多抗原提呈免疫原性組合物及其方法和用途
【專利摘要】本實(shí)施方式提供免疫原性多抗原提呈系統(tǒng)，所述免疫原性多抗原提呈系統(tǒng)包含聚合物，抗原通過(guò)互補(bǔ)親和分子締合至所述聚合物。例如，所述聚合物可為多糖、或抗原性多糖，來(lái)自相同或不同病原體的蛋白抗原或肽抗原間接連接至所述聚合物。本發(fā)明的免疫原性組合物可同時(shí)引發(fā)針對(duì)一種或多種抗原的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答兩種免疫應(yīng)答。
【專利說(shuō)明】多抗原提呈免疫原性組合物及其方法和用途
[0001]政府支持
[0002]本發(fā)明是在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes ofHealth)授予的基金號(hào)A1067737-01和AI51526-01的政府支持下完成的。美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明享有一定權(quán)利。
[0003]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0004]根據(jù)35U.S.C.§ 119(e)，本申請(qǐng)要求2011年5月11日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1 / 484，934,2012年3月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1 / 608，168以及2012年3月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1 / 609，974的優(yōu)先權(quán)，以引用的方式將其各自的內(nèi)容全部并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)和微生物學(xué)。本申請(qǐng)總體上針對(duì)用于制備免疫原性組合物的方法以及組合物。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的實(shí)施方式提供免疫原性大分子-復(fù)合物(macro-complex),所述免疫原性大分子-復(fù)合物包含連接至聚合物(如多糖)(也可為抗原)的至少一種蛋白或肽抗原。在一些實(shí)施方式中，可將這種復(fù)合物用作免疫原性組合物(例如疫苗)以賦予協(xié)同的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答；在一些實(shí)施方式中，引發(fā)協(xié)同的抗體介導(dǎo)的和細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)病原體的防護(hù)，例如，此類病原體的致死感染和粘膜運(yùn)輸(mucosal carriage)。
【背景技術(shù)】
[0006]疫苗提供對(duì)各種疾病的預(yù)防和治療，包括微生物感染、病毒感染和癌癥。然而，目前基于多糖的疫苗在多數(shù)易感人群(vulnerable populations)中并不總是有效。例如，在發(fā)展中國(guó)家中，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia,肺炎球菌)感染和傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhi)感染是兒童的兩種主要疾病。對(duì)于傷寒(typhoid fever),許可的Vi多糖疫苗對(duì)兩歲以下的兒童無(wú)效。然而，基于多糖的疫苗的成功和防止定殖(colonization)或疾病的被動(dòng)免疫已表明了莢膜抗體的重要性，特別是在對(duì)由肺炎鏈球菌引起的疾病進(jìn)行控制這一方面。此外，對(duì)動(dòng)物和人二者的研究表明由肺炎球菌接種(vaccination)引發(fā)的抗體可以保護(hù)免于鼻咽(NP)肺炎球菌定殖,其在肺炎球菌疾病之前發(fā)生。
[0007]當(dāng)前多糖肺炎球菌疫苗的局限在于，抗莢膜抗體給予的保護(hù)受到其血清型特異性限制。例如，盡管7價(jià)肺炎球菌綴合疫苗(PCV7)由于疫苗型(VT)菌株顯著地降低了侵襲性肺炎鏈球菌疾病(invasive pneumococcal disease)的發(fā)病率,但是最近的研究表明非VT血清型已逐漸取代了 VT肺炎球菌群，潛在地限制疫苗的有效性。這已導(dǎo)致對(duì)是否可以通過(guò)保守性抗原的免疫(immunization)來(lái)防止肺炎球菌定殖進(jìn)行評(píng)價(jià)。特別是，若干肺炎球菌蛋白在肺炎球菌定殖動(dòng)物模型中已被評(píng)價(jià)為候選疫苗。已經(jīng)證明，以這些蛋白中的一些進(jìn)行的粘膜免疫引發(fā)全身性抗體和粘膜抗體，并賦予針對(duì)肺炎球菌疾病和定殖的保護(hù)。仍然需要含有肺炎球菌多糖和蛋白二者的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物能夠產(chǎn)生針對(duì)所有肺炎球菌血清型的穩(wěn)健的(robust)細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答這兩種免疫應(yīng)答。
[0008]此外，固有免疫應(yīng)答提供了針對(duì)微生物病原體的迅速且通常有效的防御。這種應(yīng)答包括對(duì)病原體相關(guān)分子的細(xì)胞識(shí)別、觸發(fā)炎癥介質(zhì)(inflammatory mediators)的產(chǎn)生和釋放、白細(xì)胞的募集、以及抗菌效應(yīng)物的活化。Toll樣受體(TLR)能夠在多種病原體相關(guān)分子之間進(jìn)行識(shí)別并引發(fā)保護(hù)性應(yīng)答，就哺乳動(dòng)物而言已經(jīng)描述了其中至少十一種。例如，TLR4識(shí)別許多微生物產(chǎn)物，包括來(lái)自革蘭氏陰性菌的微生物產(chǎn)物、呼吸道合胞病毒的F蛋白以及革蘭氏陽(yáng)性菌的膽固醇依賴細(xì)胞溶素(O)C, cholesterol-dependent cytolysins)。此外，TLR2識(shí)別大量的微生物化合物和合成化合物。因此，納入此類TLR激動(dòng)劑可增強(qiáng)對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答。仍有需要通過(guò)引發(fā)針對(duì)感染(例如肺炎球菌的定殖和疾病)的固有免疫應(yīng)答(TLR介導(dǎo)的或其它的應(yīng)答)來(lái)改善疫苗的效力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明提供了免疫原性多抗原提呈系統(tǒng)(MAPS)，該免疫原性多抗原提呈系統(tǒng)對(duì)免疫原性組合物(例如，在疫苗中有用的組合物)的生產(chǎn)有用。特別地，本發(fā)明涉及含有免疫原性復(fù)合物(immunogenic` complex)的組合物,所述免疫原性復(fù)合物含有至少一種類型的聚合物(例如多糖)，所述聚合物可任選為抗原性的；至少一種抗原蛋白或抗原肽；以及至少一種互補(bǔ)親和分子對(duì)，所述互補(bǔ)親和分子對(duì)含有Q)與所述聚合物締合(associatewith)的第一親和分子，以及(ii)與所述蛋白或肽締合的互補(bǔ)親和分子，以使得所述第一親和分子和互補(bǔ)親和分子作為所述聚合物與所述抗原蛋白或抗原肽之間的間接連接。因此，所述聚合物可連接至少I(mǎi)種、或至少2種、或多種相同或不同的蛋白抗原或肽抗原。在一些實(shí)施方式中，所述聚合物為抗原性的，例如，所述聚合物為肺炎球菌莢膜多糖。在一些實(shí)施方式中，所述蛋白抗原或肽抗原為重組蛋白抗原或肽抗原。
[0010]本文所公開(kāi)的免疫原性組合物可同時(shí)引發(fā)針對(duì)一種或多種抗原的體液應(yīng)答和細(xì)胞應(yīng)答這兩種應(yīng)答。所述免疫原性組合物提供了長(zhǎng)期記憶應(yīng)答，潛在地保護(hù)受試者免于以后的感染。這允許單個(gè)免疫原性組合物產(chǎn)生高效價(jià)(titer)的功能性抗多糖抗體，并使其誘發(fā)的抗體水平類似于或高于由傳統(tǒng)綴合疫苗誘發(fā)的抗體水平。此外，對(duì)具體的載體蛋白沒(méi)有限制，并且多種抗原蛋白可用于MAPS構(gòu)建體中來(lái)生成穩(wěn)健的抗多糖抗體應(yīng)答。此外，強(qiáng)烈的抗體應(yīng)答和Thl7 / Thl應(yīng)答對(duì)經(jīng)由所述MAPS組合物提呈的多種蛋白抗原具有特異性。這呈現(xiàn)出作為用一種構(gòu)建體引發(fā)兩種形式的免疫的手段的主要優(yōu)點(diǎn)。除了針對(duì)綴合至蛋白載體的抗原多糖的更傳統(tǒng)的免疫應(yīng)答之外，本發(fā)明提供了針對(duì)全身性注射的蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答以及，更具體地說(shuō)，為T(mén)hl7和Thl應(yīng)答。此外，本免疫原性組合物可將配體并入到所述聚合物骨架上。這提供了如下潛能:通過(guò)改變蛋白/聚合物比例、復(fù)合物大小，或通過(guò)將特定共刺激因子(如TLR2 / 4配體等)并入所述組合物中，來(lái)增強(qiáng)特異性B細(xì)胞應(yīng)答或T細(xì)胞應(yīng)答。
[0011]與典型的綴合技術(shù)(涉及對(duì)蛋白的嚴(yán)苛處理)相比，本方法避免了肽抗原的其它修飾的變性風(fēng)險(xiǎn)。這提供了如下很大的優(yōu)勢(shì):保持所包含的蛋白的抗原性，并增加蛋白本身將作為抗原(而不只是載體)的可能性。同樣地，本方法避免了對(duì)多糖骨架不必要的修飾/損壞，因?yàn)闆](méi)有重度化學(xué)交聯(lián):可精確地控制生物素化以使其與多糖的特定官能團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)，并且可容易地對(duì)生物素化水平進(jìn)行調(diào)節(jié)。這有利于避免綴合的典型過(guò)程，所述綴合的典型過(guò)程導(dǎo)致關(guān)鍵側(cè)鏈或表位的損壞，這可能會(huì)導(dǎo)致降低的免疫原性和保護(hù)。
[0012]本發(fā)明的基于親和的組裝(assembly)提供了簡(jiǎn)單且高度靈活的免疫原性組合物的制備。它高度特異和穩(wěn)定；它可以在寒冷中保存數(shù)月并保持其效力。組裝過(guò)程足夠簡(jiǎn)單以確保了高重現(xiàn)性；僅需要幾個(gè)步驟，這降低了批次間存在偏差的風(fēng)險(xiǎn)，并具有巨大的工業(yè)優(yōu)勢(shì)。即使在低濃度的蛋白和多糖(如0.1mg / ml)中，MAPS組裝也是高效的(超過(guò)95%)；這是主要優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榫Y合制造的低效率(效率通常在〈50%的范圍內(nèi))是主要障礙和疫苗高成本的原因。就制劑(formulation)而言:其易于調(diào)整終產(chǎn)物的組成和物理性質(zhì)。在復(fù)合物中蛋白:聚合物的比例是可調(diào)節(jié)的；就聚合物適度的生物素化而言，蛋白:聚合物可為10:l(w / w)以上；相反，如果這就是基于免疫目標(biāo)的興趣，所述比例可為1:10以下。此外，免疫原性MAPS組合物的大小可通過(guò)對(duì)聚合物大小的選擇來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)。制備MAPS的方法在將聚合物與蛋白聯(lián)合而幾乎無(wú)需修飾這方面提供了方便。通過(guò)在單一的免疫原性構(gòu)建體中裝載來(lái)自相同或不同病原體(例如，肺炎球菌和肺結(jié)核)的多種蛋白抗原而得到的終產(chǎn)物的可能的多價(jià)性提供了如下組合物:所述組合物可用于減少針對(duì)超過(guò)一種疾病對(duì)受試者進(jìn)行免疫時(shí)所需的疫苗的數(shù)量。此外，MAPS組合物高度穩(wěn)定；只有在煮沸時(shí)才會(huì)解離(dissociated)，并且在4°C甚至許多個(gè)月后仍保持免疫原性。MAPS復(fù)合物的免疫原性可能會(huì)受到抗原蛋白或抗原肽組分的穩(wěn)定性的限制，所述抗原蛋白或抗原肽的穩(wěn)定性可通過(guò)包含于MAPS復(fù)合物 中而被延長(zhǎng)。本文所用的特定抗原在室溫下以及在至少一個(gè)冷凍-解凍循環(huán)后具有穩(wěn)定性。這提供了相比于當(dāng)前疫苗的重要優(yōu)點(diǎn)，如果沒(méi)有仔細(xì)維持“冷鏈”的話，當(dāng)前疫苗會(huì)受到損害。
[0013]因此，本發(fā)明一方面涉及免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含聚合物、至少一種蛋白抗原或肽抗原、以及至少一種互補(bǔ)親和分子對(duì)，其中，所述互補(bǔ)親和分子對(duì)包含與所述聚合物締合的第一親和分子以及與所述蛋白抗原或肽抗原締合的互補(bǔ)親和分子，以使得當(dāng)所述第一親和分子與所述互補(bǔ)親和分子締合時(shí)，間接地將所述抗原連接至所述聚合物。
