抗癌融合蛋白的制作方法
【專利摘要】融合蛋白，其包含：結(jié)構(gòu)域（a），其為hTRAIL蛋白的序列的功能片段，該片段起始于不低于hTRAIL95的位置處的氨基酸；或具有至少70%序列同一性的所述功能片段的同源物；和至少一個結(jié)構(gòu)域（b），其為具有抗腫瘤細(xì)胞的抗增殖活性的效應(yīng)子肽的序列，其中結(jié)構(gòu)域（b）的序列連接于結(jié)構(gòu)域（a）的C末端或N末端。所述融合蛋白可用于治療癌癥疾病。
【專利說明】抗癌融合蛋白
[0001]本發(fā)明涉及治療性融合蛋白、特別是重組融合蛋白的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及包含可溶性人TRAIL蛋白序列的片段和抗增殖肽的序列的融合蛋白，包含它們的藥物組合物，它們在治療、特別是作為抗癌試劑中的用途，以及編碼所述融合蛋白的多核苷酸序列，包含所述多核苷酸序列的表達(dá)載體，以及包含這些表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0002]TRAIL蛋白，細(xì)胞因子家族的成員(腫瘤壞死因子相關(guān)的細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)性配體)，也被稱作Apo2L(Apo2-配體)，是腫瘤細(xì)胞和被病毒感染的細(xì)胞中的細(xì)胞調(diào)亡的強(qiáng)有力的激活子。TRAIL是體內(nèi)天然產(chǎn)生的配體。TRAIL蛋白、其氨基酸序列、編碼DNA序列和蛋白表達(dá)系統(tǒng)首次公開于EP0835305A1。
[0003]TRAIL蛋白通過與促細(xì)胞調(diào)亡表面TRAIL受體I和2 (TRAIL-R1/R2)結(jié)合并隨后激活這些受體來發(fā)揮其抗癌活性。這些受體，也被稱作DR4和DR5 (死亡受體4和死亡受體5)，是TNF受體家族的成員并且在不同類型的癌癥細(xì)胞上過表達(dá)。這些受體的激活能誘導(dǎo)阻抑基因P53非依賴性細(xì)胞調(diào)亡的外部信號傳導(dǎo)途徑，其通過激活的胱天蛋白酶-8引起執(zhí)行性胱天蛋白酶的激活，從而降解核酸。在TRAIL激活后釋放的胱天蛋白酶-8也可引起B(yǎng)id蛋白的釋放，從而間接激活線粒體途徑，Bid蛋白轉(zhuǎn)位至線粒體，在那里其刺激細(xì)胞色素c的釋放，因此間接擴(kuò)大來自死亡受體的細(xì)胞調(diào)亡信號。[0004]TRAIL選擇性作用于腫瘤細(xì)胞，基本上不誘導(dǎo)健康細(xì)胞的調(diào)亡，健康細(xì)胞對該蛋白是抗性的。因此，認(rèn)識到TRAIL作為抗癌試劑的巨大潛力，其作用于多種不同類型的腫瘤細(xì)胞，包括血液惡性腫瘤和實體腫瘤，同時極少影響正常細(xì)胞并顯示出潛在相對小的副作用。
[0005]TRAIL蛋白是II型膜蛋白，其具有281個氨基酸的長度，在被蛋白酶切割后，它的包含氨基酸殘基114-281的細(xì)胞外區(qū)域形成大小為20kDa的可溶性sTRAIL分子，其也是具有生物活性的。TRAIL和sTRAIL這兩種形式都能通過與存在于靶細(xì)胞上的TRAIL受體相互作用而激發(fā)細(xì)胞調(diào)亡。使用細(xì)胞系測試證明了 TRAIL分子的可溶性部分的強(qiáng)烈的抗腫瘤活性和非常低的系統(tǒng)性毒性。同樣，使用具有對應(yīng)于hTRAIL的氨基酸114-281的氨基酸序列的重組人可溶性TRAIL (rhTRAIL)(在INN下稱作dulanermin)進(jìn)行的人類臨床研究顯示出其良好的耐受性并且沒有劑量限制性毒性。
[0006]短于114-281的TRAIL片段也能結(jié)合膜死亡受體并通過這些受體誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡，如最近就122-281hTRAIL的重組循環(huán)序列改變的突變體所報道的，例如見EP1688498。
[0007]到目前為止所報道的重組TRAIL蛋白對于肝細(xì)胞的毒性效應(yīng)似乎與修飾即多聚組氨酸標(biāo)簽的存在相關(guān)，而非標(biāo)簽化的TRAIL不顯示系統(tǒng)性毒性。
[0008]然而，在進(jìn)一步研究和開發(fā)的過程中，很多癌癥細(xì)胞似乎顯示出對于TRAIL的原發(fā)性或獲得性抗性(見例如W02007/022214)。雖然對于TRAIL的抗性的機(jī)理尚未完全了解，但是相信其可在TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡途徑的不同水平表現(xiàn)其自己，從細(xì)胞表面受體水平到信號傳導(dǎo)途徑內(nèi)的執(zhí)行性胱天蛋白酶。這種抗性限制了 TRAIL作為抗癌試劑的有用性。
[0009]此外，在對患者進(jìn)行的臨床試驗中證明，TRAIL作為單一治療的實際有效性是低下的。為了克服這種低的效率和腫瘤對TRAIL的抗性，設(shè)計了與放療和化療試劑的多種組合治療，其產(chǎn)生了協(xié)同性細(xì)胞調(diào)亡效應(yīng)(W02009/002947; A.Almasan andA.Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviewsl4(2003)337-348;RK Srivastava, Neoplasis, Vol3，No6, 2001，535-546，Soria JC et al., J.Clin.0ncology, Vol28, No9 (2010), p.1527-1533)。在W02009/140469中描述了 rhTRAIL與所選擇的常規(guī)的化療試劑(紫杉醇、卡鉬)和單克隆抗-VEGF抗體組合用于癌癥治療的用途。然而，此類組合必然意味著公知的常規(guī)化療或放療的缺陷。
[0010]此外，已經(jīng)證明與TRAIL治療法相關(guān)的問題是其低穩(wěn)定性以及在施用之后迅速從身體清除。
[0011]包含通過金屬蛋白酶切割位點連接子連接的血管生成抑制劑血管抑制素(vasostatin)和TRAIL114-281的序列的構(gòu)建的融合蛋白被描述為在腫瘤細(xì)胞中顯示出誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的效應(yīng)，見A.1.Guo et al, Chinese Journal of Biochemistry and MolecularBiology2008, vol.24(10)，925-930。
[0012]包含血管生成抑制劑鈣網(wǎng)蛋白和TRAIL114-281的序列的構(gòu)建的融合蛋白被描述為在腫瘤細(xì)胞中顯示誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，見CN1609124A。
[0013]CN1256347C 公開了由激肽原(kininogen)D560-148 和 TRAIL114-281 組成的融合蛋白。
[0014]包含通過編碼GGGSGGSG的連接子連接于TRAIL114-281的N或C末端的血管生成抑制劑kininostatin、血管抑制素和canstatin的序列的構(gòu)建的融合蛋白描述于FengFeng-Yi “Phaseland Clinical Trial of Rh_Apo2L and Apo2L_Related ExperimentalStudy”，Ph.D.degree thesis, Chinese Peking Union Medical, 2006-10-01;http://www.1w23.com/lunwen_957708432。
[0015]包含血管生成抑制劑腫瘤抑`素(tumstatin)的Tumstatinl83_230和TRAIL114-281的序列的構(gòu)建的融合蛋白被描述為顯示出誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡，見N.Ren et al, Academic Journal of Second Military Medical University2008, vol.28 (5)，676-478。
[0016]US2005/244370和對應(yīng)的W02004/035794公開了 TRAIL95-281 的構(gòu)建體，其作為效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域，通過肽連接子與作為細(xì)胞表面結(jié)合結(jié)構(gòu)域的TNF家族配體的另一成員CD40的細(xì)胞外部分連接。其指出該構(gòu)建體的激活是通過其CD40部分的結(jié)合。
[0017]Shin J.N.等人，Experimental Cell Research,第 312 卷，第 19期，2006，p.3892-3898公開了作為TRAIL的前體形式的具有在連接位置引入的基質(zhì)金屬蛋白酶切割位點的sTRAIL與IL-18的構(gòu)建的融合蛋白，所述TRAIL的前體形式可在病理地產(chǎn)生金屬蛋白酶的區(qū)域例如腫瘤環(huán)境中被激活和釋放。還產(chǎn)生了具有IFN-Y和內(nèi)皮他丁的sTRAIL的構(gòu)建體，但既沒有表征也沒有測試該構(gòu)建體。
