生產(chǎn)peg化的寡核苷酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了制備治療性的、PEG化的寡核苷酸的方法。該方法包括旨在提高效率，借此可以制備治療性寡核苷酸的合成、切割和純化步驟。還描述了以提高的效率進(jìn)行大規(guī)模制備的方法。
【專利說(shuō)明】生產(chǎn)PEG化的寡核苷酸的方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年4月26日提交的第61 / 479，226號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列的權(quán)益，其在此通過(guò)引用被全文并入。
[0003]背景
[0004]核酸被常規(guī)地認(rèn)為主要在生物過(guò)程中起信息性作用。在過(guò)去的幾十年，已經(jīng)清楚核酸的三維結(jié)構(gòu)可以給予它們與蛋白質(zhì)相互作用并調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的能力。此類核酸配體或“適體”為短的能以高親和性和特異性結(jié)合給定配體的DNA或RNA寡聚物。作為一種類型，適體的三維結(jié)構(gòu)足夠多變，從而允許適體結(jié)合幾乎任何化合物(不論是單體化合物還是聚合化合物)并充當(dāng)其配體。適體已成為有前景的新的診斷和治療性化合物，尤其是在癌癥治療和凝血調(diào)節(jié)中。
[0005]許多第三方已申請(qǐng)和保護(hù)覆蓋適體的鑒別、生產(chǎn)和使用的專利。Gold和Tuerk通常被認(rèn)為首次開(kāi)發(fā)出分離適體的SELEX法，并且在許多美國(guó)專利中描述過(guò)他們的方法，包括第 5，670，637 號(hào)、第 5，696，249 號(hào)、第 5，843，653 號(hào)、第 6，110，900 號(hào)和第 5，270，163 號(hào)美國(guó)專利。Thomas Bruice等在第5686242號(hào)美國(guó)專利中報(bào)道了產(chǎn)生適體的方法，該方法與Tuerk和Gold報(bào)道的原始SELEX法不同，因?yàn)槠湓诤Y選序列期間采用了完全隨機(jī)的寡核苷酸?！?42專利中篩選的寡核苷酸沒(méi)有SELEX法中所篩選的寡核苷酸中存在的寡核苷酸引物。
[0006]Sullenger, Rusconi, Kontos 和 White 在 WO 02 / 26932 中描述了 RNA 適體，其可與在止血和其它生物事件的調(diào)節(jié)中有用的凝血因子、E2F家族轉(zhuǎn)錄因子、AngU Ang2和它們的片段或肽、轉(zhuǎn)錄因子 、自身免疫抗體和細(xì)胞表面受體結(jié)合。另參見(jiàn)Rusconi etal, Thrombosis and Haemostasis83:841-848 (2000) ；White et al, J.Clin Investl06:929-34(2000) ；Ishizaki et al, Nat Med2:1386-1389 (1996)和 Lee et al, Nat.Biotechnol.15:41-45(1997))。
[0007]為了使適體適合用作治療劑，合成便宜、體內(nèi)安全且穩(wěn)定是優(yōu)選的。由所有未經(jīng)過(guò)磷酸二酯骨架修飾的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸組成的RNA和DNA適體通常在體內(nèi)是不穩(wěn)定的，這是由于它們對(duì)核酸酶降解的敏感性。通過(guò)在2'位置并入修飾基團(tuán)可以大大增加對(duì)核酸酶降解的抗性。
[0008]除了被核酸酶清除，寡核苷酸治療劑還遭受腎過(guò)濾消除。鑒于此，經(jīng)靜脈給予的核酸酶抗性寡核苷酸通常展現(xiàn)< 10分鐘的體內(nèi)半衰期，除非可以阻止過(guò)濾。這可以通過(guò)促進(jìn)快速?gòu)难鞣植既虢M織或通過(guò)將寡核苷酸的表觀分子量增加到腎小球的有效大小截點(diǎn)以上來(lái)完成。將小分子治療劑與聚亞烷基氧化聚合物(例如，PEG化)綴合能夠極大地延長(zhǎng)適體在循環(huán)中的停留時(shí)間，從而減少劑量給予頻率并提高對(duì)血管靶標(biāo)的效力。
[0009]符合食品和藥物管理局(FDA)及其他國(guó)際管理機(jī)構(gòu)設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)的PEG化寡核苷酸的大規(guī)模生產(chǎn)包括給予患者的最終產(chǎn)物的合成、純化和表征的多個(gè)步驟。每一步驟都要花費(fèi)大量的時(shí)間和金錢(qián)。因此，需要對(duì)該類治療劑的有效率的和可行的生產(chǎn)方法進(jìn)行優(yōu)化。
[0010]發(fā)明概述[0011]在一個(gè)方面，提供了制備聚亞烷基氧化物(PAO)綴合的寡核苷酸的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸為RNA適體，其中所述適體具有二級(jí)結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸為適體的中和劑或活性控制劑。
