二烷基氯化銨、芐基二甲基十六烷基-氯化銨、芐基三甲基甲醇銨、十六烷基二甲基乙基溴化銨、二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)、甲基氯化芐乙銨、氯化十烴季銨、甲基混合的三烷基氯化銨、甲基三辛基氯化銨)、N，N- 二甲基-N-[2(2-甲基-4-(1，1，3，3四甲基丁基)-苯氧基]-乙氧基)乙基]-苯甲烷-氯化銨(DEBDA)、二烷基二甲基銨鹽、[1-(2,3-二油烯基氧基)-丙基]-N，N，N，三甲基氯化銨、1，2-二酰基-3-(三甲基銨)丙烷(?；鶊F=二肉豆蘧酰、二棕櫚酰、二硬脂酰、二油酰)、1，2_ 二酰基_3( 二甲基銨)丙烷(?；鶊F=二肉豆蘧酰、二棕櫚酰、二硬脂酰、二油酰)、1，2- 二油酰-3-(4’ -三甲基-銨)丁酰-sn-甘油、1，2- 二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油膽堿酯、(4’ -三甲基銨)丁酸膽固醇)、N-烷基吡啶鎗鹽(如溴化十TK烷基批淀鐵和氣化十TK烷基批淀鐵)、N-烷基喊盯鐵鹽、二價陽尚子bola型電解質(zhì)(C12Me6;C12BU6)、二烷基甘油基磷酸膽堿、溶血卵磷脂、L-α 二油酰磷脂酰乙醇胺、膽固醇半琥珀酸膽堿酯、脂聚胺，包括但不限于雙十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇-酰氨基精胺(DPPES)、脂聚-L (或D)-賴氨酸(LPLL、LPDL)、聚(L (或D)-賴氨酸偶聯(lián)N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、具有側(cè)接氨基基團的雙十二烷基谷氨酸酯(C12GluPhCnN+)、具有側(cè)接氨基基團的雙十四烷基谷氨酸酯(C14GluCnN+)、膽固醇陽離子衍生物，包括但不限于膽固醇基-3 β -氧琥珀酰氨基乙烯基三甲基銨鹽、膽固醇基-3 β -氧琥珀酰氨基乙烯基-二甲基銨、膽固醇基-3 β -羧基酰氨基乙烯基三甲基銨鹽、和膽固醇基-3 β -羧基酰氨基乙烯基二甲基銨和3 Y _[Ν_(Ν’，N-二甲基氨基乙基氨甲?；鵠膽固醇)(DC-膽固醇)，1，2_ 二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、二甲基雙十八烷基銨(DDA)、1，2-二肉豆蘧酰-3-三甲基銨丙烷(DMTAP)、二棕櫚酰(C16:Q)三甲基銨丙烷(DPTAP)、二硬脂酰三甲基銨丙烷(DSTAP)，及其組合。
[0083]適用于本發(fā)明的其它陽離子脂質(zhì)包括例如美國專利公開2008/0085870(2008年4月10日公開)和2008/0057080 (2008年3月6日公開)所述的陽離子脂質(zhì)。
[0084]適用于本發(fā)明的其它陽離子脂質(zhì)包括例如W02011/076807(還公開制備和使用這些陽離子脂質(zhì)的方法)的表6 (112-139頁)所述脂質(zhì)E0001-E0118或E0119-E0180。其它合適的陽離子脂質(zhì)包括N-[l-(2，3-二油烯氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)、N，N-二油酰-N，N-二甲基氯化銨(DODAC)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿(DOEPC)U, 2- 二油酰-3- 二甲基銨-丙烷(DODAP)、1，2- 二亞油氧基-3- 二甲基氨丙烷(DLinDMA)。
[0085]所述乳液可包含本文所述陽離子脂質(zhì)中兩種或更多的任意組合。
[0086]在一些實施方式中，所述陽離子脂質(zhì)包含季胺。
[0087]在優(yōu)選實施方式中，所述陽離子脂質(zhì)選自下組:1，2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(0(7^)、3@-[^況州’-二甲基氨基乙基)-氨甲?；鵠膽固醇(DC膽固醇)、二甲基雙十八烷基銨(DDA)、1，2-二肉豆蘧酰-3-三甲基銨丙烷(DMTAP)、二棕櫚酰(C16:0)三甲基銨丙烷(DPTAP)、二硬脂酰三甲基銨丙烷(DSTAP)、TO2011/076807的表6(112-139頁)中公開的脂質(zhì)E0001-EO118或EOl 19-E0180，和其組合。
[0088]在其它優(yōu)選實施方式中，所述陽離子脂質(zhì)選自下組:1，2- 二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷Φ0ΤΑΡ)、3β-[Ν-(Ν’，Ν’_ 二甲基氨基乙基)-氨甲?；鵠膽固醇(DC膽固醇)、二甲基雙十八烷基銨(DDA)、1，2-二肉豆蘧酰-3-三甲基銨丙烷(DMTAP)、二棕櫚酰(C16:0)三甲基銨丙烷(DPTAP)、二硬脂酰三甲基銨丙烷(DSTAP)、Ν-[1-(2、3-二油烯氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)、N，N- 二油酰-N，N- 二甲基氯化銨(DODAC)、1，2- 二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿(DOEPC)、I，2- 二油酰-3- 二甲基銨-丙烷(DODAP)、1，2-二亞油氧基-3-二甲基氨丙烷(DLinDMA)、W02011/076807(通過引用納入本文)的表6 (112 - 139頁)中公開的脂質(zhì)E0001-E0118或E0119-E0180及其組合。
[0089]在某些實施方式中，所述陽離子脂質(zhì)為D0TAP。所述陽離子水包油乳液可含約