[0018]癌癥治療的目標(biāo)之一是抑制腫瘤細(xì)胞增殖(生長)。具有獲得的惡性表型(因突變、致癌物活性或DNA修復(fù)的障礙而引起的)的細(xì)胞喪失其正確分化的能力，并且獲得浸潤的能力。腫瘤細(xì)胞的克隆主要轉(zhuǎn)錄與快速生長和侵襲相關(guān)的基因，并且腫瘤細(xì)胞的特征，除其它以外，在于增殖控制的擾亂。
[0019]腫瘤細(xì)胞增殖的抑制在癌癥治療中的有益效應(yīng)是已知的。作為癌癥治療和輔助癌癥治療，進(jìn)行了抑制或調(diào)節(jié)增殖過程的物質(zhì)的臨床使用的嘗試。
[0020]腫瘤細(xì)胞增殖的抑制可以以各種方式例如綜述論文“Hallmarks of Cancer:TheNext Generation”(Cell, 2011，646-674)中描述的方式來實現(xiàn)。存在已知的用于抗癌療法的抗增殖蛋白質(zhì)-例如曲妥珠單抗-用于具有HER2過表達(dá)的乳腺癌患者的阻斷HER2的單克隆抗體。還已知仍未被發(fā)現(xiàn)在人癌癥的治療中具有臨床上效用的許多蛋白質(zhì)的抗增殖活性。
[0021]例如，人甲胎蛋白及其片段的抗增殖活性是公知的。個別蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)的詳細(xì)研究揭示了負(fù)責(zé)雌二醇依賴性細(xì)胞的生長抑制的位于34個氨基酸區(qū)域內(nèi)的結(jié)構(gòu)的存在(Mizejewski 等人,Mol.Cell.Endocrinol., 18:15-23，1996)。由 8 個連續(xù)氨基酸組成的該區(qū)域的羧基末端是最重要的片段，并且能夠單獨地抑制癌細(xì)胞的生長(MizejewskiG., Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals，22:73-98，2007)。
[0022]p2IffAFl蛋白的抗增殖性質(zhì)也是已知的。合成基于p21WAFl的氨基酸序列的短肽，所述短肽顯示可比較的結(jié)合并且抑制D1-CDK4復(fù)合物、從而在Gl期終止細(xì)胞周期的潛能(Ball 等人,Current Biology, 7:71-80，1996)。
[0023]還已知蛋白質(zhì)D0C_2/DAB2(在卵巢癌-2/失能的2中差異表達(dá)的)是前列腺癌細(xì)胞的增殖的強(qiáng)效抑制劑。其通過結(jié)合許多它們各自的亞元件(c-Src，Grb2)來抑制MAPK激酶傳播途徑而起作用(Zhou 等人，JBiol Chem276:27793-27798, 2001，Zhou 等人，J BiolChem, 278:6936-6941, 2003)。其基本組分是存在于羧基末端D0C-2/DAB2上的富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域(Zhou 等人，Cancer Res, 66:8954-8958，2006)。
[0024]pl6蛋白或其片段對CDK4-細(xì)胞周期蛋白結(jié)合的抑制通常被認(rèn)為是瘤形成的抑制劑(Fahraeus 等人,Oncogene, 16:587-596，1998)。
[0025]還已知激酶ERK對腫瘤細(xì)胞增殖程度的影響(Handra-Luca A.,等人，AmericanJournal of Pathology.20 03; 163:957-967)。已知 MEK-1 蛋白的肽片段是選擇性 ERK 激酶底物，從而其可用作其選擇性抑制劑(Bradley R.等人，The Journal of BiologicalChemistry, 2002，277，8741-8748)。
[0026]還已知Akt激酶活性的選擇性抑制導(dǎo)致細(xì)胞增殖的抑制和腫瘤細(xì)胞死亡(Hennessy B.T,等人，Nature Reviews Drug Discovery2005, 4，988-1004)。
[0027]還已知Phe-Trp-Leu-Arg-Phe-Thr六肽的抗增殖性質(zhì)在于E2F與DP締合的抑制和 E2F 對 DNA 結(jié)合的直接抑制(Janin Y.L.，Amino Acids, 25:1 - 40，2003)。
[0028]微管蛋白纖維解聚的抑制(在有絲分裂中阻止了姊妹染色單體分離并且引起染色體遷移的障礙)也導(dǎo)致增殖過程的障礙(Xiao等人，J.Cell Mol.Med.，2010)。
[0029]顯示了蜂毒肽與TRAIL蛋白的活性的協(xié)同作用(Wang等人，JBC Journal ofBiological Chemistry, 284, 3804-3813)。
[0030]作為蜂防衛(wèi)素的片段的蛋白質(zhì)及其類似物對端粒酶活性和在線粒體膜中的積累的抑制也是已知的(Iwasaki 等人,Biosc1.Biotechnol.Biochem., 73:683-687，2009)。
[0031]還已知Iasioglossins (從蜂Lasioglossum Iaticeps的毒液分離的帶正電荷的肽)產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性(Cerovskf等人，Chembiochem, 2009, 10:2089-2099)。
[0032]還已知例如來自SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)適體對RasGAP-Aurora B相互作用的抑制對癌細(xì)胞的增殖產(chǎn)生了抑制性影響(Pamonsinlapatham P.等人，PLoS0NE3(8):e2902, 2008)。[0033]使用例如P16肽(其為pl6INK4A基因產(chǎn)物的片段)對細(xì)胞周期依賴性激酶例如激酶⑶K4的抑制的影響也是已知的(Derossi D,等人，J BiolChem.269:10444-10450，1994)。
[0034]還已知Pep27蛋白的抗增殖性質(zhì)，細(xì)胞受體對其的結(jié)合導(dǎo)致組氨酸激酶的磷酸化，這引起效應(yīng)子因子VncR的去磷酸化，從而導(dǎo)致自動催化途徑和細(xì)胞死亡的抑制(DongGun Lee 等人，Cancer Cell International2005, 5:21)。
[0035]許多抗增殖物質(zhì)目前處于不同的研究階段，包括臨床試驗。然而，目標(biāo)在于抑制增殖的已知療法具有許多公知的不利方面。例如，存在有害作用例如血栓栓子并發(fā)癥、咳血和肺出血。許多抗增殖藥物還顯示不良的生物利用度和毒性副作用。
[0036]由于治療的長期使用和缺乏選擇性，因此抗增殖藥物的安全性是特別重要的。對有效的治療劑的強(qiáng)烈需要和腫瘤疾病的性質(zhì)使得必需簡化這類藥物的注冊程序，從而不可能了解藥物的所有副作用和不利方面。盡管如此，與針對所有快速增殖細(xì)胞的化學(xué)治療劑相反，肽抗增殖藥物針對負(fù)責(zé)觸發(fā)蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化的級聯(lián)的蛋白質(zhì)激酶和磷酸酶或針對其底物或在細(xì)胞周期的正確進(jìn)程中銜接的其它蛋白質(zhì)，這導(dǎo)致治療毒性的一定減小。然而，針對抑制增殖同時確保針對腫瘤細(xì)胞的選擇性的抗癌療法仍然是未知的。從而存在對具有改善的毒理學(xué)特征的新型抗增殖抗癌療法的需要。
[0037]本發(fā)明提出了解決該問題的方案:提供了新的融合蛋白，其包含源自TRAIL的結(jié)構(gòu)域和具有抗增殖活性并不包括TRAIL片段的短的效應(yīng)子肽結(jié)構(gòu)域，其中所述效應(yīng)子肽加強(qiáng)或補(bǔ)充TRAIL的作用。
[0038]根據(jù)本發(fā)明的蛋白選擇性針對癌細(xì)胞，其中蛋白的元件發(fā)揮它們的效應(yīng)，特別地，效應(yīng)子肽抑制腫瘤細(xì)胞增殖。 本發(fā)明的蛋白向腫瘤環(huán)境的遞送使得針對體內(nèi)的健康細(xì)胞的毒性以及副作用最小化，并且減小了施用頻率。此外，通過使用本發(fā)明的蛋白的靶向治療允許避免之前已知的非特異性抗增殖治療法的低效率問題(由高毒性和必需施用高劑量所引起的)。
[0039]在很多情況下，本發(fā)明的融合蛋白比可溶性TRAIL及其變體、包括序列的片段效力更強(qiáng)。直至目前，用于本發(fā)明的融合蛋白中的已知的效應(yīng)子肽未被用于藥物，因為例如不理想的動力學(xué)、被非特異性蛋白酶迅速降解或由于缺乏正確的激活途徑次序(這對于使效應(yīng)子肽在靶位點的正確作用是必須的)而在體內(nèi)積累。效應(yīng)子肽向融合蛋白中的摻入允許使它們選擇性地遞送至需要它們發(fā)揮作用的位點。此外，效應(yīng)子肽的連接增大了蛋白質(zhì)的質(zhì)量，這產(chǎn)生了延長的半衰期并增加了腫瘤中蛋白的保持以及其增強(qiáng)的效率。另外，在很多情況下，新的融合蛋白還克服了對于TRAIL的天然或誘導(dǎo)的抗性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]現(xiàn)在將通過閱讀附圖詳細(xì)描述本發(fā)明。
