和0.1%(v/v)的proclin300。過濾除菌，置2~8°C保存。
[0036] 3、CD80柄;準(zhǔn)品的制備：
[0037] 將基因重組的人CD80(即CD80重組蛋白）用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋至要求濃度，其中標(biāo) 準(zhǔn)品稀釋液包括濃度為0.0 Imo 1 /L、pH為7.2的PBS，0.5 % (w/v)的牛血清白蛋白和0.1 % (v/ V)的proclinSOO。過濾除菌，置2~8°C保存。
[0038] 4、樣品稀釋液的制備：
[0039] 取化2冊〇4溶液母液和K出P化溶液母液按比例混合，配置濃度為0.05mol/L、pH為 6.0的口85。
[0040] 5、洗涂液的制備：
[0041 ] 取Na2冊化溶液母液和K出P化溶液母液按比例混合，配置濃度為0.05mol/L、pH為 7.2的PBS。同時，洗涂液含體積濃度為1 /10000 (v/v)的Triton X-100。
[0042] 6、發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B液的制備：
[0043] 其中發(fā)光底物A液包括魯米諾和異魯米諾中的至少一種W及發(fā)光增強劑，發(fā)光底 物B液包括過氧化氨和過氧化脈中的至少一種W及穩(wěn)定劑。使用時將發(fā)光底物A液和發(fā)光底 物B液按1:1等體積混合均勻后使用。本實施例所用發(fā)光底物為化ermo Scientific公司的 SuperSi即al ELISA Pico Qiemiluminescent Substrate,也可W用其他商業(yè)化的產(chǎn)品。
[0044] 該實施案例，所用的抗人CD80抗體和二抗，均為本實驗室制備，當(dāng)然也可W采用其 它市售的抗體。
[0045] 二、檢測人尿中CD80的試劑盒的使用方法
[0046] (1)使用前先將試劑盒平衡30分鐘至室溫；
[0047] (2)將待檢的微小病變腎病(MCD)患者、局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)患者、狼瘡 腎炎患者的尿液標(biāo)本(各1〇化1)和CD80系列標(biāo)準(zhǔn)品分別加入到微孔板的不同板孔中，于37 °C反應(yīng)30分鐘；
[0048] (3)用洗涂液洗涂板孔3次，每次靜置3分鐘，最后棄去洗涂液；
[0049] (4)將10化1辣根過氧化物酶標(biāo)記的人CD80抗體加入到步驟(3)洗涂后的板孔中， 于37 °C反應(yīng)30分鐘；
[0050] (5)用洗涂液洗涂步驟(4)中反應(yīng)后的板孔3次，每次靜置3分鐘，最后棄去洗涂液；
[0051] (6)將發(fā)光底物A液和B液按1:1的體積混勻后，加入至步驟(5)洗涂后的板孔中，再 將微孔板放入化學(xué)發(fā)光檢測儀中，檢測發(fā)光值；
[0052] (7)根據(jù)發(fā)光值與CD80標(biāo)準(zhǔn)品的濃度關(guān)系計算待檢測的尿液中CD80的含量；
[0053] (8)結(jié)果如圖1所示，發(fā)病期MCD患者尿中可檢測到較高水平的CD80(ng/g肌酢），而 正常人、MCD緩解期、FSGS患者發(fā)病期和狼瘡腎炎患者尿中的CD80水平則極低或無(其中MCD 為微小病變腎病的患者、FSGS為局灶節(jié)段性腎小球硬化的患者）。
[0054] Ξ、本發(fā)明試劑盒的方法學(xué)評價
[0055] (1)準(zhǔn)確性
[0056] 準(zhǔn)確性檢測指把已標(biāo)定的不同含量的CD80標(biāo)準(zhǔn)品加入到含CD80的人尿液中，將其 檢測結(jié)果與加入的量，進(jìn)行對比，計算CD80的回收率。結(jié)果如下表1所示。
[0化7] 表1CD80的回收率
[0化8]_
[0059] 表1中可W看出，回收率在95-110%之間，滿足準(zhǔn)確性的可接受標(biāo)準(zhǔn)。
[0060] (2)精密性
[0061] 選擇3份不同濃度的標(biāo)本，按本發(fā)明試劑盒的檢測方法，在不同時間，重復(fù)檢測10 次，分析10次的檢測結(jié)果，計算平均偏差CV(%)值，其結(jié)果如表2所示。
[0062] 表2精密性結(jié)果
[0063]
[0064] (3)分析靈敏度
[0065] 分析靈敏度定義:在統(tǒng)計學(xué)上可W與零劑量區(qū)別的量。重復(fù)10次測量0值標(biāo)準(zhǔn)品， 計算其平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，將X+2SD計算的結(jié)果就是該試劑盒的分析靈敏度。本發(fā)明 的試劑盒靈敏度為15pg/ml，滿足試劑盒靈敏度的要求。
[0066] (4)特異性
[0067] 用該試劑盒測定含濃度為lOOOpg/ml的人血清白蛋白化SA)，轉(zhuǎn)鐵蛋白，免疫球蛋 白IgG時，不影響檢測結(jié)果。
[0068] (5)相關(guān)性
[0069] 濃縮尿液后跑SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)膜做免疫印跡(Western blot)，W皿P-抗人 CD80為檢測抗體，化學(xué)發(fā)光底物為Thermo Scientific公司的S叫erSignal ELISA Pico 化emil皿inescent Substrate。對比該方法和本發(fā)明試劑盒的檢測結(jié)果如表3所示。
[0070] 表3免疫印跡法與本發(fā)明試劑盒的檢測結(jié)果
[0071]
[0072] 兩種方法的陽性符合率=98.1 %，陰性符合率=84.6%，總符合率=95.5%。
[0073] 綜上，本發(fā)明的試劑盒可定量檢測尿液中的微量CD80,具有靈敏度高、特異性好的 優(yōu)點。