[0012]在一個(gè)實(shí)施方案中，使用固相合成合成所述寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用至少一種經(jīng)修飾的核苷酸合成所述寡核苷酸。
[0013]在一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)PAO綴合的寡核苷酸的方法包括:在固相支持物上合成未PEG化的寡核苷酸；從所述固相支持物切割所述未PEG化的寡核苷酸并將所述未PEG化的寡核苷酸去保護(hù)；對(duì)所述未PEG化的寡核苷酸脫鹽；將所述未PEG化的寡核苷酸PEG化來(lái)產(chǎn)生PEG化的寡核苷酸；純化所述PEG化的寡核苷酸；以及對(duì)所述PEG化的寡核苷酸脫鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)未PEG化的寡核苷酸脫鹽包括超濾。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)PAO綴合的寡核苷酸的方法包括:在固相支持物上合成未PEG化的寡核苷酸；從所述固相支持物切割所述未PEG化的寡核苷酸并將所述未PEG化的寡核苷酸去保護(hù)；對(duì)所述未PEG化的寡核苷酸進(jìn)行鹽交換；將所述未PEG化的寡核苷酸PEG化來(lái)產(chǎn)生PEG化的寡核苷酸；純化所述PEG化的寡核苷酸；以及對(duì)PEG化的寡核苷酸脫鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)未PEG化的寡核苷酸進(jìn)行鹽交換包括超濾。
[0015]在一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)PAO綴合的寡核苷酸的方法包括:在固相支持物上合成未PEG化的寡核苷酸；從所述固相支持物切割所述未PEG化的寡核苷酸并將所述未PEG化的寡核苷酸去保護(hù)；對(duì)所述未PEG化的寡核苷酸進(jìn)行脫鹽和鹽交換；將所述未PEG化的寡核苷酸PEG化來(lái)產(chǎn)生PEG化的寡核苷酸；純化所述PEG化的寡核苷酸；以及對(duì)所述PEG化的寡核苷酸脫鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)未PEG化的寡核苷酸進(jìn)行脫鹽和鹽交換包括超濾。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方案中，方法進(jìn)一步包括冷凍干燥PEG化的寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在使用超濾 對(duì)PEG化的寡核苷酸脫鹽和進(jìn)一步純化步驟后進(jìn)行冷凍干燥步驟。
[0017]在另一個(gè)實(shí)施方案中，純化PEG化的寡核苷酸包括使用分子量截點(diǎn)小于PEG化的寡核苷酸的分子量的超濾膜進(jìn)行超濾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，超濾膜具有約10kD、20kD或30kD的分子量閾值。在另一個(gè)實(shí)施方案中，超濾膜具有約IOkD至約20kD或約20kD至約30kD的分子量閾值。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法不包括從固相支持物切割未PEG化的寡核苷酸并將未PEG化的寡核苷酸去保護(hù)后對(duì)未PEG化的寡核苷酸進(jìn)行離子交換純化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法不包括使用超濾對(duì)未PEG化的寡核苷酸進(jìn)行脫鹽和/或鹽交換前對(duì)未PEG化的寡核苷酸進(jìn)行離子交換純化。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中，純化PEG化的寡核苷酸包括使用陰離子交換高效液相色譜(HPLC)。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方案中，未PEG化的寡核苷酸包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的堿基部分。
[0021]在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)經(jīng)修飾的堿基部分選自:5_氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基胺-O-甲基硫代尿苷、5-羧甲基胺-O-甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β -D-半乳糖基Q核苷(β-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6_異戍烯基腺嘌呤、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、1-甲基肌苷、2，2_ 