[0041]圖1顯示了根據(jù)Ex.UEx.2、Ex.3、Ex.4和Ex.5的本發(fā)明的融合蛋白的示意性結(jié)構(gòu)。
[0042]圖2顯示了根據(jù)EX.6、Ex.7、Ex.8、Ex.8A、Ex.9和Ex.10的本發(fā)明的融合蛋白的示意性結(jié)構(gòu)。
[0043]圖3顯示了根據(jù)Ex.11、Ex.12、Ex.13、Ex.14和Ex.15的本發(fā)明的融合蛋白的示意性結(jié)構(gòu)。
[0044]圖4顯示了根據(jù)Ex.16, Ex.17, Ex.18, Ex.19和Ex.20的本發(fā)明的融合蛋白的示意
性結(jié)構(gòu)。
[0045]圖5顯示了根據(jù)Ex.21, Ex.22, Ex.23, Ex.24和Ex.25的本發(fā)明的融合蛋白的示意
性結(jié)構(gòu)。
[0046]圖6A和 6B 顯不了以比捕圓率(specific ellipticity)表不的 rhTRAIL95_281 和Ex.1''與Ex.2a的融合蛋白(圖6A)以及Ex.8a的融合蛋白和rhTRAILl 14-281 (圖6B)的圓二色性光譜。
[0047]圖7顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.2a的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌HCTl 16的Crl: CDl-Foxnlnu小鼠中的腫瘤體積變化(相對于初始階段的百分率)。
[0048]圖8顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.2a的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌HCT116的Crl = CDl-FoxnlnuI小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI)。
[0049]圖9顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.2a的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肺癌NC1-H460-Luc2的CrKDl-Foxnlnu小鼠中的腫瘤體積變化(相對于初始階段的百分率)。
[0050]圖10顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.2a的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肺癌NC1-H460-Luc2的Crl: CDl-FoxnlnuI小鼠中的的腫瘤生長抑制值(％TGI )。
[0051]圖11顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.8a的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌HCTl 16的Crl = SHO-PrkdcseidHrto小鼠中的腫瘤體積變化(相對于初始階段的
百分率)。
[0052]圖12顯示了，相對于rhTRAIL114_281處理，以Ex.8a的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌HCT116的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI)。
[0053]圖1Ia顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.83的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌HCTl 16的Crl = SHO-PrkdcseidHrto小鼠中的腫瘤體積變化(相對于初始階段的百分率)。
[0054]圖12a顯示了，相對于rhTRAILl 14-281處理，以Ex.8b的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌HCT116的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI)。
[0055]圖13顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.8b的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌SW620的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤體積變化(相對于初始階段的
百分率)。
[0056]圖14顯示了，相對于rhTRAIL114-281處理，以Ex.8b的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌SW620的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI)。
[0057]圖15顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.8b的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌Colo205的Crl = SHO-PrkdcseidHrto小鼠中的腫瘤體積變化(相對于初始階段的百分率)。
[0058]圖16顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.8b的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有結(jié)腸癌Colo205的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI)。
[0059]圖17顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.8b的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肝癌H印G2的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤體積變化(相對于初始階段的百分率)。[0060]圖18顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.8b的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肝癌H印G2的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI)。
[0061]圖19顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.8b的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肺癌NC1-H460的Crl = SHO-PrkdcseidHrto小鼠中的腫瘤體積變化(相對于初始階段的
百分率)。
[0062]圖20顯示了，相對于以rhTRAILl 14-281處理，以Ex.8b的本發(fā)明的融合蛋白處理的具有肺癌NC1-H460的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的腫瘤生長抑制值(％TGI)。
[0063]發(fā)明詳述
[0064]本發(fā)明涉及融合蛋白，其包含:
[0065]-結(jié)構(gòu)域(a)，其為可溶性hTRAIL蛋白的序列的功能片段，該片段起始于不低于hTRAIL95的位置處的氨基酸；或具有至少70%序列同一性的所述功能片段的同源物；和
[0066]-至少一個結(jié)構(gòu)域(b)，其為具有抗腫瘤細(xì)胞的抗增殖活性的效應(yīng)子肽的序列，
[0067]其中結(jié)構(gòu)域(b)的序列連接于結(jié)構(gòu)域(a)的C末端和/或N末端。
[0068]術(shù)語“可溶性hTRAIL的序列的功能性可溶性片段”應(yīng)該被理解為指可溶性hTRAIL的任何能夠在結(jié)合于哺乳動物細(xì)胞表面上的其受體之后在該細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡信號的片段。
[0069]本領(lǐng)域技術(shù)人員還將認(rèn)識到:TRAIL序列的至少70%的同源性的存在是本領(lǐng)域已知的。
[0070]應(yīng)該理解，本發(fā)明的融合蛋白中的效應(yīng)子肽結(jié)構(gòu)域(b)不是hTRAIL蛋白，也不是hTRAIL蛋白的一部分或片段。
[0071]根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“肽”應(yīng)被理解為從通過肽鍵連接在一起的多個氨基酸構(gòu)建的分子。因此，根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“肽”包括寡肽、多肽和蛋白質(zhì)。
[0072]在本發(fā)明中，肽的氨基酸序列將以本領(lǐng)域采納的常規(guī)方式表示，從肽的N末端(N-端)至其C末端(C-端)。因此，任何序列均為左側(cè)為N末端，右側(cè)為C末端的線性表示。