[0014]在一些實(shí)施方式中，用交聯(lián)劑將所述第一親和分子交聯(lián)至所述聚合物，例如，交聯(lián)劑選自于=CDAP (1-氰基-4- 二甲基氨基吡啶四氟硼酸鹽)、EDC (1-乙基-3- [3- 二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽)、氰基硼氫化鈉；溴化氰；或碳酸氫銨/碘乙酸。在一些實(shí)施方式中，所述第一親和分子交聯(lián)至所述聚合物的羧基、羥基、氨基、苯氧基、半縮醛以及巰基官能團(tuán)。在一些實(shí)施方式中，所述第一親和分子共價(jià)鍵合至所述聚合物。
[0015]在一些實(shí)施方式中，所述第一親和分子為生物素或其衍生物、或具有與生物素類似的結(jié)構(gòu)或物理性質(zhì)的分子，例如，胺-PEG3-生物素((+)-生物素酰-3，6，9-三氧代十一燒二胺(trixaundecanediamine))或其衍生物。
[0016]在一些實(shí)施方式中，所述免疫原性組合物的蛋白抗原或肽抗原為融合蛋白，所述融合蛋白含有融合至互補(bǔ)親和結(jié)合分子的抗原蛋白或抗原肽。所述融合可為遺傳構(gòu)建體，即重組融合肽或重組融合蛋白。在一些實(shí)施方式中，抗原可作為融合蛋白共價(jià)連接至所述互補(bǔ)親和分子。在替代的實(shí)施方式中，所述抗原非共價(jià)連接至所述互補(bǔ)親和分子。
[0017]在一些實(shí)施方式中，所述互補(bǔ)親和分子為生物素結(jié)合蛋白或其衍生物或功能部分。在一些實(shí)施方式中，互補(bǔ)親和分子為親和素樣蛋白或其衍生物或功能部分，例如但不限于，rhizavidin或其衍生物。在一些實(shí)施方式中，互補(bǔ)親和分子為親和素或鏈霉親和素或它們的衍生物或功能部分。
[0018]在一些實(shí)施方式中，分泌信號(hào)肽位于所述親和素樣蛋白的N端。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的任何信號(hào)序列均可使用；在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列為MKKIffLALAGLVLAFSASA(SEQ ID NO:1)或其衍生物或功能部分。在一些實(shí)施方式中，所述抗原可經(jīng)由柔性接頭肽融合至互補(bǔ)親和分子，其中，所述柔性接頭肽將所述抗原連接至所述互補(bǔ)親和分子。
[0019]在一些實(shí)施方式中，免疫原的聚合物組分包含來(lái)自活生物體(living organism)的聚合物，例如多糖。在一些實(shí)施方式中，聚合物可從天然來(lái)源中純化和分離得到，或者可將所述聚合物合成為具有天然組成/結(jié)構(gòu)，或者所述聚合物可為合成(例如，具有人造組成/結(jié)構(gòu))聚合物。在一些實(shí)施方式中，聚合物來(lái)源于選自于由以下生物體所組成的組中的生物體:細(xì)菌、古生菌、或真核細(xì)胞例如真菌、昆蟲(chóng)、植物，或上述生物體的嵌合體。在一些實(shí)施方式中，所述聚合物為來(lái)源于病原性細(xì)菌的多糖。在【具體實(shí)施方式】中，所述多糖為肺炎球菌莢膜多糖、肺炎球菌細(xì)胞壁多糖或傷寒沙門(mén)氏菌Vi多糖。[0020]在一些實(shí)施方式中，本文所公開(kāi)的免疫原性組合物的聚合物為支鏈聚合物，例如分支多糖；或者，可為直鏈聚合物，例如單鏈聚合物，例如多糖。在一些實(shí)施方式中，所述聚合物為多糖，例如，葡聚糖或其衍生物。在一些實(shí)施方式中，聚合物(例如葡聚糖多糖)的平均分子量可為425kD-500kDa(包括端值)；或者，在一些實(shí)施方式中，為大于500kDa。在一些實(shí)施方式中，聚合物(例如葡聚糖多糖)的平均分子量可為60kD-90kDa(包括端值)；或者，在一些實(shí)施方式中，為小于70kDa。所述葡聚糖聚合物可來(lái)源于細(xì)菌，如腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。
[0021 ] 在一些實(shí)施方式中，本文公開(kāi)的免疫原性組合物包含至少2種抗原、或至少3種抗原、或至少5種抗原、或2-10種之間的抗原、或10-15種之間的抗原、或15-20種之間的抗原、或20-50種之間的抗原、或50-100種之間的抗原或超過(guò)100種抗原，包括端值。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)本文所公開(kāi)的免疫原性組合物包含至少2種抗原時(shí)，所述抗原可為相同的抗原或至少2種不同的抗原。在一些實(shí)施方式中，所述抗原可以來(lái)自相同病原體或不同病原體，或者可為相同抗原蛋白的不同表位或不同部分，或者可為對(duì)相同病原體的不同血清型或季節(jié)性變型(如流感病毒A、B和C)具有特異性的相同抗原。
[0022]在一些實(shí)施方式中，本文公開(kāi)的免疫原性組合物包含來(lái)自病原性生物體或異常組織的抗原。在一些實(shí)施方式中，所述抗原為腫瘤抗原。在一些實(shí)施方式中，抗原可為選自于寄生蟲(chóng)或病原體抗原的至少一種抗原，例如如下抗原:肺炎鏈球菌抗原、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原或破傷風(fēng)分枝桿菌(M tetanus)抗原、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)抗原、HIV抗原、季節(jié)性或流行性流感抗原(如HlNl或H5N1)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)抗原、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗原、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)抗原或淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)抗原、HPV抗原、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)抗原、HSV抗原或其它皰疫病毒抗原、或痕原蟲(chóng)(Plasmodia) sp抗原。這些抗原可包括肽、蛋白、糖蛋白或多糖。在一些實(shí)施方式中，所述抗原為類毒素或毒素的一部分。
[0023]在一些實(shí)施方式中，本文公開(kāi)的免疫原性組合物包含抗原多糖，例如，如Vi抗原(傷寒沙門(mén)氏菌莢膜多糖)、肺炎球菌莢膜多糖、肺炎球菌細(xì)胞壁多糖、Hib (B型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae type B))莢膜多糖、腦膜炎球菌(meningococcal)莢膜多糖、炭疽桿菌的多糖(炭疽的病原體(causative agent))、以及其它細(xì)菌莢膜多糖或細(xì)胞壁多糖，或上述多糖的任意組合。所述多糖可具有蛋白組分，例如，如來(lái)源于病毒的糖蛋白。
[0024]在一些實(shí)施方式中，本文公開(kāi)的免疫原性組合物進(jìn)一步包含至少一種與所述聚合物或多糖締合的共刺激因子，其中，所述共刺激因子可直接或間接締合。例如，在一些實(shí)施方式中，共刺激因子可共價(jià)連接至所述聚合物。例如，在一些實(shí)施方式中，共刺激因子可共價(jià)連接至所述第一親和分子，然后將其交聯(lián)至所述聚合物。例如，在一些實(shí)施方式中，共刺激因子可連接至互補(bǔ)親和分子，所述互補(bǔ)親和分子與第一親和分子締合，從而將所述共刺激因子連接至所述聚合物。在一些實(shí)施方式中，共刺激因子為佐劑(adjuvant)。在替代的實(shí)施方式中，共刺激因子可為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的任何共刺激因子，并包括任意組合，例如但不限于，Toll樣受體激動(dòng)劑(TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9等的激動(dòng)劑)、NOD激動(dòng)劑或炎性小體(inflammasome)激動(dòng)劑。
[0025]本發(fā)明的另一方面涉及將本文所公開(kāi)的免疫原性組合物給予受試者以在所述受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答的用途。在一些實(shí)施方式中，所述免疫應(yīng)答為抗體應(yīng)答/ B細(xì)胞應(yīng)答、⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答(包括Thl、Th2和Th 17細(xì)胞)和/或⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，將至少一種佐劑與所述免疫原性組合物聯(lián)合給藥。
[0026]本發(fā)明的另一方面涉及用于在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)至少一種抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述受試者給予本文所公開(kāi)的免疫原性組合物。
[0027]本發(fā)明的另一方面涉及針對(duì)至少一種抗原對(duì)動(dòng)物(例如鳥(niǎo)類、哺乳動(dòng)物或人)進(jìn)行接種的方法，所述方 法包括給予含有本文所公開(kāi)的免疫原性組合物的疫苗組合物。
[0028]在本文公開(kāi)的所有方面中，動(dòng)物或受試者可為人。在一些實(shí)施方式中，所述受試者可為農(nóng)業(yè)動(dòng)物或非馴養(yǎng)動(dòng)物(non-domestic animal)、或馴養(yǎng)動(dòng)物。在一些實(shí)施方式中,含有本文所公開(kāi)的免疫原性組合物的疫苗組合物可經(jīng)由以下方式給藥:皮下、鼻內(nèi)、口腔、舌下、陰道、直腸、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌內(nèi)注射，或經(jīng)由皮膚貼劑來(lái)經(jīng)皮免疫。
[0029]在本文公開(kāi)的所有方面中，免疫應(yīng)答是針對(duì)蛋白/肽抗原的抗體應(yīng)答/ B細(xì)胞應(yīng)答、⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答(包括Thl、Th2和Th 17應(yīng)答)或⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答是針對(duì)所述聚合物(例如，肺炎球菌多糖)的抗體應(yīng)答/ B細(xì)胞應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，將至少一種佐劑與所述免疫原性組合物聯(lián)合給藥。
[0030]本發(fā)明的另一方面涉及本文所公開(kāi)的免疫原性組合物在對(duì)暴露于病原體或免疫原性劑進(jìn)行診斷中的用途。
[0031]本發(fā)明的另一方面涉及用于制備本文所公開(kāi)的免疫原性組合物的試劑盒。例如，此類試劑盒可包含以下物質(zhì)中的任意一種或多種:含有聚合物(如多糖)的容器，所述聚合物與多個(gè)第一親和分子交聯(lián)；以及含有互補(bǔ)親和分子的容器，所述互補(bǔ)親和分子與所述第一親和分子締合，其中，所述互補(bǔ)親和分子與抗原締合。
[0032]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑盒可包含:含有聚合物(例如多糖)的容器；含有多個(gè)第一親和分子的容器；以及含有交聯(lián)分子的容器，所述交聯(lián)分子用于將所述第一親和分子交聯(lián)至所述聚合物。在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒可包含至少一種共刺激因子，所述至少一種共刺激因子可添加至所述聚合物。在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒包含用于將所述共因子連接至所述聚合物或多糖的交聯(lián)劑，例如但不限于，CDAP (1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸鹽)、EDCd-乙基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽)、氰基硼氫化鈉、溴化氰、碳酸氫銨/碘乙酸。在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒進(jìn)一步包含將所述互補(bǔ)親和分子連接至所述蛋白抗原或肽抗原的手段(means)，所述手段可為通過(guò)交聯(lián)劑或通過(guò)一些中間(intermediary)融合蛋白。
