陽離子水包油乳液的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及陽離子水包油乳液，其含有高濃度陽離子脂質(zhì)并具有限定的油:脂質(zhì)比例。所述陽離子脂質(zhì)可與帶負(fù)電分子相互作用，從而將所述分子錨定到所述乳液顆粒。本文所述的陽離子乳液可用于遞送帶負(fù)電分子如核酸分子至細(xì)胞，并可用于配制基于核酸的疫苗。
【專利說明】陽離子水包油乳液
[0001]相關(guān)申請
[0002]本申請要求2011年7月6日提交的美國臨時申請61/505，109，2011年10月11日提交的美國臨時申請61/545，936，和2012年I月11日提交的美國臨時申請61/585，641的權(quán)益，上述申請各自的全部內(nèi)容通過引用納入本文。
[0003]序列表
[0004]本申請包含通過EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并通過引用全文納入本文。所述ASCII副本創(chuàng)建于2012年7月5日，命名為PAT54691.txt，大小為424，203字節(jié)。
【背景技術(shù)】
[0005]核酸治療在治療從遺傳紊亂到獲得性病癥的疾病中具有前景，所述疾病如癌癥、感染性紊亂(AIDS)、心臟病、關(guān)節(jié)炎、和神經(jīng)變性疾病(如帕金森病和阿爾茨海默病)。不僅可遞送功能基因來修復(fù)遺傳缺陷或誘導(dǎo)外源基因產(chǎn)物表達(dá)，而且還可遞送核酸來抑制內(nèi)源基因表達(dá)以提供治療效果。基因表達(dá)的抑制可通過例如反義寡核苷酸、雙鏈RNA(如siRNAs、miRNAs)或核酶來介導(dǎo)。
[0006]該治療的關(guān)鍵步驟是體內(nèi)遞送核酸分子到細(xì)胞中。然而，體內(nèi)遞送核酸分子，尤其是RNA分子，面臨許多技術(shù)障礙。首先，由于細(xì)胞和血清核酸酶，體內(nèi)注入的RNA的半衰期僅約70秒(參見例如Kurreck, Eur.J.Bioch.270:1628-44 (2003))。已試圖通過使用化學(xué)修飾來提高注射RNA的穩(wěn)定性；然而，數(shù)個化學(xué)變化的例子導(dǎo)致細(xì)胞毒性效果增強或功能喪失或降低。在一個具體示例中，·細(xì)胞不耐受RNAi雙鏈的劑量,該雙鏈中每個第二磷酸被替換為硫代憐酸酯(Harborth 等，Antisense Nucleic Acid Drug Rev.13 (2): 83-105 (2003))。因此，需要開發(fā)能體內(nèi)遞送足量核酸分子(尤其是RNA分子)以引起治療響應(yīng)，但對宿主沒有毒性的遞送系統(tǒng)。
[0007]基于核酸的疫苗是疫苗的誘人替代方案。例如，肌肉內(nèi)(IM)免疫接種編碼抗原的質(zhì)粒DNA可誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫響應(yīng)并保護(hù)抵御攻擊。DNA疫苗比使用蛋白抗原或減毒病原體的傳統(tǒng)疫苗具有一些優(yōu)勢。例如，與蛋白疫苗相比，DNA疫苗可更有效地產(chǎn)生具有天然構(gòu)型的適當(dāng)折疊抗原和產(chǎn)生細(xì)胞免疫響應(yīng)。DNA疫苗還不具有滅活或減毒病原體相關(guān)的一些安全問題。例如，滅活的病毒制劑可包含殘留的活病毒，且減毒病毒可變異并回復(fù)為致病表型。
[0008]基于核酸的疫苗的一個限制是通常需要大劑量的核酸以在非人靈長類和人中獲得有效的免疫響應(yīng)。因此，需要遞送系統(tǒng)和佐劑來提高基于核酸的疫苗的效力。已開發(fā)各種方法用于將核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞，如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、聚戊二烯轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、微注射和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染。
[0009]陽離子脂質(zhì)已被配制為脂質(zhì)體來遞送基因到細(xì)胞中。此外，已開發(fā)陽離子脂質(zhì)乳液來遞送DNA分子到細(xì)胞中。參見例如，Kim等，International Journal ofPharmaceutics, 295, 35-45 (2005)。
[0010]Ott 等(Journal of Controlled Release, 79 卷，1-5 頁，2002)描述了用陽離子亞微米乳液作為DNA的遞送系統(tǒng)/佐劑的方案。該亞微米乳液是基于MF59，一種水佐劑中的有效鯊烯，其是市售批準(zhǔn)產(chǎn)品Fluad?的組分。1，2- 二油酰-3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)用于促進(jìn)質(zhì)粒DNA的胞內(nèi)遞送。
[0011]Yi 等(Pharmaceutical Research, 17，314-320 (2000))公開了使用豆油和 DOTAP為陽離子脂質(zhì)的陽離子水包油乳液。膽固醇、DOPE和聚合脂質(zhì)也包括在一些乳液中。所述乳液顯示能在最多至90%血清存在下增強DNA的體外轉(zhuǎn)染效率。乳液顆粒的平均粒度在18Inm到344nm，且所述粒度在乳液稀釋于PBS緩沖液后有增大。
[0012]Kim 等(Pharmaceutical Research, 18 卷，54-60 頁，2001)和 Chung 等(Journalof Controlled Release，71卷，339-350頁，2001)描述了用于提高DNA分子體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染效力的各種水包油乳液。在經(jīng)測試的陽離子脂質(zhì)中，就DNA遞送而言，DOTAP形成的乳液最穩(wěn)定、有效。在經(jīng)測試的油中，S烯、輕質(zhì)礦物油和霍霍巴豆油形成小顆粒的穩(wěn)定乳液。體外轉(zhuǎn)染的效率顯示為與乳液的穩(wěn)定性相關(guān)(例如，100mg/mL的鯊烯和24mg/mL的DOTAP配制的乳液顯示高體外轉(zhuǎn)染效率)。乳液的制備首先經(jīng)混合陽離子脂質(zhì)和水來形成脂質(zhì)體懸液(通過超聲處理)。脂質(zhì)體隨后被加入油(如鯊烯)中并超聲處理混合物以形成水包油乳液。
[0013]編碼抗原或其衍生物的RNA分子也可用作疫苗。RNA疫苗比DNA疫苗具有某些優(yōu)勢。然而，與基于DNA的疫苗相比，基于RNA的疫苗收到的關(guān)注相對較少。在作為治療劑或疫苗給予時，RNA極易被核酸酶降解。此外，RNA不能主動運輸?shù)郊?xì)胞中。參見，例如 Vajdy, M.Mucosal adjuvants and delivery systemsfor protein-, DNA-andRNA-based vaccines (基于蛋白、DNA和RNA的疫苗的胃腸道外佐劑和遞送系統(tǒng)),ImmunolCell Biol，2004(6):617-27 頁。
[0014]因此，需要提供用于核酸分子或其它帶負(fù)電分子的遞送系統(tǒng)。所述遞送系統(tǒng)可用于基于核酸的疫苗，尤其是基于RNA的疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明涉及陽離子水包油乳液，其含有高濃度陽離子脂質(zhì)并具有限定的油:脂質(zhì)比例。所述油和陽離子脂質(zhì)是乳液的單獨組分，并優(yōu)選所述油不是離子型的。所述陽離子脂質(zhì)可與帶負(fù)電分子相互作用，從而將所述分子錨定到所述乳液顆粒。本文所述的陽離子乳液可用于遞送帶負(fù)電分子如核酸分子(例如編碼抗原的RNA分子)至細(xì)胞，并可用于配制基于核酸的疫苗。