[0073]本發(fā)明的融合蛋白在結(jié)構(gòu)域(a)的C末端和/或N末端連接至少一個效應(yīng)子肽結(jié)構(gòu)域(b)。
[0074]在具體的實施方式中，結(jié)構(gòu)域(a)是hTRAIL序列的片段，起始于hTRAIL95至hTRAIL121的氨基酸，含端點，結(jié)束于氨基酸hTRAIL281。
[0075]具體地，結(jié)構(gòu)域(a)可選自對應(yīng)于hTRAIL95-281,hTRAILl 14-281、hTRAILl 19-281、hTRAIL120-281和hTRAIL121_281的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，hTRAIL95_281、hTRAILl 14-281、hTRAILl 19-281、hTRAIL120-281 和 hTRAIL121_281 分別代表 GenBank 中登記號P50591的hTRAIL的已知序列中的起始于編號95、114、119、120和121的氨基酸和終止于最后一個氨基酸281的人TRAIL蛋白的片段。
[0076]在另一個【具體實施方式】中，結(jié)構(gòu)域(a)是起始于不低于hTRAIL95的氨基酸位置并結(jié)束于氨基酸hTRAIL281的可溶性hTRAIL蛋白序列的功能片段的同源物，該序列與原始序列至少70%、優(yōu)選85%同一。
[0077]在該實施方式的具體變體中，結(jié)構(gòu)域(a)是選自對應(yīng)于hTRAIL95_281，hTRAILl 14-281，hTRAILl 16-281, hTRAIL120-281 和 hTRAIL121_281 的序列的片段的同源物。
[0078]應(yīng)該理解，hTRAIL片段的同源物是該片段的氨基酸序列的變體/修飾，其中至少一個氨基酸被改變，包括I個氨基酸、2個氨基酸、3個氨基酸、4個氨基酸、5個氨基酸、6個氨基酸，和不超過15%的氨基酸，并且其中修飾的序列的片段具有hTRAIL序列的保留的功能，即結(jié)合細(xì)胞表面死亡受體和在哺乳動物細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。氨基酸序列的修飾可以包括例如，置換、缺失和/或添加氨基酸。
[0079]優(yōu)選地，具有修飾的序列的hTRAIL片段的同源物顯示出相對于hTRAIL的天然片段而言，與死亡受體DR4 (TRAIL-Rl)或DR5 (TRAIL-R2)的改變的親和性。
[0080]術(shù)語“改變的親和性”是指增加的親和性和/或具有改變的受體選擇性的親和性。
[0081]優(yōu)選地，具有修飾的序列的hTRAIL片段的同源物顯示出相對于hTRAIL的天然片段而言對于死亡受體DR4和DR5的增加的親和性。
[0082]特別優(yōu)選地，具有修飾的序列的hTRAIL片段的同源物顯示出對于死亡受體DR5比對于死亡受體DR4增加的親和性，即增加的選擇性DR5/DR4。
[0083]同樣優(yōu)選地，具有修飾的序列的hTRAIL片段的同源物顯示出對于死亡受體DR4和/或DR5的比對于受體DRl (TRAIL-R3)和/或DR2 (TRAIL-R4)的與親和性相關(guān)的增加的選擇性。
[0084]產(chǎn)生對于死亡受體DR4和DR5的增加的親和性和/或選擇性的hTRAIL的修飾是本領(lǐng)域已知的，例如見 Tur V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, CoolRH, Samali A, Serrano L,Quax WJ.DR4-selective tumor necrosis factor-relatedapoptosis-1nducing ligand(TRAIL)variants obtained by structure-based design.J.Biol.Chem.2008Jull8; 283 (29): 20560-8，其描述了 D218H 突變具有對于 DR4 的增加的選擇性；或 Gasparian ME, Che`rnyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, SychevaAM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP.Generation of new TRAIL mutants DR5-A andDR5-B with improved selectivity to death receptor5,Apoptosis.2009Jun;14(6):778-87，其描述了 D269H突變對于DR4具有降低的親和性。產(chǎn)生對于選自DR4和DR5的一種受體的增加的親和性(相對于DRl和DR2受體)和對于受體DR5的增加的親和性(相對于DR4)的 hTRAIL 突變體也描述于 W02009077857 和 W02009066174。
[0085]合適的突變是選自下列的天然hTRAIL位置中的一個或多個氨基酸突變:131，149，159，193，199，201,204, 204，212，215，218和251，特別地，涉及以堿性氨基酸例如賴氨酸、組氨酸或精氨酸，或諸如谷氨酸或天冬氨酸的氨基酸置換某氨基酸的突變。特別地可提及選自下列的一個或多個突變:G131R, G131K, R149I, R149M, R149N, R149K, S159R, Q193H, Q193K, N199H, N199R, K201H, K201R, K204E, K204D, K204L, K204Y, K212R, S215E, S215H, S215K, S215D, D218Y, D218H, K251D, K251E 和 K251Q,描述于 TO2009066174。
[0086]合適的突變還有選自氨基酸195、269和214的天然hTRAIL位置中的一個或多個突變，特別是涉及以堿性氨基酸例如賴氨酸、組氨酸或精氨酸置換某氨基酸的突變。具體地可提及選自D269H, E195R和T214R的一個或多個突變，描述于W02009077857。
[0087]在具體的實施方式中，為hTRAIL的片段的同源物的結(jié)構(gòu)域(a)選自天然TRAIL序列的D218H突變體，如W02009066174所描述，或天然TRAIL序列的Y189N-R191K-Q193R-H264R-1266R-D269H突變體，如 Gasparian ME等人.Generation of new TRAIL mutants DR5-Aand DR5-B with improved selectivity to death receptor5, Apoptosis.2009Jun;14(6):778-87中所描述。
[0088]根據(jù)本發(fā)明，融合蛋白包含抗增殖肽作為效應(yīng)子肽，其具有抗腫瘤細(xì)胞的抗增殖活性，即對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。
[0089]應(yīng)當(dāng)理解，“腫瘤細(xì)胞增殖”涉及細(xì)胞分裂和在腫瘤細(xì)胞周期中的生長的步驟，因此效應(yīng)子肽在腫瘤細(xì)胞生長方面具有抗增殖活性。
[0090]因此，“腫瘤細(xì)胞增殖”抑制作用不包括抑制作為血管生成的步驟的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。具有抗血管發(fā)生活性(即抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長的活性)的效應(yīng)子肽因此不包括在根據(jù)本發(fā)明的效應(yīng)子肽的范圍內(nèi)。
[0091]具體地，本發(fā)明不包括選自鈣網(wǎng)蛋白、腫瘤抑素183-230、激肽原D5、血管抑素、激肽源、內(nèi)皮他丁和canstatin的效應(yīng)子肽。
[0092]根據(jù)本發(fā)明，效應(yīng)子肽可以以不同的方式例如選自如下的方式產(chǎn)生其抗腫瘤細(xì)胞的抗增殖效應(yīng):
[0093]-抑制MAPK激酶(絲裂原活化蛋白激酶)傳播途徑，例如通過阻斷FGF-2受體(堿性成纖維細(xì)胞生長因子2受體，也稱為bFGF-、FGF2-或FGF- β受體)或源自DAB2蛋白的DD2 肽;
[0094]-雌二醇依賴性細(xì)胞的生長的抑制，例如通過人甲胎蛋白或其片段；
[0095]-在Gl期中終止細(xì)胞周期，例如通過抑制細(xì)胞周期蛋白Dl-⑶Κ4(細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4)復(fù)合物；
[0096]-精氨酸的酶促斷裂，例如通過來自精氨酸支原體的精氨酸脫亞胺酶；
[0097]-細(xì)胞周期激酶的抑制，例如CDK4/5/6激酶(細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶)的抑制，或ERK激酶(細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)的激酶)激活的抑制或Akt激酶(也稱為蛋白質(zhì)激酶B(PKB)、絲氨酸/蘇氨酸特異性激酶)共激活的抑制；