[0074] 最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，W上實施例僅用W說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保 護范圍的限制，盡可能參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，可為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員所理解，可W對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的 實質(zhì)和范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種檢測人尿中CD80的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括包被有抗人CD80抗體 的固相載體、酶標(biāo)二抗、CD80標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、洗滌液和發(fā)光底物液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人尿中CD80的試劑盒，其特征在于，所述人尿為晨尿。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人尿中CD80的試劑盒，其特征在于，所述固相載體是由聚 苯乙烯制成的不透明微孔板。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人尿中CD80的試劑盒，其特征在于，所述包被有抗人CD80 抗體的固相載體是由以下方法制備而成的： 將抗人⑶80抗體按照比例（抗人⑶80抗體:包被液=2-10yg: lmL)的量加入至包被液 中，得到含有抗人⑶80抗體的包被液，其中所述包被液為pH = 9.6、0.05M的碳酸鹽;再將所 述含有抗人CD80抗體的包被液按lOOyL/孔加入至微孔板中，4°C放置24小時；去除包被液 后，按150μ!7孔加入封閉液至微孔板中，37°C放置2~3小時，其中所述封閉液包括濃度為 0 ·01mol/L、pH為7 · 2~7 ·4的PBS，1 % (w/v)的牛血清白蛋白，0 ·05% (v/v)的proclin300和 5% (w/v)的蔗糖;甩掉封閉液，拍干微孔板，室溫除濕干燥24~72小時，錫箱紙封袋，置2~8 °C保存。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人尿中CD80的試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)二抗是辣根 過氧化物酶標(biāo)記的二抗。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測人尿中CD80的試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)二抗是由以 下方法制備而成： 用戊二醛偶聯(lián)法將二抗與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，再用酶標(biāo)抗體稀釋液稀釋至工作濃 度，其中酶標(biāo)抗體稀釋液包括濃度為〇.01mol/L、pH為7.2~7.4的roS，0.5% (w/v)的牛血清 白蛋白和〇· 1%(v/v)的 proclin300。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人尿中CD80的試劑盒，其特征在于，所述CD80標(biāo)準(zhǔn)品為 ⑶80重組蛋白。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人尿中CD80的試劑盒，其特征在于，所述樣品稀釋液包括 濃度為 〇 · 01 ~〇 · 2mol/L、pH 為5 · 7~7 · 0 的PBS。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人尿中CD80的試劑盒，其特征在于，所述洗滌液包括濃度 為0 ·01 ~0 · 2mol/L、pH為7 · 2~7 ·4的PBS，和體積濃度為0 · 01 % ~0 ·05% (v/v)的Triton X- 100ο10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人尿中CD80的試劑盒，其特征在于，所述發(fā)光底物液包 括發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B液，所述發(fā)光底物A液包括魯米諾和異魯米諾中的至少一種以 及發(fā)光增強劑，所述發(fā)光底物B液包括過氧化氫和過氧化脲中的至少一種以及穩(wěn)定劑。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測人尿中CD80的試劑盒，所述試劑盒包括包被有抗人CD80抗體的固相載體、酶標(biāo)記的另一抗人CD80抗體、CD80標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、洗滌液和發(fā)光底物液。本發(fā)明的優(yōu)點在于建立了一種僅適用于尿液中微量CD80的靈敏、特異的定量檢測試劑盒，不受尿液中的其他成分干擾。本發(fā)明試劑盒基于固相酶促化學(xué)發(fā)光法，以包被抗人CD80抗體的微孔板為固相載體，用辣根過氧化物酶為催化酶催化發(fā)光底物發(fā)光，顯著提高了試劑的檢測靈敏度。本發(fā)明為微小病變腎病的鑒別診斷提供了一種無創(chuàng)的檢測手段，有助于改善腎活檢穿刺依賴的微小病變腎病的診斷現(xiàn)狀。
【IPC分類】G01N33/545, G01N33/68
【公開號】CN105628935
【申請?zhí)枴緾N201610116200
【發(fā)明人】潘慶軍, 劉華鋒, 蔡珺, 吳平, 謝彤, 楊陳, 安寧, 王淑君, 陳錦霞, 吳洪鑾, 李尚妹, 彭艷霞, 張莉芳
【申請人】廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年3月1日