二甲基鳥(niǎo)嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥(niǎo)嘌呤、3-甲基胞嘧啶、6-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、5-甲基胺-O-甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺-O-甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖Q核苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-甲基硫代-Ν6-異戍烯基腺嘌呤、尿喃唳氧乙酸(V)、氧基丁氧核苷(butoxosine)、假尿喃唳、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶氧乙酸(v)、5-甲基硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方案中，未PEG化的寡核苷酸包括一個(gè)或多個(gè)經(jīng)W -O-甲基修飾的核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，未PEG化的寡核苷酸含有一個(gè)或多個(gè)2' -O-甲基修飾和一個(gè)或多個(gè)W -氟修飾。
[0023]在一個(gè)實(shí)施方案中，未PEG化的寡核苷酸具有二級(jí)結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述二級(jí)結(jié)構(gòu)包含至少一個(gè)莖和至少一個(gè)環(huán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述二級(jí)結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)莖和三個(gè)環(huán)。
[0024]在一個(gè)實(shí)施方案中，未PEG化的寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)W -O-甲基修飾和/或一個(gè)或多個(gè)W -氟修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，未PEG化的寡核苷酸在至少一個(gè)莖和/或至少一個(gè)環(huán)中包含一個(gè)或多個(gè)W -O-甲基修飾和/或一個(gè)或多個(gè)W -氟修飾。
[0025]在一個(gè)實(shí)施方案中，未PEG化的寡核苷酸的至少一個(gè)莖中的至少一個(gè)鳥(niǎo)嘌呤包含羥基糖-0H)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，未PEG化的寡核苷酸的至少一個(gè)莖中的至少一個(gè)尿苷被用2'-氟或2' -O-甲基修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，未PEG化的寡核苷酸的至少一個(gè)莖中的至少一個(gè)胞苷為經(jīng)2'-氟修飾的。
[0026]在一個(gè)實(shí)施方案中，未PEG化的寡核苷酸包含間隔區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述間隔區(qū)為乙二醇間隔區(qū)。
[0027]在一個(gè)實(shí)施方案中，未PEG化的寡核苷酸包含SEQ ID NOs:1_20中的一個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，未PEG化的`寡核苷酸由SEQ ID NOs:1-20中的一個(gè)組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，未PEG化的寡核苷酸包含本說(shuō)明書(shū)的表1和表2中描述的經(jīng)修飾的寡核苷酸中的一個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，未PEG化的寡核苷酸由本說(shuō)明書(shū)的表1和表2中描述的經(jīng)修飾的寡核苷酸中的一個(gè)組成。
[0028]在一個(gè)實(shí)施方案中，未PEG化的寡核苷酸在綴合到PAO前被偶聯(lián)到接頭上，以產(chǎn)生綴合接頭的未PEG化的寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，未PEG化的寡核苷酸包含具有反應(yīng)性氨基的接頭，且聚亞烷基氧化物被用活化的酯基官能團(tuán)化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，未PEG化的寡核苷酸包含具有反應(yīng)性硫基的接頭，且聚亞烷基氧化物被用馬來(lái)酰亞胺基官能團(tuán)化。在一個(gè)實(shí)施方案中，活化的酯基為NHS。
[0029]在一個(gè)實(shí)施方案中，聚亞烷基氧化物未被活化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，聚亞烷基氧化物進(jìn)一步包含羧酸部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在綴合反應(yīng)中包合水溶性偶聯(lián)劑原位完成PAO到綴合接頭的未PEG化的寡核苷酸的綴合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述水溶性偶聯(lián)劑為二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述水溶性偶聯(lián)劑為1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)。
