紫檀茋的抗焦慮效果的制作方法
【專利摘要】紫檀茋(白藜蘆醇的一種天然類似物)通過下調(diào)小鼠海馬體中ERK的磷?；蕉@示出抗焦慮樣作用。使通過口服強(qiáng)飼法施用了紫檀茋(1-10mg/kg?BW)的小鼠接受了高架十字迷宮(EPM)測試。紫檀茋在1mg/kg和2mg/kg的劑量下顯示出通過增加的百分比滯留時(shí)間和開放臂進(jìn)入次數(shù)而證實(shí)的抗焦慮活性，這兩者是焦慮的關(guān)鍵決定因素。這種抗焦慮活性與EPM中1mg/kg和2mg/kg下的安定相當(dāng)。百分比封閉臂行進(jìn)距離和滯留時(shí)間在1mg/kg和2mg/kg劑量下縮短。5mg/kg和10mg/kg劑量未顯示出任何抗焦慮效果。自主活動(dòng)在所有劑量下均不受影響。Western印跡分析證實(shí)了EPM觀察結(jié)果。在單次經(jīng)口施用后在血清和腦組織中檢測到了紫檀茋，從而證實(shí)了該化合物跨過血腦屏障從而發(fā)揮其抗焦慮效果。白藜蘆醇不具有任何抗焦慮效果。
【專利說明】紫擅芪的抗焦慮效果
[0001]發(fā)明背景【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及通過施用包含治療有效量的存在于葡萄和某些越橘(Vaccinium)漿果中的紫檀芪(白藜蘆醇的類似物)的藥物組合物而治療、緩解或預(yù)防焦慮的方法。
[0003]相關(guān)領(lǐng)域描述
[0004]焦慮障礙在社區(qū)環(huán)境中以及在初級和二級醫(yī)療護(hù)理中是常見的，并通常會(huì)轉(zhuǎn)變成慢性臨床病狀(Nutt 等人 2002.1nt.J.Neuropsychopharmacol.5:315-325)。焦慮障礙是精神障礙最常見的類型，具有18.1%的發(fā)病率和28.8%的終生盛行率(Kessler等人2005.Arch.Gen.Psychiatry62:617-627;Ohayon, Μ.Μ.2006.J.Psychiatr.Res.40:475-476)。抗焦慮藥物已由人類使用了數(shù)千年。這些藥物中的苯二氮□類起效快、有效并且是最常見的處方類抗焦慮藥(Bandelow 等人 2008.World J.Biol.Psychiatry9:248-312;Baldwin等人 2005.J.Psychopharmacol.19:567-596;Rudolph 和 Mohler.2006.Curr.0pin.Pharmacol.6:18-23)。然而，它們的長期使用與副作用存在關(guān)聯(lián)，諸如鎮(zhèn)靜、產(chǎn)生耐藥性、濫用傾向和戒斷癥狀(Nutt等人，上文；Bandelow等人，上文；Baldwin等人，上文)。目前，將抗抑郁藥的選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑類用作大多數(shù)焦慮障礙的一線治療。然而，這類藥物也具有缺點(diǎn)。具體地講，治療性作用起效緩慢，因而需要若干周的治療才能發(fā)揮抗焦慮效果(Nutt等人，上文；Bandelow等人，上文；Baldwin等人，上文)。因此，仍然需要具有快速的治療性作用但沒有不合宜效果的抗焦慮化合物。
[0005]大量的天然化合物不僅提供了有用的藥理學(xué)工具(Furukawa等人1993.J.Biol.Chem.268:26026-26031)，還提供了藥物開發(fā)的潛在治療性先導(dǎo)化合物(Liu, J.1993.Trends Pharmacol.Sc1.14:182-188)。苗是一類具有α，β - 二苯乙烯核心結(jié)構(gòu)的植物化學(xué)物質(zhì)。芪已在大量不相關(guān)的植物屬中得到了報(bào)道，包括葡萄、花生和越橘(Vaccinium)漿果(Chong等人2009.Plant Sc1.177:143-155)。白藜蘆醇(一種得到廣泛研究的芪)據(jù)報(bào)道在許多生物系統(tǒng)中發(fā)揮抗氧`化、抗炎、化學(xué)預(yù)防和抗老化效果(Aggarwal等人 2004.Anticancer Res.24:2783-2840;Baur 和 Sinclair.2006.Nat.Rev.DrugDisc0.5:493-506; Bishayee, A.2009.Cancer Prev.Res.2:409-418)。最近，存在于某些越橘漿果諸如藍(lán)莓和鹿莓中的紫檀芪(白藜蘆醇的一種天然類似物)(Rimando等人2004.J.Agric.Food Chem.52:4713-4719)因具有多種多樣的效果(如白藜蘆醇顯示出的那些效果)已受到了廣泛的關(guān)注。紫檀芪具有鎮(zhèn)痛、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、降血脂和癌癥化學(xué)預(yù)防特性(Amarnath Sateesh 和 Par1.2006.J.Pharm.Pharmacol.58:1483-1490;Remsberg等人 2008.Phytotherapy Res.22:169-179;Rimando 等人 2002.J.Agric.FoodChem.50:3453-3457; Rimando 等人 2005.J.Agric.Food Chem.53:3403-3407)。紫檀芪還對結(jié)腸癌發(fā)展(Paul等人2009.Cancer Prev.Res.2:650-657)、侵襲和轉(zhuǎn)移(Pan等人2009.Carcinogenesis30:1234-1242)以及在逆轉(zhuǎn)老齡大鼠認(rèn)知缺陷(Jos印h等人2008.J.Agric.Food Chem.56:10544-10551)方面具有明顯的效果。然而，紫檀芪的抗焦慮潛力尚未得到研究。