0.5mg/ml~約25mg/ml的D0TAP。例如，所述陽離子水包油乳液包含的DOTAP可為約0.5mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.6mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.7mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.8mg/ml ~約25mg/ml、約 0.9mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.0mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.lmg/ml ~約 25mg/ml、約 1.2mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.3mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.4mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.5mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.6mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.7mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.5mg/ml ~約24mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 22mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 20mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 18mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 15mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 12mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 10mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 5mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 2mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.9mg/ml、約 0.5mg/ml ~約
1.8mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.7mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.6mg/ml、約 0.6mg/ml ~約 1.6mg/ml、約 0.7mg/ml ~約 1.6mg/ml、約 0.8mg/ml ~約 1.6mg/ml、約 0.8mg/ml ~約 3.0mg/ml、約0.5mg/ml、約 0.6mg/ml、約 0.7mg/ml、約 0.8mg/ml、約 0.9mg/ml、約 1.0mg/ml、約 1.lmg/ml、約 1.2mg/ml、約 1.3mg/ml、約 1.4mg/ml、約 1.5mg/ml、約 1.6mg/ml、約 12mg/ml、約 18mg/ml、約 20mg/ml、約 21.8mg/ml、約 24mg/ml 等。
[0090]在一個示例性實施方式中，所述陽離子水包油乳液包含約0.8mg/ml~約1.6mg/ml D0TAP，如 0.8mg/ml、l.2mg/ml、l.4mg/ml 或 1.6mg/ml。
[0091]在某些實施方式中， 所述陽離子脂質(zhì)為DC膽固醇。所述陽離子水包油乳液可含約0.lmg/ml~約5mg/ml的DC膽固醇。例如，所述陽離子水包油乳液包含的DC膽固醇可為約0.lmg/ml ~約 5mg/ml、約 0.2mg/ml ~約 5mg/ml、約 0.3mg/ml ~約 5mg/ml、約 0.4mg/ml ~約 5mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 5mg/ml、約 0.62mg/ml ~約 5mg/ml、約 lmg/ml ~約 5mg/ml、約 1.5mg/ml ~約 5mg/ml、約 2mg/ml ~約 5mg/ml、約 2.46mg/ml ~約 5mg/ml、約 3mg/ml ~約 5mg/ml、約 3.5mg/ml ~約 5mg/ml、約 4mg/ml ~約 5mg/ml、約 4.5mg/ml ~約 5mg/ml、約
0.lmg/ml ~約 4.92mg/ml、約 0.lmg/ml ~約 4.5mg/ml、約 0.lmg/ml ~約 4mg/ml、約 0.1mg/ml ~約 3.5mg/ml、約 0.lmg/ml ~約 3mg/ml、約 0.lmg/ml ~約 2.46mg/ml、約 0.lmg/ml ~約 2mg/ml、約 0.lmg/ml ~約 1.5mg/ml、約 0.lmg/ml ~約 lmg/ml、約 0.lmg/ml ~約 0.62mg/ml、約 0.15mg/ml、約 0.3mg/ml、約 0.6mg/ml、約 0.62mg/ml、約 0.9mg/ml、約 1.2mg/ml、約
2.46mg/ml、約 4.92mg/ml 等。
[0092]在一個示例性實施方式中，所述陽離子水包油乳液包含約0.62mg/ml~約
4.92mg/ml DC 膽固醇，如 2.46mg/ml。
[0093]在某些實施方式中，所述陽離子脂質(zhì)為DDA。所述陽離子水包油乳液可含約
0.lmg/ml~約5mg/ml的DDA。例如，所述陽離子水包油乳液包含的DDA可為約0.1mg/ml ~約 5mg/ml、約 0.lmg/ml ~約 4.5mg/ml、約 0.lmg/ml ~約 4mg/ml、約 0.lmg/ml ~約
