針對肺炎鏈球菌的疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及改善的免疫原性組合物和疫苗、用于制備它們的方法以及它們在醫(yī)藥中的用途。具體而言，本發(fā)明涉及選自：肺炎鏈球菌溶血素和多組氨酸三聯(lián)體家族的一個或多個成員（例如PhtD）的非綴合的肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）蛋白的免疫原性組合物，其包含含有QS21和單磷酰脂質(zhì)A（MPL）的佐劑，并且以脂質(zhì)體的形式存在。
【專利說明】針對肺炎鏈球菌的疫苗【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及改善的免疫原性組合物和疫苗、用于制備它們的方法以及它們在醫(yī)藥中的用途。具體而言，本發(fā)明涉及選自:肺炎鏈球菌溶血素和多組氨酸三聯(lián)體家族的一個或多個成員(例如PhtD)的非綴合的肺炎鏈球菌{Streptococcus pneumoniae)蛋白的免疫原性組合物，其包含含有QS21和單磷酰脂質(zhì)A (MPL)的佐劑，并且以脂質(zhì)體的形式存在。技術(shù)背景[0002]肺炎鏈球菌(StrepiococciAspneumonia (S.)也已知為肺炎球菌， 是革蘭氏陽性細菌。肺炎鏈球菌是全世界主要的公共健康問題，并且引起相當大的發(fā)病率和死亡率，尤其在嬰兒、老年人和無免疫應(yīng)答的人中。肺炎鏈球菌導(dǎo)致大范圍的重要人類病理學(xué)，其包括群落獲得性肺炎、急性鼻竇炎、中耳炎、腦膜炎、菌血癥、敗血癥、骨髓炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、腹膜炎、心包炎、蜂窩組織炎和腦膿腫。每年僅在美國肺炎鏈球菌就被估計為3，000例腦膜炎、50，000例菌血癥、500，000例肺炎和7，000, 000例中耳炎的導(dǎo)致因素(Reichler, M.R.等，1992，J.1nfect.Dis.166: 1346; Stool, S.E.和 Field, M.J.，1989 Pediatr.1nfect.Dis J.8: Sll)。在來自發(fā)達國家和發(fā)展中國家的年齡小于5歲的兒童中由于肺炎球菌疾病的死亡率尤其高。老年人、無免疫應(yīng)答的和患有其他潛在狀況(糖尿病、哮喘)的患者也對疾病特別易感。 [0003]由肺炎鏈球菌導(dǎo)致的主要臨床綜合征是在所有標準醫(yī)學(xué)教科書中廣泛認可并且討論的(Fedson D S，Muscher DM.1n: Plotkin S A, Orenstein W A, editors.Vaccines.第 4 版.Philadelphia WB Saunders Co, 2004a: 529-588)。例如，將侵襲性肺炎球菌疾病(IPD)定義為其中從血液或另一通常無菌部位中分離到肺炎鏈球菌的任何感染(Musher D M.Streptococcus pneumoniae.1n Mandell G L, Bennett J E, Dolin R (編輯).Principles and Practice of Infectious diseases (第 5 版).New York, Churchill Livingstone, 2001, p 2128-2147)。[0004]慢性阻塞性肺病是肺的慢性炎性疾病并且是全世界發(fā)病率和死亡率的主要原因。在2005年在美國大約20例死亡中有一例具有CCffD作為潛在原因。(Drugs and Aging 26:985-999 (2009))。估計在2020年COPD將上升為失能調(diào)整生命年(disability adjusted life year)、慢性無效性疾病(chronic validating disease)的第五位導(dǎo)致原因以及死亡率的第三位最重要的原因(Lancet 349:1498-1504 (1997))。[0005]coro的過程表征為空氣流動限制的漸進性惡化和肺功能的減退。coro可以與常見的和復(fù)發(fā)的急性加重(AE)并發(fā)，其與巨大的健康護理費用和高發(fā)病率相關(guān)。(Proceedings of the American Thoracic Society 4:554 - 564 (2007))。一個研究暗不 COPD 中大約 50 %的癥狀的急性加重是由非典型性流感嗜血桿菌iHaemophiIus influenzae )、粘膜炎莫拉菌(Moraxolla ca tarrhali51)、肺炎鏈球菌(51 trep tococcus pneumoniae )和銅綠假單胞菌aeruginosa')導(dǎo)致。(Drugs and Aging 26:985-999 (2009))。流感嗜血桿菌發(fā)現(xiàn)于20-30%的COPD加重中；肺炎鏈球菌發(fā)現(xiàn)于10-15%的COPD加重中；以及粘膜炎莫拉菌發(fā)現(xiàn)于10-15%的COPD加重中。(New England Journal of Medicine 359:2355-2365 (2008))。已顯示流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌和粘膜炎莫拉菌是在香港、 韓國和菲律賓的支氣管炎的急性加重中的原發(fā)性病原體，而克雷伯氏菌屬種 spp.)、銅綠假單胞菌和不動桿菌屬種spp.)構(gòu)成了在包括印度尼西亞、 泰國、馬來西亞和臺灣的其他亞洲國家/地區(qū)的大部分病原體(Respirology, (2011) 16, 532-539; do1:10.1111/j.1440.1843.2011.01943.x) ? 在孟加拉國，20% 的患有 COPD 的患者顯示對假單胞菌屬克雷伯氏菌屬0i7e/wii?77a)、肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的陽性痰培養(yǎng)，而65%的患有AECOPD的患者顯示出對假單胞菌屬、克雷伯氏菌屬、 不動桿菌屬(Xcine tobac ter )、腸桿菌屬(/? terobac ter )、粘膜炎莫拉菌及其組合的陽性培養(yǎng)。(Mymensingh Medical Journal 19:576-585 (2010))。然而，已經(jīng)表明預(yù)防COPD加重的兩種最重要的措施是主動免疫和藥物療法的慢性維持。(Proceedings of the American Thoracic Society 4:554 - 564 (2007))。[0006]盡管抗微生物藥的來到已經(jīng)降低了肺炎球菌疾病的總體死亡率，但肺炎鏈球菌的抗生素抗性菌株的出現(xiàn)是嚴重而快速增加的問題。因此開發(fā)針對肺炎鏈球菌的有效疫苗是重要的。有效的肺炎球菌疫苗可以對與肺炎鏈球菌疾病相關(guān)的發(fā)病率和死亡率具有主要影響。[0007]本發(fā)明涉及以脂質(zhì)體形式存在的非綴合的肺炎鏈球菌蛋白的免疫原性組合物。脂質(zhì)體制劑在本領(lǐng)域是已知的，并且已經(jīng)表明可用作佐劑組合物(W096/33739， W007/068907)。W096/33739 公開了含有抗原、來源于 Quillaja Saponaria Molina 的樹皮的免疫活性級分諸如QS21和留醇的某些疫苗，其可以以脂質(zhì)體形式存在，以及用于制備脂質(zhì)體的方法。W007/068907公開了包含抗原或抗原制劑的某些免疫原性組合物，組合有包含以脂質(zhì)體和脂多糖形式存在的來源于Quillaja Saponaria Molina的樹皮的免疫活性阜苷級分的佐劑，其中所述皂苷級分和脂多糖均以如低于3(^g的水平的人劑量存在。[0008]然而，仍存在對改善的疫苗組合物的需求，尤其是將在老年人中和在幼兒中預(yù)防或改善肺炎球菌疾病中更有效的疫苗組合物。本發(fā)明提供了基于非綴合的肺炎鏈球菌蛋白和佐劑的具體組合的改善的疫苗。[0009]發(fā)明陳沭本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)組合有包含QS21、單磷酰脂質(zhì)A (MPL)、磷脂和留醇的佐劑，以脂質(zhì)體的形式存在的選自:肺炎鏈球菌溶血素和多組氨酸三聯(lián)體家族的一個或多個成員(例如 PhtD)的非綴合的肺炎鏈球菌蛋白的疫苗或免疫原性組合物具有有利的特性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)非綴合的肺炎鏈球菌蛋白和佐劑的該組合提供增強的免疫原性應(yīng)答。[0010]因此，在本發(fā)明的第一方面，提供免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含至少一種選自:肺炎鏈球菌溶血素和多組氨酸三聯(lián)體家族的一個或多個成員(例如PhtD)的非綴合的肺炎鏈球菌蛋白；和包含QS21、單磷酰脂質(zhì)A(MPL)、磷脂和留醇的佐劑，以脂質(zhì)體的形式存在。[0011]在本發(fā)明的另一方面，提供疫苗組合物，所述疫苗組合物包含至少一種選自:肺炎鏈球菌溶血素和多組氨酸三聯(lián)體家族的一個或多個成員(例如PhtD)的非綴合的肺炎鏈球菌蛋白；和包含QS21、單磷酰脂質(zhì)A (MPL)、磷脂和甾醇的佐劑，以脂質(zhì)體的形式存在。[0012]在本發(fā)明的進一步的方面，提供治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致的疾病的方法，其包括向需要其的受試者肌內(nèi)施用，包括向所述受試者施用免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含至少一種選自:肺炎鏈球菌溶血素和多組氨酸三聯(lián)體家族的一個或多個成員(例如PhtD)的非綴合的肺炎鏈球菌蛋白；和包含QS21、單磷酰脂質(zhì)A (MPL)、磷脂和甾醇的佐劑，以脂質(zhì)體的形式存在。[0013]在本發(fā)明的進一步的方面，提供免疫原性組合物在生產(chǎn)用于治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致的疾病的藥物中的用途，所述免疫原性組合物包含至少一種選自:肺炎鏈球菌溶血素和多組氨酸三聯(lián)體家族的一個或多個成員(例如PhtD)的非綴合的肺炎鏈球菌蛋白；和包含QS21、單磷酰脂質(zhì)A (MPL)、磷脂和甾醇的佐劑，以脂質(zhì)體的形式存在。[0014]附圖簡沭