[0030]在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)綴合或其他方式將接頭前體連接到寡核苷酸上來(lái)產(chǎn)生含接頭的未PEG化的寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述接頭前體選自:6-(三氟乙酰氨基)己醇(2-氰基乙基-N，N- 二異丙基)亞磷酰胺、TFA-氨基C4CED亞磷酰胺、5'-氨基改性劑C3TFA、5'-氨基改性劑5、5'-氨基改性劑C12和5'巰基改性劑C6(下文闡述的接頭)。
[0031]在一個(gè)實(shí)施方案中,接頭為己基氨基接頭(hexylamino linker)。
[0032]在一個(gè)實(shí)施方案中，聚亞烷基氧化物為聚乙二醇(PEG)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PEG具有約20kD至約60kD、約20kD、約30kD、約40kD、約50kD或約60kD的分子量。
[0033]在一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)綴合PAO的寡核苷酸的方法進(jìn)一步包括超濾含接頭寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述超濾未PEG化的寡核苷酸為針對(duì)鹽溶液透析。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鹽為鈉鹽或鉀鹽。
[0034]在一個(gè)實(shí)施方案中，在凈化水存在下進(jìn)行超濾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在鹽溶液存在下超濾后在凈化水存在下進(jìn)行超濾。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述鹽為單價(jià)鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鹽為鈉鹽、鉀鹽或鋰鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鹽為一種以下陰離子的鈉鹽、鉀鹽或鋰鹽:cr、HSO3' Br03\ Br\ NO3' ClO3' HSO4' HCO3' IO3' HPO42' 甲酸鹽、乙酸鹽或丙酸鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鹽為氯化鈉。
[0035]在一個(gè)實(shí)施方案中，最終透過(guò)物具有大于O μ S / cm并且小于約75 μ S / cm、小于約 50 μ S / cm 或小于約 40 μ S / cm,或者約 20 μ S / cm 至約 70 μ S / cm、約 20 μ S / cm至約50 μ S / cm或約20 μ S / cm至約40 μ S / cm的電導(dǎo)率。
[0036]在一個(gè)實(shí)施方案中，最終透過(guò)物的滲透壓大于OmOsm并且小于或等于約4m0sm、小于或等于約2m0sm、小于或等于約ImOsm。在另一個(gè)實(shí)施方案中，最終透過(guò)物的滲透壓為約0.0OlmOsm 至約 1.0mOsmJy^ 0.5m0sm 至約 2.0mOsm 或約 0.5m0sm 至約 4.0mOsm。
[0037]在一個(gè)實(shí)施方案中 ，在(TC至約50°C的室溫下或在諸如約15°C至約30°C的環(huán)境溫度下進(jìn)行超濾。
[0038]在一個(gè)實(shí)施方案中，使用具有約IkD至約IOkD的分子量截點(diǎn)(MWCO)的膜進(jìn)行含接頭寡核苷酸的超濾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用IkD膜、2kD膜、3kD膜、5kD膜、8kD膜或IOkD膜進(jìn)行超濾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用具有約IkD至約5kD或約3kD至約5kD的分子量截點(diǎn)的膜進(jìn)行超濾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，超濾膜應(yīng)該具有小于含接頭寡核苷酸的分子量的分子量截點(diǎn)。
[0039]在一個(gè)實(shí)施方案中，最終透過(guò)物的最終電導(dǎo)率小于或等于約50 μ S / cm。在另一個(gè)實(shí)施方案中，最終透過(guò)物的最終滲透壓小于或等于約1.0mOsm。
[0040]在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)超濾含接頭未PEG化的寡核苷酸進(jìn)行未PEG化的寡核苷酸的濃縮。在另外的實(shí)施方案中，通過(guò)蒸餾進(jìn)行未PEG化的寡核苷酸的濃縮。