3.5mg/ml、約 0.lmg/ml ~約 3mg/ml、約 0.lmg/ml ~約 2.5mg/ml、約 0.lmg/ml ~約 2mg/ml、約 0.lmg/ml ~約 1.5mg/ml、約 0.lmg/ml ~約 1.45mg/ml、約 0.2mg/ml ~約 5mg/ml、約0.3mg/ml ~約 5mg/ml、約 0.4mg/ml ~約 5mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 5mg/ml、約 0.6mg/ml ~約 5mg/ml、約 0.73mg/ml ~約 5mg/ml、約 0.8mg/ml ~約 5mg/ml、約 0.9mg/ml ~約 5mg/ml、約 1.0mg/ml ~約 5mg/ml、約 1.2mg/ml ~約 5mg/ml、約 1.45mg/ml ~約 5mg/ml、約 2mg/ml ~約 5mg/ml、約 2.5mg/ml ~約 5mg/ml、約 3mg/ml ~約 5mg/ml、約 3.5mg/ml ~約 5mg/ml、約4mg/ml ~約 5mg/ml、約 4.5mg/ml ~約 5mg/ml、約 1.2mg/ml、約 1.45mg/ml 等?；蛘撸鲫栯x子水包油乳液可包含約20mg/ml、約21mg/ml、約21.5mg/ml、約21.6mg/ml、約25mg/mlDDA0
[0094]在一個示例性實施方式中，所述陽離子水包油乳液包含約0.73mg/ml~約
1.45mg/ml DDA，如 1.45mg/ml。
[0095]在某些實施方式中，所述陽離子脂質(zhì)為D0TMA。所述陽離子水包油乳液可含約
0.5mg/ml~約25mg/ml的D0TMA。例如，所述陽離子水包油乳液包含的DOTMA可為約0.5mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.6mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.7mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.8mg/ml ~約25mg/ml、約 0.9mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.0mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.lmg/ml ~約 25mg/ml、約 1.2mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.3mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.4mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.5mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.6mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.7mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.5mg/ml ~約24mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 22mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 20mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 18mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 15mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 12mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 10mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 5mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 2mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.9mg/ml、約 0.5mg/ml ~約
1.8mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.7mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.6mg/ml、約 0.6mg/ml ~約 1.6mg/ml、約 0.7mg/ml ~約 1.6mg/ml、約 0.8mg/ml ~約 1.6mg/ml、約 0.8mg/ml ~約 3.0mg/ml、約0.5mg/ml、約 0.6mg/ml、約 0.7mg/ml、約 0.8mg/ml、約 0.9mg/ml、約 1.0mg/ml、約 1.lmg/ml、約 1.2mg/ml、約 1.3mg/ml、約 1.35mg/ml、約 1.4mg/ml、約 1.5mg/ml、約 1.6mg/ml、約 12mg/ml、約 18mg/ml、約 20mg/ml、約 22.5mg/ml、約 25mg/ml 等。
[0096]在一個示例性實施方式中，所述陽離子水包油乳液包含約0.8mg/ml~約1.6mg/ml D0TMA，如 0.8mg/ml、l.2mg/ml、l.4mg/ml 或 1.6mg/ml。
[0097]在某些實施方式中，所述陽離子脂質(zhì)為D0EPC。所述陽離子水包油乳液可含約0.5mg/ml~約25mg/ml的D0EPC。例如，所述陽離子水包油乳液包含的DOEPC可為約0.5mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.6mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.7mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.8mg/ml ~約25mg/ml、約 0.9mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.0mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.lmg/ml ~約 25mg/ml、約 