[0006]許多天然化合物(包括芪)與不同信號傳導(dǎo)通路中涉及到的蛋白激酶相互作用，諸如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)加氧酶-2(C0X-2)和p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)(Paul等人2009，上文)。公認(rèn)的是，胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2 (ERK1/2) (MAPK家族的成員)在許多細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，包括神經(jīng)元(Hetman和Gozdz.2004.Eur.J.Biochem.271:2050-2055)。越來越多的證據(jù)表明，ERK信號傳導(dǎo)通路在多種刺激下得以活化(Davis, R.J.1993.J.Biol.Chem.268:14553-14556;Hetman 和 Gozdz,上文)，包括暴露于應(yīng)激下(Gerrits等人2006.Neurosciencel42:1293-1302)。此外，據(jù)推測，海馬體和外側(cè)杏仁核中的ERK信號傳導(dǎo)通路在焦慮中發(fā)揮著作用(Paul等人2007.Biol.Psychiatry61:1049-1061;Tronson 等人 2007.Neuropsychopharmacol.133:1570-1583)。這一見解通過磷酰化ERK水平在焦慮期間明顯升高的發(fā)現(xiàn)結(jié)果進(jìn)一步鞏固。因此，ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能在焦慮中發(fā)揮著重要作用，并且其抑制可能產(chǎn)生抗焦慮效果(Ailing等人2008.J.Psychiatr.Res.43:55-63)。
[0007]因此，鑒于信號傳導(dǎo)通路在焦慮中的作用以及對可用于治療焦慮的藥劑的需要，本工作的目標(biāo)是確定紫檀芪作為抗焦慮抑制劑的效果。
發(fā)明概要
[0008]我們研究了紫檀芪作為焦慮抑制劑的性質(zhì)并且確定了紫檀芪可用作抗焦慮劑。
[0009]根據(jù)該發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的目標(biāo)是提供通過施用治療有效劑量的紫檀芪、其藥學(xué)上可接受的鹽或異構(gòu)體而治療、緩解或預(yù)防對其有需要的受試者的焦慮的方法。
[0010]本發(fā)明的另一部分是試劑盒，其包含含有紫檀芪的藥物組合物；和試劑盒使用說明。
[0011]本發(fā)明的其他目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)將通過接著的說明變得顯而易見。
[0012]附圖簡述
[0013]圖1顯示了紫檀芪的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0014]圖2A和2B顯示了經(jīng)口施用紫檀芪對高架十字迷宮(EPM)測試中的行為的影響。在為時(shí)5分鐘的EPM上測試前60分鐘，將雄性Swiss Webster小鼠通過口服強(qiáng)飼法注射了媒介物或紫檀芪(l-10mg/kg)。測量了行進(jìn)距離百分比、所花時(shí)間百分比以及開放臂(圖2A)和封閉臂(圖2B)(分別為OA和EA)進(jìn)入次數(shù)。每個(gè)豎條代表平均值土SEM。n=6_10只/劑量。與媒介物對照相比，*P〈0.05，**p〈0.01 (單因素方差分析，然后為Dunnett檢驗(yàn))。
[0015]圖3示出了腹膜內(nèi)(1.p)施用安定對高架十字迷宮測試中行為的影響。在為時(shí)5分鐘的EPM上測試前30分鐘，將雄性Swiss Webster小鼠通過腹膜內(nèi)注射了媒介物或安定(0.5-2mg/kg)。測量了行進(jìn)距離百分比、所花時(shí)間百分比以及開放臂(圖3A)和封閉臂(圖2B)(分別為OA和EA)進(jìn)入次數(shù)。每個(gè)豎條代表平均值土SEM。n=6_10只/劑量。與媒介物對照相比，**p<0.01 (單因素方差分析,然后為Dunnett檢驗(yàn))。
[0016]圖4示出了經(jīng)口施用紫檀芪對小鼠自主活動(dòng)的影響。在為時(shí)5分鐘的高架十字迷宮上測試前60分鐘，將雄性Swiss Webster小鼠通過口服強(qiáng)飼法注射了媒介物或紫檀芪(l-10mg/kg)。以每個(gè)室的總中斷數(shù)評估了自發(fā)活動(dòng)。每個(gè)豎條代表平均值土SEM。n=8-10只/劑量。[0017]圖5A和5B示出了經(jīng)口施用紫檀芪對海馬體中ERKI/2磷?；挠绊憽D5A顯示了在EPM后立即處死的小鼠的磷?；疎RK1/2水平的代表性數(shù)據(jù)。圖5B顯示了在訓(xùn)練后立即處死的小鼠的ERK1/2磷?；兓墓饷芏确治?。值表示為至少三只動(dòng)物的平均值土SEM。與媒介物對照相比，*P〈0.05, **p〈0.01 (單因素方差分析,然后為Dunnett檢驗(yàn))。
[0018]圖6示出了經(jīng)口施用紫檀芪對小鼠海馬體中Akt磷酰化的影響。在高架十字迷宮測試后立即處死的小鼠的磷?；疎RK1/2水平的代表性數(shù)據(jù)。在通過磷?；疉kt特異性抗體(Ser473)探查后，將印跡用抗β _肌動(dòng)蛋白抗體再次探查。
[0019]發(fā)明詳述
[0020]與白藜蘆醇相似，紫檀芪也產(chǎn)生多種藥理學(xué)活性。我們現(xiàn)在的工作是對紫檀芪所報(bào)道的一系列健康有益特性的補(bǔ)充；在此，我們首次證實(shí)其抗焦慮效果。在本研究中，在經(jīng)典的動(dòng)物焦慮模型高架十字迷宮(EPM)(抗焦慮評估的行為模型)上研究了紫檀芪的抗焦慮效果。EPM測試被視為得到最廣泛驗(yàn)證的用于檢測分析新型抗焦慮劑的測試法之一(Pellow 等人 1985.J.Neurosc1.Methodsl4:149-167;Hogg, S.1996.Pharmacol.Biochem.Behav.54:21-30)。將安定(最常用的抗焦慮化合物之一)在本研究中用作陽性對照。鑒于嚙齒類動(dòng)物顯示出的在驅(qū)使探索新環(huán)境與害怕開放高架位置之間的矛盾，EPM是大量研究人員采用的廣泛使用的焦慮模型(Pellow等人，上文；Hogg，上文)。據(jù)提議，嚙齒類動(dòng)物的正常探索行為更傾向于高架十字迷宮模型中迷宮的封閉臂，并且對引起焦慮的開放臂的厭惡是 EPM 模型的基礎(chǔ)(Pellow 等人，上文;Ohl1F.2003.Clin.Neruosc1.Res.3:233-238)。許多證據(jù)已確立，施用抗焦慮化合物降低對開放臂的天生厭惡并促進(jìn)其探索(Pellow等人，上文；Hogg,上文)ο
[0021]在我們的研究中，我們還在向小鼠經(jīng)口施用化合物后測定了紫檀芪的血漿和組織水平。紫檀芪的血漿水平隨著劑量而升高，并且觀察到了紫檀芪海馬體水平的相應(yīng)升高(參見實(shí)驗(yàn)5)。以研究對蛋白激酶調(diào)控的影響以及闡明潛在的紫檀芪作用機(jī)理為進(jìn)一步的目標(biāo)，測量了小鼠海馬體中磷?；疎RK1/2的變化。
