用于遞送rna分子的具有有用n:p比的脂質(zhì)體的制作方法
【專利摘要】通過(guò)遞送在含陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)體內(nèi)包封的RNA實(shí)現(xiàn)核酸免疫，其中所述脂質(zhì)體和所述RNA具有1∶1-20∶1的N∶P。
【專利說(shuō)明】用于遞送RNA分子的具有有用N:P比的脂質(zhì)體
[0001]本申請(qǐng)要求2011年7月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1 / 505，088的權(quán)益，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用納入本文以用于所有目的。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及用于免疫的非病毒性遞送RNA的領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0003]多年來(lái)，用于免疫動(dòng)物的核酸遞送一直是一個(gè)目標(biāo)。已經(jīng)測(cè)試過(guò)各種方法，包括對(duì)DNA或RNA、病毒性或非病毒性遞送載體(或甚至無(wú)遞送載體，在“裸”疫苗中)、復(fù)制或非復(fù)制載體或病毒性或非病毒性載體的應(yīng)用。
[0004]仍然存在對(duì)于進(jìn)一步和經(jīng)改善核酸疫苗的需求，尤其是對(duì)于遞送核酸疫苗的改進(jìn)方式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]按照本發(fā)明，通過(guò)遞送在含陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)體內(nèi)包封的RNA實(shí)現(xiàn)核酸免疫，其中所述脂質(zhì)體和所述RNA具有1: 1-20: I的N: P比?！癗: P比”是指陽(yáng)離子脂質(zhì)中 的氮原子與RNA中磷酸鹽的摩爾比。所述脂質(zhì)體可用于體內(nèi)向脊椎動(dòng)物細(xì)胞遞送RNA。
[0006]因此，本發(fā)明提供了包封RNA的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體包括陽(yáng)離子脂質(zhì)，RNA編碼免疫原，并且所述脂質(zhì)體與RNA具有1: 1-20:1的N: P比。
[0007]本發(fā)明也提供用于制備包封免疫原編碼RNA的脂質(zhì)體的方法，其中通過(guò)將脂質(zhì)體形成組分與免疫原編碼RNA混合形成所述脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體形成成分包括陽(yáng)離子脂質(zhì)，并且其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)和所述RNA以1: 1-20: I的N: P比混合。
[0008]脂質(zhì)體
[0009]各種兩親性脂質(zhì)能在水環(huán)境下形成雙層以包封含RNA的水核心作為脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)可具有陰離子、陽(yáng)離子或兩性離子親水頭基。從陰離子磷脂形成脂質(zhì)體可追溯到上世紀(jì)六十年代，而形成陽(yáng)離子脂質(zhì)體的脂質(zhì)從上世紀(jì)九十年代已開(kāi)始研究。一些磷脂為陰離子型而其他一些為兩性離子型且另外的為陽(yáng)離子型。合適類型的磷脂包括但不限于:磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油和表1所列的一些有用的磷脂。有用的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括但不限于:二油酰-三甲胺丙烷(DOTAP)、1，2- 二硬脂氧基-N，N- 二甲基_3_氛基丙烷(DSDMA)、I, 2_ 二油氧基-N, N 二甲基_3_氛基丙烷(DODMA)、I, 2-二亞油氧基-N，N- 二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA) ,1,2- 二亞麻氧基-N，N- 二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。兩性脂質(zhì)包括但不限于酸基兩性脂質(zhì)和釀基兩性脂質(zhì)。有用的兩性脂質(zhì)不例為DPPC、D0PC和十二烷基膽堿磷酸。所述脂質(zhì)可為飽和或不飽和。優(yōu)選使用至少一種非飽和脂質(zhì)來(lái)制備脂質(zhì)體。如果非飽和脂質(zhì)有兩個(gè)尾部，所述尾部可均為非飽和的，或其可以有一個(gè)飽和尾部和一個(gè)非飽和尾部。