[0016]一方面，本發(fā)明提供一種水包油乳液，其含有分散在水性連續(xù)相中的顆粒，其中所述乳液的特征在于:(a)所述顆粒的平均直徑在約SOnm至180nm ； (b)所述乳液含有油和陽離子脂質(zhì)，其中(i)油:陽離子脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)為至少約8:1(摩爾:摩爾)，
(ii)所述乳液中陽離子脂質(zhì)的濃度為至少約2.5mM，且(iii)前提是所述陽離子脂質(zhì)不是DC-膽固醇。優(yōu)選地，所述水包油乳液是穩(wěn)定的。在一些實施方式中，油:陽離子脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)是約10:1 (摩爾:摩爾)到約43:1 (摩爾:摩爾)。所述水包油乳液可含約0.2%-約8%(w/v)的油。在一些實施方式中，所述油是鯊烯或角鯊?fù)椤?br> [0017]另一方面，本發(fā)明提供一種水包油乳液，其含有分散在水性連續(xù)相中的顆粒，其中所述乳液的特征在于:(a)所述顆粒的平均直徑在約SOnm至180nm ； (b)所述乳液含有油和陽離子脂質(zhì)，其中⑴油:陽離子脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)為至少約4:1(摩爾:摩爾)，
(ii)所述乳液中陽離子脂質(zhì)的濃度為至少約2.5mM，(iii)所述油以約0.2%至約8%(w/v)存在；且(iv)其前提是所述陽離子脂質(zhì)不是DC-膽固醇。優(yōu)選地，所述水包油乳液是穩(wěn)定的。在一些實施方式中，油:陽離子脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)是約4:1(摩爾:摩爾)到約43:1(摩爾:摩爾)。在一些實施方式中，所述油是鯊烯或角鯊?fù)?。在一些實施方式中，所述油?.6%至4% (w/v)存在。在一些實施方式中，所述油以約1%至約3.2% (w/v)存在。
[0018]這方面的所述水包油乳液還可包含表面活性劑如非離子型表面活性劑。優(yōu)選所述表面活性劑不是聚乙二醇(PEG)-脂質(zhì)。表面活性劑存在量可為約0.01到約2.5%(w/v)。在一些實施方式中，所述表面活性劑是SPAN85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、吐溫80 (聚山梨酯80)、或其組合。在一些實施方式中，所述水包油乳液含有等量的SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)和吐溫80 (聚山梨酯80)，例如各0.5%(w/v)。
[0019]優(yōu)選所述陽離子脂質(zhì)的頭部基團(tuán)包括季胺。例如，在一些實施方式中所述陽離子脂質(zhì)選自下組:1，2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1，2-二油酰-Sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿(DOEPC)、N，N- 二油酰-N，N- 二甲基氯化銨(DODAC)、和N-[1- (2，3- 二油烯氧基)丙基]-N，N, N-三甲基氯化銨(DOTMA)。
[0020]在一些實施方式中，所述乳液的特征在于:(a)所述顆粒的平均直徑在約SOnm至180nm ； (b)所述乳液含有油和D0TAP，其中⑴油:DOTAP的比例(摩爾:摩爾)為至少約8:1 (摩爾:摩爾)，且(ii)所述乳液中DOTAP的濃度為至少約2.58mM(l.8mg/mL)，或從約
2.58mM(l.8mg/mL)到約 7.16mM(5mg/mL)。所述油可為S烯或角S燒。
[0021]在一些實施方式中，所述乳液的特征在于:(a)所述顆粒的平均直徑在約SOnm至180nm ； (b)所述乳液含有油和D0TAP，其中⑴油:DOTAP的比例(摩爾:摩爾)為至少約4:1(摩爾:摩爾)，(ii)所述乳液中DOTAP的濃度為至少約2.58mM(l.8mg/mL)，且(iii)所述油以約0.2%至約8%(w/v) 存在。在一些實施方式中，所述油是鯊烯或角鯊?fù)?。在一些實施方式中，DOTAP的濃度從約2.58mM(l.8mg/mL)到約7.16mM(5mg/mL)。在一些實施方式中，所述油以0.6%至4% (w/v)存在。在一些實施方式中，所述油以約1%至約3.2% (w/v)存在。
[0022]本發(fā)明還提供一種制備水包油乳液的方法，所述乳液含有分散在水性連續(xù)相中的顆粒，其中所述乳液的特征在于:(a)所述顆粒的平均直徑在約SOnm至180nm ； (b)所述乳液含有油和陽離子脂質(zhì)，其中⑴油:陽離子脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)為至少約8:1(摩爾:摩爾)，(ii)所述乳液中陽離子脂質(zhì)的濃度為至少約2.5mM，且(iii)前提是所述陽離子脂質(zhì)不是DC-膽固醇，所述方法包括(a)直接將陽離子脂質(zhì)溶解于油中以形成油相；(b)提供所述乳液的水相；以及(c)通過均質(zhì)化將所述油相分散在水相中。所述油可加熱到溫度約30°C~約65°C以促進(jìn)所述陽離子脂質(zhì)分散在油中。也可使用更高的溫度，只要油或者陽離子脂質(zhì)沒有顯著降解。
[0023]本發(fā)明還提供一種制備水包油乳液的方法，所述乳液含有分散在水性連續(xù)相中的顆粒，其中所述乳液的特征在于:(a)所述顆粒的平均直徑在約SOnm至180nm ； (b)所述乳液含有油和陽離子脂質(zhì)，其中⑴油:陽離子脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)為至少約4:1(摩爾:摩爾)，(ii)所述乳液中陽離子脂質(zhì)的濃度為至少約2.5mM，(iii)所述油以約0.2%至約8%(w/v)存在，且(iv)其前提是所述陽離子脂質(zhì)不是DC-膽固醇，所述方法包括(a)直接將陽離子脂質(zhì)溶解于油中以形成油相；(b)提供所述乳液的水相；以及(C)通過均質(zhì)化將所述油相分散在水相中。所述油可加熱到溫度約30°C~約65°C以促進(jìn)所述陽離子脂質(zhì)分散在油中。也可使用更高的溫度，只要油或者陽離子脂質(zhì)沒有顯著降解。
[0024]另一方面，本發(fā)明提供一種含核酸分子(優(yōu)選RNA分子)的組合物，所述核酸分子與陽離子水包油乳液的顆粒復(fù)合，其中所述顆粒含有陽離子脂質(zhì)和在25°C下為液相的油，且⑴油:脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)至少約8:1(摩爾:摩爾)；(ii)所述組合物中陽離子脂質(zhì)的濃度為至少約1.25mM;以及(iii)其前提是所述陽離子脂質(zhì)不是DC-膽固醇。優(yōu)選所述乳液顆粒的平均直徑在約80nm至180nm,或約80nm至150nm,或約80nm至約130nm,以及所述組合物的N/P比例至少約4:1，或從約4:1至約20:1，或從約4:1至約15:1。在某些實施方式中，油:脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)是約10:1(摩爾:摩爾)到約43:1(摩爾:摩爾)。所述水包油乳液可含約0.1%-約5%(w/v)的油。在一些實施方式中，所述油是鯊烯或角鯊?fù)椤?[0025]另一方面，本發(fā)明提供一種含核酸分子(優(yōu)選RNA分子)的組合物，所述核酸分子與陽離子水包油乳液的顆粒復(fù)合，其中所述顆粒含有陽離子脂質(zhì)和在25°C下為液相的油，且⑴油:脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)至少約4:1(摩爾:摩爾)；(ii)所述組合物中陽離子脂質(zhì)的濃度為至少約1.25mM ； (iii)所述油以約0.1%至約4%(w/v)存在；以及(iv)其前提是所述陽離子脂質(zhì)不是DC-膽固醇。優(yōu)選所述乳液顆粒的平均直徑在約SOnm至180nm，或約80nm至150nm，或約80nm至約130nm，以及所述組合物的N/P比例至少約4:1，或從約4:1至約20:1，或從約4:1至約15:1。在某些實施方式中，油:脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)是約4:1(摩爾:摩爾)到約43:1(摩爾:摩爾)。在一些實施方式中，所述油是鯊烯或角鯊?fù)?。在一些實施方式中，所述油?.6%至4%(w/v)存在。在一些實施方式中，所述油以約1%至約3.2% (w/v)存在。