圖1:血液中總dPly特異性T細胞應(yīng)答:AS03B相比于AS01B。在PIII (即在第三次免疫后)時表達任何細胞因子(IFN-g、IL-2、IL-17、IL-13)的T細胞。[0015]圖2:血液中總PhtD特異性T細胞應(yīng)答:AS03B相比于AS01B。表達任何細胞因子 (IFN-g、IL-2、IL-17、IL-13)的 T 細胞。[0016]圖3:dPly特異性Thl應(yīng)答:AS03B相比于ASOlB0表達IFNg的T細胞(Thl)。[0017]圖4 =PhtD特異性Thl應(yīng)答:AS03B相比于ASOlB0表達IFNg的T細胞(Thl)。[0018]圖5:dPly 特異性 Thl7 應(yīng)答:AS03B 相比于 ASOlB PII10[0019]圖6:PhtD特異性Thl7應(yīng)答AS03B相比于AS01B。[0020]圖7 =ASOlB相比于AS03B:抗體應(yīng)答。圖7a =PhtD劑量IgG總計。圖7b:dPly劑量IgG總計。[0021]圖8:在致死攻擊模型中ASOlB和ASOlE的評價。[0022]圖9:在肺建群模型中ASOlB和ASOlE的評價。[0023]發(fā)明詳沭本發(fā)明提供免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含至少一種選自:肺炎鏈球菌溶血素和多組氨酸三聯(lián)體家族的一個或多個成員(例如PhtD)的非綴合的肺炎鏈球菌蛋白； 和包含QS21、單磷酰脂質(zhì)A (MPL)、磷脂和留醇的佐劑，以脂質(zhì)體的形式存在。肺炎鏈球菌蛋白是“非綴合的”，其表示蛋白沒有與糖共價連接例如作為載體蛋白。[0024]肺炎鏈球菌溶血素在一方面，本發(fā)明提供免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含至少一種選自:肺炎鏈球菌溶血素的非綴合的肺炎鏈球菌蛋白；和包含QS21、單磷酰脂質(zhì)A (MPL)、磷脂和甾醇的佐劑，以脂質(zhì)體的形式存在。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物每人劑量包含 3-90、3-20、20-40或40-70 μg (例如10、30或60 μδ)非綴合的肺炎球菌的肺炎鏈球菌溶血素。[0025]通過肺炎鏈球菌溶血素或“Ply”，它表示:來自于肺炎球菌的天然的或野生型肺炎鏈球菌溶血素、重組肺炎鏈球菌溶血素及其片段和/或變體。在一個實施方案中，肺炎鏈球菌溶血素是來自于肺炎球菌的天然的或野生型肺炎鏈球菌溶血素或重組肺炎鏈球菌溶血素。肺炎鏈球菌溶血素是發(fā)現(xiàn)于所有肺炎鏈球菌菌株中的53kDa硫羥活化的溶細胞素，其在自溶中釋放并且促成肺炎鏈球菌的發(fā)病。它是高度保守的，在不同血清型的Ply蛋白之間僅存在幾個氨基酸取代。肺炎鏈球菌溶血素是具有不同的溶細胞的(溶血的)和補體活化活性的多功能的毒素(Rubins et al., Am.Resp1.Cit Care Med, 153:1339-1346(1996))。它的作用包括例如由人單核細胞產(chǎn)生的炎性細胞因子的刺激、人呼吸上皮上纖毛的拍打的抑制和殺菌活性的降低及中性粒細胞的遷移。肺炎鏈球菌溶血素最明顯的作用是在紅細胞的溶胞中，其涉及與膽固醇的結(jié)合。野生型或天然肺炎鏈球菌溶血素的表達和克隆是本領(lǐng)域已知的。例如，見Walker等(Infect Immun, 55:1184-1189 (1987))， Mitchell 等(Biochim Biophys Acta, 1007:67-72 (1989)和Mitchell 等(NAR, 18:4010 (1990))。W02010/071986 描述了野生型 Ply,例如 SEQ ID 2-42 (例如 SEQ ID 34、35、36、 37,41) ο在一方面，肺炎鏈球菌溶血素是W02010/071986的Seq ID N0.34。在另一方面， 肺炎鏈球菌溶血素是W02010/071986的Seq ID N0.35。在另一方面，肺炎鏈球菌溶血素是TO2010/071986的Seq ID N0.36。在另一方面，肺炎鏈球菌溶血素是W02010/071986的 Seq ID N0.37。在另一方面，肺炎鏈球菌溶血素是W02010/071986的Seq ID N0.41。此外，EP1601689B1描述了在去污劑和高鹽存在的情況下通過層析純化細菌溶細胞素諸如肺炎球菌肺炎鏈球菌溶血素的方法。[0026]如本說明書中使用的術(shù)語“片段”是能夠在宿主動物中引起體液和/或細胞免疫應(yīng)答的部分。可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)例如重組地、通過蛋白水解消化、或通過化學(xué)合成來產(chǎn)生蛋白的片段?？梢酝ㄟ^從編碼多肽的核酸的一端(對于末端片段)或兩端(對于內(nèi)部片段)去除一個或多個核苷酸來產(chǎn)生多肽的內(nèi)部或末端片段。通常，片段包含全長序列的至少10、20、30、40或50個鄰近的氨基酸?？梢酝ㄟ^從N末端和C末端之一或兩者中添加或去除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50個氨基酸來容易地修飾片段。[0027]如本說明書中使用的術(shù)語“保守的氨基酸取代”包括用非天然殘基取代天然氨基酸殘基，從而使在那一位置上的氨基酸殘基的大小、極性、電荷、疏水性或親水性幾乎沒有影響或沒有影響，并且不導(dǎo)致降低的免疫原性。例如，這些可以是以下組中的取代:纈氨酸、 甘氨酸；甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。對多肽序列的保守氨基酸修飾 (和對編碼核苷酸的相應(yīng)修飾)可以產(chǎn)生具有與親本多肽的那些相似的功能和化學(xué)特征的多肽。[0028]如本說明書中所用的術(shù)語“缺失”是從蛋白序列中去除一個或多個氨基酸殘基。通常，在蛋白分子內(nèi)的任一位點上缺失不超過約1-6個殘基(例如1-4個殘基)。[0029]如本說明書中所用的術(shù)語“插入”是在蛋白序列中添加一個或多個非天然氨基酸殘基。通常，在蛋白分子內(nèi)的任一位點上插入不超過約1-6個殘基(例如1-4個殘基)。[0030]在一個實施方案中，本發(fā)明包括與野生型序列相比具有核酸或氨基酸序列中的差異的肺炎鏈球菌溶血素的片段和/或變體。在使用肺炎鏈球菌溶血素片段的位置，這些片段將是長度上至少約15個、至少約20個、至少約40個、或至少約60個連續(xù)的氨基酸殘基。在本發(fā)明的一個實施方案中，肺炎鏈球菌溶血素的免疫原性片段包含全長序列的至少約15個、至少約20個、至少約40個、或至少約60個連續(xù)的氨基酸殘基，其中所述多肽能夠引起對所述氨基酸序列特異性的免疫應(yīng)答。已知肺炎鏈球菌溶血素由四個主要結(jié)構(gòu)域組成 (Rossjohn等Cell.1997 May 30; 89 (5): 685-92)。這些結(jié)構(gòu)域可以通過去除和/或修飾這些結(jié)構(gòu)域的一個或多個來修飾。在一個實施方案中，所述片段或每一片段包含正好或至少I個、2個或3個結(jié)構(gòu)域。在另一個實施方案中，所述片段或每一片段包含正好或至少2 個或3個結(jié)構(gòu)域。在另一個實施方案中，所述片段或每一片段包含至少3個結(jié)構(gòu)域。所述`片段或每一片段可以是與野生型肺炎鏈球菌溶血素序列大于50、60、70、80、90或100%同一性的。[0031]根據(jù)本發(fā)明，肺炎鏈球菌溶血素的變體包括與野生型序列相比其中一個或多個氨基酸被取代和/或缺失和/或插入的序列。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。在一方面，氨基酸取代是保守的。取代、缺失、插入或其任何組合可以在單一變體中組合，只要該變體是免疫原性多肽。肺炎鏈球菌溶血素的變體通常包括任何肺炎鏈球菌溶血素或肺炎鏈球菌溶血素的任何片段，其與野生型肺炎鏈球菌溶血素序列共享至少80、90、94、95、98或99% 氨基酸序列同一性，例如來自W02010/071986的SEQ ID 2_42(例如SEQ ID 34、35、36、37、 41)。在一個實施方案中，肺炎鏈球菌溶血素的變體通常包括任何肺炎鏈球菌溶血素或肺炎鏈球菌溶血素的任何片段，其與來自W02010/07198的SEQ ID 36共享至少80、90、94、95、98 或99%的氨基酸序列同一'丨生。在一個實施方案中，本發(fā)明包括片段和/或變體，其中幾個、 5-10個、1-5個、1-3個、1-2個或I個氨基酸以任何組合取代、缺失或添加。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括包含B細胞或T細胞表位的片段和/或變體。此類表位可以使用2D結(jié)構(gòu)預(yù)測例如使用 PSIPRED 程序(來自 David Jones, Brunei Bioinformatics Group, Dept.Biological Sciences, Brunei University, Uxbridge UB8 3PH, UK)和基于由 Jameson 和Wolf描述的方法計算的抗原指數(shù)(CAB10S 4:181-186 [1988])的組合來預(yù)測。肺炎鏈球菌溶血素的變體例如描述于 W004/43376、W005/108580、W005/076696、W010/071986、 W010/109325 (SEQ ID 44、4δ 和站)和 W010/140119 (SEQ ID 5O 和 δ?)。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含肺炎鏈球菌溶血素的變體，例如，描述于W005/108580、 W005/076696, W010/071986 中的那些。[0032]在本發(fā)明的一個實施方案中，肺炎鏈球菌溶血素及其片段和/或其變體具有與肺炎鏈球菌溶血素的野生型序列共享至少80、85、90、95、98、99或100%同一性的氨基酸序列， 例如來自W02010/071986的SEQ ID 34、35、36、37、41。在本發(fā)明的另一個實施方案中，肺炎鏈球菌溶血素及其片段和/或其變體包含至少約15個、至少約20個、至少約40個、或至少約60個連續(xù)的肺炎鏈球菌溶血素野生型序列的氨基酸殘基。[0033]肺炎鏈球菌溶血素通常在解毒(即當以適合于保護的劑量提供時對人表現(xiàn)為非毒性的)后施用。