一種檢測人尿中cd80的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種試劑盒，具體設(shè)及一種檢測人尿中CD80的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] CD80,又稱B7-1，是最早發(fā)現(xiàn)的共刺激分子，為I型跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超 家族成員，W單體的形式表達(dá)于B細(xì)胞及其他抗原提呈細(xì)胞(APC)的表面。T細(xì)胞的活化、增 殖、分化繼而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)至少需要雙重信號的參與。第一信號是人類主要組織相容 性復(fù)合體(MHC)/抗原膚/T細(xì)胞受體(TCR)復(fù)合物，第二信號是非抗原依賴的共刺激信號 (Immunol Today，1994，15: 321-331)。后者由T細(xì)胞膜上表達(dá)的配體CD28與APC膜上表達(dá)的 共刺激分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)相結(jié)合而完成。CD80(B7-1)和CD86(B7-2)在T細(xì)胞活 化中的作用有何不同尚無定論，CD86常低水平表達(dá)于B細(xì)胞、巨隧細(xì)胞W及樹突狀細(xì)胞的表 面，抗原刺激后表達(dá)迅速上調(diào)，而CD80則為誘導(dǎo)性表達(dá)，生理狀態(tài)下不表達(dá)或低表達(dá)，且抗 原刺激后表達(dá)上調(diào)速度慢，3-4天后表達(dá)才開始上調(diào)，因此CD86可能作用于免疫應(yīng)答初期， 而CD80可能在免疫應(yīng)答后期起一定的作用（Immunol Today，1999，20: 285-288; Curr Opin Cell Biol，1999，11:203-210;國際泌尿系統(tǒng)雜志，2013，33:282-285)。
[0003] 微小病變型腎病(Minimal Change Disease,MCD)是腎病綜合征的常見類型，目 前，其診斷依賴于腎臟活檢穿刺。MCD患者的尿中CD80的水平較其他腎小球疾病，包括局灶 節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)、急性腎小球腎炎(AGN)、膜增生性腎小球腎炎(MPGN)、IgA腎病、 膜性腎病(MN)，W及系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎和正常對照均顯著增高（J Am Soc Nephrol, 2009，20:260-266)。在MCD患者的腎臟活檢組織中發(fā)現(xiàn)CD80僅表達(dá)于足細(xì)胞化idney Int， 2010,78:296-302)。因此，人尿中CD80(B7-1)含量的檢測，可為腎臟病MCD的診斷和鑒別診 斷提供依據(jù)，有望改善腎活檢穿刺依賴的微小病變腎病的診斷現(xiàn)狀。
[0004] 通過國內(nèi)專利檢索，人尿中CD80 (B7-1)的檢測尚無專利授權(quán)或申報。與CD80密切 相關(guān)的專利有:①抗人CD80雙價抗體及其應(yīng)用:所述雙價抗體由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū) 組成，其特征在于，兩者間由連接膚Gly4Ser相連，此發(fā)明所述雙價抗體與抗原的結(jié)合能力 強(qiáng)，對Raji細(xì)胞具有明顯的抑制作用，可W用于腫瘤成像中，也可W應(yīng)用在制備抑制腫瘤細(xì) 胞增殖的藥物中。（申請?zhí)?CN201110056304;未授權(quán);法律狀態(tài):發(fā)明專利申請公布后的視 為撤回）；②免疫性疾病的診斷方法:包括用例如識別CD80抗原的抗人CD80單克隆抗體對分 離自人的體液中淋己細(xì)胞和/或淋己細(xì)胞亞群的CD80抗原陽性率進(jìn)行免疫學(xué)測定的步驟。 其特征在于:可對各種免疫疾病進(jìn)行簡便且準(zhǔn)確的診斷，與W前的診斷方法相比，從患者中 可分離的外周血等體液中所含有的淋己細(xì)胞的操作簡便，患者的負(fù)擔(dān)小。而且還提供了含 有作為能減輕或預(yù)防免疫疾病的藥物的特異性識別CD80抗原的人抗CD80抗原抗體（申請 號:CN201380047212;未授權(quán);法律狀態(tài):公開）。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種新的靈敏度高、特 異性強(qiáng)的檢測人尿中CD80的試劑盒。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案:一種檢測人尿中CD80的試劑盒，所述試劑盒 包括包被有抗人CD80抗體的固相載體、酶標(biāo)記的另一抗人CD80抗體、CD80標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋 液、洗涂液和發(fā)光底物液。
[0007] 優(yōu)選地，所述人尿?yàn)槌磕?。其?4小時尿液或口診隨機(jī)尿次之。
[0008] 優(yōu)選地，所述固相載體是由聚苯乙締制成的不透明微孔板。更優(yōu)選地所述固相載 體是黑色或白色微孔板。
[0009] 優(yōu)選地，所述包被有抗人CD80抗體的固相載體是由W下方法制備而成的：