[0026]這方面的所述水包油乳液還可包含表面活性劑如非離子型表面活性劑。優(yōu)選地，表面活性劑不是聚乙二醇(PEG)-脂質(zhì)。表面活性劑存在量可為約0.005到約1.25%(w/v)。在一些實施方式中，所述表面活性劑是SPAN85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、吐溫80 (聚山梨酯80)、或其組合。在一些實施方式中，所述水包油乳液含有等量的SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)和吐溫80 (聚山梨酯80)，例如各0.25%或0.5% (w/v)。
[0027]優(yōu)選所述陽離子脂質(zhì)的頭部基團(tuán)包括季胺。例如，在一些實施方式中所述陽離子脂質(zhì)是選自下組:1，2- 二油酸氧基-3- ( 二甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1，2- 二油酸_sn_甘油-3-乙基磷酸膽堿(DOEPC)、N，N-二油酰-N，N-二甲基氯化銨(DODAC)、和N-[1-(2，3-二油烯氧基)丙基]-N，N, N-三甲基氯化銨(DOTMA)。
[0028]在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種含核酸分子(優(yōu)選RNA分子)的組合物，所述核酸分子與陽離子水包油乳液的顆粒復(fù)合，其中所述顆粒含有DOTAP和在25°C下為液相的油，且⑴油:DOTAP的比例(摩爾:摩爾)至少約8:1(摩爾:摩爾)；(ii)所述組合物中 DOTAP 的濃度為至少約 1.29mM,或從 1.29mM(0.9mg/mL)到約 3.58mM(2.5mg/mL)。所述油可為鯊烯或角鯊?fù)??？蛇x的，N/P比為至少4:1。
[0029]在優(yōu)選實施方式中，所述組合物帶緩沖(例如，含檸檬酸鹽緩沖劑、琥珀酸鹽緩沖劑、乙酸鹽緩沖劑)且PH在約6.0到約8.0，優(yōu)選約6.2到約6.8。所述還可包含無機鹽，且無機鹽濃度優(yōu)選不超過30mM?？蛇x地，所述組合物還可含有非離子型等張劑，并優(yōu)選是等滲的。
[0030]本發(fā)明還提供制備含核酸分子(優(yōu)選RNA分子)組合物的方法，所述核酸分子與陽離子水包油乳液的顆粒復(fù)合，所述方法包括(i)提供本文所述的水包油乳液；(ii)提供含所述RNA分子的水溶液；以及(iii)組合⑴的水包油乳液和(ii)的水溶液，從而制備所述組合物。在一些實施方式中，所述陽離子水包油乳液和RNA溶液以約l:l(v/v)的比例組合。所述含RNA分子的水溶液優(yōu)選帶緩沖(例如，含檸檬酸鹽緩沖劑、琥珀酸鹽緩沖劑、乙酸鹽緩沖劑)，可含有無機鹽(例如NaCl)，所述鹽優(yōu)選以約20mM存在或更少。在一種實施方式中，所述含RNA分子的水溶液含有2mM檸檬酸鹽緩沖劑和20mM NaCl?？蛇x地，所述含RNA分子的水溶液還含有非離子型等張劑，并且是等滲的。在一種實施方式中，所述水溶液還含有約560mM蔗糖?？蛇x地，所述含RNA分子的水溶液還含有聚合物或非離子型表面活性劑，如Pluronic? F127，含量從約0.05%到約20%(w/v)。
[0031]另一方面，本發(fā)明提供一種水包油乳液，其含有分散在水性連續(xù)相的顆粒，所述乳液含有油和陽離子脂質(zhì)，所述顆粒的平均直徑從約80nm到180nm,所述油以0.6%至4%(w/v)存在；且所述乳液中陽離子脂質(zhì)的濃度至少約1.25mM。優(yōu)選地，所述水包油乳液是穩(wěn)定的。在一些實施方式中，所述乳液中陽離子脂質(zhì)的濃度至少約2.5mM。在一些實施方式中，所述油是鯊烯或角鯊?fù)椤?br> [0032]這方面的所述水包油乳液還可包含表面活性劑如非離子型表面活性劑。優(yōu)選地，表面活性劑不是聚乙二醇(PEG)-脂質(zhì)。表面活性劑存在量可為約0.01到約2.5%(w/v)。在一些實施方式中，所述表面活性劑是SPAN85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、吐溫80 (聚山梨酯80)、或其組合。在一些實施方式中，所述水包油乳液含有等量的SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)和吐溫80 (聚山梨酯80)，例如各0.25%或0.5%(w/v)。
[0033]優(yōu)選所述陽離子脂質(zhì)的頭部基團(tuán)包括季胺。例如，在一些實施方式中所述陽離子脂質(zhì)是選自下組:1，2- 二油酸氧基-3- ( 二甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1，2- 二油酸_sn_甘油-3-乙基磷酸膽堿(DOEPC)、N，N-二油酰-N，N-二甲基氯化銨(DODAC)、和N-[1-(2，3-二油烯氧基)丙基]-N，N, N-三甲基氯`化銨(DOTMA)。
[0034]本發(fā)明提供一種含核酸分子(優(yōu)選RNA分子)的組合物，所述核酸分子與陽離子水包油乳液的顆粒復(fù)合，所述乳液含有分散在水性連續(xù)相中的顆粒，其中所述乳液含有油和陽離子脂質(zhì)，所述顆粒的平均直徑從約80nm到180nm,所述油以0.6%至4%(w/v)存在；且所述乳液中陽離子脂質(zhì)的濃度至少約1.25mM。優(yōu)選地，所述水包油乳液是穩(wěn)定的。在一些實施方式中，所述乳液中陽離子脂質(zhì)的濃度至少約2.5mM。在一些實施方式中，所述油是鯊烯或角鯊?fù)?。?yōu)選地，所述組合物的N/P比至少約4:1。
[0035]在優(yōu)選實施方式中，所述組合物帶緩沖(例如，含檸檬酸鹽緩沖劑、琥珀酸鹽緩沖劑、乙酸鹽緩沖劑)且PH在約6.0到約8.0，優(yōu)選約6.2到約6.8。所述還可包含無機鹽，且無機鹽濃度優(yōu)選不超過30mM?？蛇x地，所述組合物還可含有非離子型等張劑，并優(yōu)選是等滲的。
[0036]本發(fā)明還涉及在對象中產(chǎn)生免疫響應(yīng)的方法，所述方法包括給予有需要的對象本文所述的組合物。優(yōu)選在單次給藥中給予所述對象的陽離子脂質(zhì)(作為所述組合物的成分)的量不超過約30mg。在【具體實施方式】中，所述陽離子脂質(zhì)是DOTAP且單次給藥中給予對象的DOTAP總量不超過約24mg,或者不超過約4mg?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0037]圖1是編碼5種CMV蛋白的五順反子RNA復(fù)制子A526、A527、A554、A555和A556的示意圖。亞基因組啟動子用箭頭表示，標(biāo)記了其它控制元件。
[0038]圖2的熒光柱狀圖顯示用A527RNA復(fù)制子轉(zhuǎn)染的BHKV細(xì)胞表達(dá)gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚體復(fù)合物。用抗體進(jìn)行細(xì)胞染色，所述抗體結(jié)合五聚體復(fù)合物上所呈遞的構(gòu)象表位。
[0039]圖3是示意圖和圖表。該示意圖顯示編碼CMV gH和gL的雙順反子RNA復(fù)制子A160和A531-A537。該圖表顯示免疫血清的中和活性，所述免疫血清來自用含有復(fù)制子的VRP免疫的小鼠。
[0040]圖4顯示免疫血清中抗VZV蛋白的抗體應(yīng)答，所述免疫血清來自用編碼VZV蛋白的單順反子RNA復(fù)制子或編碼VZV gE和gl、或gH和gL的雙順反子RNA復(fù)制子免疫的小鼠。所述小鼠經(jīng)7 μ g RNA免疫，該RNA以CMF32配制。
【具體實施方式】
[0041]1.概述