[0022]紫檀芪在lmg/kg和2mg/kg劑量下表現(xiàn)出抗焦慮作用:作為關(guān)鍵決定因素并視為與焦慮相關(guān)的百分比開放臂滯留時(shí)間(permanence Time in Open ^rms, ΡΤ0Α)和開放臂進(jìn)入次數(shù)(Number of Entries in Open Arms, ΝΕ0Α)在限定的低劑量下增加(參見實(shí)施例2)。紫檀苗還能夠在lmg/kg和2mg/kg兩種劑量下增加百分比開放臂行進(jìn)距離(XraveledDistance in Open Arms, TD0A) ?然而，較高的劑量(5mg/kg和lOmg/kg)未顯示出任何抗焦慮效果；相反，較高的劑量具有增加對開放臂的厭惡的趨勢，即較高的劑量為致焦慮的。紫檀芪的抗焦慮活性通過以下發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí):百分比封閉臂行進(jìn)距離(IraveledDistance in the Enclosed Arms, TDEA)和百分比封閉臂滯留時(shí)間(Permanence Time inthe Enclosed Arms, PTEA)也在用lmg/kg和2mg/kg紫檀苗處理時(shí)縮短。另外,紫檀苗的抗焦慮活性與安定非常相似。2mg/kg的紫檀芪顯示出與2mg/kg安定至少在EPM中相當(dāng)?shù)男ЧＪ褂冒捕ㄗ鳛殛栃詫φ找蚨M(jìn)一步證實(shí)了紫檀芪在EPM行為典范中的抗焦慮潛力。封閉臂進(jìn)入次數(shù)(Number of Entries in the Enclosed Arms, NEEA)(由于其獨(dú)立于 NEOA和PTOA而變化，是自主活動(dòng)的完美度量)在用于本實(shí)驗(yàn)的劑量范圍內(nèi)無變化。值得一提的是，紫檀芪的母體分子白藜蘆醇在3mg/kg和20mg/kg的劑量下測試時(shí)不具有任何抗焦慮效果(Patisaul 等人 2009.Hormones and Behavior55:319-328)。[0023]對動(dòng)物的自主活動(dòng)進(jìn)行了評估以證實(shí)在較低的劑量(lmg/kg和2mg/kg)下紫檀芪的抗焦慮活性不是化合物對動(dòng)物活動(dòng)度抑制作用的繼發(fā)結(jié)果。在較高劑量(5mg/kg和10mg/kg)下不存在抗焦慮效果不是因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)損傷。因此，未記錄到刺激或抑制作用，從而表明所觀察到的抗焦慮效果為假陽性的可能性極低。
[0024]除了 EPM和自主活動(dòng)測試外，我們還通過研究在焦慮中發(fā)揮作用的蛋白表達(dá)關(guān)注于能夠解釋所觀察到的紫檀芪抗焦慮樣作用的分子底物。在Western印跡研究中所得的結(jié)果顯示出在用在EPM中證實(shí)了抗焦慮效果的那些低劑量(lmg/kg和2mg/kg)紫檀苗處理的動(dòng)物的海馬體中磷酰化ERKl水平的顯著降低。也觀察到了相同劑量下海馬體中ERK2的磷?；癄顟B(tài)的輕度降低。重要的是，較高的劑量(5mg/kg和10mg/kg)不能導(dǎo)致ERK1/2磷?；癄顟B(tài)的任何變化與在相同劑量下在EPM中觀察到的化合物無抗焦慮效果一致。此外，Akt家族中的三種基因(Aktl、Akt2和Akt3)編碼為絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶家族(EC2.7.11.1)成員的酶，并且我們的分析表明在動(dòng)物的海馬體中磷?；疉kt水平無變化。因此，我們的結(jié)果表明，紫檀芪的抗焦慮作用與其降低小鼠海馬體中ERK活性的能力之間存在關(guān)聯(lián)。其他研究已表明，紫檀芪阻斷RAW264.7細(xì)胞中ERK1/2的活化(Pan等人2008.J.Agric.Food Chem.56:7502-7509)。我們的研究首次在活體內(nèi)證實(shí)了特定低劑量的紫檀芪下調(diào)ERK1/2的活化。
[0025]最近的報(bào)道指出，在不同腦區(qū)域(包括海馬體和前額皮質(zhì)(PFC))中pERK的水平在焦慮期間顯著升高，并且其受到抑制能夠產(chǎn)生抗焦慮樣作用(Ailing等人，上文；Martinez 等人 2009.Pharmacol.Biochem.Behav.92:291-296)。這一事實(shí)與綠茶多酚類化合物表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯在小鼠中急性施用后觀察到的抗焦慮樣活性一致(Vignes等人2006.Brain Res.1110:102-115)，并且該化合物還具有降低ERKI/2磷?；癄顟B(tài)的能力(Chung 等人，2001.FASEB J.15:2022-2024; Sah 等人 2004.J.Biol.Chem.279:12755-12762)。此外，據(jù)報(bào)道，pERKl/2的持續(xù)性核聚集被稱為具有危害性后果的事件(Colucc1-D，Amato等人2002.Bioessays25:1085-1095)。在慢性應(yīng)激后增強(qiáng)的PERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過在邊緣結(jié)構(gòu)施用環(huán)狀17 β -雌二醇而阻止，這可避免復(fù)發(fā)性應(yīng)激的危害性后果(Gerrits等人，上文)。更鼓舞人心地，使用MEK抑制劑抑制ERK通路還顯示出對多種器官損害的治療性效果(Otani等人2007.J.Clin.Neurosc1.14:42-48)。
[0026]腦含有可潛在改變MAP激酶磷酰化的多種受體(如NMDA、GABA)和離子通道。證實(shí)通過NMDA受體活化MAP激酶的研究已有充分的記載(Xia等人1996.J.Neurosc1.16:5425-5436; Orban 等人 1999.Trends Neurosc1.22:38-44)。另外，多項(xiàng)研究涉及作為GABA受體功能負(fù)調(diào)節(jié)子的ERK/MAPK通路(Bel1-Horner等人2006.J.Neurobiol.66:1467-1474)。ERK1/2磷酰化的降低由NMDA受體阻斷還是由GABA受體活化介導(dǎo)是我們正在進(jìn)行的研究的課題。