[0033]在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒可包含含有表達(dá)載體的容器，所述表達(dá)載體用于表達(dá)蛋白抗原- 親和分子融合蛋白或肽抗原-親和分子融合蛋白，例如，用于將蛋白抗原或肽抗原以與所述互補(bǔ)親和分子一起的融合蛋白進(jìn)行表達(dá)的表達(dá)載體。在一些實(shí)施方式中，所述載體可任選地包含接頭肽序列，其中，所述表達(dá)載體可表達(dá)含有接頭肽的抗原-互補(bǔ)親和分子融合蛋白，所述接頭肽位于所述抗原和所述親和分子之間。
[0034]在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒可任選地包含含有互補(bǔ)親和分子的容器，所述互補(bǔ)親和分子與所述第一親和分子締合，其中，所述互補(bǔ)親和分子與肽抗原/蛋白抗原締合。在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒可進(jìn)一步含有將所述互補(bǔ)親和分子連接至所述抗原的手段，例如，使用本文所公開(kāi)的交聯(lián)劑或其它中間蛋白(例如二價(jià)抗體或抗體片段)。
[0035]本文還提供了以本文所公開(kāi)的免疫原性組合物對(duì)受試者(例如哺乳動(dòng)物，如人)進(jìn)行接種的方法，所述方法包括向所述受試者給予本文所公開(kāi)的疫苗組合物。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1是多抗原提呈系統(tǒng)(MAPS)的示意圖。MAPS表示復(fù)合免疫原性組合物的新平臺(tái)，其通過(guò)如下方式制得:將若干蛋白抗原經(jīng)由親和對(duì)(例如，親和素-生物素對(duì))的穩(wěn)定相互作用連接至多糖或多糖抗原。在MAPS復(fù)合物的一個(gè)實(shí)施方式中，將來(lái)自同一病原體或不同病原體的蛋白抗原重組融合至親和素樣蛋白，并將其在大腸桿菌(E.coli)中進(jìn)行表達(dá)。將多糖骨架(可選自于各種病原體)進(jìn)行生物素化和/或?qū)⒍嗵枪羌芘c共刺激因子交聯(lián)或不與共刺激因子交聯(lián)(使用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)或1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)作為活化試劑)。MAPS復(fù)合物可僅通過(guò)將純化的融合抗原(一種或多種)以所需的比例與生物素化的多糖進(jìn)行混合和孵育而容易地組裝?？赏ㄟ^(guò)凝膠過(guò)濾色譜根據(jù)大小對(duì)組裝的MAPS復(fù)合物進(jìn)行純化/分離。
[0037]圖2示出了多糖生物素化的示例性實(shí)例:生物素衍生物(胺-PEG3-生物素，也稱作(+)_生物素酰_3，6，9-三氧代十一烷二胺)的結(jié)構(gòu)、CDAP的結(jié)構(gòu)、以及EDC的結(jié)構(gòu)。圖中還顯示了多糖生物素化方法的示意圖:使用CDAP作為活化試劑的過(guò)程(I);或使用EDC作為活化試劑的過(guò)程(2)。用于生物素化的其它方式均涵蓋于本發(fā)明的方法中。
[0038]圖3A-圖3C顯示了重組rhizavidin和rhizavidin-抗原融合蛋白的實(shí)施方式。圖3A顯示了修飾的rhizavidin(上圖)和rhizavidin-抗原融合蛋白(下圖)的結(jié)構(gòu)示意圖。將所有構(gòu)建體克隆進(jìn)PET21b載體，并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21(DE3)菌株中以進(jìn)行表達(dá)。圖3B顯示了純化的重組rhizavidin (rRhavi)的SDS-PAGE。圖3C顯示了純化的rhav1-抗原融合蛋白的 SDS-PAGEo 泳道 I:rhav1-Pdt ;泳道 2:rhav1-PsaA ;泳道 3:rhav1-spl733 ;泳道4:rhav1-spl534 ;泳道 5:rhav1-sp0435 ;泳道 6:rhav1-spl458 ;泳道 7:rhav1-ESAT-6 /CfplO ;泳道 8:rhav1-TB9.8 / TB10.4 ;泳道 9:rhavi_MPT64 ;泳道 10:rhavi_MPT83。
[0039]圖4A-圖4C顯示了組裝的實(shí)例MAPS的洗脫圖譜。圖4A的MAPS通過(guò)將0.5mg純化的rRhavi與Img生物素化的葡聚糖90(BD90，平均MW60-90KD)在4°C孵育過(guò)夜組裝而成，然后施加于superdex-200柱。峰A和峰B表示含有MAPS復(fù)合物的洗脫部分(fraction),峰C表示含有游離rRhavi的洗脫部分。圖4B顯示了峰部分的SDS-PAGE。所有樣品在具有IOmM DTT的SDS樣品緩沖液中煮沸。圖4C顯示了 MAPS復(fù)合物的穩(wěn)定性。處理相同量的樣品，然后將其應(yīng)用于SDS-PAGE。即使是在經(jīng)含有還原劑的SDS樣品緩沖液處理之后(泳道I)，MAPS復(fù)合物仍保持完整，其僅在煮沸后可被破壞，這證明了締合的穩(wěn)定性。泳道1:用含有IOmM DTT的SDS樣品緩沖液處理過(guò)的MAPS，在室溫下10分鐘；泳道2:用不含DTT的SDS樣品緩沖液處理過(guò)的MAPS，煮沸10分鐘；泳道3:用含有IOmM DTT的SDS樣品緩沖液處理過(guò)的MAPS，煮沸10分鐘。
[0040]圖5顯示了在不同溫度以及不同濃度的PS和蛋白抗原下MAPS復(fù)合物的組裝。MAPS復(fù)合物在多糖(PS)或蛋白抗原的寬濃度范圍內(nèi)(低至0.1mg / ml)均可有效地進(jìn)行組裝。該組裝可通過(guò)在4°C (圖5A)或在25V (圖5B)孵育過(guò)夜而完成，這取決于抗原的穩(wěn)定性?？赏ㄟ^(guò)在事先將樣品煮沸或不煮沸的情況下，將組裝混合物通過(guò)SDS-PAGE跑膠來(lái)對(duì)MAPS復(fù)合物的組裝效率進(jìn)行評(píng)價(jià)。在不經(jīng)過(guò)煮沸處理的情況下，并入到MAPS復(fù)合物中的蛋白抗原繼續(xù)待在PS上，因此在凝膠上顯示為分子量非常大的帶(MAPS / PS);只有未結(jié)合的蛋白可跑至凝膠的較低處，并在抗原的預(yù)期分子量處(單體位置或二聚體位置)被檢測(cè)到。通過(guò)對(duì)煮沸前后的蛋白抗原條帶作比較，可估算出組裝至MAPS復(fù)合物中的抗原的百分比。通常情況下，4°C的組裝效率大于85%，25°C的組裝效率接近95% -99%。
[0041]圖6顯示了以不同比例的蛋白與多糖組裝的MAPS的洗脫圖譜。將0.5mg純化的rRhavi分別與lmg、0.5mg或0.1mg的BD90孵育過(guò)夜,然后應(yīng)用于使用superdex200柱的凝膠過(guò)濾色譜。相比以較低的蛋白對(duì)多糖比例組裝的MAPS復(fù)合物，以較高的蛋白對(duì)多糖比例組裝的MAPS復(fù)合物似乎具有更高的分子量。對(duì)每個(gè)樣品中含有MAPS復(fù)合物的峰部分(用箭頭表示)進(jìn)行收集。對(duì)純化的MAPS復(fù)合物中的蛋白對(duì)多糖的比例進(jìn)行測(cè)定并且顯示出與輸入比(inpu t ratio)具有良好的相關(guān)性。
[0042]圖7顯示了以各種大小的多糖組裝的MAPS的洗脫圖譜。將0.5mg融合抗原與0.25mg生物素化的葡聚糖一起進(jìn)行孵育，所述生物素化的葡聚糖的平均分子量為425KD-500KD (BD500)、150KD (BD150)或 60KD-90KD (BD90)。使用 Superpose6 柱對(duì) MAPS 復(fù)合物進(jìn)行分離；色譜圖譜顯示，用較大的多糖組裝的MAPS復(fù)合物具有較大的大小。
[0043]圖8A-圖8D顯示了具有多抗原的MAPS組裝。圖8A顯示了具有不同比例的兩種抗原的MAPS組裝。二價(jià)MAPS復(fù)合物通過(guò)如下方式來(lái)制備:將生物素化肺炎鏈球菌(SP)血清型14莢膜多糖與兩種不同的肺炎球菌融合抗原rhav1-1652和rhavi_0757進(jìn)行孵育，所述 rhav1-1652 和 rhav1-0757 以 1:4、1:2、1:1、2:1 或 4:1 的摩爾比進(jìn)行混合。SDS-PAGE顯示，MAPS復(fù)合物中所并入的每種抗原的量與輸入比具有很好的相關(guān)性。圖SB-圖8D顯示了多價(jià)MAPS復(fù)合物，所述多價(jià)MAPS復(fù)合物用生物素化的多糖(葡聚糖或血清型3肺炎球菌莢膜多糖)連接2種(2V，圖8B)、3種(3V，圖8C)或5種(5V，圖8D)不同的肺炎球菌抗原和/或肺結(jié)核抗原而制得。SDS-PAGE顯示了并入到MAPS復(fù)合物中的抗原。在具有IOmMDTT的SDS樣品緩沖液中將所有樣品煮沸。
[0044]圖9顯示以MAPS復(fù)合物進(jìn)行的免疫誘發(fā)了針對(duì)多糖抗原的強(qiáng)抗體應(yīng)答。與僅接受佐劑(無(wú)Ag)的動(dòng)物組或接受未偶聯(lián)(uncoupled)的多糖和蛋白混合物(混合物)的動(dòng)物組相比，用MAPS復(fù)合物免疫的小鼠產(chǎn)生了顯著較高量的抗多糖抗體，所述MAPS復(fù)合物是由生物素化葡聚糖(9A)、Vi多糖(9B)或肺炎球菌細(xì)胞壁多糖(CWPS) (9C)制成。圖9D-圖9F顯示了，與傳統(tǒng)綴合疫苗相比，MAPS復(fù)合物在產(chǎn)生抗PS Ab方面要更優(yōu)。MAPS復(fù)合物由SP血清型1、5和14莢膜多糖(CPS)制成，其裝載有五種蛋白抗原。用MAPS或Prevnar 13?(肺炎球菌13價(jià)綴合疫苗[白喉CRM197蛋白]；ffyeth / Pfizer) (PCV13)間隔2周對(duì)小鼠皮下免疫兩次，并在第二次免疫后2周，通過(guò)ELISA對(duì)針對(duì)所接種的血清型CPS的血清IgG抗體進(jìn)行分析。將PCV13免疫小鼠中的抗CPS IgG的效價(jià)任意地(arbitrarily)設(shè)置為1200單位以進(jìn)行比較。對(duì)于所有測(cè)試的血清型而言，與PCV13接種所產(chǎn)生的抗CPS IgG抗體水平相比，MAPS復(fù)合物的免疫產(chǎn)生了相似(血清型5)或者高得多(血清型I和血清型14)的抗CPS IgG抗體水平。血清型I (圖9D);血清型5 (圖9E);血清型14 (圖9F)。
[0045]圖10比較了由不同免疫劑量的MAPS誘導(dǎo)出的抗PS抗體。MAPS復(fù)合物是由血清型5SP CPS制成，裝載有五種蛋白抗原。以每劑量PS含量為I μ g-16 μ g向小鼠給予MAPS復(fù)合物，免疫兩次，間隔2周。在第二次免疫后兩周，對(duì)不同免疫組間針對(duì)血清型5CPS的血清抗體進(jìn)行測(cè)量和比較。在所有劑量中，MAPS的免疫均誘導(dǎo)出針對(duì)血清型5CPS的穩(wěn)健IgG抗體。給予每劑量2 μ g PS產(chǎn)生了最高的抗體效價(jià)，而將PS劑量增加至16 μ g使抗體效價(jià)減少了約4倍。
[0046]圖11顯示了由MAPS復(fù)合物免疫所產(chǎn)生的抗PS抗體在體外促進(jìn)了對(duì)靶病原體的殺滅。圖1lA證明了對(duì)表達(dá)Vi的細(xì)菌的抗體介導(dǎo)的殺滅。來(lái)自用MAPS復(fù)合物(使用Vi作為骨架)免疫而非來(lái)自其它兩組的動(dòng)物的血清在孵育I小時(shí)內(nèi)顯示出對(duì)表達(dá)Vi的菌株強(qiáng)有力的殺滅(超過(guò)90%的殺滅)。來(lái)自于用明礬(Alum)(虛線)、混合物(黑線)、或MAPS (灰線)免疫的小鼠的血清。圖1lB-圖1lD表明來(lái)自MAPS免疫小鼠的血清的調(diào)理吞曬(opsonophagocytic) 殺滅活性比來(lái)自許可疫苗PCV13免疫小鼠的血清的殺滅活性要好。對(duì)來(lái)自PCV13免疫的小鼠或MAPS免疫的小鼠的血清在如下方面的能力進(jìn)行測(cè)量和比較:介導(dǎo)通過(guò)嗜中性粒細(xì)胞對(duì)肺炎球菌的體外調(diào)理吞噬殺滅。人嗜中性粒細(xì)胞分化自HL-60細(xì)胞系的細(xì)胞。調(diào)理吞噬殺滅通過(guò)如下方式完成:將不同稀釋度的血清(血清型1(圖11B)、血清型5(圖11C)或血清型13(圖11D))、肺炎球菌以及分化的HL-60細(xì)胞在37°C孵育I小時(shí)(在幼兔補(bǔ)體存在下)。孵育后，將小份(aliquot)混合物鋪板以對(duì)存活的細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。將調(diào)理吞噬殺滅單位定義為觀察到50%細(xì)菌殺滅的血清的稀釋倍數(shù)。對(duì)于所有測(cè)試的血清型而言，相比來(lái)自PCV13免疫小鼠的血清，來(lái)自MAPS免疫小鼠的血清顯示出高至少4倍的殺滅活性(0ΡΑ效價(jià))。圖1lB-圖1lD:來(lái)自用明礬(虛線)、PCV13(黑線)、或MAPS (灰線)免疫小鼠的血清。