[0042]本發(fā)明一般涉及陽離子水包油乳液，其含有高濃度陽離子脂質(zhì)并具有限定的油:陽離子脂質(zhì)比例。所述油和陽離子脂質(zhì)是乳液的單獨組分，并優(yōu)選所述油不是離子型的。所述陽離子脂質(zhì)可與帶負(fù)電分子如核酸相互作用，從而將所述帶負(fù)電分子錨定到所述乳液顆粒。本文所述陽離子乳液可用于體內(nèi)遞送帶負(fù)電分子，例如核酸分子(如編碼蛋白或肽的RNA分子，小干擾RNA，自復(fù)制RNA等)到細(xì)胞，并可用于配制基于核酸的疫苗。
[0043]具體地，本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn):能成功制得含有高濃度陽離子脂質(zhì)并具有限定的油:陽離子脂質(zhì)比例的陽離·子水包油穩(wěn)定乳液。含有高濃度陽離子脂質(zhì)的乳液使得能夠用乳液顆粒配制更多帶負(fù)電的分子(如RNA分子)，從而提高遞送效率。具體地，對于很多治療劑如疫苗，優(yōu)選小體積(例如，每劑0.5mL)給藥。如本文所述的含有高濃度陽離子脂質(zhì)并具有限定的油:陽離子脂質(zhì)比例的乳液將能在特定的體積內(nèi)遞送更高劑量的RNA。
[0044]在優(yōu)選實施方式中，RNA分子與所述水包油乳液的顆粒復(fù)合。相對于游離(“裸露”)RNA,復(fù)合的RNA分子穩(wěn)定且受保護(hù)免于RNA酶介導(dǎo)的降解，并且能被細(xì)胞更有效攝入。
[0045]此外，當(dāng)所述RNA被遞送以誘導(dǎo)編碼蛋白的表達(dá)時，例如在RNA疫苗的情況中，含有高濃度陽離子脂質(zhì)的乳液能提高與乳液顆粒復(fù)合的RNA分子的量。由于更多RNA分子被遞送至宿主細(xì)胞，所編碼蛋白抗原的產(chǎn)生量更高，繼而增強所述RNA疫苗的效力和免疫原性。最后，所編碼蛋白的免疫原性可由于乳液的佐劑效應(yīng)而得以增強。因此，除了更有效遞送帶負(fù)電分子(如編碼抗原的RNA分子)之外，陽離子乳液還可通過佐劑活性增強免疫響應(yīng)。例如，如本文所述和示例的，與低DOTAP乳液復(fù)合的RNA分子相比，RNA分子(編碼呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白)和高DOTAP乳液復(fù)合的制劑在RSV小鼠模型和棉鼠模型中產(chǎn)生更高的免疫響應(yīng)。
[0046]因此，一方面，本發(fā)明提供一種水包油乳液，其含有分散在水性連續(xù)相中的顆粒，其中所述乳液的特征在于:(a)所述顆粒的平均直徑在約SOnm至180nm ； (b)所述乳液含有油和陽離子脂質(zhì)，其中⑴油:陽離子脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)為至少約8:1(摩爾:摩爾)，(ii)所述乳液中陽離子脂質(zhì)的濃度為至少約2.5mM，且(iii)所述陽離子脂質(zhì)不是DC-膽固醇。
[0047]另一方面，本發(fā)明提供一種水包油乳液，其含有分散在水性連續(xù)相中的顆粒，其中所述乳液的特征在于:(a)所述顆粒的平均直徑在約SOnm至180nm ； (b)所述乳液含有油和陽離子脂質(zhì)，其中⑴油:陽離子脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)為至少約4:1(摩爾:摩爾)，
(ii)所述乳液中陽離子脂質(zhì)的濃度為至少約2.5mM, (iii)所述油以約0.2%至約8%(w/v)存在；且(iv)其前提是所述陽離子脂質(zhì)不是DC-膽固醇。
[0048]所述陽離子乳液還可含有表面活性劑(例如，吐溫80、SPAN85、或其組合)。
[0049]在另一方面，本發(fā)明還提供陽離子水包油乳液的數(shù)種具體制劑，其含有高濃度陽離子脂質(zhì)并可用于遞送帶負(fù)電分子。
[0050]另一方面，本發(fā)明提供一種制備水包油乳液的方法，所述方法包括:(I)直接將陽離子脂質(zhì)溶解在油中以形成油相；(2)提供所述乳液的水相；和(3)將所述油相分散在所述水相中(例如，通過均質(zhì)化)。若需要，所述油可加熱到溫度約30°C~約65°C以促進(jìn)所述陽離子脂質(zhì)溶解在油中。優(yōu)選地，油相的油:陽離子脂質(zhì)比例(摩爾:摩爾)至少約8:1(摩爾:摩爾)，并且可選或補充地，所述顆粒的平均直接從約80nm到ISOnm和/或油相中的陽離子脂質(zhì)濃度至少約5mM。
[0051]另一方面，本發(fā)明提供制備包含帶負(fù)電分子(如RNA分子)的組合物的方法，所述帶負(fù)電分子與陽離子水包油乳液顆粒復(fù)合，所述方法包括:(i)提供本文所述的水包油乳液；(ii)提供含所述RNA分子的水溶液；以及(iii)組合(ii)的水溶液和(i)的水包油溶液，從而制備所述組合物。若需要，含所述RNA分子的水溶液可含有鹽(NaCl)、緩沖劑(例如檸檬酸鹽緩沖液)、非離子型等張劑(例如蔗糖、海藻糖、山梨糖醇或右旋糖)、聚合物(例如Pluronic? F127)、或其組合物。
[0052]本發(fā)明所述陽離子乳液可用`于遞送帶負(fù)電分子，如核酸(如RNA)。所述組合物可給予有需要的對象來產(chǎn)生或增強免疫響應(yīng)。所述組合物還可與另一免疫原性分子、免疫原性組合物或疫苗共遞送以增強所誘發(fā)免疫響應(yīng)的效能。
[0053]2.定義
[0054]本文所用的術(shù)語“約”指某數(shù)值的+/_5%。
[0055]“抗原”指含一個或多個表位(線性、構(gòu)象或兼有)的分子。
[0056]“緩沖液”指抗拒溶液pH變化的水溶液。
[0057]本文所用“核苷酸類似物”或“修飾的核苷酸”指在核苷的含氮堿基(如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)，腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G))中或其上含一種或多種化學(xué)修飾(如取代)的核苷酸。
[0058]如本文所用，乳液“顆粒”指懸浮在水包油乳液的水(連續(xù))相中的油滴。所述顆粒還包含陽離子液體，和可選的其它組分，如表面活性劑。
[0059]術(shù)語“聚合物”指由相同或不同的個體化學(xué)部分連接在一起所組成的分子。如本文所用，術(shù)語“聚合物”指那些首尾相連而形成線性分子的個體化學(xué)部分，以及以分支(如“多臂”或“星型”)結(jié)構(gòu)形式連接在一起的個體化學(xué)部分。示例性聚合物包括，例如，泊洛沙姆。泊洛沙姆是非離子三嵌段共聚物，其具有聚氧丙烯(聚(環(huán)氧丙烷))中央疏水鏈，側(cè)連兩條聚氧乙烯(聚(環(huán)氧乙烷))親水鏈。[0060]如本文所述，“糖(saccharide) ”涵蓋單糖、寡糖或以直鏈或環(huán)形或其組合的形式形成糖鏈的多糖。寡糖是具有2種或更多單糖殘基的糖。糖的示例包括葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、蔗糖和海藻糖。
[0061]當(dāng)乳液顆粒在4°C下至少1個月，優(yōu)選至少2個月保持分散而沒有顯著聚集或聚結(jié)時，乳液是“穩(wěn)定的”。當(dāng)乳液于4°C保存I個月，或優(yōu)選2個月時，穩(wěn)定乳液的平均顆粒直徑(數(shù)量平均直徑)的改變不超過10%。
[0062]術(shù)語“表面活性劑”是本領(lǐng)域術(shù)語并通常指同時具有親水基團(tuán)(如極性基團(tuán))和疏水基團(tuán)的任何分子，親水基團(tuán)在能量上傾向于被水溶劑化，而疏水基團(tuán)不能被水良好溶劑化。術(shù)語“非離子表面活性劑”是本領(lǐng)域已知術(shù)語并通常指其親水基團(tuán)(如極性基團(tuán))不帶靜電荷的表面活性劑分子。
[0063]乳液的“ζ電勢”通過乳液顆粒的電泳遷移率來確定。顆粒在單位電場內(nèi)的速度被稱作其電泳遷移率。(電勢通過亨利方程與電泳遷移率關(guān)聯(lián):..2v, ~
[0064]
【權(quán)利要求】