[0027]鑒于在較高劑量下紫檀芪不明顯改變自主活動(dòng)或?qū)е旅黠@的減少，有人可能會(huì)爭論為什么該化合物在較高的劑量下不能在EPM測試中表現(xiàn)出任何抗焦慮樣作用。在嚙齒類動(dòng)物探索新環(huán)境(EPM在這里即為新環(huán)境)時(shí)，工作記憶緩沖區(qū)的容量可開始至少部分地發(fā)揮作用，即便EPM不純粹是行為典范?？臻g學(xué)習(xí)對于動(dòng)物認(rèn)識EPM中的開放臂和封閉臂位置也具有重要意義，并且獲取空間信息取決于海馬體功能(Olton和Papas.1979.Neuropsychologial7:669-682)。因此,可能的是,初始EPM經(jīng)驗(yàn)可能與時(shí)間相關(guān)地改變小鼠在相同迷宮場景中接下來的行為。此外，高劑量紫檀芪(10mg/kg)能夠改善認(rèn)知表現(xiàn)，尤其是大鼠中的空間記憶(Jos印h等人，上文)。實(shí)際上，我們在研究中發(fā)現(xiàn)，在10mg/kg的劑量下，紫檀芪的水平為1.1217ng/海馬體(表2)，這與上文Jos印h等人報(bào)道的相似。因此，可合理推測，同時(shí)作用于記憶通路的高劑量(5和10mg/kg)下的紫檀芪可能提高了小鼠工作記憶緩沖區(qū)的容量，從而在它們最初暴露于EPM中的開放臂后限制它們對引起應(yīng)激的、厭惡性開放臂的探索行為。這一見解通過以下發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步加強(qiáng):高劑量下的紫檀芪與低劑量相比增加了海馬體中磷酰化ERK的水平，從而表明提高的pERK水平可在增大工作記憶緩沖區(qū)中發(fā)揮了作用。
[0028]我們的結(jié)果首次證實(shí)了作為藍(lán)莓組分的紫檀芪在小鼠高架十字迷宮測試中顯示出抗焦慮樣作用。另外，較高劑量的紫檀芪在EPM和自主活動(dòng)監(jiān)測室中未顯示出任何鎮(zhèn)靜趨勢，從而表明化合物的良性副作用特征。化合物的抗焦慮活性伴有動(dòng)物海馬體中ERK1/2磷?；南抡{(diào)。然而，還需要將來的研究以更好地理解紫檀芪下調(diào)ERK磷酰化的機(jī)理。
[0029]本發(fā)明的化合物因此具有治療、緩解或預(yù)防對其有需要的受試者的焦慮的用途。在一個(gè)特殊實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物被視為可用于治療、預(yù)防或緩解焦慮障礙，諸如具有或不具有廣場恐怖癥的驚恐障礙、不具有驚恐障礙史的廣場恐怖癥、動(dòng)物及其他恐懼癥(包括社交恐懼癥)、強(qiáng)迫性精神障礙和廣泛性或藥物誘發(fā)型焦慮障礙；應(yīng)激障礙，包括創(chuàng)傷后和急性應(yīng)激障礙；睡眠障礙；記憶障礙；神經(jīng)癥;驚厥性疾患，例如癲癇、痙攣、抽搐或兒童高熱驚厥；偏頭痛；情緒障礙；抑郁或雙極障礙，例如抑郁、首發(fā)或復(fù)發(fā)性大抑郁障礙、輕郁癥、雙極障礙、雙極I及雙極II型躁郁癥、和循環(huán)性情緒障礙、精神病性障礙，包括精神分裂癥；由腦缺血引起的神經(jīng)變性；注意力缺陷多動(dòng)障礙；疼痛和傷害感受，例如神經(jīng)性疼痛；嘔吐，包括急性、延遲性和預(yù)期性嘔吐，尤其是因化療或輻射引起的嘔吐；暈動(dòng)病、術(shù)后惡心及嘔吐；進(jìn)食障礙，包括神經(jīng)性厭食癥和暴食癥；經(jīng)前期綜合征；神經(jīng)痛，例如三叉神經(jīng)痛；肌肉痙攣或強(qiáng)直狀態(tài)，例如在截癱患者中；藥物濫用或依賴的影響，包括戒酒；認(rèn)知障礙，諸如阿爾茨海默??；腦缺血、中風(fēng)、頭部外傷；耳鳴；以及生理節(jié)律障礙，例如在遭受時(shí)差或倒班影響的受試者中。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的含有紫檀`芪或藥學(xué)上可接受的紫檀芪鹽的組合物可通過用于共混及混合化合物的常規(guī)程序而制備。優(yōu)選地，組合物還包含賦形劑，最優(yōu)選藥學(xué)賦形劑。包含賦形劑并結(jié)合了紫檀芪的組合物可通過本領(lǐng)域已知的程序制備。例如，可將紫檀芪配制成片劑、膠囊劑、散劑、混懸劑、經(jīng)口施用溶液劑和腸胃外施用溶液劑(包括靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、肌內(nèi)和皮下施用)，以及配制成涂敷到貼片上以與常見的常規(guī)載體、粘結(jié)劑、稀釋劑和賦形劑一起透皮應(yīng)用的溶液。
[0031]雖然可將用于治療的本發(fā)明的化合物以原始化合物的形式施用，但是優(yōu)選的是，將活性成分(優(yōu)選地以生理上可接受的鹽的形式)與一種或多種佐劑、賦形劑、載體、緩沖劑、稀釋劑和/或其他通常的藥學(xué)助劑一起引入藥物組合物中。
[0032]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供藥物組合物，該藥物組合物包含與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體以及任選地本領(lǐng)域已知的并用于本領(lǐng)域的其他治療性和/或預(yù)防性成分一起的本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物。從與配方的其他成分相容并且對其受體無害的意義上講，載體必須是“可接受的”。
[0033]本發(fā)明的藥物組合物可以是適于經(jīng)口、直腸、支氣管、鼻腔、肺、局部(包括頰面和舌下)、經(jīng)皮、陰道或腸胃外(包括皮膚、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、大腦內(nèi)、眼內(nèi)注射或輸注)施用的那些，或以適于通過吸入或吹入而施用(包括粉末和液體氣溶膠施用或通過持續(xù)釋放體系施用)的劑型的那些。持續(xù)釋放體系的合適實(shí)例包括含有本發(fā)明化合物的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，該基質(zhì)可以為成型制品的形式，例如膜或微囊。
[0034]因此，與常規(guī)佐劑、載體或稀釋劑一起的本發(fā)明化合物可置于藥物組合物的劑型和其單位劑型中。此類劑型包括固體劑型，具體地講，片劑、充填膠囊劑、散劑和顆粒劑；以及液體劑型，具體地講，均供經(jīng)口使用的水性或非水性溶液劑、混懸劑、乳劑、酏劑和充填液體的膠囊劑，供直腸給藥的栓劑，以及供腸胃外使用的無菌注射用溶液劑。此類藥物組合物及其單位劑型可包含常規(guī)比例的常規(guī)成分，具有或不具有另外的活性化合物或組成部分，并且此類單位劑型可包含與要采用的預(yù)期每日劑量范圍相應(yīng)的任何適當(dāng)有效量的活性成分。