[0010]本發(fā)明的脂質(zhì)體顆粒能夠形成自單個(gè)脂質(zhì)或脂質(zhì)的混合物，前提是使用至少一種陽(yáng)離子脂質(zhì)。在使用混合物的情況下，所述混合物可包括飽和以及不飽和脂質(zhì)。例如，本發(fā)明使用的混合物可包括DlinDMA(陽(yáng)離子、不飽和)、DSPC(兩性、飽和)和/或DMG(陰離子、飽和)。在使用脂質(zhì)混合物的情況下，并非所有混合物中的組成脂質(zhì)都需要帶電，例如一種或多種兩親性脂質(zhì)能與膽固醇混合，所述兩親性脂質(zhì)包括陽(yáng)離子脂質(zhì)。
[0011]本發(fā)明的脂質(zhì)體顆粒包括至少一種陽(yáng)離子脂質(zhì)，其頭部基團(tuán)包括至少一個(gè)能夠質(zhì)子化的氮原子。這些能在脂質(zhì)體中質(zhì)子化的脂質(zhì)氮原子的數(shù)量對(duì)本文使用的“N: P比”起作用。
[0012]優(yōu)選的陽(yáng)離子脂質(zhì)具有pKa范圍為5.0-7.6的可質(zhì)子化氮。理想地，pKa在此范圍內(nèi)的脂質(zhì)具有叔胺基；這種脂質(zhì)與諸如DOTAP或DC Chol的具有季胺基的脂質(zhì)表現(xiàn)不同。在生理pH下，pKa范圍為5.0-7.6范圍的胺具有中性或減少的(reduced)表面電荷，其中諸如DOTAP的脂質(zhì)是強(qiáng)陽(yáng)離子型。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)形成自季胺脂質(zhì)(例如，D0TAP)的脂質(zhì)體相比形成自叔胺脂質(zhì)的脂質(zhì)體(例如，DLinDMA)不太適合用于遞送免疫原編碼RNA。
[0013]在該pKa范圍內(nèi)，優(yōu)選脂質(zhì)的pKa是5.5至6.7，例如5.6至6.8,5.6至6.3,5.6至6.0,5.5至6.2或5.7至5.9。pKa值是50%脂質(zhì)帶電時(shí)的pH值，處于該脂質(zhì)完全帶電點(diǎn)和該脂質(zhì)完全不帶電點(diǎn)的中間。其可通過(guò)各種方法測(cè)定，但優(yōu)選使用在下面題為“PKa測(cè)定”的部分中公開(kāi)的方法測(cè)定。通常應(yīng)該就單獨(dú)脂質(zhì)測(cè)定PKa而不是就還包含其它脂質(zhì)的混合物背景下的脂質(zhì)測(cè)定(例如，并非如參考文獻(xiàn)5中所實(shí)施，其觀察SNALP而并非單獨(dú)脂質(zhì)的pKa)。
[0014]pKa在此范圍內(nèi)的優(yōu)選脂質(zhì)具有叔胺(tertiary amine)。例如，它們可以包括I，2- 二亞油氧基-N，N- 二甲基_3_氣基丙烷(DLinDMA ；pKa5.8)和/或1，2- 二亞麻氧基-N，N- 二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。另一個(gè)具有叔胺的合適脂質(zhì)是I，2-二油氧基-N，N 二甲基-3-氨基丙烷(D0DMA)。見(jiàn)參考文獻(xiàn)I。還可使用參考文獻(xiàn)2中的一些氨基酸脂質(zhì)，也可使用參考文獻(xiàn)3中的某些氨基脂質(zhì)。參考文獻(xiàn)4中公開(kāi)了其他在頭部基團(tuán)中具有叔胺的有用脂質(zhì)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用納入本文。
[0015]脂質(zhì)的親水部分可PEG化(即通過(guò)聚乙二醇共價(jià)連接修飾)。此修飾可增加穩(wěn)定性并防止所述脂質(zhì)體的非特異性吸收。例如，可使用例如參考文獻(xiàn)I和5公開(kāi)的那些技術(shù)將脂質(zhì)與PEG偶聯(lián)?？墒褂酶鞣N長(zhǎng)度的PEG，例如0.5-8kDa。
[0016]當(dāng)從脂質(zhì)混合物形成脂質(zhì)體時(shí)，優(yōu)選那些含有可質(zhì)子化氮的脂質(zhì)比例應(yīng)為脂質(zhì)總量的20-80%，例如，30-70%或40-60 %。脂質(zhì)內(nèi)容物的其余部分能由例如膽固醇(例如35-50%膽固醇)和/或DMG (任選PEG化)和/或DSPC制成。該混合物在下文使用。這些百分比值是摩爾百分比。實(shí)施例中使用DSPC、DlinDMA、PEG-DMG和膽固醇的混合物。