[0098]-轉(zhuǎn)錄因子E2F(高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄因子(TF))與DP蛋白(也稱為轉(zhuǎn)錄因子DP, E2F 二聚化伴侶)的締合的抑制；
[0099]-微管蛋白纖維締合/聚合的抑制；
[0100]-端粒酶活性的抑制；
[0101]-RasGAP (Ras-樣GTP酶的GTP酶激活蛋白)-Aurora B激酶相互作用或組氨酸激酶激活的抑制；和
[0102]-擾亂跨細(xì)胞膜的離子平衡。
[0103]在本發(fā)明的一個實施方式中，結(jié)構(gòu)域(b)的效應(yīng)子肽可以是能夠抑制MAPK激酶傳播途徑的肽。實例是負(fù)責(zé)FGF-2受體的阻斷，從而抑制腫瘤生長的FGF-2受體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的類似物。具體地，這樣的效應(yīng)子肽可以是由序列表中的SEQ.N0.26所示的16個氨基酸肽。
[0104]本發(fā)明的該實 施方式的另一個效應(yīng)子肽可以是D0C-2/DAB2蛋白的片段。具體地，這樣的效應(yīng)子肽可以是18個氨基酸的肽DD2 -存在于D0C-2/DAB2的羧基末端上的富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域，示于序列表中的SEQ.N0.30，其通過結(jié)合許多它們各自的亞元件(c-Src, Grb2)參與MAPK激酶的傳播途徑的抑制。
[0105]在本發(fā)明的另一個實施方式，結(jié)構(gòu)域(b)的效應(yīng)子肽可以是能夠抑制雌二醇依賴性細(xì)胞的生長的肽，例如人甲胎蛋白或其片段。具體地，這樣的效應(yīng)子肽可以是序列表中的SEQ.N0.27所示的人α-甲胎蛋白的34個氨基酸的片段。本實施方式的另一個效應(yīng)子肽可以是位于SEQ.N0.27的C末端上的人α-甲胎蛋白的8個氨基酸的片段，并且示于序列表中的 SEQ.N0.28。
[0106]在本發(fā)明的另一個實施方式中，結(jié)構(gòu)域(b)的效應(yīng)子肽可以是能夠使細(xì)胞周期終止于Gl期的肽，例如通過抑制細(xì)胞周期蛋白D1-CDK4復(fù)合物。具體地，這樣的效應(yīng)子肽可以是trojan pl6肽，或其片段，其抑制激酶⑶K4和⑶K6的活性。具體地，效應(yīng)子肽-P16INK4A基因產(chǎn)物的片段-示于序列表中的SEQ.N0.32。這樣的效應(yīng)子肽還可以是trojan pl6肽的另一個片段-與觸角足蛋白的17個氨基酸轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域融合的pl6INK4A 基因產(chǎn)物的片段(Derossi D, AH Joliot, G Chassaings, A Prochiantz, J BiolChem.269:10444-10450, 1994)，示于序列表中的 SEQ.N0.33。
[0107]在本發(fā)明的另一個實施方式中，結(jié)構(gòu)域(b)的效應(yīng)子肽可以是能夠酶促斷裂精氨酸的肽，例如利用來自精氨酸支原體的精氨酸脫亞胺酶。具體地，這樣的效應(yīng)子肽示于序列表中的 SEQ.N0.31。
[0108]在本發(fā)明的另一個實施方式中，結(jié)構(gòu)域(b)的效應(yīng)子肽可以是能夠抑制細(xì)胞周期激酶的肽，例如⑶K4/5抑制劑。具體地，這樣的效應(yīng)子肽可以是P21WAF1蛋白的片段，例如序列表中的SEQ.N0.29所示的p21WAFl蛋白的20個氨基酸的片段。
[0109]本實施方式的另一個效應(yīng)子肽可以是肽-ERK激活的抑制劑。具體地，這樣的效應(yīng)子肽可以是序列表中的SEQ.N0.34所示的MEK-1蛋白的片段。
[0110]本發(fā)明的另一個效應(yīng)子肽可以是Akt激酶的肽-共激活物。具體地，這樣的效應(yīng)子肽-TCLl蛋白的PH結(jié)構(gòu)域的N末端片段-示于序列表中的SEQ.N0.35。
[0111]在本發(fā)明的另一個實施方式中，結(jié)構(gòu)域(b)的效應(yīng)子肽可以是能夠抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F與DP蛋白締合的肽。具體地,這樣的效應(yīng)子肽-六肽Phe-Trp-Leu-Arg-Phe-Thr -示于序列表中的SEQ.N0.36。結(jié)構(gòu)域(b)的另一個效應(yīng)子肽可以是為FGF-2結(jié)合結(jié)構(gòu)域的類似物的肽。具體地，這樣的效應(yīng)子肽-阻斷FGF-2受體的8個氨基酸的肽-示于序列表中折 SEQ.N0.41。
[0112]在本發(fā)明的另一個實施方式中，結(jié)構(gòu)域(b)的效應(yīng)子肽可以是能夠抑制微管蛋白纖維締合/聚合的肽。這樣的效應(yīng)子肽可以是負(fù)責(zé)形成異二聚體結(jié)構(gòu)、促成微管蛋白纖維聚合的抑制的微管蛋白的片段。具體地，這樣的效應(yīng)子肽-微管蛋白的13個氨基酸的片段-示于序列表中的SEQ.N0.37，另一個效應(yīng)子肽-微管蛋白的10個氨基酸的片段-示于序列表的中的SEQ.N0.38。
[0113]在本發(fā)明的另一個實施方式中，結(jié)構(gòu)域(b)的效應(yīng)子肽可以是能夠抑制端粒酶活性的肽。這樣的效應(yīng)子肽可以是負(fù)責(zé)端粒酶活性抑制的基于蜂防衛(wèi)素的序列的肽。具體地，這樣的效應(yīng)子肽-基于蜂防衛(wèi)素的6個氨基酸的C2肽-不于序列表中的SEQ.N0.40。該實施方式的另一個效應(yīng)子肽可以是存在于蜂毒中的肽lasioglossin。具體地，這樣的效應(yīng)子肽-lasioglossin LL-2 -示于序列表中的 SEQ.N0.42。
[0114]在本發(fā)明的另一個實施方式中，結(jié)構(gòu)域(b)的效應(yīng)子肽可以是能夠抑制RasGAP-Aurora B相互作用或組氨酸激酶激活的肽。具體地,這樣的效應(yīng)子肽_結(jié)合RasGAP的SH3結(jié)構(gòu)域的13個氨基酸肽-示于序列表的SEQ.N0.43。本實施方式的另一個效應(yīng)子肽可以是在被細(xì)胞受體結(jié)合后引起組氨酸激酶磷酸化的肽，其繼而導(dǎo)致效應(yīng)子因子VncR去磷酸化。具體地，這樣的效應(yīng)子肽- P印27肽的類似物-示于序列表中的SEQ.N0.44。
[0115]在本發(fā)明的另一個實施方式中，結(jié)構(gòu)域(b)的效應(yīng)子肽可以是能夠擾亂跨細(xì)胞膜離子平衡的肽。具體地，這樣的效應(yīng)子肽蜂毒肽-顯示于序列表中的SEQ.N0.39。
[0116]在本發(fā)明的融合蛋白的【具體實施方式】中，效應(yīng)子肽選自:
[0117]-SEQ.N0.26 (阻斷FGF-2受體的16個氨基酸的肽)，
[0118]-SEQ.N0.27 ( α甲胎蛋白的片段)，
[0119]-SEQ.N0.28 ( α甲胎蛋白的C末端片段)，
[0120]-SEQ.N0.29 (p2Iwafi 蛋白的片段)，
[0121 ] -SEQ.N0.30 (來自 DAC-2/DAB-2 蛋白的 DD2 肽)，
[0122]-SEQ.N0.31(精氨酸脫亞胺酶)，
[0123]-SEQ.N0.32(pl6 肽的片段)，
[0124]_SEQ.N0.33(與觸角足蛋白的17個氨基酸的轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域融合的pl6肽的片段)，
[0125]-SEQ.N0.34 (MEK-1 的片段)，
[0126]-SEQ.N0.35 (T CL1蛋白的pH結(jié)構(gòu)域的片段)，
[0127]-SEQ.N0.36 (E2F 的六肽抑制劑)，
[0128]-SEQ.N0.37 (微管蛋白聚合作用的抑制劑)，
[0129]-SEQ.N0.38 (微管蛋白聚合作用的抑制劑)，
[0130]-SEQ.N0.39 (蜂毒肽)，
[0131]-SEQ.N0.40 (合成的C2端粒酶抑制劑)，
[0132]-SEQ.N0.41 (與FGF-2R相互作用的8個氨基酸的抑制劑)，
[0133]-SEQ.N0.42 (lassioglossin LL—2)，
[0134]-SEQ.N0.43 (Aurora RG27 激酶的抑制劑)，和
[0135]-SEQ.N0.44 (Pep27 的類似物)。
[0136]在結(jié)合存在于癌細(xì)胞表面上的TRAIL受體后，融合蛋白顯示雙重效應(yīng)。結(jié)構(gòu)域(a)，其為TRAIL的功能片段或具有保留的功能的其同源物，將顯示出其已知的激動劑活性，即結(jié)合細(xì)胞表面上的死亡受體并激活細(xì)胞凋亡的外部途徑。融合蛋白的結(jié)構(gòu)域(b)的效應(yīng)子肽將能夠通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來與TRAIL結(jié)構(gòu)域的活性平行地潛在地細(xì)胞內(nèi)地發(fā)揮其作用。
[0137]如果融合蛋白包含被蛋白酶識別的切割序列，則效應(yīng)子肽可先前被在腫瘤環(huán)境中過表達(dá)的金屬蛋白酶或尿激酶從TRAIL的片段切除掉。