[0035]本發(fā)明的化合物可以多種經(jīng)口和腸胃外劑型施用。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員將顯而易見的是，以下劑型可包含作為活性組分的本發(fā)明化合物或本發(fā)明化合物的藥學(xué)上可接受的鹽。
[0036]對于由本發(fā)明的化合物制備藥物組合物，藥學(xué)上可接受的載體可以是固體或液體。固體制劑包括散劑、片劑、丸劑、膠囊劑、扁囊劑、栓劑和分散性顆粒劑。固體載體可以是一種或多種也可用作稀釋劑、矯味劑、增溶劑、潤滑劑、助懸劑、粘結(jié)劑、防腐劑、片劑崩解劑或包封材料的物質(zhì)。
[0037]在散劑中，載體是細(xì)分的固體，其與細(xì)分的活性組分一起處于混合物中。在片劑中，將活性成分與合適比例 的具有必要粘結(jié)能力的載體混合，然后以所需的形狀和大小壓片。
[0038]散劑和片劑優(yōu)選地包含5%或10%至約70%的活性化合物。合適的載體為碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、果膠、糊精、淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點(diǎn)蠟、可可油等。術(shù)語“制劑”旨在包括活性化合物與包封材料(作為提供膠囊的載體)的配方，在膠囊中含或不含載體的活性組分被載體圍繞，載體因而與活性組分相聯(lián)系。相似地，也包括扁囊劑和錠劑。片劑、散劑、膠囊劑、丸劑、扁囊劑和錠劑可用作適合經(jīng)口施用的固體劑型。
[0039]液體制劑包括溶液劑、混懸劑和乳劑，例如水或水-丙二醇溶液劑。例如，腸胃外注射用液體制劑可在水性丙二醇溶液中配制成溶液劑。根據(jù)本發(fā)明的化合物可因此配制成供腸胃外施用(例如通過注射，例如推注或連續(xù)輸注)并可以單位劑型與外加的防腐劑一起存在于安瓿、預(yù)充注射器、小容量注射液中或存在于多劑量容器中。組合物可呈諸如油性或水性媒介物中的混懸劑、溶液劑或乳劑的劑型，并可包含諸如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑的配方劑。作為另外一種選擇，活性成分可以為通過無菌固體的無菌分裝或通過溶液的凍干而得到的粉末形式，以在使用前通過合適的媒介物例如無菌、無熱原水復(fù)溶。
[0040]適于經(jīng)口使用的水溶液可通過將活性成分溶于水并根據(jù)需要添加合適的著色劑、矯味劑、穩(wěn)定劑和增稠劑而制備。適于經(jīng)口使用的水性混懸劑可通過將細(xì)分的活性組分與粘稠材料諸如天然或合成膠、樹脂、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉或其他熟知的助懸劑一起分散在水中而制備。
[0041]對于向表皮局部施用，可將本發(fā)明的化合物配制成膏劑、霜?jiǎng)┗蛳匆?，或配制成透皮貼片。膏劑和霜?jiǎng)┛衫缤ㄟ^添加合適的增稠劑和/或膠凝劑由水性或油性基料配制而成。洗液可通過水性或油性基料配制而成并且通常還將包含一種或多種乳化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、助懸劑、增稠劑和/或著色劑。
[0042]適于在口腔局部施用的組合物包括在矯味基料(通常為蔗糖和阿拉伯樹膠或黃蓍膠)中包含活性劑的錠劑；在惰性基料(諸如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯樹膠)中包含活性成分的錠劑(pastilles);以及在合適的液體載體中包含活性成分的漱口水。
[0043]溶液劑或混懸劑可通過常規(guī)裝置(例如通過點(diǎn)滴器、吸管或噴霧器)直接應(yīng)用于鼻腔。組合物可以單劑量或多劑量形式提供。在旨在用于呼吸道施用的組合物(包括鼻內(nèi)給藥組合物)中，化合物將通常具有較小的粒度，例如約5微米或更小。這樣的粒度可通過本領(lǐng)域已知的方式例如通過微粉化而獲得。
[0044]藥物制劑優(yōu)選地為單位劑量形式。在這種形式中，將制劑分成含有適量活性組分的單位劑量。單位劑量形式可以是包裝好的制劑，而包裝則含有制劑的離散量，諸如包裝好的片劑、膠囊劑以及小瓶或安瓿中的粉末。另外，單位劑量形式可以是膠囊劑、片劑、扁囊劑或錠劑本身，或者其可以為包裝形式的合適數(shù)量的任何這些制劑。
[0045]供經(jīng)口施用的片劑、膠囊劑和錠劑以及供靜脈內(nèi)施用和連續(xù)輸注的液體是優(yōu)選的組合物。應(yīng)用到鼻腔或呼吸道的溶液劑或混懸劑是優(yōu)選的組合物。供表皮局部施用的透皮貼片是優(yōu)選的。
[0046]有關(guān)配方和施用的進(jìn)一步詳細(xì)信息可見于最新版的Remington’sPharmaceutical Sciences(Maack Publishing C0.，Easton, PA)。
[0047]在本發(fā)明的另一方面，提供治療、預(yù)防或緩解對其有需要的受試者的焦慮的方法，并且該方法包括向?qū)ζ溆行枰倪@樣的受試者(包括人)施用有效量的本發(fā)明的紫檀芪。
[0048]治療有效劑量是指改善癥狀或病狀的活性成分的量。療效和毒性(例如ED5tl和LD50)可通過在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中`的標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)程序加以測定。治療性與毒性效應(yīng)之間的劑量比率是治療指數(shù)，并可以通過比率LD5(i/ED5(i表示。表現(xiàn)出具有大治療指數(shù)的藥物組合物是優(yōu)選的。
[0049]根據(jù)本發(fā)明使用的化合物的劑量取決于化合物和進(jìn)行治療的病狀。接受患者的年齡、瘦體重、總體重、體表面積和臨床病狀；以及施行治療的臨床醫(yī)生或從業(yè)者的經(jīng)驗(yàn)和判斷都屬于影響所選劑量的因素。其他因素包括施用途徑、患者病史、病程嚴(yán)重性和特定化合物的效能。劑量應(yīng)當(dāng)足以改善所治療疾病的癥狀或體征，而不會(huì)對患者產(chǎn)生不可接受的毒性。劑量可通過將劑量針對本發(fā)明的特定情況加以調(diào)整以產(chǎn)生所需治療性效果而變化。
[0050]藥物劑量從動(dòng)物研究適當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)化到人類研究(人體等效劑量，HED)通過使用體表面積(BSA)歸一化方法獲得。動(dòng)物和人類的劑量相互關(guān)系(基于每平方米體表面的毫克數(shù))由 Reagan-Shaw 等人(2007.FASEB J.22:659-661)進(jìn)行了描述。通過對 BSA(mg/m2)的歸