[0041]在一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)綴合PAO的寡核苷酸的方法進(jìn)一步包括將聚亞烷基二醇前體部分綴合到綴合接頭的未PEG化的寡核苷酸的接頭上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，聚亞烷
基二醇前體為聚乙二醇。
[0042]在一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)綴合PAO的寡核苷酸的方法進(jìn)一步包括通過(guò)離子交換層析純化所述綴合PAO的寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述離子交換層析為陰離子交換HPLC。
[0043]在一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)綴合PAO的寡核苷酸的方法進(jìn)一步包括通過(guò)超濾來(lái)自離子交換層析的洗脫液進(jìn)行純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)綴合PAO的寡核苷酸的方法進(jìn)一步包括通過(guò)超濾進(jìn)行濃縮。在一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)綴合PAO的寡核苷酸的方法包括在超濾純化前通過(guò)超濾不經(jīng)過(guò)陰離子交換純化的PEG化混合物進(jìn)行純化。
[0044]在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)蒸餾濃縮綴合PAO的寡核苷酸。
[0045]在一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)綴合PAO的寡核苷酸的方法進(jìn)一步包括將綴合PAO的寡核苷酸冷凍干燥。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0046]圖1闡述了合成和純化寡核苷酸組合物的方法。
[0047]圖2A和2B闡述了寡核苷酸與PEG部分通過(guò)接頭部分進(jìn)行的綴合。
[0048]圖3A-3C闡述了 RB006和RB007的結(jié)構(gòu)以及由它們形成的復(fù)合物。
[0049]圖4A-4B闡述了合成和純化寡核苷酸組合物的方法I和方法2的一些實(shí)施方案。
[0050]圖5闡述了本文中描述的方法中觀察到的一些雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
[0051]圖6闡述了合成和純化寡核苷酸組合物的方法I和方法2的一些實(shí)施方案。
[0052]圖7顯示了分析PEG化反應(yīng)混合物所進(jìn)行的陰離子交換HPLC分析的譜圖。
[0053]圖8顯示了分析超濾PEG化反應(yīng)混合物后的滯留物所進(jìn)行的陰離子交換HPLC分析的譜圖。
[0054]圖9顯示了分析超濾PEG化反應(yīng)混合物后的透過(guò)物所進(jìn)行的陰離子交換HPLC分析的譜圖。
[0055]圖10顯示了分析超濾PEG化反應(yīng)混合物后的滯留物所進(jìn)行的離子對(duì)HPLC分析的譜圖。
[0056]詳細(xì)描述
[0057]為了產(chǎn)生維持晚期臨床試驗(yàn)和后來(lái)的商業(yè)銷售所需的足夠量的藥物，進(jìn)行了大量的努力來(lái)提高生產(chǎn)方法的穩(wěn)定性和產(chǎn)率，同時(shí)維持產(chǎn)品質(zhì)量。另外，必須嚴(yán)格控制關(guān)鍵原材料以確保更好地控制全過(guò)程和質(zhì)量。
[0058]在整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中，詳細(xì)表征了不同步驟的產(chǎn)物以確保整個(gè)過(guò)程中的必要的質(zhì)量和數(shù)量。由于該表征，鑒定出該方法的可能有利于進(jìn)一步發(fā)展和優(yōu)化的步驟變得可能。
[0059]本文中公開(kāi)了改進(jìn)的和更有效率的生產(chǎn)PEG化的寡核苷酸適體的方法的開(kāi)發(fā)。令人吃驚的是發(fā)現(xiàn)了，省略進(jìn)行PEG化反應(yīng)前的用于去除寡核苷酸雜質(zhì)的陰離子交換層析，產(chǎn)生的最終物質(zhì)與在PEG化反應(yīng)前進(jìn)行陰離子交換純化產(chǎn)生的最終物質(zhì)不能區(qū)分。還出乎意料的是，當(dāng)從該方法中省略PEG化反應(yīng)前的陰離子交換純化步驟并用未純化的含接頭寡核苷酸和不含接頭寡核苷酸的混合物進(jìn)行PEG化反應(yīng)時(shí)，含接頭寡核苷酸的PEG化的效率在該方法中得到維持。此外，驚奇地發(fā)現(xiàn)，超濾可以有效去除在陰離子交換純化中與PEG化的寡核苷酸產(chǎn)物共洗脫的未PEG化的寡核苷酸種類。
[0060]生產(chǎn)治療性寡核苷酸為多步驟方法，包括:寡核苷酸鏈的固相化學(xué)合成、粗寡核苷酸的切割和去保護(hù)、通過(guò)制備型陰離子交換層析進(jìn)行的純化、脫鹽后的PEG化、通過(guò)制備型陰離子交換層析進(jìn)行的PEG化的寡核苷酸的純化以去除未PEG化的寡核苷酸雜質(zhì)和未反應(yīng)的ΡΑ0、用于脫鹽的超濾以及最終產(chǎn)物的濃縮和凍干。這整個(gè)過(guò)程被示意性地顯示在圖1的方法流程圖中。