[0138]在本發(fā)明的融合蛋白中，TRAIL的抗腫瘤效應(yīng)可通過其它影響細(xì)胞增殖的元件的激活來潛在地增強(qiáng)，例如抑制雌二醇依賴性細(xì)胞的生長、抑制細(xì)胞周期蛋白D1-CDK4復(fù)合物、抑制MAPK激酶傳輸途徑、精氨酸的酶促斷裂、CDK4/5/6激酶的抑制、抑制ERK激酶激活、抑制Akt激酶共激活、抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F與DP蛋白締合、抑制微管蛋白纖維締合、抑制端粒酶活性、抑制RasGAP-AuiOra B相互作用或組氨酸激酶激活。
[0139]在本發(fā)明的一個實施方式中，結(jié)構(gòu)域(a)和結(jié)構(gòu)域(b)通過至少一個結(jié)構(gòu)域(c)連接，結(jié)構(gòu)域(C)包含被存在于細(xì)胞環(huán)境、特別是腫瘤細(xì)胞環(huán)境中的蛋白酶識別的切割位點序列。結(jié)構(gòu)域(a)和結(jié)構(gòu)域(b)通過至少一個結(jié)構(gòu)域(C)連接意思是在結(jié)構(gòu)域(a)和(b)之間可以存在不止一個結(jié)構(gòu)域(C)，特別是I個或2個結(jié)構(gòu)域(C)。
[0140]蛋白酶切割位點可以選自:
[0141]-被金屬蛋白酶MMP識別的序列，特別是表示為SEQ.N0.45的(Pro Leu Gly LeuAla Gly Glu Pro/PLGLAGEP)或(Pro Leu Gly He Ala Gly Glu/PLGIAGE)或(Pro LeuGly Leu Ala Gly GluPro/PLGLAGEP)；
[0142]-被尿激酶uPA識別的序列，特別是表示為SEQ.N0.46的Arg Val Val Arg (RVVR)；或其片段，其與其所結(jié)合的序列的最后一個氨基酸形成SEQ.N0.46 ；
[0143]以及它們的組合。
[0144]在本發(fā)明的一個實施方式中，蛋白酶切割位點是被金屬蛋白酶MMP識別的序列與被尿激酶uPA識別的序列的組合，以任何順序彼此相鄰。
[0145]在一個實施方式中，結(jié)構(gòu)域(c)是MMP/uPA的組合，例如SEQ.N0.45/SEQ.N0.46的組合，或uPA/MMP的組合，例如SEQ.No46/SEQ.N0.45的組合。
[0146]金屬蛋白酶MMP和尿激酶uPA在腫瘤環(huán)境中過表達(dá)。被蛋白酶識別的序列的存在能夠使結(jié)構(gòu)域(a)從結(jié)構(gòu)域(b)切割下來，即釋放效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域(b)并由此實現(xiàn)其激活。
[0147]蛋白酶切割位點的存在允許迅速釋放效應(yīng)子肽，增加融合蛋白被存在于細(xì)胞中的蛋白酶隨機(jī)降解之前肽向其作用位點轉(zhuǎn)運的機(jī)會。
[0148]此外，轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(d)可連接于本發(fā)明的融合蛋白的效應(yīng)子肽的結(jié)構(gòu)域(b)。
[0149]結(jié)構(gòu)域(d)可以例如選自:
[0150](dl)由6，7，8，9，10或11個Arg殘基組成的轉(zhuǎn)運通過細(xì)胞膜的聚精氨酸序列，
[0151](d2)作為轉(zhuǎn)運通過細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)域的觸角足蛋白結(jié)構(gòu)域的片段(SEQ.N0.48)，
[0152](d3)作為轉(zhuǎn)運通過細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)域的觸角足蛋白結(jié)構(gòu)域的另一個片段(SEQ.N0.49)，
[0153]及其組合。
[0154]結(jié)構(gòu)域(dl)、(d2)和(d3)的組合可具體地包括(dl)/(d2)、(dl)/(d3)或(dl)/(d2)/(d3)的組合。
[0155]此外，結(jié)構(gòu)域(dl)、(d2)和(d3)的組合可包括彼此相鄰的并且連接于結(jié)構(gòu)域(b)的一個末端和/或連接于結(jié)構(gòu)域(b)的不同末端的結(jié)構(gòu)域。
[0156]應(yīng)當(dāng)理解,在當(dāng)融合蛋白具有連接于結(jié)構(gòu)域(b)的轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(d)和在結(jié)構(gòu)域(a)和(b)之間具有切割位點的結(jié)構(gòu)域(C)的情況下，結(jié)構(gòu)域(C)以在切割構(gòu)建體轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(d)后仍然連接于結(jié)構(gòu)域(b)的方式定位。換句話說，如果融合蛋白包含轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(d)和切割位點結(jié)構(gòu)域(c)，則結(jié)構(gòu)域(d)位于結(jié)構(gòu)域(b)和結(jié)構(gòu)域(c)之間，或位于與結(jié)構(gòu)域(d)的連接位置相對的結(jié)構(gòu)域(b)的末端。
[0157]本發(fā)明不包括其中結(jié)構(gòu)域(d)位于結(jié)構(gòu)域(C)和結(jié)構(gòu)域(a)之間的這樣的變體，即為當(dāng)切割構(gòu)建體轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域后仍然連接于TRAIL結(jié)構(gòu)域的情況。
[0158]構(gòu)成觸角足蛋白結(jié)構(gòu)域的片段(SEQ.N0.48)以及觸角足蛋白結(jié)構(gòu)域的另一個片段(SEQ.N0.49)的易位結(jié)構(gòu)域能夠通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移(Derossi D, AH Joliot1GChassaings, A Prochiantz, J Biol Chem.269:10444-10450 (1994)并且可用于將效應(yīng)子月太引入腫瘤細(xì)胞區(qū)室。[0159]轉(zhuǎn)運通過細(xì)胞膜的序列(dl)可以是本領(lǐng)域已知的由幾個精氨酸殘基組成的任何序列，其將效應(yīng)子肽轉(zhuǎn)移通過細(xì)胞膜至靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(D.，Hea, H.，Yangb, Q.，Lina, H.，Huang, Arg9-peptide facilitates the internalization of an ant1-CEA immunotoxin andpotentiates its specific cytotoxicity to target cells, The international Journalof Biochemistry & Cell Biology37 (2005) 192 - 205; Shiroh Futaki 等人 JBC,第 276卷，N0.8，2 月 23 日，pp.5836 - 5840，2001)。
[0160]其它有用的細(xì)胞滲透性肽描述于F.Said Hassane等人Cell.Mol.Life Sc1.D0I10.1007/s00018-009-0186-0 中。
[0161]除了融合蛋白的主要功能元件和切割位點結(jié)構(gòu)域之外，本發(fā)明的融合蛋白可包含中性序列/柔性空間甘氨酸-半胱氨酸-丙氨酸連接子(間隔子)的序列。此類連接子/間隔子是本領(lǐng)域熟知的并且在文獻(xiàn)中有描述。將它們摻入融合蛋白的序列中是為了使得通過在宿主細(xì)胞中過表達(dá)而產(chǎn)生的蛋白的正確折疊。
[0162]特別地，柔性空間連接子可以是SEQ.N0.47，其為半胱氨酸和丙氨酸殘基的組合。在另一實施方式中，柔性空間連接子可以是甘氨酸和絲氨酸殘基的組合例如片段Gly GlyGly Ser Gly/GGGSG，或用作空間連接子的其任何片段例如Gly Gly Gly/GGG。
[0163]在其它實施方式中，柔性空間連接子可以是SEQ.N0.47和甘氨酸和絲氨酸殘基組成的任何連接子組合，例如片段Gly Gly Gly Ser Gly/GGGSG或用作空間連接子的其任何片段例如片段Gly Gly Gly/GGG。在這樣的情況下，空間連接子可以是甘氨酸、半胱氨酸和丙氨酸殘基的組合，例如 Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys Gly Gly Gly/CAACAAACGGG。
[0164]在其它實施方式中，柔性空間連接子可以是序列Gly Gly Gly Cys Ala Ala AlaCys Ala Ala Cys Gly Ser Gly/GGGCAAACAACGSG(SEQ.N0.77)或其任意組合。
[0165]在一個實施方式中，柔 性空間連接子也可以選自單一氨基酸殘基，例如單一半胱氨酸殘基。