一化從動(dòng)物劑量到人類劑量的劑量轉(zhuǎn)化公式為:
[0051]
HED (mg/kg) ^ ___量_9_》χ


人失氏.H
[0052]其中將K111因子(體重(kg)除以BSA(m2))用于將用在動(dòng)物研究中的mg/kg劑量轉(zhuǎn)化成mg/m2。小鼠的Km因子為3,而人類的Km因子為37。表格(表1，Reagan-Shaw等人，上文)列出了基于得自FDA指南的數(shù)據(jù)而為若干動(dòng)物物種計(jì)算出的Km因子。
[0053]紫檀芪以足以治療、緩解或預(yù)防對其有需要的受試者的焦慮的量存在于組合物中。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，紫檀芪以足以單獨(dú)地治療、緩解或預(yù)防焦慮的量存在于組合物中?；钚猿煞挚稍谝惶旆忠粋€(gè)或多個(gè)劑量施用。令人滿意的結(jié)果在某些情況下可在低至0.0405mg/kg的口服人體等效劑量(HED)的劑量下或?qū)τ?0kg的人類患者約3mg/天的口服劑量下至對于60kg的人類患者約15mg/天的口服劑量下獲得。鑒于紫檀芪具有約2小時(shí)的半衰期，對于所述人類患者而言，合適的范圍可以為約IOmg/天口服至約IOOmg/天口服。
[0054] 本發(fā)明設(shè)想，合適的劑量范圍對于人類患者而言為每天lO-lOOmg，照常取決于精確的施用模式、施用的劑型、施用的適應(yīng)癥、涉及的受試者和涉及的受試者的體重及體表面積，另外還有所負(fù)責(zé)的醫(yī)生或獸醫(yī)的偏好和經(jīng)驗(yàn)。當(dāng)聯(lián)合用于治療疾病的本領(lǐng)域已知的化合物施用時(shí)，可以降低給藥方案。
實(shí)施例
[0055]現(xiàn)在已對本發(fā)明進(jìn)行了大體描述，而通過參考某些具體實(shí)施例將能更好地理解本發(fā)明，這些實(shí)施例包括在本文中只是為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明而不旨在限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將由權(quán)利要求書加以限定。
[0056]實(shí)施例1
[0057]紫檀芪
[0058]如前人所述合成了紫檀芪(Jos印h等人，上文)。簡而言之，紫檀芪通過3，5-二甲氧基苯甲醛和4-羥基苯乙酸在乙酸酐和三乙胺中的縮合而合成。將反應(yīng)混合物在氮?dú)夥諊录訜?150°C)并連續(xù)攪拌。20h后，停止反應(yīng)，冷卻到室溫，將濃鹽酸(5mL)加入。沉淀形成，將沉淀溶于50mL氯仿，然后用10%氫氧化鈉水溶液萃取。將水性萃取物用濃鹽酸酸化到PH1，攪拌至少6h，得到中間產(chǎn)物α-[(3，5_ 二甲氧基苯基)亞甲基]_4_羥基-(α Ζ)苯乙酸的沉淀。將該中間產(chǎn)物與1.(^銅在101^喹啉中加熱(2001:，611，氮?dú)庀?。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫并過濾。向?yàn)V液中加入5Ν鹽酸(25mL)，攪拌lh，然后用氯仿萃取。將含有不純紫檀苗的氯仿萃取物通過快速層析在Horizon HPFC系統(tǒng)(Biotage, Inc.，Charlottesville,VA)上純化，其中使用硅膠柱和乙酸乙酯:己烷溶劑體系(從15:85至100%乙酸乙酯的線性梯度)。將含有純紫檀芪的餾分合并，真空濃縮。將紫檀芪在己烷中重結(jié)晶，通過其光譜數(shù)據(jù)(UV、質(zhì)譜和核磁共振光譜)確認(rèn)了其結(jié)構(gòu)(圖1)。
[0059]將紫檀苗以lmg/kg與10mg/kg體重之間的劑量溶于氫化蓖麻油(cremophor)、乙醇和鹽水(1:1:18)混合物中。在行為測試前l(fā)h，將10mL/kg的體積經(jīng)口施用。
[0060]實(shí)施例2
[0061 ] 紫檀芪在鼠高架十字迷宮行為研究中的作用
[0062]將測試時(shí)體重為24_30g的八周齡雄性Swiss Webster小鼠(Harlan, IN, USA)用于所有研究。將動(dòng)物五只一組關(guān)在籠中，隨意提供食物和水，維持在12:12h的光暗循環(huán)下。隨機(jī)選擇所有小鼠用于每個(gè)處理組。關(guān)養(yǎng)、處理和實(shí)驗(yàn)程序得到了 University ofMississippi 的 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)的批準(zhǔn)，并遵守National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals 的規(guī)范。
[0063]對于高架十字迷宮(EPM)研究而言，EPM設(shè)備由兩個(gè)開放臂(30X5cm)和兩個(gè)封閉壁(30X5cm,壁高15cm)組成,這些臂從共同的中央平臺(5X5cm)延伸。該構(gòu)造形成了十字符號的形狀，類似的臂彼此相對布置。設(shè)備高于地面50cm。
[0064]將動(dòng)物(n=6-10只/組)在紫檀芪或安定處理前在EPM室中馴化30分鐘。雖然紫檀芪經(jīng)口給予，但安定卻經(jīng)腹膜內(nèi)(1.p.)施用。在分別通過口服強(qiáng)飼法和1.p.完成紫檀芪或安定施用后，分別讓小鼠呆在相同的室中60分鐘和30分鐘，然后進(jìn)行EPM試驗(yàn)。之后，將小鼠單獨(dú)地置于設(shè)備的中心，面向開放臂，讓其自由探索5分鐘。測量了開放臂行進(jìn)距離(TDOA)、封閉臂行進(jìn)距離(TDEA)、開放臂滯留時(shí)間(PTOA)、封閉臂滯留時(shí)間(PTEA)、開放臂進(jìn)入次數(shù)(NEOA)和封閉臂進(jìn)入次數(shù)(NEEA);即使用計(jì)算機(jī)輔助視頻跟蹤系統(tǒng)(San DiegoInstruments, CA, USA)對行進(jìn)距離的百分比、和花在開放臂及封閉臂上的時(shí)間、以及開放臂及封閉臂進(jìn)入次數(shù)進(jìn)行了定量。在每次試驗(yàn)后，將迷宮用玻璃清潔劑擦干凈并干燥。當(dāng)小鼠的所有四只爪子均在臂中時(shí)，記錄為一次臂進(jìn)入。花在開放臂中的時(shí)間的百分比和開放臂進(jìn)入次數(shù)被視為焦慮的關(guān)鍵決定因素和純粹度量(Hogg，上文)。