[0010] 將抗人CD80抗體按照比例（抗人CD80抗體:包被液=2~lOyg: ImL)的量加入至包 被液中，得到含有抗人CD80抗體的包被液，其中所述包被液為抑=9.6、0.05M的碳酸鹽;再 將所述含有抗人CD80抗體的包被液按10化L/孔加入至微孔板中，4°C放置24小時;去除包被 液后，按15化L/孔加入封閉液至微孔板中，37°C放置2~3小時，其中所述封閉液包括濃度為 O.Olmol/L、抑為7.2~7.4的口85(憐酸鹽緩沖液），1%(訊八）的牛血清白蛋白，0.05%(乂八） 的proclin300和5%(w/v)的薦糖;甩掉封閉液，拍干微孔板，室溫除濕干燥24~72小時，錫 錐紙封袋，置2~8Γ保存。
[0011] 優(yōu)選地，所述酶標(biāo)二抗是辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗。所述二抗是與CD80結(jié)合的 檢測抗體。
[0012] 優(yōu)選地，所述酶標(biāo)二抗是由W下方法制備而成：
[0013] 用戊二醒偶聯(lián)法將二抗與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，再用酶標(biāo)抗體稀釋液稀釋至工作 濃度，其中酶標(biāo)抗體稀釋液包括濃度為0.01~0. 〇5mol/L、pH為7.2~7.4的PBS，0.5% (w/v) 的牛血清白蛋白和0. l%(v/v)的proclinSOO。
[0014] 所述抗人CD80抗體和二抗，可W采用重組表達(dá)的人CD80免疫BALB/c小鼠，再經(jīng)單 克隆篩選制備獲得，或用商品化人CD80抗體。
[0015] 優(yōu)選地，所述CD80標(biāo)準(zhǔn)品為CD80重組蛋白。
[0016] 優(yōu)選地，所述樣品稀釋液包括濃度為0.01~0.2mol/L、pH為5.7~7.0的PBS。
[0017] 優(yōu)選地，所述洗涂液包括濃度為0.01~0.2mol/L、pH為7.2~7.4的PBS，和體積濃 度為0.01%~0.05%(v/v)的TritonX-100。
[0018] 優(yōu)選地，所述發(fā)光底物液包括發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B液，所述發(fā)光底物A液包括 魯米諾和異魯米諾中的至少一種W及發(fā)光增強(qiáng)劑，所述發(fā)光底物B液包括過氧化氨和過氧 化脈中的至少一種W及穩(wěn)定劑。優(yōu)選地，所述發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B液的體積比為1:1。
[0019] 本發(fā)明試劑盒的使用方法如下：
[0020] (1)試劑盒保存于2~8°C冰箱，使用前先將試劑盒平衡至室溫，平衡時間不少于30 分鐘；
[0021] (2)將10化1待檢的尿液標(biāo)本和CD80系列標(biāo)準(zhǔn)品分別加入微孔板的不同板孔中，于 37 °C反應(yīng)30分鐘；
[0022] (3)用洗涂液洗涂板孔2~3次，每次靜置3~5分鐘，最后棄去洗涂液；
[0023] (4)將10化1辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗加入步驟(3)洗涂后的板孔中，于37°C反 應(yīng)30分鐘；
[0024] (5)用洗涂液洗涂板孔2~3次，每次靜置3~5分鐘，最后棄去洗涂液；
[0025] (6)將發(fā)光底物A液和B液按1:1的體積混勻后，加入步驟(5)洗涂后的板孔中，再將 微孔板放入化學(xué)發(fā)光檢測儀中，檢測發(fā)光值；
[0026] (7)根據(jù)發(fā)光值與CD80標(biāo)準(zhǔn)品的濃度關(guān)系計(jì)算待檢測的尿液中CD80的含量。
[0027] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于建立了一種僅適用于尿液中微量CD80 的靈敏、特異的定量檢測試劑盒，不受尿液中其他成分的干擾。本發(fā)明試劑盒基于固相酶促 化學(xué)發(fā)光法，W包被抗人CD80抗體的微孔板為固相載體，用辣根過氧化物酶為催化酶催化 發(fā)光底物發(fā)光，顯著提高了試劑的檢測靈敏度。本發(fā)明為微小病變腎病的鑒別診斷提供了 一種檢測手段，有助于改善腎活檢穿刺依賴的微小病變腎病的診斷現(xiàn)狀。
【附圖說明】
[0028] 圖1為采用本發(fā)明所述試劑盒檢測微小病變腎病(MCD)患者、局灶節(jié)段性腎小球硬 化(FSGS)患者和狼瘡腎炎患者尿液標(biāo)本中CD80的含量結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 為更好地說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明 作進(jìn)一步說明。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 一、檢測人尿中CD80的試劑盒的制備
[0032] 1、抗人CD80抗體的固相載體的制備：
[0033] 將抗人CD80抗體按照比例（抗人CD80抗體:包被液=化g: ImL)的量加入至包被液 中，得到含有抗人CD80抗體的包被液，其中所述包被液為抑=9.6、0.05M的碳酸鹽;再將所 述含有抗人CD80抗體的包被液按10化17孔加入至微孔板中，4°C放置24小時；去除包被液 后，按150μLν孔加入封閉液至微孔板中，37°C放置3小時，其中所述封閉液包括濃度為 O.Olmol/L、抑為 7.2 的 PBS，l%(w/v)的牛血清白蛋白，0.05%(v/v)的 proclin300 和 5%(w/ V)的薦糖;甩掉封閉液，拍干微孔板，室溫除濕干燥24小時，錫錐紙封袋，置2~8°C保存。
[0034] 2、酶標(biāo)二抗的制備：
[0035] 用戊二醒偶聯(lián)法將二抗與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，再用酶標(biāo)抗體稀釋液稀釋至工作 濃度，其中酶標(biāo)抗體稀釋液包括濃度為0.0 lmol/L、抑為7.2的PBS，0.5% (w/v)的牛血清白 蛋白