如本文所用，理解術(shù)語“dPly”指適合于醫(yī)學(xué)用途的(即非毒性的)解毒的肺炎鏈球菌溶血素。肺炎鏈球菌溶血素可以化學(xué)解毒和/或遺傳解毒。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含dPly。[0034]可以通過化學(xué)方法例如使用交聯(lián)劑諸如甲醛、戊二醛和含有N-羥基琥珀酰亞胺酯和/或馬來酰亞胺基團(例如GMBS)或這些的組合的交聯(lián)劑來完成肺炎鏈球菌溶血素的解毒作用。此類方法在本領(lǐng)域中對于多種毒素是熟知的，例如見EP1601689B1、 W004/081515、W02006/032499?；瘜W(xué)解毒作用中使用的肺炎鏈球菌溶血素可以是天然的或重組蛋白或已經(jīng)遺傳工程化以降低其毒性的蛋白(見下文)。肺炎鏈球菌溶血素的融合蛋白或肺炎鏈球菌溶血素的片段和/或變體還可以通過化學(xué)方法解毒。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物可以包含已經(jīng)化學(xué)解毒例如通過甲醛處理的肺炎鏈球菌溶血素。[0035]肺炎鏈球菌溶血素還可以是遺傳解毒的。因此，本發(fā)明包含例如可以是突變的蛋白的肺炎球菌蛋白。本文使用的術(shù)語“突變的”表示已經(jīng)例如通過使用用于位點定向`誘變的眾所周知的技術(shù)或任何其他常規(guī)方法進行一個或多個氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、 IOUl或12個氨基酸)的缺失、添加或取代的分子。在一個實施方案中，分子已經(jīng)進行1-15 個、合適的10-15氨基酸的缺失或取代。突變的序列可以去除不需要的活性諸如膜滲透、細胞溶解和針對人紅細胞和其他細胞的溶細胞活性，以降低毒性，而保留在向人施用后誘導(dǎo)抗肺炎鏈球菌溶血素保護性的和/或中和抗體的能力。肺炎鏈球菌溶血素的融合蛋白或肺炎鏈球菌溶血素的片段和/或變體還可以通過遺傳方法解毒。可以使用標準分子生物學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)引入任何這些修飾。例如，如上文描述，可以改變突變體肺炎鏈球菌溶血素蛋白，從而使它是生物學(xué)失活的而同時仍保持它的免疫原性表位，例如見W090/06951、Berry 等(Infect Immun, 67:981-985 (1999))和W099/03884。例如，肺炎鏈球菌溶血素蛋白可以通過包含T65至C、G293至C和C248至A三個氨基酸取代來解毒?？梢杂糜诒景l(fā)明中的遺傳解毒的肺炎鏈球菌溶血素的另一個實例是來自W02011/075823的SEQ ID 9。因此，在進一步的實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物可以包含已經(jīng)遺傳解毒的肺炎鏈球菌溶血素。[0036]可以使用技術(shù)的組合來將肺炎鏈球菌溶血素解毒。例如，本發(fā)明的免疫原性組合物可以包含已經(jīng)化學(xué)和遺傳解毒的肺炎鏈球菌溶血素。[0037]多組氨酸Ξ聯(lián)體家族蛋白在另一個方面，本發(fā)明提供免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含至少一種選自: 多組氨酸三聯(lián)體家族的一個或多個成員(例如PhtD)的非綴合的肺炎鏈球菌蛋白；和包含 QS21、單磷酰脂質(zhì)A (MPL)、磷脂和留醇的佐劑，以脂質(zhì)體的形式存在。在一個實施方案中， 本發(fā)明的免疫原性組合物每人劑量包含3-90、3-20、20-40或40-70 μδ (例如10、30或60 Kg)選自:多組氨酸三聯(lián)體家族的一個或多個成員(例如PhtD)的非綴合的肺炎鏈球菌蛋白。[0038]Pht (多組氨酸三聯(lián)體，PhtX)家族包含蛋白PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。該家族表征為脂化序列、由富含脯氨酸區(qū)分隔的兩個結(jié)構(gòu)域和可能參與金屬或核苷酸結(jié)合或酶活性的幾個組氨酸三聯(lián)體、(3-5個)卷曲螺旋區(qū)、保守的N末端和異質(zhì)的C末端。[0039]術(shù)語“多組氨酸三聯(lián)體家族的一個或多個成員”包括全長多組氨酸三聯(lián)體家族 (Pht)蛋白、其片段或融合蛋白或免疫功能等價物。這些可以選自具有與W000/37105或 W000/39299中公開的序列共享至少80、85、90、95、98、99或100%同一性的氨基酸序列的 PhtA、PhtB、PhtD或PhtE蛋白。當使用Pht蛋白片段時(單獨地或作為融合蛋白的部分)，這些片段將是長度為至少約15個、至少約20個、至少約40個或至少約60個連續(xù)的例如來自 W000/37105或W000/39299中的Pht氨基酸序列的氨基酸殘基，其中所述多肽能夠引起對 W000/37105或W000/39299中的所述氨基酸序列特異性的免疫應(yīng)答。在一個實施方案中，所述片段或每一片段包含正好或至少2、3、4或5個組氨酸三聯(lián)體基序(任選地，具有2個或更多個三聯(lián)體之間的天然Pht序列、或與天然的肺炎球菌三聯(lián)體內(nèi)Pht序列為大于50、60、70、 80、90或100%同一'丨生的三聯(lián)體內(nèi)序列。在一個實施方案中，所述片段或每一片段包含正好或至少2個、3個或4個卷曲螺旋區(qū)。融合蛋白可以由2個、3個或4個PhtA、PhtB, PhtD、 PhtE 的全長或片段組成，例如 PhtA/B、PhtA/E、PhtB/A、PhtB/E、PhtE/A、PhtE/B、PhtA/D, PhtB/D、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E和PhtE/D，其中蛋白在N末端與第一個提及的連接(例如見 TOO1/98334)。[0040]關(guān)于PhtX蛋白，公開于W098/18930中的PhtA也指Sp36。它是來自多組氨酸三聯(lián)體家族的蛋白并且具有II型信號基序。PhtB公開于W000/37105，并且也指Sp036B。如 W000/17370中所公開，PhtB家族的另一成員是C3降解多肽。該蛋白也來自多組氨酸三聯(lián)體家族的蛋白并且具有II型信號基序。免疫功能等價物是公開于W098/18930的蛋白Sp42。 PhtB截短物(大約79kD)公開于W099/15675，其也被認為是PhtX家族的成員。PhtE公開于 W000/30299,并且被稱為 BVH-3。[0041]在一個實施方案中，選自多組氨酸三聯(lián)體家族的一個或多個成員的肺炎鏈球菌蛋白是PhtD。如本文使用的術(shù)語“PhtD”包括附有信號序列的全長蛋白或信號肽(例如在N末端的20個氨基酸)去除的成熟全長蛋白、和其片段、變體和/或融合蛋白，例如W000/37105 的SEQ ID N0:4。PhtD也指“Sp036D”。在一方面，PhtD是附有信號序列的全長蛋白，例如 W000/37105的SEQ ID NO: 4。在另一方面，PhtD是包含信號肽(例如在N末端的20個氨基酸)去除的成熟全長蛋白的序列，例如W000/37105的SEQ ID NO:4的氨基酸21-838。適合地，PhtD序列包含N末端甲硫氨酸。本發(fā)明還包括PhtD多肽，其是PhtD的免疫原性片段、PhtD的變體和/或PhtD的融合蛋白。例如，如W000/37105、W000/39299、US6699703和 W009/12588 中描述。[0042]當使用PhtD蛋白片段時(單獨地或作為融合蛋白的部分)，這些片段將是長度為至少約15個、至少約20個、至少約40個或至少約60個連續(xù)的例如來自W000/37105或 W000/39299中的PhtD氨基酸序列的氨基酸殘基，諸如W000/37105的SEQ ID N0:4。在本發(fā)明的一個實施方案中，PhtD蛋白的免疫原性片段包含至少約15個、至少約20個、至少約 40個、或至少約60個連續(xù)的W000/37105的SEQ ID NO: 4中顯示的序列的氨基酸殘基，其中所述多肽能夠引起對所述氨基酸序列特異性的免疫應(yīng)答。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含例如描述于W005/12601、W005/98334、W010/12588中的PhtD的片段。 當使用PhtD蛋白片段時(單獨地或作為融合蛋白的部分)，每一片段任選包含此類多肽的一個或多個組氨酸三聯(lián)體基序。組氨酸三聯(lián)體基序是具有序列HxxHxH的多肽的部分，其中H 為組氨酸并且X為組氨酸之外的氨基酸。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述片段或每一片段包含正好或至少2、3、4或5個組氨酸三聯(lián)體基序(任選地，具有2個或更多個三聯(lián)體之間的天然PhtD序列、或三聯(lián)體內(nèi)序列)，其中所述片段與天然的肺炎球菌三聯(lián)體內(nèi)PhtD序列(例如顯示于W000/37105的SEQ ID NO: 4的三聯(lián)體內(nèi)序列)為大于50、60、70、80、90或 100%同一性的。PhtD蛋白的片段任選包含一個或多個此類多肽的卷曲螺旋區(qū)。卷曲螺旋區(qū)是通過“螺旋”算法預(yù)測的區(qū)域Lupus, A等(1991) Science 252; 1162-1164。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述片段或每一片段包含正好或至少2個、3個或4個卷曲螺旋區(qū)。 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述片段或每一片段包含正好或至少2個、3個或4個卷曲螺旋區(qū)，其中所述片段與天然的肺炎球菌PhtD序列(例如顯示于W000/3 7105的SEQ ID NO: 4中的序列)為大于50、60、70、80、90、95、96或100%同一性的。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述片段或每一片段包括一個或多個組氨酸三聯(lián)體基序以及至少I個、2個、3個或4 個卷曲螺旋區(qū)。[0043]在其中PhtD多肽為變體的情況下，盡管一個或多個這些區(qū)域中可以形成變異，但變異通常在其組氨酸三聯(lián)體殘基和卷曲螺旋區(qū)之外的部分中。