[0065]在這里，我們首次證實(shí)了紫檀芪在EPM中(圖1)劑量依賴性地顯示出具有抗焦慮樣作用?？菇箲]作用在lmg/kg的化合物劑量下是明顯的，在2mg/kg下達(dá)到最大值，然后在5mg/kg和10mg/kg劑量下減弱。當(dāng)與對照(Omg/kg)相比時(shí),紫檀苗顯著增大了與抗焦慮樣效果相關(guān)的所有參數(shù):％開放臂行進(jìn)距離(TDOA) [F(4, 43)=3.056，p < 0.05]、％開放臂滯留時(shí)間(PTOA) [F(4, 43)=2.657，p < 0.05]和開放臂進(jìn)入次數(shù)(NEOA) [F(4, 43)=4.257，p<0.01](圖2A)。另外，紫檀芪顯示出與焦慮相關(guān)的封閉臂中參數(shù)的降低趨勢，諸如％封閉臂行進(jìn)距離(TDEA)、％封閉臂滯留時(shí)間(PTEA)以及封閉臂進(jìn)入次數(shù)(NEEA)(圖2B)。因此，通過2mg/kg的劑量獲得了最大抗焦慮活性。10mg/kg的最高劑量無效。
[0066]通常，當(dāng)動(dòng)物向某一臂跨過某一閾值時(shí)，計(jì)為臂進(jìn)入和退出(Hogg，上文)。在我們的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)小鼠的所有四只爪`子都在臂中時(shí)，記錄為臂進(jìn)入。因此，可能的是，小鼠處于既不是迷宮的開放部分也不是封閉部分的中央方形區(qū)。在我們的記錄中，我們將中央?yún)^(qū)視為與開放臂和封閉臂均分離，從而產(chǎn)生更精確并表示真實(shí)抗焦慮效果的結(jié)果。
[0067]實(shí)施例3
[0068]紫檀芪在鼠自發(fā)活動(dòng)行為研究中的影響
[0069]為了測量自發(fā)活動(dòng),將成年Swiss Webster小鼠(n=8_10只/組)通過口服強(qiáng)飼法施用了紫檀芪。然后將每只小鼠置于自主活動(dòng)室內(nèi)，在樹脂玻璃(Plexiglas)外殼中馴化30分鐘。30分鐘的馴化期后，使用自動(dòng)化活動(dòng)監(jiān)測系統(tǒng)(San Diego Instruments, CA, USA)測量了 30分鐘的自主活動(dòng)。將總活動(dòng)表示為每個(gè)室16個(gè)電池光子束的總中斷數(shù)。
[0070]為了闡明對自發(fā)活動(dòng)的影響，我們在以lmg/kg與10mg/kg之間劑量的紫檀芪處理后測量了動(dòng)物的自主活動(dòng)(圖3)。單因素方差分析表明藥物處理對自主活動(dòng)物明顯的影響。事后比較表明自發(fā)活動(dòng)不受最大抗焦慮劑量的紫檀芪的影響。最高的劑量對動(dòng)物的自主活動(dòng)無任何影響。
[0071]實(shí)施例4
[0072]Western印跡分析:血液和組織
[0073]在EPM試驗(yàn)后，在肝素化采血瓶中通過下頜下靜脈穿刺從每只小鼠采集了血樣。然后將小鼠處死，迅速摘除腦。將它們的前額皮質(zhì)(PFC)和海馬體在冰上解剖出來,然后立即置于液氮中，在-80 V下儲(chǔ)存，直至進(jìn)一步加工。將血樣在4°C下以2000rpm離心20分鐘，以得到作為上清液的血漿。將血漿樣品在_80°C下儲(chǔ)存，直至使用。
[0074]如前人所述加以輕微改動(dòng)進(jìn)行了小鼠腦海馬體的Western印跡分析(AlRahim等人2009.Biochemistry48:7713-7721)。簡而言之，將冷凍的海馬體在冰冷的勻化緩沖液[每 mL 緩沖液:50mM Tris-HCl (pH7.5) U50mM NaCl、5mM EDTA、1%NP_40、0.5mM DTT 以及IOyL Halt蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物(Thermo Scientific, IL, USA)]中勻化。將勻漿在4°C下以12，OOOg離心10分鐘。收集上清液，補(bǔ)充了樣品緩沖液，然后在95°C煮沸5分鐘。制得的樣品因而可直接用于Western印跡實(shí)驗(yàn)。使等量的蛋白(30 μ g)接受了 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(12%凝膠)，將吸附膜在含有5%脫脂乳的TBST緩沖液中在室溫下封閉
I小時(shí)。然后將膜用抗憐酸化 ERK(Thr202/Tyr204, Cell Signaling Technologies, USA)抗體進(jìn)行了孵育。將另一凝膠用相同的樣品運(yùn)行，然后將膜用抗β_肌動(dòng)蛋白抗體(Cell signaling Technologies, USA)孵育。通過使用抗憐酸化 Akt (Ser473, Cellsignaling Technologies, USA)抗體然后通過抗 β -肌動(dòng)蛋白抗體(Cell signalingTechnologies, USA)再次探查而檢查了海馬體中磷酸化Akt的表達(dá)水平。結(jié)合的抗體通過辣根過氧化物酶連接的抗兔抗體(Cell Signaling Technologies, USA)檢測，并使用VersaDoc成像系統(tǒng)(Bio-Rad, USA)顯色。相關(guān)的免疫反應(yīng)性條帶使用Quantity Onel-D分析軟件(Bio-Rad，USA)進(jìn)行了定量。為了評價(jià)ERK活化，將磷酸化ERK水平歸一化到了β-肌動(dòng)蛋白的水平。
[0075]考慮到pERK的水平在焦慮期間明顯升高，并且ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制可能在產(chǎn)生抗焦慮作用中發(fā)揮著作用(Ailing等人，2008)，我們接下來測定了得自海馬體的勻漿中的ERK1/2的磷?；癄顟B(tài)。 Western印跡分析揭露出在用lmg/kg和2mg/kg紫檀苗處理的小鼠的海馬體勻漿中 ERK1[F(4, 15)=12.49，p < 0.001]和 ERK2[F(4, 15)=3.024，p < 0.05]磷酰化均降低(圖4A和4B)。未在EPM中顯示出任何抗焦慮樣效果的劑量5mg/kg和IOmg/kg未顯示出對ERK磷酰化的明顯影響。還值得注意的是，ERKl磷?；慕档捅菶RK2明顯得多。在用紫檀芪處理的小鼠的前額皮質(zhì)中，ERK的磷?；療o明顯變化(數(shù)據(jù)未示出)。