[0047]圖12A-圖12D表明MAPS復(fù)合物的免疫誘導(dǎo)出針對(duì)蛋白抗原的穩(wěn)健抗體應(yīng)答和細(xì)胞應(yīng)答。二價(jià)MAPS復(fù)合物由生物素化的葡聚糖(BD500)和兩種肺炎球菌抗原(rhav1-Pdt和rhav1-PsaA)制成。皮下接種每?jī)芍苓M(jìn)行一次，進(jìn)行三次。圖12A顯示了在最后一次免疫后2周時(shí)所測(cè)量到的針對(duì)PsaA或Pdt的血清IgG抗體的結(jié)果。相比接受混合物的小鼠，用MAPS復(fù)合物免疫的小鼠產(chǎn)生出具有顯著較高效價(jià)的抗Pdt抗體和抗PsaA抗體。通過(guò)對(duì)免疫動(dòng)物全血的體外刺激來(lái)對(duì)抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)血液樣品中的IL-17A(圖12B)和IFN-y (圖12C)的體外生產(chǎn)進(jìn)行測(cè)量，所述血液樣品與純化的PsaA、Pdt或肺炎球菌全細(xì)胞抗原(WCA) —起孵育了 6天。與用混合物免疫的小鼠相比，接受MAPS復(fù)合物的動(dòng)物顯示出顯著較強(qiáng)的IL-17A應(yīng)答和IFN-y應(yīng)答。圖12D顯示了通過(guò)WCA刺激得到的IL-17A生產(chǎn)和IFN-y生產(chǎn)的相關(guān)性。對(duì)于所有圖，棒表示具有標(biāo)準(zhǔn)差的平均值，使用Mann-Whitney檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，或者對(duì)于相關(guān)性使用Spearman R。
[0048]圖13顯示了對(duì)不同大小的MAPS復(fù)合物的免疫原性的評(píng)價(jià)。MAPS復(fù)合物由兩種肺炎球菌融合抗原Crhav1-PsaA和rhav1-Pdt)制成,并使用不同長(zhǎng)度的葡聚糖作為骨架(BD500, Mw為425-500kDa ；BD90, Mw為60_90kDa)。在免疫三次之后，對(duì)針對(duì)葡聚糖、兩種蛋白抗原PdT和PsaA的抗體應(yīng)答以及抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行測(cè)量和比較。如圖所示，相比接受較小復(fù)合物(MAPS BD90)的動(dòng)物，用較大復(fù)合物(MAPS BD500)免疫的小鼠產(chǎn)生了相似水平的抗PsaA抗體和抗Pdt抗體(圖13B)，但是產(chǎn)生了顯著較高效價(jià)的抗葡聚糖抗體(圖13A)以及顯著較高的IL-17A相關(guān)的T細(xì)胞應(yīng)答(圖13C)。
[0049]圖14顯示了，將共刺激因子(TLR配體)加入到MAPS復(fù)合物中促進(jìn)了 IL-17A和IFN-Y相關(guān)的T細(xì)胞應(yīng)答。MAPS復(fù)合物由生物素化的葡聚糖和一種肺炎球菌蛋白抗原(rhav1-0435)制成，具有或不具有額外的TLR配體/激動(dòng)劑:rhavi_Pdt，TLR4配體；Pam3CSK4，TLR2激動(dòng)劑。Rhav1-Pdt的并入經(jīng)由rhavi和生物素之間的親和相互作用實(shí)現(xiàn)，而Pam3CSK4共價(jià)連接至`葡聚糖骨架。皮下給予三次免疫，并對(duì)針對(duì)0435蛋白的T細(xì)胞應(yīng)`答進(jìn)行測(cè)量和比較。結(jié)果顯示，TLR2激動(dòng)劑或TLR4和TLR2配體的聯(lián)合的添加顯著增強(qiáng)了針對(duì)蛋白抗原的IL-17A和IFN-y相關(guān)的T細(xì)胞應(yīng)答。
[0050]圖15顯示多價(jià)肺炎球菌/結(jié)核分枝桿菌(TB)聯(lián)合疫苗(combination vaccine)的實(shí)例。多價(jià)SP / TB聯(lián)合MAPS疫苗通過(guò)使用SP血清型3，并裝載一種SP蛋白(肺炎球菌溶血素類毒素，Pdt)以及六種TB蛋白(四種融合構(gòu)建體)而制成(圖15A)。用SP /TB MAPS免疫小鼠誘導(dǎo)出針對(duì)3型CPS (圖15B，左側(cè))以及針對(duì)Pdt (圖15B，右側(cè))的高效價(jià)IgG抗體，并導(dǎo)致100%保護(hù)小鼠免受血清型3肺炎球菌的致死肺部感染(圖15C)。圖15D-圖15J顯示了通過(guò)接種SP / TB MAPS所誘導(dǎo)的針對(duì)TB抗原的B細(xì)胞免疫和T細(xì)胞免疫。圖MD顯示了針對(duì)不同TB蛋白抗原的抗體應(yīng)答。圖15E-圖15F顯示了，在用純化的TB蛋白抗原體外刺激后，在來(lái)自MAPS免疫小鼠的全血樣品中強(qiáng)烈的IL-17A(圖15E)和IFN-Y (圖15F)相關(guān)的T細(xì)胞應(yīng)答。圖15G和圖15H顯示了在來(lái)自MAPS免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞中，針對(duì)純化的TB蛋白抗原的混合物或針對(duì)TB全細(xì)胞提取物的IL-17A(圖15G)和IFN-y (圖15H)相關(guān)的T細(xì)胞應(yīng)答。圖151和圖15J提供了關(guān)于由MAPS免疫誘導(dǎo)的TB特異性記憶T細(xì)胞/效應(yīng)T細(xì)胞的更多數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，⑶4+T細(xì)胞而非⑶8+T細(xì)胞的耗竭(depleted)對(duì)TB抗原特異性細(xì)胞因子的產(chǎn)生具有重大影響，這表明用MAPS疫苗的免疫主要致敏(primed) 了 CD4+T細(xì)胞(T輔助細(xì)胞)免疫應(yīng)答。
[0051]圖16證明了基于原型(prototype)MAPS的多價(jià)免疫原性組合物預(yù)防肺炎球菌的侵襲性感染和鼻咽定殖。多價(jià)SP MAPS使用SP細(xì)胞壁多糖(CWPS)作為骨架制成，并裝載有五種肺炎球菌蛋白抗原(圖16A)。用該SP MAPS對(duì)小鼠進(jìn)行三次免疫，每次間隔兩周，并在最后一次免疫后兩周，對(duì)針對(duì)肺炎球菌的血清抗體和特異性T細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行分析。圖16B顯示了針對(duì)CWPS (左側(cè))或針對(duì)肺炎球菌全細(xì)胞抗原(WCA)(右側(cè))的血清IgG抗體。相比僅接受佐劑(無(wú)Ag)或未偶聯(lián)的PS /蛋白混合物(混合物)的對(duì)照組小鼠，用SP MAPS免疫的小鼠產(chǎn)生了具有顯著較高效價(jià)的針對(duì)CWPS或WCA的抗體。圖16C和圖16D顯示了由SP MAPS接種所誘導(dǎo)的SP特異性T細(xì)胞應(yīng)答。用純化的肺炎球菌蛋白(抗原混合物)或WCA對(duì)來(lái)自不同免疫組小鼠的外周血進(jìn)行刺激。來(lái)自MAPS接種小鼠而非來(lái)自對(duì)照組的細(xì)胞對(duì)SP抗原應(yīng)答強(qiáng)烈，并且引起了 IL-17A(圖16C)和IFN-y (圖16D)的穩(wěn)健產(chǎn)生。圖16E和圖16F顯示了用MAPS復(fù)合物進(jìn)行的接種保護(hù)小鼠免受肺炎球菌的侵襲性感染以及鼻咽定殖。不同免疫組的小鼠在肺穿刺模型(lung aspiration model)中以SP血清型3菌株WU2進(jìn)行激發(fā)(challenged)(圖16E)，或在鼻定殖模型中以血清型6肺炎球菌菌株603進(jìn)行激發(fā)(圖16F)。對(duì)膿毒癥或定殖的保護(hù)僅在MAPS免疫的小鼠中觀察到。
【具體實(shí)施方式】
[0052]應(yīng)該理解的是，本發(fā)明并不限于本文所述的具體方法學(xué)、方案和試劑等，此類方法學(xué)、方案和試劑等可以變化。本文所使用的術(shù)語(yǔ)僅出于描述【具體實(shí)施方式】的目的，而并不意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅由權(quán)利要求限定。
[0053]除非上下文中清楚地另有說(shuō)明，本文和權(quán)利要求中所使用的單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)的情況，反之亦然。除非通過(guò)例如“任一(either)”進(jìn)行修飾，術(shù)語(yǔ)“或(or)”具有包含的意味。除了在操作實(shí)施例中或另有說(shuō)明的情況下，本文所使用的表示成分的量或反應(yīng)條件的所有數(shù)字均應(yīng)被理解為在所有情況下由術(shù)語(yǔ)“約(about)”修飾。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解的是，對(duì)于核酸或多肽所給出的所有堿基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子質(zhì)量的值均為近似值，并且提供用于說(shuō)明。
[0054]為了描述和公開(kāi)的目的，以引用的方式將所標(biāo)明的所有專利和其它出版物明確并入本文，例如，在此類出版物中描述的可用于本發(fā)明的方法學(xué)。這些出版物僅由于它們的公開(kāi)早于本申請(qǐng)的申請(qǐng)日而提供。在這一方面不應(yīng)視作本發(fā)明人無(wú)權(quán)借助于在先發(fā)明或因任何其它原因而將公開(kāi)的內(nèi)容提前。所有關(guān)于這些文件的日期的聲明或這些文件的內(nèi)容的表述是基于申請(qǐng)者可得的信 息，并不構(gòu)成關(guān)于這些文件的日期或這些文件的內(nèi)容的正確性的任何承認(rèn)。
[0055]除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】中的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。盡管任何已知的方法、設(shè)備和材料可被用于本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中，就這一點(diǎn)而言，在本文中對(duì)所述方法、設(shè)備和材料進(jìn)行了描述。
[0056]本發(fā)明涉及免疫原性組合物和包含免疫原性復(fù)合物的組合物，所述免疫原性復(fù)合物包含至少一種抗原或多種抗原，所述至少一種抗原或多種抗原連接至聚合物支架以在給予受試者時(shí)用于引發(fā)針對(duì)連接至所述聚合物的各抗原的免疫應(yīng)答，以及任選的針對(duì)所述聚合物本身的免疫應(yīng)答。該多抗原提呈系統(tǒng)(MAPS)刺激體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答:它可使用單個(gè)MAPS免疫原性構(gòu)建體來(lái)產(chǎn)生針對(duì)多種蛋白抗原的抗多糖抗體和B細(xì)胞/ Thl /Thl7應(yīng)答。賦予生物體的聯(lián)合的B細(xì)胞免疫力和T細(xì)胞免疫力可能代表了針對(duì)多種疾病的最佳疫苗策略，所述疾病包括肺炎球菌疾病相關(guān)的侵襲性感染和鼻咽攜帶(carriage)。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原性組合物為疫苗或包含于疫苗中。
[0057]因此，本發(fā)明一方面涉及免疫原性組合物(多抗原提呈系統(tǒng)，或MAPS)，所述免疫原性組合物包含至少一種聚合物(例如，一種多糖)、至少一種蛋白抗原或肽抗原及至少一種互補(bǔ)親和分子對(duì)，所述互補(bǔ)親和分子對(duì)包含(i)與所述聚合物締合的第一親和分子以及(?)與所述抗原締合的互補(bǔ)親和分子，所述互補(bǔ)親和分子對(duì)用于間接地將所述抗原連接至所述聚合物(例如，所述第一親和分子與所述互補(bǔ)親和分子締合，以將所述抗原連接至所述聚合物)。因此，可將所述聚合物用作支架以連接至少I(mǎi)種、或至少2種或更多種(例如，多種)相同或不同的抗原。本文所公開(kāi)的免疫原性組合物可用于同時(shí)引發(fā)針對(duì)多種抗原的體液免疫力和細(xì)胞免疫力這兩種免疫力。
[0058]因此，本文的實(shí)施方式提供了對(duì)引發(fā)受試者中的免疫應(yīng)答有用的免疫原性組合物和方法，所述免疫原性組合物和方法可使用其自身或與基本上任意已存在的疫苗方法結(jié)合或混合使用。
[0059]定義:
[0060]為了方便起見(jiàn)，這里收集了在整個(gè)申請(qǐng)(包括說(shuō)明書(shū)、實(shí)施例以及所附的權(quán)利要求書(shū))中所使用到的某些術(shù)語(yǔ)。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。
[0061]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“免疫原性組合物”被定義為當(dāng)給予受試者時(shí)，能夠引發(fā)免疫應(yīng)答(例如抗體免疫應(yīng)答或細(xì)胞免疫應(yīng)答)的組合物。本發(fā)明的免疫原性組合物可具有免疫保護(hù)性或治療性，或可不具有免疫保護(hù)性或治療性。當(dāng)本發(fā)明的免疫原性組合物預(yù)防、轉(zhuǎn)佳(ameliorate)、緩和(palliate)或消除(eliminate)受試者的疾病時(shí),所述免疫原性組合物即可任選地被稱為疫苗。然而，本文使用的術(shù)語(yǔ)免疫原性組合物并不意味著局限于疫苗。