根據(jù)本發(fā)明，多肽變體包括與野生型序列相比其中一個或多個氨基酸被取代和/或缺失和/或插入的序列。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。在一方面，氨基酸取代是保守的。取代、缺失、插入或其任何組合可以在單一變體中組合，只要該變體是免疫原性多肽。PhtD的變體通常包括PhtD的任何片段或變體，其與野生型PhtD序列例如W000/37105的SEQ ID NO:4共享至少80、90、95、96、98或99%的氨基酸序列同一'丨生。在一個實施方案中，本發(fā)明包括片段和/或變體， 其中幾個、5-10個、1-5個、1-3個、1-2個或I個氨基酸以任何組合取代、缺失或添加。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括包含B細胞或T細胞表位的片段和/或變體。此類表位可以使用2D結(jié)構(gòu)預(yù)測例如使用PSIPRED程序(來自David Jones, Brunei Bioinformatics Group, Dept.Biological Sciences, Brunei University, Uxbridge UB8 3PH, UK)和基于由Jameson和Wolf描述的方法計算的抗原指數(shù)(CABIOS 4:181-186 [1988])的組合來預(yù)測?？梢酝ㄟ^常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生變體。本文使用的變體還可以包括來自于替代的鏈球菌菌株的天然產(chǎn)生的PhtD等位基因，其在同源PhtD基因內(nèi)的一個或多個位點展示出多態(tài)性。[0044]融合蛋白由PhtD和PhtA、PhtB和/或PhtE的全長或片段組成。融合蛋白的實例為PhtA/D、PhtB/D、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E和PhtE/D，其中所述蛋白在N末端與第一個提及的連接(例如見WOO1/98334)。例如，可以通過重組技術(shù)或使用適合的接頭將之前制備的多肽或活性片段融合來產(chǎn)生融合片段或融合多肽。[0045]在本發(fā)明的一個實施方案中，PhtD及其片段、變體和/或其融合蛋白包含與 W000/37105 的 SEQ ID NO:4 的氨基酸序列 21-838 共享至少 80、85、90、95、96、97、98、99 或 100%同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個實施方案中，PhtD及其片段、變體和/或其融合蛋白具有與W000/37105的SEQ ID NO:4的氨基酸序列21-838具有至少80、85、90、95、96、97、98、99或100%同一性的氨基酸序列。適合地，PhtD及其片段、變體和/或其融合蛋白包含具有N末端甲硫氨酸的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個實施方案中，PhtD及其片段、 變體和/或其融合蛋白包含至少約15個、至少約20個、至少約40個、或至少約60個或至少約100個、或至少約200個、或至少約400個或至少約800個連續(xù)的顯示于W000/37105 的SEQ ID NO:4中的序列的氨基酸殘基。[0046]在本發(fā)明的一個實施方案中，PhtD及其片段、變體和/或其融合蛋白包含與 W000/39299 的氨基酸序列 SEQ ID NO: 73 具有至少 80、85、90、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個實施方案中，PhtD及其片段、變體和/或其融合蛋白具有與W000/39299的氨基酸序列SEQ ID NO: 73具有至少80、85、90、95、96、97、98、99或 100%同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個實施方案中，PhtD及其片段、變體和/或其融合蛋白包含至少約15個、至少約20個、至少約40個、或至少約60個或至少約100個、或至少約200個、或至少約400個或至少約800個連續(xù)的顯示于W000/39299的SEQ ID NO: 73 中的序列的氨基酸殘基。在本發(fā)明的另一個實施方案中，PhtD序列是來自W02011/075823 的 SEQ ID N0.1-5。[0047]本發(fā)明還包括以不涉及氨基酸序列的方式與天然產(chǎn)生的肺炎鏈球菌多肽不同的 PhtD蛋白。非序列修飾包括乙?；?、甲基化、磷酸化、羧基化或糖基化中的改變。還在本發(fā)明的范圍內(nèi)是具有提高肽穩(wěn)定性的修飾的那些；此類類似物例如可以在肽序列中包含一個或多個非肽鍵(其代替肽鍵)。還在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是包括天然產(chǎn)生的L-氨基酸之外的殘基例如D-氨基酸或非天然產(chǎn)生的或合成的氨基酸例如β或Y氨基酸的類似物和環(huán)狀類似物。`[0048]在一方面，本發(fā)明的免疫原性組合物包含至少一種選自:肺炎鏈球菌溶血素(例如 dPly)和PhtD (例如包含W000/37105的SEQ ID NO: 4的氨基酸21-838的序列)的非綴合的肺炎鏈球菌蛋白；和包含QS21、單磷酰脂質(zhì)A(MPL)、磷脂和甾醇的佐劑，以脂質(zhì)體的形式存在。本發(fā)明的免疫原性組合物還可以包含兩個多多個不同的非綴合的肺炎鏈球菌蛋白抗原。在另一方面，本發(fā)明的免疫原性組合物包含2個或更多個選自:肺炎鏈球菌溶血素和 PhtD的非綴合的肺炎鏈球菌蛋白。在另一方面，本發(fā)明的免疫原性組合物包含肺炎鏈球菌溶血素和PhtD。例如，本發(fā)明的免疫原性組合物可以包含非綴合的肺炎鏈球菌溶血素例如 dPly和非綴合的肺炎球菌PhtD。[0049]QS21本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)結(jié)合至少一種選自:肺炎鏈球菌溶血素和多組氨酸三聯(lián)體家族的一個或多個成員(例如PhtD)的非綴合的肺炎鏈球菌蛋白；和包含QS21、單磷酰脂質(zhì)A (MPL) 的佐劑的免疫原性組合物提供有利的特性。[0050]QS-21是來自南美樹皂樹(Mdllaja saponaria )的樹皮提取物的純化的皂苷級分。QS21通常包含兩種主要的異構(gòu)體，其共享三萜、支鏈三糖和糖基化的假二聚?；?。 兩種異構(gòu)形式區(qū)別在于線性四糖區(qū)段內(nèi)末端糖的組成，其中主要的異構(gòu)體QS-21-Api摻入 β -D-芹菜糖殘基，并且次要的異構(gòu)體QS-21-Xyl在β -D-木糖取代基處終止。(Cleland， J.L.等 J.Pharm.Sc1.1996，85，22 - 28)。[0051]QS21可以通過HPLC純化從QuiI A中制備。由Dalsgaard等在1974年將Quil A描述為具有佐劑活性(“Saponin adjuvants，，，Archiv.fiir die gesamte Virusforschung, 第44卷，Springer Verlag, Berlin, p243_254)。用于產(chǎn)生QS21 的方法描述于US5057540 (作為QA21)和EP0362278中。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含以基本上純的形式的QS21，也就是說，所述QS21為至少90%純，例如至少95%、或至少98%純。[0052]QS21的劑量能夠合適地在人中增強對抗原的免疫應(yīng)答。具體而言，合適的QS21 量是這樣的量，與非佐劑化的組合物相比，或者與用另一 QS21量佐劑化的組合物相比，所述量改善了組合物的免疫潛力，同時從反應(yīng)原性概況上是可接受的。例如，QS21可以以每組合物劑量1-100 Pg的量例如以每組合物劑量10-50 Pg的量使用。例如，QS21合適的量是每組合物劑量 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 Pg中的任何。在一個實施方案中，QS21量的范圍為每組合物劑量25-75 Pg。在一個實施方案中，QS21量的范圍為每組合物劑量1-30 Pg，合適地為每組合物劑量5-20 Pg，例如每組合物劑量5-15 Pg、或每組合物劑量6-14 Pg或每組合物劑量7-13 Pg。在一個實施方案中，每ml疫苗組合物包含100 μg的QS21的終濃度，或每0.5 ml疫苗劑量50 Pg。在另一個實施方案中，每ml疫苗組合物包含50 μg的QS21的終濃度，或每0.5 ml疫苗劑量25 Kg。具體而言，0.5 ml疫苗劑量體積包含每劑量25 Pg或50 Pg的QS21。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含5-60、45-55或20-30 μ g (例如20、25、30、35、40、45或 50 yg)的QS21。例如，本發(fā)明的免疫原性組合物每人劑量可以包含50 Pg的QS21。適合地，肺炎鏈球菌蛋白:QS21的比例為以重量計(w/w) (yg)為0.05:1-3:1，例如1:1-3:1。