1.2mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.3mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.4mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.5mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.6mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.7mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.5mg/ml ~約24mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 22mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 20mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 18mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 15mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 12mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 10mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 5mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 4mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 3mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 2mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.9mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.8mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.7mg/ml、約
0.5mg/ml ~約 1.6mg/ml、約 0.6mg/ml ~約 1.7mg/ml、約 0.7mg/ml ~約 1.7mg/ml、約 0.8mg/ml ~約 1.7mg/ml、約 0.8mg/ml ~約 3.0mg/ml、約 0.5mg/ml、約 0.6mg/ml、約 0.7mg/ml、約
0.8mg/ml、約 0.9mg/ml、約 1.0mg/ml、約 1.lmg/ml、約 1.2mg/ml、約 1.3mg/ml、約 1.4mg/ml、約 1.5mg/ml、約 1.6mg/ml、約 L7mg/ml、約 1.8mg/ml、約 1.9mg/ml、約 2.0mg/ml、約 12mg/ml、約 18mg/ml、約 20mg/ml、約 22.5mg/ml、約 25mg/ml 等。
[0098]在一個示例性實施方式中，所述陽離子水包油乳液包含約0.8mg/ml~約1.8mg/ml D0EPC，如 0.8mg/ml、l.2mg/ml、l.4mg/ml、l.6mg/ml、l.7mg/ml 或 1.8mg/ml0
[0099]在某些實施方式中，所述陽離子脂質(zhì)為DSTAP。所述陽離子水包油乳液可含約0.5mg/ml~約50mg/ml的DSTAP。例如，所述陽離子水包油乳液包含的DSTAP可為約0.5mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.6mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.7mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.8mg/ml ~約25mg/ml、約 0.9mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.0mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.lmg/ml ~約 25mg/ml、約 1.2mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.3mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.4mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.5mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.6mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.7mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.5mg/ml ~約24mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 22mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 20mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 18mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 15mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 12mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 10mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 5mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 4mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 3mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 2mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.9mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.8mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.7mg/ml、約0.5mg/ml ~約 1.6mg/ml、約 0.6mg/ml ~約 1.7mg/ml、約 0.7mg/ml ~約 1.7mg/ml、約 0.8mg/ml ~約 1.7mg/ml、約 0.8mg/ml ~約 3.0mg/ml、約 0.5mg/ml、約 0.6mg/ml、約 0.7mg/ml、約0.8mg/ml、約 0.9mg/ml、約 1.0mg/ml、約 1.lmg/ml、約 1.2mg/ml、約 1.3mg/ml、約 1.4mg/ml、約 1.5mg/ml、約 1.6mg/ml、約 1.7mg/ml、約 1.8mg/ml、約 1.9mg/ml、約 2.0mg/ml、約 12mg/ml、約 18mg/ml、約 20mg/ml、約 22.5mg/ml、約 25mg/ml 等。
[0100]在一個示例性實施方式中，所述陽離子水包油乳液包含約0.8mg/ml~約1.6mg/ml DSTAP，如 0.8mg/ml、l.2mg/ml、l.4mg/ml 或 1.6mg/ml0
[0101]在某些實施方式中，所述陽離子脂質(zhì)為D0DAC。所述陽離子水包油乳液可含約 0.5mg/ml~約50mg/ml的D0DAC。例如，所述陽離子水包油乳液包含的DODAC可為約0.5mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.6mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.7mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.8mg/ml ~約25mg/ml、約 0.9mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.0mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.lmg/ml ~約 25mg/ml、約 1.2mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.3mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.4mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.5mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.6mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.7mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.5mg/ml ~約24mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 22mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 20mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 18mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 15mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 12mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 10mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 5mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 4mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 3mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 2mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.9mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.8mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.7mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.6mg/ml、約 0.6mg/ml ~約 1.7mg/ml、約 0.7mg/ml ~約 1.7mg/ml、約
0.8mg/ml ~約 1.7mg/ml、約 0.8mg/ml ~約 3.0mg/ml、約 0.5mg/ml、約 0.6mg/ml、約 0.7mg/ml、約 0.8mg/ml、約 0.9mg/ml、約 1.0mg/ml、約 1.lmg/ml、約 1.15mg/ml、約 1.16mg/ml、約
1.17mg/ml、約 1.2mg/ml、約 1.3mg/ml、約 1.4mg/ml、約 1.5mg/ml、約 1.6mg/ml、約 1.7mg/ml、約 1.8mg/ml、約 1.9mg/ml、約 2.0mg/ml、約 12mg/ml、約 18mg/ml、約 20mg/ml、約 22.5mg/ml、約 25mg/ml 等。
[0102]在一個示例性實施方式中，所述陽離子水包油乳液包含約0.73mg/ml~約
1.45mg/ml D0DAC，如 1.45mg/ml。