[0017]脂質(zhì)體顆粒通常分為3組:多層囊泡(MLV);小單層囊泡(SUV);和大單層囊泡(LUV)。MLV的各囊泡中具有多種雙層，形成數(shù)個(gè)分開(kāi)的水性隔室。SUV和LUV具有包封水性核心的單一雙層；SUV通常直徑≤50nm, LUV直徑>50nm。本發(fā)明的脂質(zhì)體顆粒理想上為直徑范圍50-220nm的LUV。對(duì)于含不同直徑LUV群的組合物:(i)至少數(shù)量上80%的直徑應(yīng)在20-220nm范圍內(nèi)，(ii)所述群體的平均直徑(Zav，按照強(qiáng)度)理想上在40_200nm范圍內(nèi)，和/或(iii)所述直徑的多分散性指數(shù)應(yīng)〈0.2。
[0018]脂質(zhì)DLinDMA在本文中有時(shí)稱為RVOl ;這是用于本發(fā)明的優(yōu)選陽(yáng)離子脂質(zhì)，雖然在一些實(shí)施方式中，所述脂質(zhì)體不包括DLinDMA:[0019]
【權(quán)利要求】
1.一種包封免疫原編碼RNA的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體包括陽(yáng)離子脂質(zhì)并且所述脂質(zhì)體與RNA具有1: 1-20:1的N: P比。
2.如權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體具有50-220nm范圍的直徑。
3.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述RNA為自復(fù)制RNA。
4.如權(quán)利要求3所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述自復(fù)制RNA編碼(i)RNA依賴性RNA聚合酶，所述RNA聚合酶可從所述自復(fù)制RNA分子轉(zhuǎn)錄RNA，和(ii)免疫原。
5.如權(quán)利要求4所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述RNA含有兩個(gè)開(kāi)放閱讀框，第一個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼α病毒復(fù)制酶并且第二個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼所述免疫原。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述RNA長(zhǎng)度為9000-12000個(gè)核苷酸。
7.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述免疫原可在體內(nèi)引起抵御細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲的免疫應(yīng)答。
8.如權(quán)利要求7所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述免疫原可在體內(nèi)引起抵御呼吸道合胞病毒F糖蛋白的免疫應(yīng)答。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體和RNA具有2: 1-18:1 的 N : P 比。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體和RNA具有3: 1-11:1 的 N: P 比。
11.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體和RNA具有4: 1-16:1 的 N: P 比。
12.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體和RNA具有6: 1-14:1 的 N: P 比。
13.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體和RNA具有8: 1-12:1 的 N: P 比。
14.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體和RNA具有2: 1、4: 1、8:1 或 10:1 的 N: P 比。
15.一種藥物組合物，所述組合物包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體。
16.—種在脊椎動(dòng)物中引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向脊椎動(dòng)物給予有效量的如權(quán)利要求1-14所述脂質(zhì)體或權(quán)利要求15所述藥物組合物的步驟。
【文檔編號(hào)】A61K39/39GK103764121SQ201280033241
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月6日
【發(fā)明者】A·吉爾, A·維爾瑪 申請(qǐng)人:諾華股份有限公司