[0062]本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗原”是指促進(jìn)針對(duì)該物質(zhì)的免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，抗原為肽或多肽；在其它實(shí)施方式中，它可為引發(fā)針對(duì)該物質(zhì)的免疫應(yīng)答的任何化學(xué)品或部分，例如，碳水化合物。
[0063]本文使用的術(shù)語(yǔ)“締合(associates) ”是指兩個(gè)以上分子通過(guò)非共價(jià)鍵或共價(jià)鍵的連接。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)兩個(gè)以上分子的連接通過(guò)共價(jià)鍵發(fā)生時(shí)，所述兩個(gè)以上分子可融合在一起、或交聯(lián)在一起。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)兩個(gè)以上分子的連接通過(guò)非共價(jià)鍵發(fā)生時(shí)，所述兩個(gè)以上分子可形成復(fù)合物。
[0064]本文使用的術(shù)語(yǔ)“復(fù)合物”是指兩個(gè)以上分子的集合(collection)，所述分子通過(guò)除共價(jià)相互作用以外的手段進(jìn)行空間連接；例如它們可通過(guò)靜電相互作用、氫鍵或通過(guò)疏水相互作用(即，范德華力)連接。
[0065]本文使用的術(shù)語(yǔ)“交聯(lián)”是指在聚合物鏈和第二分子之間形成的共價(jià)鍵。術(shù)語(yǔ)“交聯(lián)劑”是指如下實(shí)體(entity)或試劑:所述實(shí)體或試劑為催化聚合物和實(shí)體(例如，第一親和分子或共刺激因子)形成共價(jià)連接的中間分子。
[0066]本文使用的術(shù)語(yǔ)“融合”意思是至少一個(gè)蛋白或肽與第二個(gè)蛋白或肽物理締合。在一些實(shí)施方式中，融合通常為共價(jià)連接，但是，其它類型的連接也包含于術(shù)語(yǔ)“融合”之內(nèi)，所述其它類型的連接包括例如經(jīng)由靜電相互作用、或疏水相互作用等的連接。共價(jià)連接可包括如融合蛋白的連接、或化學(xué)偶聯(lián)的連接(例如，通過(guò)在兩個(gè)半胱氨酸殘基之間形成的二硫鍵)。
[0067]本文使用的術(shù)語(yǔ)“融合多肽”或“融合蛋白”是指通過(guò)將兩個(gè)以上多肽序列接合(joining)在一起而制造的蛋白。本發(fā)明所涵蓋的融合多肽包括嵌合基因構(gòu)建體的翻譯產(chǎn)物，所述嵌合基因構(gòu)建體將編碼一種或多種抗原或其部分或突變體的DNA序列與編碼第二多肽的DNA序列接合以形成單個(gè)開(kāi)放讀碼框。換句話說(shuō)，“融合多肽”或“融合蛋白”為通過(guò)肽鍵或經(jīng)由數(shù)個(gè)肽接合的兩個(gè)以上蛋白的重組蛋白。在一些實(shí)施方式中，抗原融合的第二蛋白為能夠與互補(bǔ)親和對(duì)的第一親和分子相互作用的互補(bǔ)親和分子。
[0068]術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白”可交換使用，是指通過(guò)肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合物，出于所請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明的目的，通常具有至少25個(gè)氨基酸的最小長(zhǎng)度。術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白”可包括多體蛋白(multimeric protein),例如,包含一個(gè)以上結(jié)構(gòu)域或亞基的蛋白。本文使用的術(shù)語(yǔ)“肽”是指肽鍵連接的氨基酸的序列，含有小于25個(gè)氨基酸，例如，長(zhǎng)度為約4個(gè)氨基酸至25個(gè)氨基酸。蛋白和肽可由通過(guò)肽鍵連接的線性排列的氨基酸組成，無(wú)論是生物生產(chǎn)的、重組生產(chǎn)的、或是合成生產(chǎn)的，以及無(wú)論是由天然存在的氨基酸組成的還是由非天然存在的氨基酸組成的，均包含在這一定義內(nèi)。大于25個(gè)氨基酸的全長(zhǎng)蛋白及其片段均涵蓋在蛋白這一定義中。該術(shù)語(yǔ)還包括具有多肽的共翻譯修飾(例如，信號(hào)肽切割)和翻譯后修飾的多肽，例如，二硫鍵形成、糖基化、乙?；⒘姿峄?、脂化、蛋白水解切割(例如，金屬蛋白酶的切割)等。此外，本文使用的“多肽”是指包含對(duì)天然序列的修飾(例如刪除、添加和替換(如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知在自然界通常是保守的))的蛋白，只要該蛋白保持所需的活性。這些修飾可以是仔細(xì)考慮過(guò)的，例如通過(guò)定點(diǎn)突變，或者可為偶然的，例如通過(guò)產(chǎn)生所述蛋白的宿主的突變，或由于PCR擴(kuò)增或其它重組DNA方法所產(chǎn)生的錯(cuò)誤。
[0069] “信號(hào)序列”是指這樣的核酸序列:當(dāng)將其可操作地連接至核酸分子時(shí)，促進(jìn)由所述核酸分子編碼的產(chǎn)物(例如，蛋白或肽)的分泌。在一些實(shí)施方式中，所述信號(hào)序列優(yōu)選位于所述核酸分子的5’端。
[0070]本文使用的術(shù)語(yǔ)“N-糖基化的(glycosylated) ”或“N-糖基化(glycosylation) ”是指糖部分與多肽中的天冬酰胺殘基的共價(jià)連接。糖部分可包括但不限于葡萄糖、甘露糖和N-乙酰葡糖胺。聚糖的修飾還包括，例如，唾液酸化。
[0071]“抗原提呈細(xì)胞”或“APC”是表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子，并可將與MHC復(fù)合的外源抗原呈現(xiàn)在其表面的細(xì)胞。抗原提呈細(xì)胞的實(shí)例為樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、成纖維細(xì)胞(皮膚)、胸腺上皮細(xì)胞、甲狀腺上皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞(腦)、胰腺β細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。
[0072]在“抗原功能部分”的背景下使用的術(shù)語(yǔ)“功能部分”或“功能片段”是指抗原或抗原多肽的一部分，所述部分介導(dǎo)與全抗原部分相同的作用(例如，在受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答)或介導(dǎo)與其它分子的締合(例如，包含至少一個(gè)表位)。
[0073]本文所使用的術(shù)語(yǔ)靶抗原的“部分”為至少3個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，并且可以為例如，至少6個(gè)、至少8個(gè)、至少10個(gè)、至少14個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少18個(gè)、至少19個(gè)、至少20個(gè)或至少25個(gè)氨基酸或更多個(gè)氨基酸，包括端值。
[0074]術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞”或“CTL”是指通過(guò)凋亡或其它機(jī)制誘導(dǎo)靶細(xì)胞死亡的淋巴細(xì)胞。CTL與靶細(xì)胞通過(guò)TCR與靶細(xì)胞表面的經(jīng)處理的抗原(Ag)的相互作用而形成抗原特異性綴合物，從而導(dǎo)致所靶向的細(xì)胞凋亡。凋亡小體被巨噬細(xì)胞清除。術(shù)語(yǔ)“CTL應(yīng)答”用于指CTL細(xì)胞介導(dǎo)的初次免疫應(yīng)答。
[0075]本文使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞介導(dǎo)的免疫”或“CMI”是指如下免疫應(yīng)答:所述免疫應(yīng)答不涉及抗體或補(bǔ)體，而是涉及例如巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)、抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Τ細(xì)胞)、T輔助細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞的活化，以及在針對(duì)靶抗原的應(yīng)答中各種細(xì)胞因子的釋放。換種說(shuō)法，CMI涉及免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞和其它淋巴細(xì)胞)，所述免疫細(xì)胞結(jié)合至呈現(xiàn)靶抗原的其它細(xì)胞(如抗原提呈細(xì)胞(APC))的表面并觸發(fā)應(yīng)答。所述應(yīng)答可能涉及其它淋巴細(xì)胞和/或任何其它白血細(xì)胞(白細(xì)胞)以及細(xì)胞因子的釋放。細(xì)胞免疫通過(guò)以下機(jī)制保護(hù)機(jī)體:(I)活化抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，所述CTL能夠破壞將外源抗原的表位呈現(xiàn)在其表面的機(jī)體細(xì)胞，例如，病毒感染的細(xì)胞和攜帶胞內(nèi)細(xì)菌的細(xì)胞；(2)活化巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，使它們能夠破壞胞內(nèi)病原體；以及(3)刺激細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子或趨化因子，所述細(xì)胞因子或趨化因子影響涉及適應(yīng)性免疫應(yīng)答和固有免疫應(yīng)答的其它細(xì)胞(例如T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞)的功能。
[0076]本文使用的術(shù)語(yǔ)“免疫細(xì)胞”是指在針對(duì)直接或間接抗原刺激的應(yīng)答中能夠釋放細(xì)胞因子、趨化因子或抗體的任何細(xì)胞。本文中的“免疫細(xì)胞”涵蓋淋巴細(xì)胞，包括天然殺傷(NK)細(xì)胞、T細(xì)胞(CD4+和/或CD8+細(xì)胞)、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞；白細(xì)胞；樹(shù)突狀細(xì)胞；肥大細(xì)胞；s單核細(xì)胞；以及能夠在針對(duì)直接或間接抗原刺激的應(yīng)答中生產(chǎn)細(xì)胞因子分子或趨化因子分子的任何其它細(xì)胞。通常，免疫細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，例如，T細(xì)胞淋巴細(xì)胞。
[0077]本文使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”是指在用抗原刺激的應(yīng)答中由免疫細(xì)胞所釋放的分子。此類細(xì)胞因子的實(shí)例包括但不限于:GM-CSF、IL-1 a、IL-1 β、IL_2、IL_3、IL_4、IL_5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17A、IL-17F 或 IL-17 家族的其它成員、IL-22、IL-23、IFN- a、IFN- β、IFN- y、MIP-1 a、MIP-1 β、TGF- β , TNF a 或 TNF β。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”不包括抗體。
[0078]本文使用的術(shù)語(yǔ)“受試者”是指對(duì)引發(fā)免疫應(yīng)答有用的任何動(dòng)物。所述受試者可以是野生動(dòng)物、馴養(yǎng)動(dòng)物、商業(yè)動(dòng)物或伴侶動(dòng)物，例如，鳥(niǎo)類或哺乳動(dòng)物。所述受試者可為人。盡管在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，設(shè)想本文所公開(kāi)的免疫原性組合物可適于對(duì)人進(jìn)行治療性處理或預(yù)防性處理，但其也適用于溫血脊椎動(dòng)物，例如，哺乳動(dòng)物，如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(特別是高等靈長(zhǎng)類動(dòng)物)、綿羊(sheep)、狗、嚙齒類動(dòng)物(例如，小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、豬、貓、兔、牛(cow);以及非哺乳動(dòng)物，如雞、鴨或火雞。在另一實(shí)施方式中，所述受試者為野生動(dòng)物，例如，用于 對(duì)例如禽流感進(jìn)行診斷的鳥(niǎo)。在一些實(shí)施方式中，所述受試者為作為疾病模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或動(dòng)物替代品。所述受試者可為需要獸醫(yī)處理的受試者，在其中，弓丨發(fā)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答對(duì)預(yù)防疾病和/或控制疾病的傳播有用，例如，SIV、STL1、SFV，或就畜禽(live-stock)而言為口蹄疫,或就鳥(niǎo)類而言為馬立克氏病(Marek’s disease)或禽流感，以及其它此類疾病。