1.一種水包油乳液，其含有分散在水性連續(xù)相中的顆粒，其特征在于，所述顆粒的平均直徑為約80nm到180nm，所述乳液含有油和陽離子脂質(zhì)，并且 其中: (i)油:脂質(zhì)(摩爾:摩爾)至少約8:1(摩爾:摩爾)； (ii)所述乳液中陽離子脂質(zhì)的濃度至少約2.5mM ;且 (iii)所述陽離子脂質(zhì)不是DC-膽固醇。
2.如權(quán)利要求1所述的水包油乳液，其特征在于，所述顆粒的平均直徑為約80nm到約150nmo
3.如權(quán)利要求1或2所述的水包油乳液，其特征在于，所述顆粒的平均直徑為約SOnm到約130nm。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油乳液是穩(wěn)定的。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述油:脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)是約10:1(摩爾:摩爾)到約43:1 (摩爾:摩爾)。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油乳液含有約0.2%到約8%(w/v)的油。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述油是鯊烯或角鯊?fù)?。`
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述顆粒還含有表面活性劑。
9.如權(quán)利要求8所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性劑是非離子型表面活性劑。
10.如權(quán)利要求8或9所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性劑不是聚乙二醇(PEG)-脂質(zhì)。
11.如權(quán)利要求8-10中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述陽離子水包油乳液含有約0.01%到約2.5%(v/v)的表面活性劑。
12.如權(quán)利要求8-11中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性劑是SPAN85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、吐溫80 (聚山梨酯80)、或其組合。
13.如權(quán)利要求12所述的水包油乳液，其特征在于，所述陽離子水包油乳液包含約0.5%(v/v)吐溫 80 和約 0.5%(v/v) SPAN85。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)的頭部基團(tuán)包括季胺。
15.如權(quán)利要求1-13中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)選自下組:1，2- 二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1，2- 二油酰-sn_甘油-3-乙基磷酸膽堿(DOEPC)、N，N- 二油酰-N，N- 二甲基氯化銨(DODAC)、和N-[1-(2，3- 二油烯氧基)丙基]-N，N, N-三甲基氯化銨(DOTMA)。
16.如權(quán)利要求15所述的水包油乳液，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)是D0TAP。
17.如權(quán)利要求16所述的水包油乳液，其特征在于，所述乳液中的DOTAP濃度是至少約2.58mM(l.8mg/mL)。
18.如權(quán)利要求16所述的水包油乳液，其特征在于，所述乳液中的DOTAP濃度是約，2.58mM(l.8mg/mL)到約 7.16mM(5mg/mL)。
19.制備權(quán)利要求1-18中任一所述的水包油乳液的方法，所述方法包括:(a)直接將陽離子脂質(zhì)溶解在油中以形成油相；(b)提供所述乳液的水相；和(C)通過均質(zhì)化將所述油相分散在所述水相中。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，步驟(a)還包括加熱所述油至溫度在約30°C到約65°C之間。
21.一種組合物，其包含與陽離子水包油乳液顆粒復(fù)合的RNA分子，其特征在于，所述顆粒包括在25°C時為液相的油，和陽離子脂質(zhì)，其中: (i)油:脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)至少約8:1(摩爾:摩爾)； (ii)所述乳液中陽離子脂質(zhì)的濃度至少約1.25mM ;且 (iii)所述陽離子脂質(zhì)不是DC-膽固醇。
22.如權(quán)利要求21所述的組合物，其特征在于，所述顆粒的平均直徑為約SOnm到約180nm。
23.如權(quán)利要求21所述的組合物，其特征在于，所述顆粒的平均直徑為約SOnm到約150nmo
24.如權(quán)利要求21所述的組合物，其特征在于，所述顆粒的平均直徑為約SOrnn到約130nmo
25.如權(quán)利要求21-24中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物的N/P比至少約 4:1。
26.如權(quán)利要求21-24中任一項所述的組合物，其特征在于，所述乳液的N/P比為約4:1 到約 20:1。
27.如權(quán)利要求21-24中任一項所述的組合物，其特征在于，所述乳液的N/P比為約4:1 到約 15:1。
28.如權(quán)利要求21-27中任一項所述的組合物，其特征在于，所述油:脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)是約10:1(摩爾:摩爾)到約43:1 (摩爾:摩爾)。
29.如權(quán)利要求21-28中任一項所述的組合物，其特征在于，所述陽離子水包油乳液包含約0.1%-約5%(w/v)的油。
30.如權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于，所述油是鯊烯或角鯊?fù)椤?br> 31.如權(quán)利要求21-30中任一項所述的組合物，其特征在于，所述顆粒還包含表面活性劑。
32.如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述表面活性劑是非離子型表面活性劑。
33.如權(quán)利要求31或32所述的組合物，其特征在于，所述表面活性劑不是聚乙二醇(PEG)-脂質(zhì)。
34.如權(quán)利要求31-33中任一項所述的組合物，其特征在于，所述陽離子水包油乳液包含約0.005%到約1.25%(v/v)的表面活性劑。
35.如權(quán)利要求31-33中任一項所述的組合物，其特征在于，所述表面活性劑是SPAN85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、吐溫80 (聚山梨酯80)、或其組合。
36.如權(quán)利要求35所述的組合物，其特征在于，所述陽離子水包油乳液包含約.0.25%(v/v)吐溫 80 和約 0.25%(v/v) SPAN85。
37.如權(quán)利要求21-36中任一項所述的組合物，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)的頭部基團(tuán)包括季胺。
38.如權(quán)利要求21-36中任一項所述的組合物，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)選自下組:1，2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿(DOEPC)、N，N-二油酰-N，N-二甲基氯化銨(DODAC)、和N-[1-(2，3-二油烯氧基)丙基]-N, N, N-三甲基氯化銨(DOTMA)。
39.如權(quán)利要求38所述的組合物，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)是D0TAP。