[0053]單磷酰脂質(zhì)A單磷酰脂質(zhì)A (MPL)是革蘭氏陰性細菌例如明尼蘇達沙門氏菌iSalmonellaffii/we>soia)R595的脂多糖(LPS)的無毒衍生物。它保持LPS的佐劑特性同時顯示出降低的毒性(Johnson 等 1987 Rev.1nfect.Dis.9 Suppl: S512-S516)。MPL 由一連串 4’ -單磷酰脂質(zhì)A種類組成，其在脂肪酸取代的程度和位置中不同。它可以通過用溫和的酸和堿水解處理LPS隨后通過純化修飾的LPS來制備。例如，LPS可以在中等強度的無機酸溶液(例如0.1 M HCl)中回流大約30分鐘的時期。該處理導(dǎo)致在I位的脫磷酸化和在6’位的脫糖化(decarbohydration)。如本文所用的術(shù)語“單磷酰脂質(zhì)A(MPL) ”包括單磷酰脂質(zhì)A的衍生物。單磷酰脂質(zhì)A的衍生物包括3D-MPL和合成的衍生物。[0054]3D-MPL是3-0-脫酰單磷酰脂質(zhì)A(或3脫_0_酰化單磷酰脂質(zhì)A)?；瘜W(xué)上它是具有4、5或6個?；湹?-脫酰單磷酰脂質(zhì)A的混合物。3D - MPL可以通過GlaxoSmithKline Biologicals North America在商標MPL?下購得。3_0_脫酰單磷酰脂質(zhì)A (3D-MPL)。它具有進一步降低的毒性同時還保持佐劑性，并且通?？梢酝ㄟ^溫和的堿水解來制備，例如見US4912094。堿水解通常在有機溶劑諸如氯仿/甲醇的混合物中通過用弱堿的水溶液諸如以pH 10.5的0.5 M碳酸鈉飽和進行。對于3D-MPL制備的進一步的信息見GB2220211A 和TO02078637 (Corixa Corporation)。在本發(fā)明的一方面，可以使用小顆粒3 D-MPL0小顆粒3D-MPL具有的顆粒大小使它可以經(jīng)0.22 μ m濾器無菌過濾。此類制備描述于國際專利申請?zhí)朩094/21292中。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含3_0_脫酰單磷酰脂質(zhì)A(3D-MPL)。[0055]來自革蘭氏陰性細菌的脂多糖(LPS)及其衍生物或其片段包括3D-MPL是TLR-4 (Toll樣受體4)配體，能夠?qū)е陆?jīng)TLR-4信號傳遞途徑的信號傳遞應(yīng)答(Sabroe等，JI 2003 pl630-5)。Toll樣受體(TLRs)是在昆蟲和人之間進化上保守的I型跨膜受體。目前已確定了 10個TLR (TLRs 1-1OhTLR家族的成員具有相似的胞外域和胞內(nèi)域；它們的胞外域已顯示具有富含亮氨酸的重復(fù)序列，并且它們的胞內(nèi)域與白細胞介素-1受體(IL-1R) 的胞內(nèi)域是相似的。TLR細胞在免疫細胞和其他細胞(包括血管上皮細胞、脂肪細胞、心肌細胞和腸上皮細胞)中差別表達。TLRs的胞內(nèi)域可以與銜接蛋白Myd88相互作用，其還在它的胞質(zhì)域內(nèi)具有IL-1R結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致細胞因子的NF-KB活化；該Myd88途徑是一種由此細胞因子釋放受TLR活化影響的方式。目前為止進行的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雖然某些激動劑對于幾個 TLRs是共同的，但TLRs識別不同類型的激動劑。[0056]脂質(zhì)A的合成衍生物是已知的，并且被認為是TLR4激動劑，包括但不限于: 0M174 (2-脫氧-6-0-[2-脫氧-2-[(R)-3-十二?；趸?癸?；被鵠_4-0_膦?；?β -D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-a -D-吡喃葡萄糖基二氫磷酸酯)，(W095/14026);OM 294 DP (3S, 9 R) _ 3—[ (R)-十二酰基氧基十四?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9(R)-[(R)-3-羥基十四?；被鵠癸-1，10- 二醇，1，10-雙(二氫磷酸酯 (dihydrogenophosphate)) (W099 /64301 and W000/0462); OM 197 MP-Ac DP ( 3S-, 9R) -3-[(R)-十二酰基氧基十四?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]癸-1，10- 二醇，1- 二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯) (W001/46127)。[0057]單磷酰脂質(zhì)A(MPL)例如3D-MPL的劑量能夠合適地在人中增強對抗原的免疫應(yīng)答。具體而言，單磷酰脂質(zhì)A (MPL)例如3D-MPL的量是這樣的量，與非佐劑化的組合物相比， 或者與用另一 MPL量佐劑化的組合物相比，所述量改善了組合物的免疫潛力，同時從反應(yīng)原性概況上是可接受的。例如,單磷酰脂質(zhì)A (MPL)例如3D-MPL可以以每組合物劑量1-100 Kg的量例如以每組合物劑量10-50 μg的量使用。例如，單磷酰脂質(zhì)A (MPL)例如3D-MPL合適的量是每組合物劑量 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48,49或50 μg中的任何。在一個實施方案中，單磷酰脂質(zhì)A (MPL)例如3D-MPL的量的范圍為每組合物劑量25-75 Pg。在一個實施方案中，3D-MPL量的范圍為每組合物劑量1-30 Mg，合適地為每組合物劑量5-20 Pg,例如每組合物劑量5-15 Pg、或每組合物劑量6-14 Pg 或每組合物劑量7-13 Pg。在一個實施方案中，每ml疫苗組合物包含100 Pg的單磷酰脂質(zhì) A(MPL)例如3D-MPL的終濃度，或每0.5 ml疫苗劑量50 Pg。在另一個實施方案中，每ml疫苗組合物包含50 μg的單磷酰脂質(zhì)A (MPL)例如3D-MPL的終濃度，或每0.5 ml疫苗劑量25 Kg。具體而言，0.5 ml疫苗劑量體積包含每劑量25 μg或50 μg的單磷酰脂質(zhì)A(MPL)例如3D-MPL。在一方面，本發(fā)明的免疫原性組合物包含5-60、45-55或20-30 μ g (例如20、 25、30、35、40、45或50 μ g)的單磷酰脂質(zhì)A (MPL)。例如，本發(fā)明的免疫原性組合物每人劑量可以包含50 μg的3D-MPL。適合地，肺炎鏈球菌蛋白:單磷酰脂質(zhì)A(MPL)例如3D-MPL 的比例為以重量計(w/w) ( μ g) 0.05:1-3:1，例如1:1-3:1。[0058]在另一個實施方案中，將TLR分子的其他天然或合成激動劑用作任選的額外免疫刺激劑。這些可以包括但不限于對TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9 或其組合的激動劑(例如見Sabroe等，JI 2003 pl630_5)?？梢允褂玫钠渌鸗LR4配體為氨基葡糖苷磷酸酯(AGPs)諸如公開于W09850399或US6303347中的那些(還公開了制備 AGPs的方法)、或如US6764840中公開的AGPs的藥學(xué)上可接受的鹽。某些AGPs是TLR4激動劑，并且某些是TLR4拮抗物。認為兩者均可用作佐劑。其他合適的TLR激動劑為:熱休克蛋白(HSP) 10、60、65、70、75或90 ;表面活性劑蛋白A、乙酰透明質(zhì)酸寡糖、類肝素硫酸酯片段、纖連蛋白片段、纖維蛋白原和b-防衛(wèi)素_2、胞壁酰二肽(MDP)或呼吸道合胞病毒的F 蛋白。在一個實施方案中，TLR激動劑為HSP 60、70或90。[0059]在本發(fā)明的一個實施方案中，免疫原性組合物的每人劑量中QS21和單磷酰脂質(zhì) A(MPL)例如3D-MPL以相同的終濃度存在。在另一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物的人劑量包含50 μg的單磷酰脂質(zhì)A(MPL)例如3D-MPL和50 μg的QS21的終水平。在進一步的實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物的人劑量包含25 Pg的單磷酰脂質(zhì)A(MPL)例如3D-MPL和25 Pg的QS21的終水平。[0060]脂質(zhì)體載體用于本發(fā)明的組合物的佐劑包含脂質(zhì)體載體。可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)從磷脂(諸如二油酰磷脂酰膽堿，D0PC)和留醇例如膽固醇來制備脂質(zhì)體。此類脂質(zhì)體載體可以攜帶 QS21和/或單磷酰脂質(zhì)A(MPL)例如3D-MPL。合適的本發(fā)明的組合物是那些組合物，其中最初在無MPL的情況下制備脂質(zhì)體(如W096/33739中所描述)，并且隨后添加MPL，適合地為小于100 nm顆粒的小顆?；蛉菀捉?jīng)0.22 膜無菌過濾的顆粒。因此MPL不包含在小泡膜內(nèi)(稱為MPL在外)。其中MPL包含在小泡膜內(nèi)(稱為MPL在內(nèi))的組合物也形成本發(fā)明的方面。非綴合的肺炎鏈球菌蛋白可以包含在小泡膜內(nèi)或包含在小泡膜外部。合適地可`溶性抗原在外部，并且疏水的或脂化的抗原包含在膜的內(nèi)部或者外部。脂質(zhì)體內(nèi)的膠囊化描述于 US4235877 中。[0061]本發(fā)明的脂質(zhì)體包含磷脂，例如磷脂酰膽堿，其可以在室溫下是非結(jié)晶的，例如卵黃磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿或二月桂基磷脂酰膽堿。適合地，磷脂是二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)。進一步的方面是包含0.1-1Omg,0.2-7,0.3-5,0.4-2或0.5-1 mg (例如0.4-0.6,0.9-1.1,0.5-1 mg)磷脂的本發(fā)明的免疫原性組合物。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，DOPC的量為每人劑量1000 Pg。在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，DOPC的量為每人劑量500 Pg。[0062]本發(fā)明的脂質(zhì)體包含留醇。留醇提高脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。合適的留醇包括 β -谷留醇、豆留醇、麥角留醇、麥角鈣化醇和膽固醇。這些留醇是本領(lǐng)域熟知的，例如膽固醇公開于Merck Index，第11版，第341頁，作為動物脂肪中發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)生的甾醇。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，甾醇是膽固醇。通常，如W096/33739中所描述，可以在抗原制備過程中使用用留醇猝滅的QS21來添加甾醇。[0063]甾醇對磷脂的量為1-50% (w/w)，適合地為20-35%，例如25%。QS21:甾醇的比例適合地在1:10-1:1 (w/w)之間，存在適合地過量的甾醇，QS21:甾醇的比例為至少1:2 (w/w)，例如1:5 (w/w) 0在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含0.025-2.5、0.05-1.5,0.075-0.75,0.1-0.3 或 0.125-0.25 mg (例如 0.2-0.3,0.1-0.15,0.25-0.125 mg)留醇。