[0079]本文使用的術(shù)語(yǔ)“病原體”是指在受試者中引發(fā)疾病或紊亂的生物體或分子。例如，病原體包括但不限于病毒、真菌、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)以及其它感染性生物體或從中而來(lái)的分子，以及在藻類、真菌、酵母、原生動(dòng)物等分類中的分類學(xué)相關(guān)宏觀生物體(taxonomicallyrelated macroscopic organisms)。
[0080]“癌細(xì)胞”是指在體內(nèi)、離體，或者在組織培養(yǎng)中的癌細(xì)胞、癌前細(xì)胞(pre-cancerous cell)或轉(zhuǎn)化細(xì)胞,其具有自發(fā)的或誘發(fā)的表型變化,所述表型變化無(wú)需涉及對(duì)新遺傳物質(zhì)的吸收。盡管轉(zhuǎn)化可由轉(zhuǎn)化病毒的感染和新基因組核酸的并入而引起、或由對(duì)外源核酸的吸收而引起，它也可自發(fā)引起或在暴露于致癌物質(zhì)(carcinogen)后使得內(nèi)源性基因發(fā)生突變而引起。轉(zhuǎn)化/癌癥與如下?tīng)顩r有關(guān):例如，在適合的動(dòng)物宿主(如裸鼠)中的形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞永生化、異常生長(zhǎng)控制、病灶形成、錨著非依賴性(anchorageindependence)、惡性腫瘤(malignancy)、接觸抑制和生長(zhǎng)密度限制的缺失、生長(zhǎng)因子或血清非依賴性、腫瘤特異性標(biāo)志物、侵襲或轉(zhuǎn)移、以及腫瘤生長(zhǎng)。參見(jiàn)例如Freshney，CULTUREANIMAL CELLS =MANUAL BASIC TECH.(第三版，1994 年)。
[0081]術(shù)語(yǔ)“野生型”分別指通常與其在體內(nèi)存在時(shí)相同的、天然存在的編碼蛋白的正常多核苷酸序列或其部分，或蛋白序列或其部分。
[0082]術(shù)語(yǔ)“突變體”是指如下生物體或細(xì)胞:在其遺傳物質(zhì)方面具有任何變化、特別是相對(duì)于野生型多核苷酸序列的變化(即，刪除、替換、添加或改變)的生物體或細(xì)胞；或相對(duì)于野生型蛋白序列具有任何變化的生物體或細(xì)胞。可將術(shù)語(yǔ)“變體(variant)”與“突變體(mutant) ”互換使用。盡管通常假定遺傳物質(zhì)的變化導(dǎo)致蛋白功能改變，但術(shù)語(yǔ)“突變體”和“變體”是指野生型蛋白序列的改變，而不管所述改變是否使所述蛋白的功能發(fā)生變化(如，增加、減少、賦予新的功能)，或者所述改變是否對(duì)蛋白的功能不產(chǎn)生影響(例如，突變或變異是沉默的)。
[0083]術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指可給予哺乳動(dòng)物而不產(chǎn)生過(guò)度毒性的化合物和組合物。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”不包括組織培養(yǎng)基。示例性的藥學(xué)上可接受的鹽包括但不限于無(wú)機(jī)酸鹽(mineral acid)，例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽等；以及有機(jī)酸鹽，例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。藥學(xué)上可接受的載體在本領(lǐng)域是公知的。 [0084]應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，蛋白或多肽通常含有除通常被稱為20種天然存在的氨基酸的20種氨基酸外的氨基酸，還應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可通過(guò)天然過(guò)程(如糖基化和其它翻譯后修飾)或通過(guò)本領(lǐng)域已知的化學(xué)修飾技術(shù)，對(duì)給定多肽中的多種氨基酸(包括末端氨基酸)進(jìn)行修飾。可在本發(fā)明的多肽中存在的已知修飾包括但不限于，乙?；Ⅴ；?、ADP核糖基化、酰胺化、黃素(flavin)的共價(jià)連接、血紅素(heme)部分的共價(jià)連接、多核苷酸或多核苷酸衍生物的共價(jià)連接、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)連接、磷脂?；嫉墓矁r(jià)連接、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、去甲基化、共價(jià)交聯(lián)的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、制劑、Y-羧化、糖化(glycation)、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蘧?；?、氧化、蛋白水解處理、磷酸化、異戍烯化(prenylation)、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化(sulfation)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)的向蛋白添加氨基酸(例如精氨酰化(arginylation))、以及泛素化(ubiquitination)。
[0085]本文使用的術(shù)語(yǔ)“同源(homologous) ”或“同源物(homologues) ”可互換使用，并且在用于描述多核苷酸或多肽時(shí)，表示當(dāng)進(jìn)行高同源性的最佳比對(duì)(optimally aligned)和比較(例如使用就比對(duì)具有默認(rèn)參數(shù)的BLAST，2.2.14版本)時(shí)，兩個(gè)多核苷酸或多肽、或其指定序列(具有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖騽h除或氨基酸插入或刪除)通常在其核苷酸中的至少70%的核苷酸是相同的。對(duì)于多肽，在多肽中應(yīng)該有至少30%的氨基酸一致性，或者對(duì)于較高的同源性為至少50%的氨基酸一致性。本文使用的術(shù)語(yǔ)“同系物(homolog)”或“同源”還指在結(jié)構(gòu)方面的同源性。對(duì)基因或多肽同源性的測(cè)定可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。在定義的百分比的情況下，所定義的百分比同源性意味著至少該百分比的氨基酸相似度(similarity)。例如，85%的同源性是指至少85%的氨基酸相似度。
[0086]本文使用的關(guān)于核酸序列、蛋白或多肽的術(shù)語(yǔ)“異源(heterologous) ”意味著在該細(xì)胞中這些分子并不是天然存在的。例如，插入細(xì)胞中的編碼本文所述的融合抗原多肽的核酸序列(例如在蛋白表達(dá)載體的情況下)即為異源核酸序列。
[0087]對(duì)于序列比較，通常一個(gè)序列作為參比序列，將測(cè)試序列與所述序列進(jìn)行比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試序列和參比序列輸入計(jì)算機(jī)，指定子序列坐標(biāo)(subsequencecoordinates)(如果需要的話)，并且指定序列算法程序參數(shù)。然后，序列比較算法基于指定的程序參數(shù)，計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參比序列的百分比序列一致性。在必要或需要的情況下，用于序列比較的最佳比對(duì)可通過(guò)本領(lǐng)域所公知的各種方法中的任何方法來(lái)進(jìn)行。
[0088]本文使用的術(shù)語(yǔ)“變體”可以指如下多肽或核酸:通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核酸的刪除、添加、替換或側(cè)鏈修飾而不同于天然存在的多肽或核酸，但還保留了天然存在分子的一種或多種特定功能或生物活性。氨基酸替換包括將氨基酸替換為不同的天然存在的氨基酸殘基或非常規(guī)的氨基酸殘基的改變。此類替換可被分類為“保守的”，在這種情況下，將多肽中含有的氨基酸殘基替換為另一種在極性、或側(cè)鏈功能或大小上具有類似特性的天然存在的氨基酸。本文所述的變體所涵蓋的替換也可為“非保守的”，其中，將存在于多肽中的氨基酸殘基替換為具有不同性質(zhì)的氨基酸(例如，用丙氨酸替換帶電氨基酸或疏水性氨基酸)，或者其中，將天然存在的氨基酸替換為非常規(guī)氨基酸。當(dāng)針對(duì)多核苷酸或多肽而使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“變體”內(nèi)還涵蓋了分別相比于參比多核苷酸或多肽(例如，相對(duì)于野生型多核苷酸或多肽)而言，在一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)方面的變化。
[0089]當(dāng)針對(duì)相比于原始抗原而言抗原的變體或抗原的功能衍生物而使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基本上相似”意味著特定的主題序列與抗原多肽序列因存在一個(gè)或多個(gè)替換、刪除或添加而不同，但保留了至少50%或更高(例如，至少60%、70%、80%、90%以上(包括端值))的抗原在受試者中引發(fā) 免疫應(yīng)答的功能。在對(duì)多核苷酸序列進(jìn)行測(cè)定中，能夠編碼基本上相似的氨基酸序列的所有主題多核苷酸序列均被認(rèn)為是與參比多核苷酸序列基本上相似，而不考慮密碼子序列的差別。如果滿足以下條件，則核苷酸序列“基本上類似”于給定抗原核酸序列:(a)所述核苷酸序列雜交至天然抗原序列的編碼區(qū)域；或(b)所述核苷酸序列能夠在適度嚴(yán)格條件(moderately stringent conditions)下雜交至天然抗原的核苷酸序列，并且具有類似于天然抗原蛋白的生物活性；或者(C)所述核苷酸序列相對(duì)于(a)或(b)中定義的核苷酸序列為遺傳密碼子簡(jiǎn)并的結(jié)果?；旧舷嗨频牡鞍着c相應(yīng)天然蛋白序列通常具有高于約80%的相似度。
[0090]如下所述，變體可包含保守的氨基酸變化或非保守的氨基酸變化。多核苷酸的改變可導(dǎo)致在由參比序列編碼的多肽中發(fā)生氨基酸替換、添加、刪除、融合和截短。變體還可包含氨基酸的插入、刪除或替換，包括通常不會(huì)發(fā)生在作為變體的基礎(chǔ)的多肽序列中的氨基酸和其它分子的插入和替換，例如但不限于通常不會(huì)在人蛋白中發(fā)生的鳥(niǎo)氨酸插入。“保守的氨基酸替換”由將一個(gè)氨基酸替換為另一種具有類似結(jié)構(gòu)性質(zhì)和/或化學(xué)性質(zhì)的氨基酸造成。提供了功能相似氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域所公知的。例如，以下六組各自包含彼此為保守替換的氨基酸:(I)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T) ； (2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；⑶天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；⑷精氨酸(R)、賴氨酸⑷；(5)異亮氨酸⑴、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、繳氨酸(V)；以及(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)。參見(jiàn)例如 Creighton, PROTEINS (ff.H.Freeman&C0.，1984 年)。
[0091]保守氨基酸的選擇可基于肽中待被替換的氨基酸的位置進(jìn)行選擇，例如，所述氨基酸是否在肽的外部并暴露于溶劑，或者是否在肽的內(nèi)部而不會(huì)暴露于溶劑。此類對(duì)保守氨基酸替換的選擇在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技能之內(nèi)。因此，能夠選擇適于蛋白或肽外部氨基酸(即暴露于溶劑的氨基酸)的保守氨基酸替換。這些替換包括但不限于以下替換:將Y替換為F，將T替換為S或K，將P替換為A，將E替換為D或Q，將N替換為D或G，將R替換為K，將G替換為N或A，將T替換為S或K，將D替換為N或E，將I替換為L(zhǎng)或V，將F替換為Y，將S替換為T(mén)或A，將R替換為K，將G替換為N或A，將K替換為R，將A替換為S、K 或 P。