[0076]為了確定這些效應(yīng)是否是通過紫檀芪的中樞性作用對其他激酶磷?；癄顟B(tài)不加區(qū)別地降低的結(jié)果，我們測量了海馬體中的磷?；疉kt水平。與明顯的ERK磷?；档拖鄬Γ瑩?jù)發(fā)現(xiàn)，Akt的磷酰化狀態(tài)在用lmg/kg至10mg/kg范圍內(nèi)的化合物處理的小鼠的海馬體中幾乎無變化(圖5)。
[0077]實(shí)施例5
[0078]通過氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析血漿和海馬體以及PFC中的紫檀芪
[0079]將血漿保持在_80°C下，在提取前在冰上解凍。根據(jù)已公布的程序(Remsberg等人，上文)，將血漿用葡糖苷酸酶處理，以水解任何葡糖醛酸化的紫檀芪。簡而言之，將50 μ L血漿(得自每只動(dòng)物)轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，然后將60 μ L β -葡糖苷酸酶溶液(5000U/mL磷酸鉀緩沖液，75mM, pH6.8，37°C )加入。將混合物渦旋，然后在以750rpm振蕩下在37°C孵育20小時(shí)。之后，將冰冷的HPLC級乙腈加入，渦旋，在5000rpm、4°C下離心5分鐘。收集上清液，在氮?dú)饬飨赂稍?。將干燥后的上清液用于GC-MS分析。
[0080]將海馬體組織保持_80°C下，直至提取時(shí)。將得自2-3只動(dòng)物的海馬體(左和右)在Eppendorf管中合并，作為一個(gè)樣品加工。向管中加入200 μ L磷酸鹽緩沖液(0.2ΜNaH2P04:0.2Μ Na2HPO4)，將組織手動(dòng)勻化2分鐘。向100 μ I等分試樣中加入50 μ L3 -葡糖苷酸酶(5000U/mL磷酸鉀緩沖液)。將混合物渦旋，在振蕩(750rpm)下孵育(37°C，20小時(shí))。然后將樣品離心(15分鐘，7000g，4°C)。收集上清液，并通過乙酸乙酯(200 μ L，兩次)進(jìn)行分配。將乙酸乙酯層合并，在氮?dú)饬飨赂稍?，然后用于GC-MS分析。以與海馬體相同的方式進(jìn)行了前額皮質(zhì)(PFC)的提?。粚⒌米匀粍?dòng)物的PFC組織合并，作為一個(gè)樣品處理。
[0081]將氮?dú)飧稍锏臉悠?血漿和腦組織提取物)用30yLl:l的Ν，0_雙[三甲基甲娃烷基]三氟乙酰胺和二甲基甲酰胺(Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL)混合物處理，在70°C加熱40分鐘。使用配備了 J&W DB-5毛細(xì)管(0.25mm內(nèi)徑、0.25μπι膜厚和 30m 長；Agilent Technologies, Foster City, CA)的 JEOL GCMate II 儀器(JE0L USAInc.，Peabody, MA)分析了衍生化樣品的紫檀芪水平。GC升溫程序?yàn)?初始190°C，以20°C /min的速率升至240°C，以2.5°C /min的速率升至280°C，最后以30°C /min的速率升至300°C，然后保持在該溫度下0.5分鐘。載氣為超高純氦氣，流速為lmL/min。進(jìn)樣口、GC-MS接口和電離室分別保持在250°C、230°C和230°C。進(jìn)樣量為2yL (不分流進(jìn)樣)。質(zhì)譜以正、選擇離子監(jiān)測模式(m/z328、313和297)采集；電子轟擊70eV。GC-MS分析一式兩份地進(jìn)行。紫檀芪的保留時(shí)間為10.2分鐘。使用之前已表征了結(jié)構(gòu)和純度的紫檀芪合成樣品作為外標(biāo)，對紫檀芪進(jìn)行了定量。
[0082]據(jù)發(fā)現(xiàn)，lmg/kg劑量下的紫檀芪血漿水平為10.08±6.67ng/mL,并隨著劑量相應(yīng)地升高，在10mg/kg下達(dá)到130.26±40.25ng/mL (表1)。在lmg/kg劑量下，能夠檢測到海馬體組織中的紫檀芪水平，但低于定量限(0.0840ng)。在2、5和10mg/kg劑量下，水平可以定量，并在0.2627-1.1217ng/海馬體的范圍內(nèi)(表2)。對于所有施用劑量，在前額皮質(zhì)組織中僅發(fā)現(xiàn)了痕量的紫檀芪(無法定量)。
[0083]表1.紫檀芪在血漿中 的水平。
[0084]
【權(quán)利要求】
1.一種治療、緩解或預(yù)防對其有需要的受試者的焦慮的方法，包括向所述受試者施用包含治療有效量的紫檀芪的藥物或營養(yǎng)組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受試者是患有因諸如災(zāi)難性事件、環(huán)境變化或旅行的情況導(dǎo)致的焦慮的哺乳動(dòng)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受試者是患有因諸如睡眠障礙、肥胖癥或抑郁的病狀導(dǎo)致的焦慮的人。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受試者是患有作為諸如阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓氏舞蹈病、糖尿病和癌癥的疾病的副作用的焦慮的人。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述量是基于所述哺乳動(dòng)物的體重和體表面積的總量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述量是約IOmg/天至約IOOmg/天的總量。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述營養(yǎng)組合物是食物或飲料或者食物或飲料的補(bǔ)充組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述量以約IOmg/天至約IOOmg/天的量存在。
9.一種治療、緩解或預(yù)防焦慮的試劑盒，其中所述試劑盒包含: 根據(jù)權(quán)利要求1的含有有效量`紫檀芪的組合物；以及容納所述組合物的容器。
【文檔編號】A61K31/05GK103561729SQ201280022178
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年5月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月11日
【發(fā)明者】阿格尼斯·M·里曼多, 阿比爾·厄爾-阿勒菲, 穆德·阿爾·拉希姆 申請人:美國農(nóng)業(yè)部, 密西西比大學(xué)