在進一步的實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含每人劑量250 Pg的甾醇例如膽固醇。在進一步的實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含每人劑量125 Pg的甾醇例如膽固醇。[0064]本發(fā)明的脂質(zhì)體將適合地包含在液體培養(yǎng)基中。液體培養(yǎng)基包含生理可接受液體諸如水、鹽水溶液和緩沖溶液，例如PBS等。例如，本發(fā)明的免疫原性組合物可以包含水和磷酸鈉緩沖液。[0065]在本發(fā)明的一方面，佐劑為ASOlB (例如見W096/33739)。在本發(fā)明的另一方面， 佐劑為 ASOlE (例如見 W02007/068907)。[0066]額外杭原本發(fā)明的免疫原性組合物可以包含能夠引起針對人或動物病原體的免疫應(yīng)答的額外抗原。這些額外的抗原例如包括額外的肺炎鏈球菌抗原，例如肺炎鏈球菌蛋白抗原。當額外抗原為肺炎球菌蛋白時，所述蛋白例如任選與糖類綴合。任選地，肺炎球菌蛋白是非綴合的或者作為游離蛋白存在于免疫原性組合物中。[0067]在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含至少I種選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX 截短物嵌合蛋白(或融合蛋白)、PspA, PsaA, Spl28、SplOl、Spl30、Spl25 和 Spl33 的額外蛋白。在進一步的實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含兩種或更多種選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合蛋白)、PspA、PsaA和Spl28的額外蛋白。 在進一步的實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含兩種或更多種選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合蛋白)和Sp 128的額外蛋白。[0068]關(guān)于膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)，該家族的成員包含N末端區(qū)(N)、保守的重復(fù)區(qū) (Rl和/或R2)、富含脯氨酸區(qū)(P)和保守的膽堿結(jié)合區(qū)(C)，由多個重復(fù)組成，其包含大約蛋白的一半。如本申請中使用，術(shù)語“膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX) ”選自如W097/41151中鑒定的膽堿結(jié)合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD 和 CbpG。CbpA 公開于 W097/41151 中。CbpD 和 CbpG 公開于 W000/29434 中。PspC 公開于 W097/09994 中。PspA 公開于 W098/21337 中。 SpsA為公開于W098/39450中的膽堿結(jié)合蛋白。任選地,膽堿結(jié)合蛋白選自CbpA、PbcA、SpsA 和 PspC0[0069]本發(fā)明的一個實施方案包含CbpX截短物，其中“CbpX”在上文定義并且“截短物” 指缺少膽堿結(jié)合區(qū)(C)的50%或更多的CbpX蛋白。任選地，此類蛋白缺少整個膽堿結(jié)合區(qū)。任選地，此類蛋白截短物缺少(i)膽堿結(jié)合區(qū)和(ii)以及蛋白的N末端一半的部分， 仍保留至少一個重復(fù)區(qū)(Rl或R2)。任選地，截短物具有2個重復(fù)區(qū)(Rl和R2)。此類實施方案的實例為如W099/51266或W099/51188中說明的NRlxR2和RlxR2，然而，認為其他缺少類似膽堿結(jié)合區(qū)的膽堿結(jié)合蛋白也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在另一個實施方案中哦功能，本發(fā)明的免疫原性組合物可以包含PcpA的免疫原性多肽，例如選自肺炎鏈球菌TIGR4、肺炎鏈球菌14453、肺炎鏈球菌B6 (GenBank登記號CAB04758)、或肺炎鏈球菌R6 (GenBank登記號NP_359536)。在一個實施方案中，免疫原性多肽PcpA缺少N末端信號序列。在另一個實施方案中，免疫原性多肽PcpA缺少在天然產(chǎn)生的序列中發(fā)現(xiàn)的膽堿結(jié)合域錨定序列。在另一個實施方案中，免疫原性多肽PcpA缺少信號序列和一個或多個膽堿結(jié)合域。例如，本發(fā)明的免疫原性組合物可以包含與W02011/075823的SEQ ID N0.2具有至少50、60、70、80、 90、95、97、99%同一性的PcpA的免疫原性多肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物可以包含具有W02011/075823的序列SEQ ID N0.7的PcpA的免疫原性多肽。[0070]LytX家族是與細胞溶解相關(guān)的膜相關(guān)蛋白。N末端結(jié)構(gòu)域包含一個或多個膽堿結(jié)合域，然而，LytX家族不具有上文提及的CbpA家族中發(fā)現(xiàn)的所有特征，并且因此對于本發(fā)明而言，認為LytX家族與CbpX家族不同。與CbpX家族相反，C末端結(jié)構(gòu)域包含LytX蛋白家族的催化結(jié)構(gòu)域。家族包含LytA、B和C。關(guān)于LytX家族,LytA公開于Ronda等，Eur J Biochem, 164:621-624 (1987)中。LytB 公開于 W098/18930 中，并且也被稱為 Sp46。LytC 也公開于W098/18930中，并且也被稱為Sp91。本發(fā)明的一個實施方案包含LytC。[0071]另一個實施方案包含LytX截短物，其中“LytX”在上文定義并且“截短物”指缺少膽堿結(jié)合區(qū)的50%或更多的LytX蛋白。任選地，此類蛋白缺少整個膽堿結(jié)合區(qū)。本發(fā)明的仍另一個實施方案包含CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合蛋白)。任選地,這包含CbpX的NRlxR2 (或RlxR2)和LytX的C末端部分(Cterm，即，缺少膽堿結(jié)合域)(例如 LytCCterm 或 Sp9ICterm)。任選地，CbpX 選自 CbpA、PbcA、SpsA 和 PspC0 任選地,它是 CbpA。任選地，LytX是LytC (也稱作Sp91)。本發(fā)明的另一個實施方案是缺少膽堿結(jié)合域 (C)并且表達為與LytX的融合蛋白的PspA或PsaA截短物。任選地，LytX是LytC。[0072]關(guān)于PsaA和PspA，兩者都是本領(lǐng)域已知的。例如，PsaA及其跨膜缺失變體已經(jīng)由 Berry 和 Paton, Infect Tmmun 1996 Dec; 64 (12): 5255-62 所描述。PspA 及其跨膜缺失變體已經(jīng)例如在 US5804193、W092/14488 和 W099/53940 中公開。[0073]Sp128和Spl30公開于W000/76540中。Spl25是具有LPXTG (其中X為任何氨基酸)的細胞壁錨定基序的肺炎球菌表面蛋白的實例。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有該基序的肺炎球菌 表面蛋白的這一類中的任何蛋白均可用在本發(fā)明的背景中，并且因此被認為是本發(fā)明的進一步的蛋白。Spl25自身公開于W098/18930中，并且也已知為ZmpB -鋅金屬蛋白酶。SplOl公開于W098/06734 (其中它具有參考# y85993)。將它表征為I型信號序列。Spl33公開于TO98/06734 (其中它具有參考# y85992)。將它也表征為I型信號序列。[0074]本發(fā)明的免疫原性組合物還可以包含肺炎鏈球菌莢膜糖(合適地與載體蛋白綴合)。所述糖(例如多糖)可以來源于肺炎球菌的血清型諸如血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F。在一個實施方案中， 至少四種血清型包括在組合物中，例如6B、14、19F和23F。在另一個實施方案中，至少7種血清型包括在組合物中，例如4、6B、9V、14、18C、19F和23F。適合地，糖類的每一種與載體蛋白綴合。在一個實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含肺炎鏈球菌溶血素和/或多組氨酸三聯(lián)體家族的一個或多個成員(例如PhtD)作為載體蛋白。[0075]逝量 如本文所用的術(shù)語“人劑量”表示以適合于人使用的體積的劑量。通常，終劑量體積(疫苗組合物體積)可以為0.25-1.5 ml,0.4-1.5 ml或0.4-0.6 ml。在一個實施方案中，人劑量為0.5 ml ο在進一步的實施方案中，人劑量高于0.5 ml，例如0.6、0.7、0.8、0.9或I ml。 在進一步的實施方案中，人劑量為I ml-1.5 ml。在另一個實施方案中，尤其是當免疫原性組合物用于兒科人群，人劑量可以為少于0.5 ml諸如0.25-0.5 ml。[0076]選擇每一劑量中肺炎鏈球菌蛋白的量為在一般接種者中誘導(dǎo)免疫保護應(yīng)答而不具有明顯的不良副作用的量。這樣的量將根據(jù)使用的具體免疫原以及它如何呈現(xiàn)而有所不同。通常，期望每一劑量將包含1-1000 μ g的蛋白抗原，例如1-500 μ gu-100 yg或 1-50 μ g。對具體免疫原性組合物的最佳量可以通過關(guān)于在受試者中觀察合適的免疫應(yīng)答的標準研究來確定。[0077]接赴本發(fā)明提供包含本發(fā)明的免疫原性組合物的疫苗。本文中本發(fā)明涉及“免疫原性組合物”的實施方式也適用于本發(fā)明涉及“疫苗”的實施方式，并且反之亦然。在一個實施方案中，疫苗包含本發(fā)明的免疫原性組合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。[0078]本發(fā)明的疫苗可以通過任何合適的遞送途徑來施用，諸如皮內(nèi)、粘膜例如鼻內(nèi)、 口腔、肌內(nèi)或皮下。