[0103]在某些實施方式中，所述陽離子脂質(zhì)為D0DAP。所述陽離子水包油乳液可含約0.5mg/ml~約50mg/ml的DODAP。例如,所述陽離子水包油乳液包含的DODAP可為約0.5mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.6mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.7mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.8mg/ml ~約25mg/ml、約 0.9mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.0mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.lmg/ml ~約 25mg/ml、約 1.2mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.3mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.4mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.5mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.6mg/ml ~約 25mg/ml、約 1.7mg/ml ~約 25mg/ml、約 0.5mg/ml ~約24mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 22mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 20mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 18mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 15mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 12mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 10mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 5mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 4mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 3mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 2mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.9mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.8mg/ml、約 0.5mg/ml ~約 1.7mg/ml、約0.5mg/ml ~約 1.6mg/ml、約 0.6mg/ml ~約 1.7mg/ml、約 0.7mg/ml ~約 1.7mg/ml、約 0.8mg/ml ~約 1.7mg/ml、約 0.8mg/ml ~約 3.0mg/ml、約 0.5mg/ml、約 0.6mg/ml、約 0.7mg/ml、約0.8mg/ml、約 0.9 mg/ml、約 1.0mg/ml、約 1.lmg/ml、約 1.2mg/ml、約 1.3mg/ml、約 1.4mg/ml、約 1.5mg/ml、約 1.6mg/ml、約 1.7mg/ml、約 1.8mg/ml、約 1.9mg/ml、約 2.0mg/ml、約 12mg/ml、約 18mg/ml、約 20mg/ml、約 22.5mg/ml、約 25mg/ml 等。
[0104]在一個示例性實施方式中，所述陽離子水包油乳液包含約0.8mg/ml~約1.6mg/ml D0DAP,如 0.8mg/ml、l.2mg/ml、l.4mg/ml 或 1.6mg/ml。
[0105]在一些情況中，可能需要使用可溶于油核心的陽離子脂質(zhì)。例如，D0TAP、D0EPC、DODAC和DOTMA可溶于鯊烯或角鯊?fù)?。在其它情況中，可能需要使用不溶于油核心的陽離子脂質(zhì)。例如DDA和DSTAP不溶于鯊烯。確定具體脂質(zhì)溶于或不溶于油以及由此選擇合適的油和脂質(zhì)組合在本領(lǐng)域認識范圍內(nèi)。例如，溶解度可根據(jù)所述脂質(zhì)和油的結(jié)構(gòu)來預(yù)測(如脂質(zhì)的溶解度可通過其尾部的結(jié)構(gòu)來確定)。例如，具有一個或兩個不飽和脂肪鏈(如油酰尾)的脂質(zhì)如D0TAP、D0EPC、D0DAC、D0TMA，可溶于鯊烯或鯊?fù)椋欢哂酗柡椭舅徭?如硬脂酰尾)的脂質(zhì)不溶于鯊烯?；蛘撸芙舛瓤筛鶕?jù)溶于給定量油以形成飽和溶液的脂質(zhì)的量來確定。
[0106]如上所述，上述脂質(zhì)的濃度根據(jù)制備乳液所用脂質(zhì)的初始量確定。本領(lǐng)域應(yīng)理解終產(chǎn)物(如待給予的包裝滅菌乳液)中油的濃度可稍低，有時低最多約20%。
[0107]C.其它組分
[0108]本文所述陽離子水包油乳液還可包含其它組分。例如，所述乳液可包含能夠促進顆粒形成、改善所述核酸分子與所述陽離子顆粒間的復(fù)合或提高所述核酸分子的穩(wěn)定性(例如，防止RNA分子降解)的組分。必要時，所述陽離子水包油乳液可含有抗氧化劑，如檸檬酸鹽、抗壞血酸或其鹽。
[0109]表面活性劑
[0110]在某些實施方式中，所述陽離子水包油乳液的顆粒還包含表面活性劑。
[0111]大量表面活性劑已用于藥物科學(xué)。這些包括天然衍生的材料如樹膠、植物蛋白、基于糖的聚合物如海藻酸鹽和纖維素等。在碳主鏈上具有氫氧根或其它親水取代基的某些氧聚合物或聚合物具有表面活性劑活性，例如聚維酮、聚乙烯醇和基于醇醚的單和多官能化合物。長鏈脂肪酸衍生的化合物形成本發(fā)明可用的第三大組乳化和懸浮劑。
[0112]合適表面活性劑的特定例子包括下列:
[0113]1.水溶性皂如高級脂肪酸(Cltl~C22)的鈉、鉀、銨和烷醇銨的鹽，尤其是鈉和鉀牛脂和椰子皂。