40.如權(quán)利要求39所述的組合物，其特征在于，所述組合物中的DOTAP濃度是至少約.1.29mM(0.9mg/mL)。
41.如權(quán)利要求39所述的組合物，其特征在于，所述組合物中的DOTAP濃度是約1.29mM(0.9mg/mL)到約 3.58mM(2.5mg/mL)。
42.如權(quán)利要求21-41中任一項所述的組合物，其特征在于，所述RNA分子是編碼抗原的自復(fù)制RNA分子。
43.如權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于，所述自復(fù)制RNA是α病毒衍生的RNA復(fù)制子。
44.一種制備組合物的方法，所述組合物包含與陽離子水包油乳液的顆粒復(fù)合的RNA分子，所述方法包括: (i)提供權(quán)利要求1-18中任一項所述的水包油乳液； (ii)提供含有所述RNA分子的水溶液；以及 (iii)組合⑴的水包油乳液和(ii)的水溶液，從而制備所述組合物。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，(i)的所述陽離子水包油乳液和(ii)的所述RNA溶液以約1:1 (v/v)的比例組合。
46.如權(quán)利要求44或45所述的方法，其特征在于，包含所述RNA分子的水溶液含有鹽。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述鹽是NaCl。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述水溶液包含約20mMNaCl。
49.如權(quán)利要求44-48中任一項所述的方法，其特征在于，包含所述RNA分子的水溶液是緩沖液。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述緩沖液是檸檬酸鹽緩沖液。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述緩沖液包含約2mM檸檬酸鹽。
52.如權(quán)利要求44-51中任一項所述的方法,其特征在于,包含所述RNA分子的水溶液包含非離子型等張劑。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述非離子型等張劑是糖或糖醇。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述非離子型等張劑選自下組:蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、右旋糖和其組合。
55.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述非離子型等張劑是蔗糖。
56.如權(quán)利要求55所述的方法,其特征在于,所述水溶液包含約560mM鹿糖。
57.如權(quán)利要求44-56中任一項所述的方法,其特征在于,包含所述RNA分子的水溶液包含聚合物。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述聚合物是Pluronic?F127。
59.如權(quán)利要求57或58所述的方法，其特征在于，所述水溶液包含約0.05%到約20%(w/v)的聚合物。
60.如權(quán)利要求57-59中任一項所述的方法，其特征在于，所述水溶液包含約l%(w/V) Pluronic? F127。
61.一種水包油乳液，其含有分散在水性連續(xù)相的顆粒，其特征在于，所述乳液含有油和陽離子脂質(zhì)，所述顆粒的平均直徑從約80nm到180nm,所述油以0.6%至4%(w/v)存在；且所述乳液中陽離子脂質(zhì)的濃度至少約1.25mM。
62.如權(quán)利要求61所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油乳液是穩(wěn)定的。
63.如權(quán)利要求61或62所述的水包油乳液，其特征在于，所述乳液中的陽離子脂質(zhì)濃度至少約2.5mM。
64.如權(quán)利要求61-63中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述油是鯊烯或角鯊燒。
65.如權(quán)利要求61-64中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述顆粒還含有表面活性劑。
66.如權(quán)利要求65所 述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性劑是非離子型表面活性劑。
67.如權(quán)利要求66所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性劑不是聚乙二醇(PEG)-脂質(zhì)。
68.如權(quán)利要求65-67中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述陽離子水包油乳液含有約0.01%到約2.5%(v/v)的表面活性劑。
69.如權(quán)利要求65-68中任一項所述的水包油乳液,其特征在于,所述表面活性劑是SPAN85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、吐溫80 (聚山梨酯80)、或其組合。
70.如權(quán)利要求61-69中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)的頭部基團(tuán)包括季胺。
71.如權(quán)利要求61-69中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)選自下組:1，2- 二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1，2- 二油酰-sn_甘油-3-乙基磷酸膽堿(DOEPC)、N，N- 二油酰-N，N- 二甲基氯化銨(DODAC)、和N-[1-(2，3- 二油烯氧基)丙基]-N，N, N-三甲基氯化銨(DOTMA)。
72.如權(quán)利要求71所述的水包油乳液，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)是D0TAP。
73.—種組合物，其包含與權(quán)利要求61-72中任一項所述的陽離子水包油乳液的顆粒復(fù)合的RNA分子。
74.如權(quán)利要求73所述的組合物，其特征在于，所述組合物的N/P比至少約4:1。
75.如權(quán)利要求73所述的組合物，其特征在于，所述組合物的N/P比為約4:1到約20:1。
76.如權(quán)利要求73所述的組合物，其特征在于，所述組合物的N/P比為約4:1到約15:1。
77.如權(quán)利要求73-76中任一項所述的組合物，其特征在于，所述RNA分子是編碼抗原的自復(fù)制RNA分子。
78.如權(quán)利要求77所述的組合物，其特征在于，所述自復(fù)制RNA是α病毒衍生的RNA復(fù)制子。
79.如權(quán)利要求73-78中任一項所述的組合物，其特征在于，所述乳液顆粒的平均直徑為約80nm到約180nm。
80.如權(quán)利要求21-43和73-79中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物經(jīng)緩沖且pH為約6.0-約8.0。
81.如權(quán)利要求21-43和73-80中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含無機鹽，且無機鹽濃度不超過30mM。
82.如權(quán)利要求21-43和73-81中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含非離子型等張劑并且為等滲的。
83.如權(quán)利要求1-20中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油乳液是穩(wěn)定的。