其他遞送途徑在本領(lǐng)域是廣泛知曉的。疫苗制劑通常描述于Vaccine Design (〃The subunit and adjuvant approach" (Powell M.F.和 Newman M.J.編輯) (1995) Plenum Press New York)中。[0079]在一方面，本發(fā)明的免疫原性組合物通過肌內(nèi)遞送途徑施用。肌內(nèi)施用可以向大腿或上臂進行。注射通常經(jīng)針(例如皮下針)，但或者可以使用無針注射。通常的肌內(nèi)劑量為 0.5 ml ο[0080]疫苗的皮內(nèi)施用形成本發(fā)明的一個實施方案。人皮膚包含被稱為角質(zhì)層(stratum corneum)外“角質(zhì)”層，其覆蓋表皮。在該表皮下是被稱為真皮的層，其依次覆蓋皮下組織。 皮內(nèi)注射的常規(guī)技術(shù)“mantoux方法”包括清潔皮膚并隨后用一只手伸展的步驟，并且使狹窄的計量針(26-31量規(guī))的斜面向上，將針以10-15°的角插入。一旦針的斜面插入，針筒降低并且進一步向前，同時提供輕微壓力以在皮膚下使其升高。隨后液體由此非常緩慢地注入，在皮膚表面上形成皰或腫塊，隨后緩慢地抽出針。[0081]更近期，已經(jīng)描述了特別設(shè)計來向皮膚內(nèi)或經(jīng)皮膚施用液體藥劑的設(shè)備，例如描述于W099/34850和EP1092444中的設(shè)備，以及例如描述于W001/13977、US5, 480，381、US5, 599，302、US5, 334，144、US5, 993，412、US5, 649，912、US5, 569，189、US5, 704，911、 US5, 383，851、US5, 893，397、US5, 466，220、US5, 339，163、US5, 312，335、US5, 503，627、 US5, 064，413、US5, 520，639、US4, 596，556、US4, 790，824、US4, 941，880、US4, 940，460、 W097/37705和W097/13537中的噴射注射設(shè)備。疫苗制劑的皮內(nèi)施用的可選方法可以包括常規(guī)注射器和針、或設(shè)計用于固體疫苗發(fā)射遞送的設(shè)備(W099/27961)、或透皮貼劑(W097/48440、W098/28037)、或用于皮膚表面的(透皮或經(jīng)皮膚遞送W098/20734、 W098/28037)。[0082]當將本發(fā)明的疫苗向皮膚(或者更具體而言向真皮內(nèi))施用時，疫苗為小的液體體積，具體為約0.05 ml-0.2 ml的體積。[0083]另一個合適的施用途徑是皮下途徑?？梢允褂萌魏魏线m的設(shè)備進行皮下遞送， 例如經(jīng)典的針。在本發(fā)明的一方面，使用無針噴射注射器服務(wù)，諸如發(fā)表于W001/05453、 W001/05452、W001/05451、W001/32243、W001/41840、W001/41839、W001/47585、 W001/56637、TO01/58512、TO01/64269、TO01/78810、TO01/91835、TO01/97884、TO02/09796、 W002/34317中。在本發(fā)明的另一方面，用液體疫苗制劑將設(shè)備預(yù)先充滿。[0084]或者，鼻內(nèi)施用疫苗。通常，將疫苗向鼻咽區(qū)域局部施用，例如不被吸入肺內(nèi)。期望使用鼻內(nèi)遞送設(shè)備，其向鼻咽區(qū)域遞送疫苗制劑，它不會或基本上不會進入肺。用于本發(fā)明的疫苗的鼻內(nèi)施用的優(yōu)選設(shè)備為噴霧設(shè)備。合適的商品化鼻腔噴霧設(shè)備包括Accuspray? (Becton Dickinson)。[0085]在一個實施方案中，用于鼻內(nèi)使用的噴霧設(shè)備是設(shè)備的性能不依賴于由使用者施加的壓力的設(shè)備。已知這些設(shè)備為壓力閾值設(shè)備。只有當施加閾值壓力時，才從噴嘴中釋放液體。這些設(shè)備使得其更容易獲得具有規(guī)則小滴大小的噴霧。適合用于本發(fā)明的壓力閾值設(shè)備是本領(lǐng)域已知的，并且例如描述于W091/13281和EP311 863和EP516636中，其通過引用并入本文。此類設(shè)備可以商業(yè)上購自于Pfeiffer GmbH,并且還描述于Bo_er, R.Pharmaceutical Technology Europe, Sept 1999。[0086]在另一個實施方案中，鼻內(nèi)設(shè)備產(chǎn)生1-200 Wn例如10-120 Wn范圍內(nèi)的小滴(使用水作為液體測量)。低于10 Mffl存在吸入風(fēng)險，因此期望具有不多于約5%的低于10 Mffl 的小滴。120 Mffl以上的小滴無法如更小的小滴散布那么好，因此期望具有不多于約5%的超過120 Mm的小滴。[0087]雙劑量遞送是用于本發(fā)明疫苗的鼻內(nèi)遞送系統(tǒng)的另一個實施方案。雙劑量設(shè)備包含單次疫苗劑量的兩個亞劑量，一個亞劑量用于向每一鼻孔施 用。通常，兩個亞劑量存在于單一室中，并且設(shè)備的結(jié)構(gòu)允許單一亞劑量在一次的有效遞送?；蛘?，單劑量設(shè)備可以用于施用本發(fā)明的疫苗。[0088]本發(fā)明的進一步的方面是本發(fā)明的疫苗的生產(chǎn)方法，其包括將非綴合的肺炎鏈球菌蛋白與佐劑組合物混合的步驟。[0089]盡管本發(fā)明的疫苗可以作為單一劑量施用，其組分也可以在同一時間或在不同時間一同共施用(例如，肺炎球菌糖綴合物可以單獨、在疫苗的任何細菌蛋白組分施用的同一時間或其后1-2周施用，以獲得彼此相關(guān)的免疫應(yīng)答的最適協(xié)調(diào))。初始接種后，受試者可以接受一次或適當分隔開的幾次加強免疫。[0090]在本發(fā)明的一方面，目標人群是未接觸過抗原的人群，是首次用于實驗的或者是之前已經(jīng)無法對感染或接種應(yīng)答。在另一方面，目標人群是年齡為65歲和以上的適合的老年人、更年輕的高風(fēng)險成人(即年齡18-64歲之間)諸如在健康機構(gòu)中工作的人、或那些具有風(fēng)險因素諸如心血管和肺疾病或糖尿病的年輕成人。另一目標人群是年齡為6個月及以上的所有兒童，尤其是年齡為6-23個月的兒童。另一目標人群是無免疫應(yīng)答的人。[0091]本發(fā)明的免疫原性組合物可以用于預(yù)防和治療目的。由肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致的疾病包括肺炎、急性鼻竇炎、中耳炎、腦膜炎、菌血癥、敗血癥、骨髓炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、腹膜炎、心包炎、蜂窩組織炎和腦膿腫。在本發(fā)明的一個實施方案中，肺炎鏈球菌感染包括肺炎、中耳炎、腦膜炎和菌血癥。在一個實施方案中，由肺炎鏈球菌導(dǎo)致的疾病是肺炎，例如群落獲得性肺炎。在另一個實施方案中，由肺炎鏈球菌導(dǎo)致的疾病是侵入性肺炎球菌疾病(iro)，即其中可以從血液或另一通常無菌部位中分離到肺炎鏈球菌的感染。在另一個實施方案中，由肺炎鏈球菌導(dǎo)致的疾病是肺炎，例如重癥肺炎。已知為“重癥肺炎”的狀況根據(jù)由多個組織包括American Thoracic Society (ATS) (Am J Respir Crit Care Med 2001; 163:1730-1754)提出的指導(dǎo)方針進行表征。例如，除了對重癥肺炎診斷的其他標準之外， ATS要求至少一個主要標準，諸如需要機械通氣或感染性休克。通常，重癥肺炎可以產(chǎn)生自急性肺病、肺炎性疾病或由于諸如炎癥或凝固因素的肺功能中的任何干擾。本發(fā)明的免疫原性組合物還可以用于AECOPD的治療或預(yù)防中。在一方面，本發(fā)明的免疫原性組合物可以用于由肺炎鏈球菌導(dǎo)致的AECOPD的治療或預(yù)防中。[0092]本發(fā)明的進一步方面包括:-通過用本發(fā)明的免疫原性組合物免疫哺乳動物引起免疫應(yīng)答的方法；-治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致的疾病的方法，包括向需要其的受試者例如人肌內(nèi)施用，包括向所述受試者例如人施用本發(fā)明的免疫原性組合物；-a治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致的疾病的方法,包括向經(jīng)受肺炎鏈球菌感染或?qū)Ψ窝祖溓蚓腥疽赘械幕颊呒?nèi)施用本發(fā)明的免疫原性組合物；-用于治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致的疾病的本發(fā)明的免疫原性組合物；-本發(fā)明的免疫原性組合物在制造用于治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致的疾病的藥物中的用途；-本發(fā)明的免疫原性組合物在制造用于治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致的疾病的肌內(nèi)疫苗中的用途。[0093]免瘡原件特件本發(fā)明的進一步的方面是能夠在哺乳動物中引起T細胞應(yīng)答的本發(fā)明免疫原性組合物。在一方面，T細胞應(yīng)答可以是溶細胞性T細胞應(yīng)答。溶細胞性T細胞應(yīng)答可以使用標準試驗來測量，例如通過使用鉻釋放試驗測量T細胞的細胞毒性活性，例如將向靶細胞添加51Cr并且測量由溶解的細胞釋放的51Cr的量，或通過流失細胞術(shù)測定參與T細胞細胞毒性的分子(例如粒酶B、穿孔蛋白)的表達。[0094]在一方面，與用相應(yīng)的非佐劑化的組合物(即不包含任何外源佐劑(本文也稱為 ‘簡單組合物(plain composition)’))和/或本領(lǐng)域已知的其他佐劑化的化合物獲得的 CD4 T細胞免疫應(yīng)答相比，本發(fā)明的免疫原性組合物能夠誘導(dǎo)針對至少一種或多種組分抗原或抗原組合物之一的改善的CD4 T細胞免疫應(yīng)答。[0095]“改善的CD4 T細胞`免疫應(yīng)答”指在施用佐劑化的免疫原性組合物之后，在哺乳動物例如人中獲得了比在施用無佐劑和/或具有其他已知佐劑的相同組合物之后所獲得的應(yīng)答更高的CD4應(yīng)答。