[0092]或者，還能夠選擇適于蛋白或肽內(nèi)部氨基酸(即，不會(huì)暴露于溶劑的氨基酸)的保守氨基酸替換。例如，能夠使用如下保守替換:其中，將Y替換為F，將T替換為A或S，將I替換為L(zhǎng)或V，將W替換為Y，將M替換為L(zhǎng)，將N替換為D，將G替換為A，將T替換為A或S，將D替換為N，將I替換為L(zhǎng)或V，將F替換為Y或L，將S替換為A或T以及將A替換為S、G、T或V。在一些實(shí)施方式中，包含非保守氨基酸替換的LF多肽也涵蓋在術(shù)語(yǔ)“變體”內(nèi)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“非保守”替換是指將氨基酸殘基替換為具有不同化學(xué)性質(zhì)的不同氨基酸殘基。非保守替換的非限制性實(shí)例包括將天冬氨酸(D)用甘氨酸(G)替代；將天冬酰胺(N)用賴氨酸(K)替代；以及將丙氨酸(A)用精氨酸(R)替代。
[0093]本文使用的術(shù)語(yǔ)“衍生物”是指經(jīng)化學(xué)修飾的蛋白或多肽，例如，通過(guò)泛素化、標(biāo)記、聚乙二醇化(用聚乙二醇進(jìn)行的衍生化)或其它分子的添加進(jìn)行。當(dāng)分子包含通常不是該分子的一部分的附加化學(xué)部分時(shí)，該分子也是另一分子的“衍生物”。此類部分可改善分子的溶解度、吸收、生物半衰期等?；蛘?，所述部分可降低分子的毒性、或者消除或減弱該分子的不希望的副作用等。能夠介導(dǎo)此類效果的部分公開(kāi)于REMINGTON’ S PHARMACEUTICALSCIENCES (第 21 版，Tory 著，Lippincott ffilliams&ffilkins, Baltimore, MD, 2006 年)。
[0094]當(dāng)與“衍生物”或“變體”結(jié)合使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“功能性”是指具有與實(shí)體或分子的生物活性基本上相似的生物活性的蛋白分子，所述蛋白分子為所述實(shí)體或分子的衍生物或變體。在這樣的上下文中，“基本上相似”意味著生物活性(例如，多肽的抗原性)為參比(例如，相應(yīng)的野生型多肽)活性的至少50%，例如，至少60%、70%、80%、90%、95%、100%或甚至更高(即，相比于野生型， 變體或衍生物具有更高的活性)，例如，110^^120%以上，包括端值。
[0095]當(dāng)用于描述核酸分子時(shí)，術(shù)語(yǔ)“重組體”意味著基因組、cDNA、病毒、半合成和/或合成來(lái)源的多核苷酸，所述多核苷酸借助于其來(lái)源或操作與其在自然界中是相關(guān)的多核苷酸序列的全部或部分不相關(guān)。關(guān)于肽、多肽、蛋白或重組融合蛋白所使用的術(shù)語(yǔ)重組體是指由重組多核苷酸表達(dá)而產(chǎn)生的多肽。關(guān)于宿主細(xì)胞所使用的術(shù)語(yǔ)重組體意味著其中引入有重組多核苷酸的宿主細(xì)胞。就材料(例如，細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)、或載體)而言，重組體在本文中還用于指所述材料已通過(guò)引入異源材料(例如，細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)、或載體)進(jìn)行修飾。
[0096]術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠?qū)愒春怂徇\(yùn)送至宿主細(xì)胞或在宿主細(xì)胞中介導(dǎo)異源核酸表達(dá)的核酸分子，所述異源核酸已連接至所述核酸分子；質(zhì)粒為術(shù)語(yǔ)“載體”所涵蓋的種類中的一種形式。術(shù)語(yǔ)“載體”通常是指含有在宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和/或維持所必需的復(fù)制起點(diǎn)和其它實(shí)體的核酸序列。在本文中，能夠指導(dǎo)與其可操作地連接的基因和/或核酸序列的表達(dá)的載體被稱為“表達(dá)載體”。通常情況下，實(shí)用的表達(dá)載體往往處于“質(zhì)?！钡男问?指環(huán)狀雙鏈DNA分子(所述環(huán)狀雙鏈DNA分子在其載體形式中并不結(jié)合至染色體))，并且通常包含用于穩(wěn)定表達(dá)或瞬時(shí)表達(dá)的實(shí)體或編碼DNA?？捎糜诒疚墓_(kāi)的方法中的其它表達(dá)載體包括但不限于，質(zhì)粒、附加體(episomes)、細(xì)菌人工染色體、酵母人工染色體、噬菌體或病毒載體，并且此類載體可整合進(jìn)宿主的基因組或在特定細(xì)胞中自主復(fù)制。載體可以是DNA載體或RNA載體。也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的具有等同功能的其它形式的表達(dá)載體，例如自我復(fù)制的染色體外載體或整合至宿主基因組的載體。優(yōu)選的載體為能夠自主復(fù)制和/或表達(dá)與它們相連的核酸的載體。[0097]本文使用的術(shù)語(yǔ)“減少/降低(reduced / reduce / decrease) ”通常意味著相對(duì)于參比而言降低了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的量。為避免疑問(wèn)，如本文所定義的術(shù)語(yǔ)，“減少”意味著相對(duì)于參比水平而言至少10%的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性降低，例如，降低至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、至少90%以上、上至并包括降低100% (即，相對(duì)于參比樣品為缺失水平(absent level))，或者相對(duì)于參比水平而言降低在10% -100%之間的任意量。
[0098]本文使用的術(shù)語(yǔ)“低”通常意味著低了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的量；為避免疑問(wèn)，“低”意味著相比參比水平而言低了至少10%的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著值，例如低于參比水平至少20%、低于參比水平至少30%、低于參比水平至少40%、低于參比水平至少50%、低于參比水平至少60%、低于參比水平至少70%、低于參比水平至少80%、低于參比水平至少90%、上至并包括低于參比水平100 %的值(即，相對(duì)于參比樣品為缺失水平)。
[0099]本文使用的術(shù)語(yǔ)“增加/提高(increased / increase) ”通常意味著增加了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的量；例如，如在本文中所定義的術(shù)語(yǔ)，相對(duì)于參比水平而言至少10%的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性增加，包括增加至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80%、至少90%、至少100%或以上，包括端值；包括例如相對(duì)于參比水平增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍或更多。
[0100]本文使用的術(shù)語(yǔ)“高”通常意味著相對(duì)于參比而言高了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的量；例如，相比于參比水平而言高了至少10%的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著值，例如，與參比水平相比高至少20%、高至少30%、高至少40%、高至少50%、高至少60%、高至少70%、高至少80%、高至少90%、高至少100%，包括端值；例如，與參比水平相比高至少2倍、高至少3倍、高至少4倍、高至少5倍、高至少10倍或更高。
[0101]本文使用的術(shù)語(yǔ)“包含/包括(comprising) ”表示除已存在的確定要素外，還可存在其它要素。“包含/包括”的使用表示含有而非限制。
[0102]術(shù)語(yǔ)“由...組成”是指本文所述的組合物、方法以及它們各自的組分，排除未在實(shí)施方式描述中詳述的任何要素。
[0103]本文使用的術(shù)語(yǔ)“基本上由...組成”是指對(duì)于給定的實(shí)施方式而言所需的那些要素。該術(shù)語(yǔ)允許存在實(shí)質(zhì)上不影響本發(fā)明該實(shí)施方式的基礎(chǔ)和新穎性或功能性特征的要素。
[0104]本發(fā)明提供靈活且通用的組合物，所述組合物可被設(shè)計(jì)并制造用于引發(fā)特定、廣譜、或多種抗原性靶標(biāo)。表1提供了用于設(shè)想MAPS實(shí)施方式的靈活性的簡(jiǎn)單示例指南:
[0105]表1.MAPS平臺(tái)的通用性
[0106]
【權(quán)利要求】
1.一種免疫原性組合物，所述組合物包含聚合物、至少一種抗原以及至少一種互補(bǔ)親和分子對(duì)，所述互補(bǔ)親和分子對(duì)包含: 與所述聚合物締合的第一親和分子；和 與所述抗原締合的互補(bǔ)親和分子， 其中，所述第一親和分子與所述互補(bǔ)親和分子締合，從而連接所述抗原和所述聚合物。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述聚合物為多糖。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述聚合物為聚乙二醇。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述第一親和分子交聯(lián)至所述聚合物。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，使用交聯(lián)劑將所述第一親和分子交聯(lián)至所述聚合物，所述交聯(lián)劑選自于由以下交聯(lián)劑所組成的組中的任意交聯(lián)劑: CDAP (1-氰基-4_ 二甲基氨基吡唳四氟硼酸鹽)；EDC (1-乙基-3- [3- 二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽)；氰基硼氫化鈉；溴化氰；以及碳酸氫銨/碘乙酸。
6.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述第一親和分子交聯(lián)至所述聚合物的羧基、羥基、氨基、苯氧基、半縮醛和巰基官能團(tuán)。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述第一親和分子共價(jià)鍵合至所述聚合物。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述互補(bǔ)親和分子對(duì)選自于由以下互補(bǔ)親和分子對(duì)所組成的組: 生物素/生物素結(jié)合蛋白、抗體/抗原、酶/底物、受體/配體、金屬/金屬結(jié)合蛋白、碳水化合物/碳水化合物結(jié)合蛋白、脂質(zhì)/脂質(zhì)結(jié)合蛋白、His標(biāo)簽/His標(biāo)簽結(jié)合物。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述第一親和分子為生物素或其衍生物或模擬分子。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中，所述生物素衍生物為胺-PEG3-生物素((+)-生物素酸_3，6, 9- 二氧代十一燒二胺)。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述抗原為融合蛋白，所述融合蛋白含有融合至蛋白親和結(jié)合分子的抗原。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述抗原非共價(jià)連接至所述互補(bǔ)親和分子。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述抗原作為融合蛋白共價(jià)連接至所述互補(bǔ)親和分子。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述互補(bǔ)親和分子為生物素結(jié)合蛋白或其衍生物或功能部分。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述互補(bǔ)親和分子為親和素樣蛋白或其衍生物。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的組合物,其中，所述親和素樣蛋白為rhizavidin或其衍生物。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述親和素樣蛋白為親和素或鏈霉親和素或它們的衍生物。
18.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，分泌信號(hào)肽位于所述親和素樣蛋白的N端。
19.如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述分泌信號(hào)序列為MKKIffLALAGLVLAFSASA(SEQ ID NO:1)或其衍生物。