84.—種組合物，其包含與陽離子水包油乳液的顆粒復(fù)合的RNA分子，其特征在于，所述組合物用下述過程制得: (i)提供權(quán)利要求61-72中任一項所述的水包油乳液； (ii)提供含有所述RNA分子的水溶液；以及 (iii)組合⑴的水包油乳液和(ii)的水溶液，從而制備所述組合物。
85.如權(quán)利要求21-43、73-82和84中任一項所述的組合物，其特征在于，所述RNA分子是編碼兩個或更多抗原的多順反子RNA。
86.如權(quán)利要求85所述的組合物，其特征在于，所述多順反子RNA是α病毒復(fù)制子。
87.如權(quán)利要求86所述的組合物，其特征在于，所述α病毒復(fù)制子含有編碼第一抗原的第一核苷酸序列和編碼第二抗原的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列操作性連接于控制元件。
88.如權(quán)利要求87所述的組合物，其特征在于，所述第一核苷酸序列操作性連接于第一控制元件且所述第二核苷酸序列操作性連接于第二控制元件。
89.如權(quán)利要求87或88所述的組合物，其特征在于，還包含編碼第三蛋白或其片段的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列操作性連接于控制元件。
90.如權(quán)利要求89所述的組合物，其特征在于，所述第三核苷酸序列操作性連接于第二控制兀件。
91.如權(quán)利要求89或90所述的組合物，其特征在于，還包含編碼第四蛋白或其片段的第四核苷酸序列，其中所述第四核苷酸序列操作性連接于控制元件。
92.如權(quán)利要求91所述的組合物，其特征在于，所述第四核苷酸序列操作性連接于第四控制元件。
93.如權(quán)利要求91或92所述的組合物，其特征在于，還包含編碼第五蛋白或其片段的第五核苷酸序列，其中所述第五核苷酸序列操作性連接于控制元件。
94.如權(quán)利要求93所述的組合物，其特征在于，所述第五核苷酸序列操作性連接于第五控制元件。
95.如權(quán)利要求87-94中任一項所述的組合物，其特征在于，所述控制元件獨立選自下組:亞基因組啟動子、IRES、和病毒2A位點。
96.一種在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將權(quán)利要求21-43、73-82和84-95中任一項所述的組合物給予有需要的對象。
97.如權(quán)利要求96所述的方法，其特征在于，單次給藥中給予所述對象的陽離子脂質(zhì)總量不超過約30mg。
98.如權(quán)利要求96所述的方法，其特征在于，單次給藥中給予所述對象的DOTAP總量不超過約24mg。
99.如權(quán)利要求96所述的方法，其特征在于，單次給藥中給予所述對象的DOTAP總量不超過約4mg。
100.一種水包油乳液，其含有分散在水性連續(xù)相中的顆粒，其特征在于，所述顆粒的平均粒徑為約SOnm到180nm，所述乳液含有油和陽離子脂質(zhì)，并且 其中: (i)油:脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)至少約4:1(摩爾:摩爾); (ii)所述乳液中陽離子脂質(zhì)的濃度至少約2.5mM ； (iii)所述油以約0.2%至約8%(w/v)存在；且 (iv)所述陽離子脂質(zhì)不是DC-膽固醇。
101.如權(quán)利要求100所述的水包油乳液，其特征在于，所述油以約0.6%到4% (w/v)存在。
102.如權(quán)利要求100或101所述的水包油乳液，其特征在于，所述油以約1%到約3.2% (w/v)存在。
103.如權(quán)利要求100-102中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述顆粒的平均直徑為約80nm到約150nm。
104.如權(quán)利要求100-103中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述顆粒的平均直徑為約80nm到約130nm。
105.如權(quán)利要求100-104中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油乳液是穩(wěn)定的。`
106.如權(quán)利要求100-105中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，油:脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)是約4:1 (摩爾:摩爾)到約43:1(摩爾:摩爾)。
107.如權(quán)利要求100-106中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述油是鯊烯或角鯊?fù)椤?br> 108.如權(quán)利要求100-107中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述顆粒還含有表面活性劑。
109.如權(quán)利要求108所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性劑是非離子型表面活性劑。
110.如權(quán)利要求108或109所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性劑不是聚乙二醇(PEG)-脂質(zhì)。
111.如權(quán)利要求108-110中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述陽離子水包油乳液含有約0.01%到約2.5%(v/v)的表面活性劑。
112.如權(quán)利要求108-111中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性劑是SPAN85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、吐溫80 (聚山梨酯80)、或其組合。
113.如權(quán)利要求112所述的水包油乳液，其特征在于，所述陽離子水包油乳液包含約0.5%(v/v)吐溫 80 和約 0.5%(v/v) SPAN85。
114.如權(quán)利要求100-113中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)的頭部基團(tuán)包括季胺。
115.如權(quán)利要求100-113中任一項所述的水包油乳液，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)選自下組:1，2- 二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP) ,1,2- 二油酰-sn_甘油-3-乙基磷酸膽堿(DOEPC)、N, N- 二油酰-N，N- 二甲基氯化銨(DODAC)、和N_[l_(2，3- 二油烯氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)。
116.如權(quán)利要求115所述的水包油乳液，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)是D0TAP。
117.如權(quán)利要求116所述的水包油乳液，其特征在于，所述乳液中的DOTAP濃度是至少約 2.58mM(l.8mg/mL)。
118.如權(quán)利要求116所述的水包油乳液，其特征在于，所述乳液中的DOTAP濃度是約2.58mM(l.8mg/mL)到約 7.16mM(5mg/mL)。
119.制備權(quán)利要求100-118中任一所述的水包油乳液的方法，所述方法包括:(a)直接將陽離子脂質(zhì)溶解在油中以形成油相；(b)提供所述乳液的水相；和(C)通過均質(zhì)化將所述油相分散在所述水相中。
120.如權(quán)利要求119所述的方法，其特征在于，步驟(a)還包括加熱所述油至溫度在約30°C到約65°C之間。