例如，與在施用非佐劑化的免疫原性組合物和/或本領(lǐng)域已知的其他佐劑化的組合物后誘導(dǎo)的應(yīng)答相比，施用本發(fā)明的免疫原性組合物在哺乳動物中獲得了更高的⑶4 T細胞應(yīng)答。[0096]可以通過測量產(chǎn)生任何以下細胞因子的細胞的數(shù)目來評價改善的⑶4 T細胞免疫應(yīng)答:?產(chǎn)生任何細胞因子(IFNy、IL-2、IL-17、IL-13)的細胞 ?產(chǎn)生IFNy的細胞 ?產(chǎn)生IL-17的細胞與施用非佐劑化的組合物和/或其他佐劑化的組合物相比，當施用本發(fā)明的免疫原性組合物后產(chǎn)生任何上述細胞因子的細胞將為更高的量時，將存在改善的CD4 T細胞免疫應(yīng)答。在一個實施方案中，本文上述的三個條件中的至少一個將會實現(xiàn)。在另一個實施方案中，本文上述的三個條件中的至少兩個將會實現(xiàn)。在另一個實施方案中，本文上述的所有三個條件均將會實現(xiàn)。在進一步的方面，本發(fā)明的免疫原性組合物能夠刺激IFNy產(chǎn)生。可以如本文實施例中描述的測量IFNy產(chǎn)生。例如，可以通過使用對應(yīng)于IFNy的抗原例如 PhtD和dPly體外再刺激外周血抗原特異性⑶4和⑶8、常規(guī)免疫熒光標記和通過流式細胞術(shù)的測量來確定在CD4或CD8細胞亞群中細胞因子陽性的CD4或CD8 T細胞的頻度來測量IFN Y產(chǎn)生。在進一步的方面，本發(fā)明的免疫原性組合物能夠刺激IL-17產(chǎn)生?？梢匀绫疚膶嵤├忻枋龅臏y量IL-17產(chǎn)生。例如，可以通過使用對應(yīng)于IL-17的抗原例如PhtD 和dPly體外再刺激外周血抗原特異性CD4和CD8、常規(guī)免疫熒光標記和經(jīng)流式細胞術(shù)測量來確定在CD4或CD8細胞亞群中細胞因子陽性的CD4或CD8 T細胞的頻度來測量IL-17產(chǎn)生。[0097]本發(fā)明將通過參考以下非限制性實施例來進一步描述:實施例1在PhtD和dPly的小鼠模型(C57B16)中ASOlB相比于AS03B Th應(yīng)答的臨床前比較用9 Pg或3 Pg配制于ASOlB或AS03B中的PhtD或dPly在第O、14和28天通過頂途徑免疫六周齡的C57bl6小鼠。用5 Pg配制于AS15中的PhtD,dPIy或Sivp27 (將Sivp27 用作陽性對照)免疫對照組。在第二次和第三次免疫后7天進行對全血的FACS分析，并且在第三次免疫后9天進行對脾臟的FACS分析。[0098]實驗1:
【權(quán)利要求】
1.一種免疫原性組合物，其包含至少一種選自:肺炎鏈球菌溶血素和多組氨酸三聯(lián)體家族的一個或多個成員的非綴合的肺炎鏈球菌蛋白；和包含QS21、單磷酰脂質(zhì)A (MPL)、磷脂和留醇的佐劑，以脂質(zhì)體的形式存在。
2.權(quán)利要求1中所述的免疫原性組合物，其中肺炎鏈球菌蛋白:單磷酰脂質(zhì)A(MPL) 的比例為 0.05:1-3:1 (w/w) ο
3.權(quán)利要求1-2中所述的免疫原性組合物，其中肺炎鏈球菌蛋白:QS21的比例為 0.05:1-3:1 (w/w)。
4.權(quán)利要求1-3中所述的免疫原性組合物，其包含5-60、45-55、5-20或20-30μ g (例如 20、25、30、35、40、45 或 50 μ g)的單磷酰脂質(zhì) A (MPL)。
5.權(quán)利要求1-4中所述的免疫原性組合物，其包含5-60、45-55、5-20或20-30μ g (例如 20、25、30、35、40、45 或 50 μ g)的 QS21。
6.權(quán)利要求1-5中所述的免疫原性組合物，其包含0.l-10mg、0.2-7,0.3-5,0.4-2或 0.5-1 mg (例如 0.4-0.6,0.9-1.1、0.5 或 I mg)的磷脂。
7.權(quán)利要求1-6中所述的免疫原性組合物，其包含0.025-2.5,0.05-1.5、 0.075-0.75,0.1-0.3 或 0.125-0.25 mg (例如 0.2-0.3,0.1-0.15,0.25-0.125 mg)的甾醇。
8.權(quán)利要求1-7中所述的免疫原性組合物，其中所述單磷酰脂質(zhì)A(MPL)為3-0-脫酰單磷酰脂質(zhì)A(3D-MPL)。
9.權(quán)利要求8中所述的免疫原性組合物，其中每人劑量3D-MPL的量為50Pg。
10.權(quán)利要求1-9中所述的免疫原性組合物，其中每人劑量QS21的量為50Pg。
11.權(quán)利要求1-10中所述的免疫原性組合物，其中磷脂是二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)。
12.權(quán)利要求11中所述的免疫原性組合物，其中每人劑量DOPC的量為1000Pg。
13.權(quán)利要求1-12中所述的免疫原性組合物，其中甾醇是膽固醇。
14.權(quán)利要求13中所述的免疫原性組合物，其中每人劑量膽固醇的量為250Pg。
15.權(quán)利要求1-14中所述的免疫原性組合物，其能夠在哺乳動物中引起溶細胞性T細胞應(yīng)答。
16.權(quán)利要求1-15中所述的免疫原性組合物，其能夠刺激干擾素Y產(chǎn)生。
17.權(quán)利要求1-16中所述的免疫原性組合物，其能夠刺激IL-17產(chǎn)生。
18.權(quán)利要求1-17中所述的免疫原性組合物，其中所述肺炎鏈球菌溶血素是解毒的肺炎鏈球菌溶血素(dPly)。
19.權(quán)利要求18中所述的免疫原性組合物，其中所述肺炎鏈球菌溶血素已經(jīng)被化學(xué)解毒。
20.權(quán)利要求18或19中所述的免疫原性組合物，其中所述肺炎鏈球菌溶血素已經(jīng)被遺傳解毒。
21.權(quán)利要求1-20中所述的免疫原性組合物，其每人劑量包含3-90、3-20、20-40或 40-70 μg (例如10、30或60 μδ)非綴合的肺炎球菌肺炎鏈球菌溶血素。
22.權(quán)利要求1-21中所述的免疫原性組合物，其中所述多組氨酸三聯(lián)體家族的成員為 PhtD。
23.權(quán)利要求22中所述的免疫原性組合物，其中所述PhtD包含與在W000/37105的序列ID N0.4的氨基酸21-838處的序列至少90 %同一性的氨基酸序列。
24.權(quán)利要求22中所述的免疫原性組合物，其中所述PhtD具有與在W000/37105的序列ID N0.4的氨基酸21-838處的序列至少90%同一性的氨基酸序列。
25.權(quán)利要求22中所述的免疫原性組合物，其中所述PhtD具有包含W000/37105的序列ID NO: 4的氨基酸21-838的氨基酸序列。
26.權(quán)利要求22中所述的免疫原性組合物，其中所述PhtD具有包含W000/37105的序列ID N0.4的至少10個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列。
27.權(quán)利要求1-26中所述的免疫原性組合物，其每人劑量包含3-90、3-20、20-40或 40-70 μδ (例如 10、30 或 60 μδ)非綴合的 PhtD。
28.權(quán)利要求1-27中所述的免疫原性組合物，其包含非綴合的肺炎鏈球菌溶血素和非綴合的肺炎球菌PhtD。
29.權(quán)利要求1-28中所述的免疫原性組合物，其包含一種或多種進一步的抗原。
30.權(quán)利要求1-28中所述的免疫原性組合物，其包含一種或多種肺炎鏈球菌莢膜糖。
31.前述權(quán)利要求中任一項的免疫原性組合物，其中所述劑量體積為0.4-1.5 ml。
32.權(quán)利要求31中所述的免疫原性組合物，其中所述劑量體積為0.5 ml ο
33.包含權(quán)利要求1-32中所述的免疫原性組合物的疫苗。
34.生產(chǎn)權(quán)利要求33中請求保護的疫苗的方法，其包括將所述非綴合的肺炎鏈球菌蛋白與所述佐劑組合物混合的步驟。
35.通過用權(quán)利要求1-32的免疫原性組合物免疫哺乳動物引起免疫應(yīng)答的方法。
36.一種治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致的疾病的方法，其包括向經(jīng)受肺炎鏈球菌感染或?qū)Ψ窝祖溓蚓腥疽赘械幕颊呤┯脵?quán)利要求1-32中任一項中所述的免疫原性組合物。
37.一種治療或預(yù)防AE COPD的方法，其包括向經(jīng)受AE COPD或?qū)E COPD易感的患者施用權(quán)利要求1-32中任一項中所述的免疫原性組合物。
38.一種治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致的疾病的方法，其包括向需要其的受試者肌內(nèi)施用，包括向所述受試者施用權(quán)利要求1-32中任一項中所述的免疫原性組合物。
39.一種治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致的疾病的方法，其包括向需要其的人肌內(nèi)施用，包括向所述人施用權(quán)利要求1-32中任一項中所述的免疫原性組合物。
40.權(quán)利要求1-32中任一項中所述的免疫原性組合物，其用于治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致的疾病。
41.權(quán)利要求1-32中任一項中所述的免疫原性組合物，其用于治療或預(yù)防AECOPD0
42.權(quán)利要求1-32中任一項中所述的免疫原性組合物在制造用于治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致的疾病的藥物中的用途。
43.權(quán)利要求1-32中任一`項中所述的免疫原性組合物在制造用于治療或預(yù)防由肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致的疾病的肌內(nèi)疫苗中的用途。
44.權(quán)利要求1-32中任一項中所述的免疫原性組合物在制造用于治療或預(yù)防AE COPD的藥物中的用途。
【文檔編號】A61P31/00GK103533953SQ201280023465
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月17日
【發(fā)明者】P.德內(nèi)爾, J.波爾曼, V.弗蘭特, H.瓦萊馬克 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司