[0166]本發(fā)明的【具體實施方式】是選自由SEQ.N0.1、SEQ.N0.4、SEQ.N0.5和SEQ.N0.6代表的蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)，其包含由SEQ.N0.27所示的人甲胎蛋白的34個氨基酸的片段作為抗增殖效應(yīng)子肽。
[0167]本發(fā)明的其它【具體實施方式】是選自由SEQ.N0.2、SEQ.N0.3和SEQ.N0.7所示的蛋白質(zhì)的融合蛋白，其包含SEQ.N0.28所示的人甲胎蛋白的8個氨基酸的片段作為抗增殖效應(yīng)子肽。
[0168]本發(fā)明的其它【具體實施方式】是選自由SEQ.N0.8和SEQ.N0.9所示的蛋白質(zhì)的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.29所示的來自P21WAF的肽作為效應(yīng)子肽。
[0169]本發(fā)明的其它【具體實施方式】是由SEQ.N0.10所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.26所示的來自結(jié)構(gòu)域結(jié)合性FGF-2受體的16個氨基酸類似物作為效應(yīng)子肽。
[0170]本發(fā)明的其它【具體實施方式】是由SEQ.N0.11所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.30所示的來自D0C-2/DAB2蛋白的DD2作為效應(yīng)子肽。
[0171]本發(fā)明的其它【具體實施方式】是由SEQ.N0.12所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.31所示的來自精氨酸支原體的精氨酸脫亞胺酶作為效應(yīng)子肽。
[0172]本發(fā)明的其它【具體實施方式】是由SEQ.N0.13所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.32所示的pl6肽的片段作為效應(yīng)子肽。[0173]本發(fā)明的其它【具體實施方式】是由SEQ.N0.13所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.33所示的與觸角足蛋白的17個氨基酸的轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域融合的pl6肽的片段作為效應(yīng)子肽。
[0174]本發(fā)明的其它【具體實施方式】是由SEQ.N0.14所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.34所示的MEK-1蛋白的片段作為效應(yīng)子肽。
[0175]本發(fā)明的其它【具體實施方式】是由SEQ.N0.15所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.35所示的TCLl蛋白的PH結(jié)構(gòu)域的N末端片段作為效應(yīng)子肽。
[0176]本發(fā)明的其它【具體實施方式】是由SEQ.N0.16所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.36所示的六肽Phe-Trp-Leu-Arg-Phe-Thr作為效應(yīng)子肽。
[0177]本發(fā)明的其它【具體實施方式】是由SEQ.N0.17所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.37所示的微管蛋白的13個氨基酸的片段作為效應(yīng)子肽。
[0178]本發(fā)明的其它【具體實施方式】是由SEQ.N0.18所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.39所示的微管蛋白的10個氨基酸的片段作為效應(yīng)子肽。
[0179]本發(fā)明的其它【具體實施方式】是由SEQ.N0.19所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.39所示的蜂毒肽作為效應(yīng)子肽。
[0180]本發(fā)明的其它【具體實施方式】是由SEQ.N0.20所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.40所示的基于蜂防衛(wèi)素的序列的6個氨基酸的肽C2作為效應(yīng)子肽。
[0181]本發(fā)明的其它【具體實施方式】是由SEQ.N0.21所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.41所示的結(jié)合FGF-2配體的8個氨基酸的肽作為效應(yīng)子肽。
[0182]本發(fā)明的其它【具體實施方式】是由SEQ.N0.22所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.42所示的15個氨基酸的肽lasioglossin LL2作為效應(yīng)子`肽。
[0183]本發(fā)明的其它【具體實施方式】是由SEQ.N0.23所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.43所示的結(jié)合RasGAP的SH3結(jié)構(gòu)域的13個氨基酸的肽作為效應(yīng)子肽。
[0184]本發(fā)明的其它【具體實施方式】是由SEQ.N0.25所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.44所示的Pep27肽的類似物作為效應(yīng)子肽。
[0185]上述代表性融合蛋白的詳細(xì)描述顯示于圖1-5，以及如下文的實施例所描述。
[0186]根據(jù)本發(fā)明，融合蛋白意思是包含2個或更多個蛋白或其片段的單一的蛋白分子，所述2個或更多個蛋白或其片段通過它們各自的肽鏈內(nèi)的肽鍵共價連接而無另外的化學(xué)連接子。
[0187]融合的蛋白也可另外被描述為蛋白構(gòu)建體或嵌合蛋白。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“構(gòu)建體”或“嵌合蛋白”如果被使用的話，應(yīng)該被理解為是指上文定義的融合蛋白。
[0188]對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，顯而易見的是由此定義的融合蛋白可通過肽和蛋白的已知的化學(xué)合成方法來合成。
[0189]融合蛋白可通過化學(xué)肽合成的方法來合成，特別是使用合適的樹脂作為載體，使用固相肽合成技術(shù)進(jìn)行。此類技術(shù)是常規(guī)的和本領(lǐng)域已知的，特別描述于例如下列專論中:Bodanszky 和 Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag,New York, Stewart 等人，Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, PierceChemical Company。
[0190]融合蛋白可通過肽的化學(xué)合成方法作為連續(xù)蛋白來合成?；蛘?，可以單獨合成蛋白的各個片段(結(jié)構(gòu)域)，然后通過一個肽片段的氨基末端與另一個肽的羧基末端的縮合經(jīng)由肽鍵而組合在一起。此類技術(shù)是常規(guī)的和本領(lǐng)域已知的。
[0191]為了驗證得到的肽的結(jié)構(gòu)，可以使用肽的氨基酸組成的已知的分析方法，例如高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，以確定肽的分子量。為了確認(rèn)肽的序列，也可以使用蛋白測序儀，其依次降解肽并鑒定氨基酸的序列。
[0192]然而，優(yōu)選地，本發(fā)明的融合蛋白是重組蛋白，通過編碼融合蛋白的多核苷酸序列在宿主細(xì)胞中的基因表達(dá)的方法來產(chǎn)生。
[0193]本發(fā)明的另一方面是編碼如上所述的融合蛋白的多核苷酸序列、特別是DNA序列。
[0194]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的編碼如上所述的融合蛋白的多核苷酸序列、特別是DNA序列是針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的序列。
[0195]本發(fā)明的另一個方面是包含多核苷酸序列、特別是如上所述的本發(fā)明的DNA序列的表達(dá)載體。
[0196]本發(fā)明的另一個方面是包含上文所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0197]用于表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的優(yōu)選宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