121.—種組合物，其包含與陽離子水包油乳液顆粒復(fù)合的RNA分子，其特征在于，所述顆粒包括在25°C時為液相的油，和陽離子脂質(zhì)，其中: (i)油:脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)至少約4:1(摩爾:摩爾)； (ii)所述乳液中陽離子脂質(zhì)的濃度至少約1.25mM ;且 (iii)所述油以約0.1%至約4%(w/v)存在；且 (iv)所述陽離子脂質(zhì)不是DC-膽固醇。
122.如權(quán)利要求121所述的組合物，其特征在于，所述油以約0.3%到2%(w/v)存在。
123.如權(quán)利要求121或122所述的水包油乳液，其特征在于，所述油以約0.5%到約1.6%(w/v)存在。
124.如權(quán)利要求121-123中任一項所述的組合物，其特征在于，所述顆粒的平均直徑為約 80nm 到 180nm。
125.如權(quán)利要求121-124中任一項所述的組合物，其特征在于，所述顆粒的平均直徑為約 80nm 到 150nm。
126.如權(quán)利要求121-125中任一項所述的組合物，其特征在于，所述顆粒的平均直徑為約80nm到約130nm。
127.如權(quán)利要求121-126中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物的N/P比至少約4:1。
128.如權(quán)利要求121 -126中任一項所述的組合物，其特征在于，所述乳液的N/P比為約4:1 到約 20:1。
129.如權(quán)利要求121-126中任一項所述的組合物，其特征在于，所述乳液的N/P比為約4:1 到約 15:1。
130.如權(quán)利要求121-129中任一項所述的組合物，其特征在于，油:脂質(zhì)的比例(摩爾:摩爾)是約4:1 (摩爾:摩爾)到約43:1(摩爾:摩爾)。
131.如權(quán)利要求121-130中任一項所述的組合物，其特征在于，所述油是鯊烯或角鯊燒。
132.如權(quán)利要求121-131中任一項所述的組合物，其特征在于，所述顆粒還包含表面活性劑。
133.如權(quán)利要求132所述的組合物，其特征在于，所述表面活性劑是非離子型表面活性劑。
134.如權(quán)利要求132或133所述的組合物，其特征在于，所述表面活性劑不是聚乙二醇(PEG)-脂質(zhì)。
135.如權(quán)利要求132-134中任一項所述的組合物，其特征在于，所述陽離子水包油乳液包含約0.005%到約1.25%(v/v)的表面活性劑。
136.如權(quán)利要求132-135中任一項所述的組合物，其特征在于，所述表面活性劑是SPAN85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、吐溫80 (聚山梨酯80)、或其組合。
137.如權(quán)利要求136所述的組合物，其特征在于，所述陽離子水包油乳液包含約0.25%(v/v)吐溫 80 和約 0.25%(v/v) SPAN85。
138.如權(quán)利要求121-137中任一項所述的組合物，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)的頭部基團(tuán)包括季胺。
139.如權(quán)利要求121-138中任一項所述的組合物，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)選自下組:1，2- 二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1，2- 二油酰-sn_甘油-3-乙基磷酸膽堿(DOEPC)、N，N- 二油酰-N，N- 二甲基氯化銨(DODAC)、和N-[1-(2，3- 二油烯氧基)丙基]-N，N, N-三甲基氯化銨(DOTMA)。
140.如權(quán)利要求139所述的組合物，其特征在于，所述陽離子脂質(zhì)是D0TAP。
141.如權(quán)利要求140所述的組合物，其特征在于，所述乳液中的DOTAP濃度是至少約1.29mM(0.9mg/mL)。
142.如權(quán)利要求140所述的組合物，其特征在于，所述組合物中的DOTAP濃度是約1.29mM(0.9mg/mL)到約 3.58mM(2.5mg/mL)。
143.如權(quán)利要求121-142中任一項所述的組合物，其特征在于，所述RNA分子是編碼抗原的自復(fù)制RNA分子。
144.如權(quán)利要求143所述的組合物，其特征在于，所述自復(fù)制RNA是α病毒衍生的RNA復(fù)制子。
145.一種制備組合物的方法，所述組合物包含與陽離子水包油乳液的顆粒復(fù)合的RNA分子，所述方法包括: (i)提供權(quán)利要求100-118中任一項所述的水包油乳液； (ii)提供含有所述RNA分子的水溶液；以及 (iii)組合⑴的水包油乳液和(ii)的水溶液，從而制備所述組合物。
146.如權(quán)利要求145所述的方法，其特征在于，(i)的所述陽離子水包油乳液和(ii)的所述RNA溶液以約1:1 (v/v)的比例組合。
147.如權(quán)利要求61所述的水包油乳液，其特征在于，所述油以約1%到約3.2%(w/v)存在。
148.如權(quán)利要求121-144中任一項所述的組合物，其特征在于，所述RNA分子是編碼兩個或更多抗原的多順反子RNA。
149.如權(quán)利要求148所述的組合物，其特征在于，所述多順反子RNA是α病毒復(fù)制子。
150.如權(quán)利要求149所述的組合物，其特征在于，所述α病毒復(fù)制子含有編碼第一抗原的第一核苷酸序列和編碼第二抗原的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列操作性連接于控制元件。
151.如權(quán)利要求150所述的組合物，其特征在于，所述第一核苷酸序列操作性連接于第一控制元件且所述第二核苷酸序列操作性連接于第二控制元件。
152.如權(quán)利要求150或151所述的組合物，其特征在于，還包含編碼第三蛋白或其片段的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列操作性連接于控制元件。
153.如權(quán)利要求152所述的組合物，其特征在于，所述第三核苷酸序列操作性連接于第三控制元件。
154.如權(quán)利要求152或153所述的組合物，其特征在于，還包含編碼第四蛋白或其片段的第四核苷酸序列，其中所述第四核苷酸序列操作性連接于控制元件。
155.如權(quán)利要求154所述的組合物，其特征在于，所述第四核苷酸序列操作性連接于第四控制元件。
156.如權(quán)利要求154或155所述的組合物，其特征在于，還包含編碼第五蛋白或其片段的第五核苷酸序列，其中所述第五核苷酸序列操作性連接于控制元件。
157.如權(quán)利要求156所述的組合物，其特征在于，所述第五核苷酸序列操作性連接于第五控制元件。
158.如權(quán)利要求150-157中任一項所述的組合物，其特征在于，所述控制元件獨立選自下組:亞基因組啟動子、IRES、和病毒2A位點。
159.—種在對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將權(quán)利要求121-144任一項所述的組合物給予有需要的對象。
160.如權(quán)利要求159所述的方法，其特征在于，單次給藥中給予所述對象的陽離子脂質(zhì)總量不超過約30mg。
161.如權(quán)利要求159所述的方法，其特征在于，單次給藥中給予所述對象的DOTAP總量不超過約24mg。
162.如權(quán)利要求159所述的方法，其特征在于，單次給藥中給予所述對象的DOTAP總量不超過約4mg。
163.如權(quán)利要求1-18、21-43、61-83、85-95、100-118、121-144 或 147-158 中任一項所述的水包油乳液或組合物，其還包含抗氧化劑。
【文檔編號】A61K47/06GK103796639SQ201280033539
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月6日
【發(fā)明者】L·布里托, M·陳, A·吉爾, 德里克·奧黑根, M·辛格 申請人:諾華股份有限公司