20.如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述聚合物或多糖由活生物體純化得到，或者為合成聚合物或合成多糖。
21.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述活生物體選自于由以下生物體所組成的組: 細(xì)菌、古生菌、真核細(xì)胞、真菌、昆蟲(chóng)、植物、動(dòng)物，或上述生物體的嵌合體。
22.如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述聚合物為支鏈多糖。
23.如權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述聚合物為直鏈多糖。
24.如權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述多糖為葡聚糖。
25.如權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述葡聚糖為平均分子量為100kDa-500kDa的葡聚糖，包括端值。
26.如權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述葡聚糖為平均分子量為50kDa-300kDa的葡聚糖，包括端值。
27.如權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述至少兩種抗原為不同的抗原。
28.如權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述至少兩種抗原為相同抗原的不同變體。
29.如權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述至少兩種抗原為相同抗原的不同結(jié)構(gòu)域或不同部分。
30.如權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物進(jìn)一步包含連接至所述抗原的柔性接頭肽，其中，所述柔性接頭肽將所述抗原連接至所述互補(bǔ)親和分子。
31.如權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物包含至少2種抗原。
32.如權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物包含至少3種抗原。
33.如權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物包含至少5種抗原。
34.如權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物包含2-10種抗原。
35.如權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物包含10-15種抗原。
36.如權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物包含15-20種抗原。
37.如權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物包含20-50種抗原。
38.如權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物包含50-100種抗原。
39.如權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物包含超過(guò)100種抗原。
40.如權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述抗原來(lái)自病原性生物體。
41.如權(quán)利要求1-40中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述抗原來(lái)自腫瘤。
42.如權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述抗原選自于由以下抗原所組成的組: 肺炎球菌抗原、結(jié)核抗原、炭疽抗原、HIV抗原、季節(jié)性流感抗原或流行性流感抗原、流感抗原、百日咳抗原、金黃色葡萄球菌抗原、腦膜炎球菌抗原、嗜血桿菌抗原、HPV抗原，或上述抗原的組合。
43.如權(quán)利要求1-42中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述多糖選自于由以下多糖所組成的組:Vi多糖、肺炎球菌莢膜多糖、肺炎球菌細(xì)胞壁多糖、b型流感嗜血桿菌多糖、腦膜炎球菌多糖、以及其它細(xì)菌莢膜多糖或細(xì)胞壁多糖。
44.如權(quán)利要求1-43中任一項(xiàng)所述的組合物,所述組合物進(jìn)一步包含與所述聚合物或多糖締合的至少一種共刺激因子。
45.如權(quán)利要求1-44中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述共刺激因子選自于由以下共刺激因子所組成的組: Toll樣受體配體或激動(dòng)劑、NOD配體或激動(dòng)劑、或者炎性小體激活劑/激動(dòng)劑。
46.如權(quán)利要求44所述的組合物，其中，所述共刺激因子直接連接至聚合物，或通過(guò)互補(bǔ)親和分子對(duì)連接至聚合物，所述互補(bǔ)親和分子對(duì)包含: 第一親和分子，所述第一親和分子與所述聚合物締合；以及 互補(bǔ)親和分子，所述互補(bǔ)親和分子與所述共刺激因子締合， 其中，所述第一親和分子與所述互補(bǔ)親和分子締合，從而將所述共刺激因子連接至所述聚合物。
47.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物用于在受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答。
48.如權(quán)利要求47所述的組合物，其中，所述免疫應(yīng)答為抗體應(yīng)答/B細(xì)胞應(yīng)答。
49.如權(quán)利要求48所述的組合物，其中，所述免疫應(yīng)答為針對(duì)所述聚合物的抗體應(yīng)答/ B細(xì)胞應(yīng)答。
50.如權(quán)利要求48所述的組合物，其中，所述免疫應(yīng)答為針對(duì)與所述聚合物締合的所述抗原的抗體應(yīng)答/B細(xì)胞應(yīng)答。
51.如權(quán)利要求48所述的組合物，其中，所述免疫應(yīng)答為CD4+T細(xì)胞應(yīng)答，所述CD4+T細(xì)胞應(yīng)答包括Thl應(yīng)答、Th2應(yīng)答和Th 17應(yīng)答。
52.如權(quán)利要求51所述的組合物，其中，所述免疫應(yīng)答為特異性針對(duì)所述聚合物或多糖的⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答。
53.如權(quán)利要求51所述的組合物，其中，所述免疫應(yīng)答為特異性針對(duì)與所述聚合物或多糖締合的所述抗原的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。
54.如權(quán)利要求47所述的組合物，其中，所述免疫應(yīng)答為CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
55.如權(quán)利要求54所述的組合物，其中，所述免疫應(yīng)答為特異性針對(duì)所述聚合物或多糖的⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答。
56.如權(quán)利要求54所述的組合物，其中，所述免疫應(yīng)答為特異性針對(duì)與所述聚合物或多糖締合的所述抗原的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
57.如權(quán)利要求1-56中任一項(xiàng)所述的組合物,所述組合物進(jìn)一步包含至少一種佐劑。
58.一種用于在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)至少一種抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予所述受試者如權(quán)利 要求1-57中任一項(xiàng)所述的組合物。
59.一種針對(duì)帶有至少一種抗原的病原體對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行接種的方法，所述方法包括給予如權(quán)利要求1-57中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物。
60.如權(quán)利要求58或59所述的方法，其中，所述受試者為人。
61.如權(quán)利要求58或59所述的方法，其中，所述受試者為農(nóng)業(yè)動(dòng)物或非馴養(yǎng)動(dòng)物。
62.如權(quán)利要求58或59所述的方法，其中，所述受試者為馴養(yǎng)動(dòng)物。
63.如權(quán)利要求58或59所述的方法，其中，經(jīng)由皮下注射、鼻內(nèi)注射、皮內(nèi)注射或肌內(nèi)注射進(jìn)行給藥，或者經(jīng)由透皮皮膚貼劑進(jìn)行給藥。
64.如權(quán)利要求58所述的方法，其中，所述免疫應(yīng)答為抗體應(yīng)答/B細(xì)胞應(yīng)答。
65.如權(quán)利要求58所述的方法，其中，所述免疫應(yīng)答為CD4+T細(xì)胞應(yīng)答，所述CD4+T細(xì)胞應(yīng)答包括Thl應(yīng)答、Th2應(yīng)答或Th 17應(yīng)答。
66.如權(quán)利要求58所述的方法，其中，所述免疫應(yīng)答為CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
67.如權(quán)利要求1-57中任一項(xiàng)所述的組合物在對(duì)暴露于病原體或免疫威脅進(jìn)行診斷中的用途。
68.—種試劑盒，所述試劑盒包含: (?)含有多糖的容器，所述多糖與多個(gè)第一親和分子交聯(lián)；以及(iii)含有互補(bǔ)親和分子的容器，所述互補(bǔ)親和分子與所述第一親和分子締合，其中，所述互補(bǔ)親和分子與抗原締合。
69.如權(quán)利要求68所述的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包含將所述互補(bǔ)親和分子連接至所述抗原的手段。
70.如權(quán)利要求68所述的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包含至少一種共刺激因子。
71.如權(quán)利要求68-70中任一項(xiàng)所述的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包含用于將所述共刺激因子連接至所述多糖的交聯(lián)劑，所述交聯(lián)劑選自于由以下交聯(lián)劑所組成的組: CDAP (1-氰基-4- 二甲基氨基吡卩定四氟硼酸鹽)、EDC (1-乙基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽)、氰基硼氫化鈉、溴化氰、或碳酸氫銨/碘乙酸。
72.—種試劑盒，所述試劑盒包含: (?)含有聚合物的容器； (iii)含有多個(gè)第一親和分子的容器；以及 (iv)含有交聯(lián)劑的容器，所述交聯(lián)劑用于將所述第一親和分子交聯(lián)至所述聚合物。
73.如權(quán)利要求72所述的試劑盒，其中，所述試劑盒為多糖。
74.如權(quán)利要求72所述的試劑盒，其中，所述交聯(lián)劑選自于由以下交聯(lián)劑所組成的組: CDAP (1-氰基-4- 二甲基氨基吡卩定四氟硼酸鹽)、EDC (1-乙基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽)、氰基硼氫化鈉、溴化氰、碳酸氫銨/碘乙酸，以及上述交聯(lián)劑的衍生物。
75.如權(quán)利要求72所述的試劑盒，所述試劑盒任選包含含有表達(dá)載體的容器，所述表達(dá)載體用于表達(dá)抗原-親和分子融合蛋白。
76.如權(quán)利要求72所述的試劑盒，其中，所述表達(dá)載體任選含有接頭肽序列，其中，所述表達(dá)載體表達(dá)含有接頭肽的抗原-親和分子融合蛋白，所述接頭肽位于所述抗原和所述未和分子之間。
77.如權(quán)利要求72所述的試劑盒，所述試劑盒任選包含含有互補(bǔ)親和分子的容器，所述互補(bǔ)親和分子與所述第一親和分子締合，其中，所述互補(bǔ)親和分子與抗原締合。
78.如權(quán)利要求72所述的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包含將所述互補(bǔ)親和分子連接至所述抗原的手段。
【文檔編號(hào)】A61K39/39GK103648489SQ201280034406
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月11日
【發(fā)明者】理查德·馬利, 陸英杰, 張帆 申請(qǐng)人:兒童醫(yī)療中心有限公司