[0061]例如，通過(guò)本領(lǐng)域熟知的亞磷酰胺或硫代磷酸化學(xué)過(guò)程，可以進(jìn)行寡核苷酸的化學(xué)合成。該合成包括活化的單體順序偶聯(lián)至延伸的聚合物，所述延伸的聚合物的一個(gè)末端被共價(jià)結(jié)合到固相支持物基質(zhì)上。該固相方法允許在合成的每一步驟中通過(guò)簡(jiǎn)單地對(duì)固相的溶劑洗滌而方便地純化反應(yīng)產(chǎn)物。通過(guò)將支持物結(jié)合分子的5'末端去保護(hù)，允許支持物結(jié)合分子與進(jìn)入的經(jīng)四唑活化的亞磷酰胺單體反應(yīng)，將產(chǎn)生的亞磷酸三酯氧化為磷酸三酯，并通過(guò)乙?；?加帽)阻止任何未反應(yīng)的羥基以阻止與下一進(jìn)入單體非順序偶聯(lián)形成“缺失序列”，可從3'末端向5'末端順序組裝寡核苷酸。對(duì)后續(xù)偶聯(lián)反應(yīng)重復(fù)步驟的這一順序，直到合成出全長(zhǎng)寡核苷酸。
[0062]為了產(chǎn)生具有增加的體內(nèi)穩(wěn)定性的治療性寡核苷酸，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種修飾方法合成寡核苷酸。例如，Cook等人的第5，670，633號(hào)和第6，005，087號(hào)美國(guó)專利描述了與RNA或DNA堿基序列互補(bǔ)的熱穩(wěn)定性V -氟寡核苷酸。Cook等人的第6，222，025號(hào)和第5，760, 202號(hào)美國(guó)專利描述了經(jīng)W _0取代的嘧啶和含有經(jīng)修飾的嘧啶的寡聚物的合成。另外的描述可參見(jiàn)第7，531，524號(hào)美國(guó)專利，其內(nèi)容通過(guò)引用被完整并入。
[0063]為了允許后來(lái)綴合到諸如聚亞烷基氧化物分子的載體部分上，可以通過(guò)加入合適的接頭部分來(lái)完成寡核苷酸的合成。例如，可以將諸如圖2中顯示的C6己基氨基接頭的氨基接頭加入到合成的寡核苷酸的5'末端?？梢允褂玫钠渌宇^被描述如下且包括但不限于:
[0064]以下結(jié)構(gòu)的6_(三氟乙酰氨基)己醇(2-氰基乙基-N，N- 二異丙基)亞磷酰胺:
[0065]
【權(quán)利要求】
1.制備治療性的、PEG化的寡核苷酸的方法，包括: (a)在固相支持物上合成未PEG化的寡核苷酸， (b)從所述固相支持物切割所述未PEG化的寡核苷酸，并將所述寡核苷酸去保護(hù)， (c)使用超濾對(duì)所述未PEG化的寡核苷酸脫鹽， (d)將所述未PEG化的寡核苷酸PEG化，來(lái)產(chǎn)生PEG化的寡核苷酸， (e)使用陰離子交換HPLC純化所述PEG化的寡核苷酸，以及 (f)使用超濾對(duì)所述PEG化的寡核苷酸脫鹽和進(jìn)一步純化， 其中在步驟(b)和步驟(c)之間沒(méi)有進(jìn)行所述未PEG化的寡核苷酸的離子交換純化。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括步驟(g):冷凍干燥最終產(chǎn)物。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述未PEG化的寡核苷酸包含二級(jí)結(jié)構(gòu)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述二級(jí)結(jié)構(gòu)包含莖和環(huán)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述未PEG化的寡核苷酸包含經(jīng)修飾的核苷酸。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述未PEG化的寡核苷酸包含經(jīng)2'-O-甲基修飾的核苷酸。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述未PEG化的寡核苷酸包含經(jīng)2'-氟修飾的核 苷酸。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述未PEG化的寡核苷酸在步驟d前被偶聯(lián)到接頭上。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述未PEG化的寡核苷酸包括RB005。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述PEG化的寡核苷酸包括RB006。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(f)包括使用具有約IOkD至約20kD或約20kD至約30kD的分子量截點(diǎn)的超濾膜。
【文檔編號(hào)】A61K47/30GK103608042SQ201280029219
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月26日
【發(fā)明者】道格拉斯·布魯克斯, 克里斯多佛·P·魯斯科尼 申請(qǐng)人:雷加多生物科學(xué)公司