[0114]2.陰離子合成非皂表面活性劑，其可由有機硫磺酸反應(yīng)產(chǎn)物的水溶性鹽代表，其分子結(jié)構(gòu)中具有含約8~22碳原子的烷基基團和選自磺酸和硫酸酯基團的基團。這些的示例是牛脂或椰子油衍生的烷基硫酸鈉或鉀；烷基苯磺酸鈉或鉀；烷基甘油醚磺酸鈉；椰子油脂肪酸單甘酯磺酸或硫酸鈉；1摩爾高級脂肪醇和約I~6摩爾環(huán)氧乙烷的反應(yīng)產(chǎn)物的硫酸酯的鈉或鉀鹽；烷基苯酚環(huán)氧乙烷醚磺酸鈉或鉀，每摩爾具有I~10單元的環(huán)氧乙烷且其中所述烷基基團含8~12個碳原子；脂肪酸以羥乙基磺酸酯化并以氫氧化鈉中和的反應(yīng)產(chǎn)物；甲基?；撬岬闹舅狨０返拟c或鉀鹽；和SO3-磺化Cltl-C24 α -烯烴的鈉和鉀鹽。
[0115]3.環(huán)氧烷基團與有機疏水化合物縮合產(chǎn)生的非離子合成表面活性劑。典型疏水基團包括烷基酚、丙二醇與環(huán)氧丙烷的縮合產(chǎn)物，和脂肪酸的酰胺和具有8~22個碳原子的脂族醇、乙二胺和環(huán)氧丙烷的縮合產(chǎn)物。
[0116]4.具有半極性特征的非離子表面活性劑，如氧化胺、氧化膦和亞砜。長鏈氧化叔胺的具體示例包括二甲基十二烷基氧化胺和二(2-羥乙基)十二烷基胺。氧化膦的具體示例參見1967年2月14日授權(quán)的美國專利號3，304, 263，且包括二甲基十二烷基氧化膦和二甲基_(2羥基十二烷基)氧化膦。
[0117]5.長鏈亞砜，包括對應(yīng)化學(xué)式R1—SO — R2的那些，其中R1和R2由烷基基團取代或未取代，前者含約10~約28個碳原子，而R2含I~3個碳原子。這些亞砜的具體示例包括十二烷基甲基亞砜和3-羥基十三烷基甲基亞砜。
[0118]6.兩性合成表面活性劑如3-十二烷基氨基丙酸鈉和3-十二烷基氨基丙烷磺酸鈉。
[0119]7.兩性離子合成表面活性劑，如3-(N，N-二甲基-N-十六烷基胺基)丙烷_1_磺酸鹽/酯和3- (N, N- 二甲基-N-十六烷基胺基)-2-羥丙烷-1-磺酸鹽/酯。
[0120]此外，下述類型的表面活性劑都可用于本發(fā)明的組合物:(a)脂肪酸、松香酸和妥爾油的皂(即堿性鹽)；(b)烷基芳烴磺酸鹽；(c)烷基硫酸鹽，包括具有支鏈和直鏈?zhǔn)杷鶊F以及一代和二代硫酸基團的表面活性劑；(d)疏水與親水基團之間含中間連接的硫酸鹽/酯和磺酸鹽/酯，如脂肪酰基化的甲基?；撬岷土蛩峄闹締胃术ィ?e)聚乙二醇的長鏈酸酯，尤其是妥兒油酯；(f)烷基酚的聚乙二醇醚；(g)長鏈醇和硫醇的聚乙二醇醚；和(h)脂肪?；掖减０?。由于表面活性劑可用多于一種方法分類，本段所列的許多表面活性劑類別與前述的表面活性劑類別有重疊。
[0121]有許多為生物條件特別設(shè)計且常用于生物條件的表面活性劑。此類表面活性劑分為四種基本類型:陰離子、陽離子、兩性離子(兩性)和非離子。示例性陰離子表面活性劑包括例如，全氟辛酸鹽(PF0A或PF0)、全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)，烷基硫酸鹽如十二烷基硫酸鈉(SDS)或月桂基硫酸銨，月桂醇聚醚硫酸鈉(也稱月桂基醚硫酸鈉，SLES)，烷基苯磺酸鹽和脂肪酸鹽。示例性陽離子表面活性劑包括例如，烷基三甲基銨鹽如鯨蠟基三甲基溴化銨(CTAB，或十六烷基溴化三甲基銨)，氯化鯨蠟基吡啶(CPC)，聚乙氧基化牛油胺(POEA)，苯扎氯銨(BAC)和芐索氯銨(BZT)。示例性兩性離子(兩性)表面活性劑包括例如,十二烷基甜菜堿，椰油酰胺丙基甜菜堿和椰油兩性甘氨酸鹽。示例性非離子型表面活性劑包括例如，烷基聚(環(huán)氧乙烯)、烷基苯酚聚(環(huán)氧乙烯)、聚(環(huán)氧乙烯)和聚(環(huán)氧丙烯)的共聚物[商品名為泊洛沙姆(Poloxamer)或泊洛沙胺(Poloxamine)]、烷基聚葡萄糖苷(如辛基葡萄糖苷和癸基麥芽糖苷)、脂肪醇(例如鯨蠟醇和油醇)、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA，PiufMlie? F68 (聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)和聚山梨醇酯,如吐溫(Tween)-20(聚山梨醇酯20)、吐溫_80(聚山梨醇酯80，聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯)、十二烷基二甲基氧化胺和維生素E生育酚丙二醇琥珀酸酯(維生素E TPGS)。
[0122]一組特別有用的表面活性劑是基于去水山梨糖醇的非離子表面活性劑。這些表面活性劑通過山梨糖醇脫水產(chǎn)生1，4-去水山梨糖醇，然后與一種或多種脂肪酸等價物反應(yīng)來制得。脂肪酸取代的部分還可與環(huán)氧乙烷反應(yīng)產(chǎn)生第二組表面活性劑。
[0123]制備脂肪酸取代的去水山梨糖醇表面活性劑是通過1，4-去水山梨糖醇和脂肪酸如月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸或相似長鏈脂肪酸反應(yīng)，產(chǎn)生1，4-去水山梨糖醇單酯、1，4-去水山梨糖醇倍半酯或1，4-去水山梨糖醇三酯。這些表面活性劑的常用名包括例如去水山梨糖醇單月桂酸酯、去水山梨糖醇單棕櫚酯、去水山梨糖醇單硬脂酸酯、去水山梨糖醇單油酸酯、去水山梨糖醇倍半油脂和去水山梨糖醇三油酸酯。這些表面活性劑市售可得，名為SPAN?,(司盤)或ARLACEL?,通常有字母或數(shù)字標(biāo)號來區(qū)別各種單、雙和三酯取代的去水山梨糖醇。
[0124]SPAN?和ARLACEL?表面活性劑是親水的并通常可溶或可分散在油中。它們還可溶于大多數(shù)有機溶劑。在水中它們通常不可溶但可分散。通常這些表面活性劑的親水-親脂平衡(HLB)數(shù)為1.8~8.6。此類表面活性劑可通過本領(lǐng)域已知的手段方便地制得或市售可得。
[0125]—組相關(guān)表面活性劑包含聚氧乙烯(olyoxyethylene)去水山梨糖醇單酯和聚氧乙烯去水山梨糖醇三酯。這些材料通過添加環(huán)氧乙烷到1，4-去水山梨糖醇單酯或三酯中來制備。添加聚氧乙烯將親脂去水山梨糖醇單或三酯表面活性劑轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水表面活性劑，后者通?？扇芑蚩煞稚⒃谒胁⒁圆煌潭瓤扇苡谟袡C液體中。
[0126]這些材料以商標(biāo)TWEEN?市售可`得，可用于制備水包油乳液和分散體，或用于溶解油并使無水藥膏變?yōu)樗苄曰蚩汕逑?。TWEEN?表面活性劑可與相關(guān)去水山梨糖醇單酯或三酯表面活性劑組合以促進乳液穩(wěn)定性。TWEEN_表面活性劑的HLB值通常落在
9.6~16.7之間。TWEEN?表面活性劑可市售購得。
[0127]可單獨使用或與SPAN?、ARLACEL?和TWEEN?:表面活性劑聯(lián)用的第三組非離子表面活性劑是通過環(huán)氧乙烷與長鏈脂肪酸反應(yīng)制得的聚氧乙烯脂肪酸。該類型的最常見表面活性劑是名為MYRJ⑩的固體并且是硬脂酸的聚氧乙烯衍生物。MYRJ?表面活性劑是親水的且可溶或可分散在水中，類似TWEEN?表面活性劑。MYRJ?表面活性劑可與TWEEN?表面活性劑或與TWEEN€)/SPAN?或ARLACEL.?表面活性劑混合物相混用于形成乳液。MYRJ?表面活性劑可通過本領(lǐng)域已知方法制備或市售購得。
[0128]第四組基于聚氧乙烯的非離子表面活性劑是衍生自月桂酰、乙酰、硬脂酰、和油酰醇的聚氧乙烯脂肪酸醚。這些材料如上通過添加環(huán)氧乙烷到脂肪醇中來制備。這些表面活性劑的商品名為URLlt表面活性劑可為親水或親脂，取決于所述表面活性劑中聚氧乙烯部分的大小。這些化合物的制備在本領(lǐng)域可得，同時其還可容易地獲自商業(yè)來源。
[0129]可潛在使用的其它非離子表面活性劑是例如，聚氧乙烯、多元醇脂肪酸酯、聚氧乙烯醚、聚氧丙烯脂肪醚、含聚氧乙烯的蜂蠟衍生物、聚氧乙烯羊毛脂衍生物、聚氧乙烯脂肪甘油酯、丙三醇脂肪酸酯或12~22個碳原子長鏈脂肪酸的其它聚氧乙烯酸醇或醚衍生物。
[0130]由于本發(fā)明的乳液和制劑意在為多相系統(tǒng)，優(yōu)選選擇形成乳液的非離子表面活性劑，其HLB值在約7~16范圍內(nèi)。該值可通過使用單一非離子表面活性劑如表面活性劑來獲得，或可通過使用表面活性劑混合物來實現(xiàn)，例如有基于去水山梨糖醇單、雙或三酯的表面活性劑；去水山梨糖醇酯聚氧乙烯脂肪酸；去水山梨糖醇酯與聚氧乙烯羊毛脂衍生表面活性劑組合；去水山梨糖醇酯表面活性劑與高HLB聚氧乙烯脂肪醚表面活性劑組合；或聚乙烯脂肪醚表面活性劑或聚氧乙烯去水山梨糖醇脂肪酸。
[0131]在某些實施方式中，乳液含單一非離子表面活性劑，最具體的有TWEEN?表面活性劑，作為乳液穩(wěn)定用非離子表面活性劑。在示例性實施方式中，乳液含TWEEN? 80，或稱為聚山梨酯80或聚氧乙烯20去水山梨糖醇單酯。在其它實施方式中，乳液含兩種或多種非離子表面活性劑，尤其是TWEEN?表面活性劑和SPAN?表面活性劑。在示例性實施方式中，乳液含TWEEN? 80和SPAN? 85。
[0132]水包油乳液可包含約0.01%~約2.5%表面活性劑(v/v或w/v)，約0.01%~約2%表面活性劑，0.01%~約1.5%表面活性劑，0.01%~約1%表面活性劑，0.01%~約0.5%表面活性劑，0.05%~約0.5%表面活性劑，0.08%~約0.5%表面活性劑，約0.08%表面活性劑，約0.1%表面活性劑，約0.2%表面活性劑，約0.3%表面活性劑，約0.4%表面活性劑，約0.5%表面活性劑，約0.6%表面活性劑，約0.7%表面活性劑，約0.8%表面活性劑，約0.9%表面活性劑，或約1%表面活性劑。
[0133]或者或此外，所述水包油乳液可包含0.05%~約1%、0.05%~約0.9%、0.05%~約0.8%、0.05% ~約 0.7%、0.05% ~約 0.6%、0.05% ~約 0.5%、約 0.08%、約 0.1%、約 0.2%、約0.3%、約 0.4%、約 0.5%、約 0.6%、約 0.7%、約 0.8%、約 0.9%、或約 1% 吐溫 80 (聚山梨酯 80;
聚氧乙烯去水山梨糖醇單油脂)。
[0134]在一個示例性實施方式中，所述水包油乳液含0.08%吐溫80。
[0135]或者或此外，所述水包油乳液可包含0.05%~約1%、0.05%~約0.9%、0.05%~約0.8%、0.05% ~約 0.7%、0.05% ~約 0.6%、0.05% ~約 0.5%、約 0.08%、約 0.1%、約 0.2%、約
0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、或約1%司盤85 (去水山梨糖醇
三油脂)。
[0136]或者或此外，所述水包油乳液可包含本文所述表面活性劑的組合。例如，可使用吐溫80 (聚山梨酯80，聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯)和司盤85 (失水山梨糖醇三油酸酯)的組合。所述乳液可含各種量的Tween? 80和司盤85 (如上面所示例的那些)，包括等量的這些表面活性劑。例如，所述水包油乳液可包含約0.05% Tween? 80和約0.05% SPAN?85、約 0.1% Tweea? 80 和約 0.1% SPAN? 85、約 0.2% Tween? 80 和約 0.2% SPAN?85、約 0.3% Tween? 80 和約 0.3% SPANd: 85、約 0.4% Tween? 80 和約 0.4% SPAN?85、約 0.5% Tween? 80 和約 0.5% SPAN? 85、約 0.6% Tween⑩ 80 和約 0.6% SPAN?85、約 0.7% Tween? 80 和約 0.7% SPAN? 85、約 0.8% Tween? 80 和約 0.8% SPAN?85、約 0.9% Tween? 80 和約 0.9% SPAN? 85 或約 1% Tween⑩ 80 和約 1.0% SPAN?85。
[0137]聚乙二醇(PEG) -脂質(zhì)，如PEG偶聯(lián)二烷氧基丙基(PEG-DAA)、PEG偶聯(lián)二酰甘油(PEG-DAG)、PEG偶聯(lián)磷脂酰乙醇胺(PE) (PEG-PE)或一些其它磷脂(PEG-磷脂)、PEG偶聯(lián)神經(jīng)酰胺(PEG-Cer)、或其組合也可用作表面活性劑(參見例如美國專利號5，885，613 ;美國專利申請
【發(fā)明者】L·布里托, M·陳, A·吉爾, 德里克·奧黑根, M·辛格 申請人:諾華股份有限公司