[0198]用于產(chǎn)生重組蛋白、包括融合蛋白的方法是熟知的。簡而言之，該技術(shù)為:產(chǎn)生編碼靶蛋白的氨基酸序列和在宿主中指導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)的多核苷酸分子例如DNA分子。然后，將編碼靶蛋白的多核苷酸分子摻入合適的表達(dá)載體，其確保多肽的有效表達(dá)。然后將重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞以進(jìn)行轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化，由此產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。然后培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以過表達(dá)靶蛋白，純化所獲`得的蛋白，任選地通過切割用于表達(dá)或純化蛋白的標(biāo)簽序列而切下來。
[0199]用于表達(dá)和純化的合適的技術(shù)描述于例如下列專著:Goeddel, Gene ExpressionTechnology, Methods in Enzymologyl85, Academic Press,San Diego,CA(1990)和A.Staron 等人,Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995。
[0200]作為用于導(dǎo)入和在宿主細(xì)胞中復(fù)制DNA序列的表達(dá)載體，可以使用粘粒、質(zhì)?；蛐揎椀牟《?。通常使用質(zhì)粒作為表達(dá)載體。合適的質(zhì)粒是熟知的和商業(yè)上可獲得的。
[0201]本發(fā)明的表達(dá)載體包含編碼本發(fā)明的融合蛋白的多核苷酸分子和用于轉(zhuǎn)錄和翻譯摻入合適的宿主細(xì)胞的編碼序列的必要的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的選擇取決于宿主細(xì)胞的類型，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地進(jìn)行。此類調(diào)節(jié)序列的實例是包含轉(zhuǎn)錄起始信號的、插入編碼序列之前的轉(zhuǎn)錄啟動子和增強(qiáng)子或RNA聚合酶結(jié)合序列，核糖體結(jié)合序列，和插入編碼序列之后的轉(zhuǎn)錄終止序列。此外，取決于所用的宿主細(xì)胞和載體，可以將其它序列導(dǎo)入表達(dá)載體，例如復(fù)制起始子，另外的DNA限制性位點，增強(qiáng)子和允許誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的序列。
[0202]表達(dá)載體還包含標(biāo)記物基因序列，其賦予轉(zhuǎn)化的細(xì)胞確定的表型并使得能夠特異性選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。此外，載體還可以包含第二標(biāo)記物序列，其允許將以包含插入的編碼靶蛋白序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞與攝取了無插入物的質(zhì)粒的細(xì)胞區(qū)分開。通常，使用典型的抗生素抗性標(biāo)記物，然而，任何其它本領(lǐng)域已知的報告子基因均可使用，其在細(xì)胞(在體內(nèi))中的存在可使用放射自顯影技術(shù)、分光光度法或生物和化學(xué)發(fā)光法容易地確定。例如，取決于宿主細(xì)胞，可使用例如下列報告基因:β -半乳糖苷酶、β -葡萄糖苷酸酶、螢光素酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或綠色熒光蛋白。[0203]此外，表達(dá)載體可包含信號序列，其將蛋白轉(zhuǎn)運至合適的細(xì)胞腔室，例如周質(zhì)，在那里促進(jìn)折疊。另外，可以存在編碼標(biāo)記物/標(biāo)簽例如連接于N末端的HisTag或連接于C末端的GST的序列，其促進(jìn)后續(xù)使用親和法、通過鎳柱上的親和層析純化所產(chǎn)生的蛋白。也可以存在另外的序列，其保護(hù)蛋白免于宿主細(xì)胞中的蛋白水解降解，以及增強(qiáng)其溶解性的序列。
[0204]連接于靶蛋白的序列的輔助元件可能阻斷其活性，或者由于別的原因而具有有害效應(yīng)，例如由于毒性。此類元件必須被除掉，這可通過酶促或化學(xué)切割來完成。特別地，為了允許通過親和層析而純化蛋白而連接的6個組氨酸的標(biāo)簽HisTag或這種類型的其它標(biāo)記物應(yīng)該被除去，因為其被描述對于可溶性TRAIL蛋白的肝臟毒性具有影響?？梢允褂没诙喾N熟知的宿主細(xì)胞的異源表達(dá)系統(tǒng)，包括原核細(xì)胞:細(xì)菌，例如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌；酵母，例如釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母；和真核細(xì)胞系(昆蟲、哺乳動物、植物)。
[0205]優(yōu)選地，由于培養(yǎng)和遺傳操作的容易性和大量的獲得的產(chǎn)物，使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。因此，包含編碼本發(fā)明的融合蛋白的靶序列的多核苷酸序列將針對在大腸桿菌中的表達(dá)而進(jìn)行優(yōu)化，即，其將包含在大腸桿菌中表達(dá)優(yōu)化的編碼序列密碼子，選自本領(lǐng)域已知的可能的序列變體。此外，表達(dá)載體將包含適合大腸桿菌的連接于編碼序列的上述元件。
[0206]因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的包含編碼本發(fā)明的融合蛋白的序列的多核苷酸序列選自下組的多核苷酸序列:[0207]SEQ.N0.50 ；SEQ.N0.51 ；SEQ.N0.52 ；SEQ.N0.53 ；SEQ.N0.54 ；SEQ.N0.55 ；SEQ.N0.56 ；SEQ.N0.57 ；SEQ.N0.58 ；SEQ.N0.59 ；SEQ.N0.60 和 SEQ.N0.61 ；SEQ.N0.62; SEQ.N0.63; SEQ.N0.64; SEQ.N0.65; SEQ.N0.66，SEQ.N0.67 ；SEQ.N0.68 ；SEQ.N0.69 ；SEQ.N0.70 ；SEQ.N0.71 ；SEQ.N0.72 ；SEQ.N0.73 ；SEQ.N0.74 和 SEQ.N0.76 ;其分別編碼具有對應(yīng)于選自下列的氨基酸序列的氨基酸序列的融合蛋白:
[0208]SEQ.N0.1 ；SEQ.N0.2 ；SEQ.N0.3 ；SEQ.N0.4 ；SEQ.N0.5 ；SEQ.N0.6 ；SEQ.N0.7 ；SEQ.N0.8 ；SEQ.N0.9 ；SEQ.N0.10 ；SEQ.N0.11，SEQ.N0.12，SEQ.N0.13 ；SEQ.N0.14 ；SEQ.N0.15，SEQ.N0.16 ；SEQ.N0.17 ；SEQ.N0.18 ；SEQ.N0.19; SEQ.N0.20 ; SEQ.N0.21; SEQ.N0.22; SEQ.N0.23; SEQ.N0.24; SEQ.N0.25 和 SEQ.N0.75。
[0209]在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明還提供了適合于轉(zhuǎn)化大腸桿菌的表達(dá)載體,其包含上述選自SEQ.N0.50至SEQ.N0.74和SEQ.N0.76的多核苷酸序列，以及以此類表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞。
[0210]轉(zhuǎn)化，即將DNA序列導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞特別是大腸桿菌，通常在準(zhǔn)備好攝取DNA的感受態(tài)細(xì)胞上進(jìn)行，例如通過以鈣離子在低溫(4°C )處理，然后進(jìn)行熱擊(37-42°C )或通過電穿孔進(jìn)行。此類技術(shù)是熟知的并且通常由表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)商確定，或描述于文獻(xiàn)和實驗室工作手冊中，例如 Maniatis 等人，Molecular Cloning.Cold Spring Harbor, N.Y.，1982)。
[0211]在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中過表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的程序?qū)⒃谙挛脑斒觥?br> [0212]本發(fā)明還提供了包含如上文所述的本發(fā)明的融合蛋白作為活性成分以及合適的藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和常規(guī)輔助性成分的藥物組合物。藥物組合物將包含有效量的本發(fā)明的融合蛋白和藥學(xué)上可接受的溶解或分散于載體或稀釋劑中的輔助性成分，優(yōu)選是配制為單元劑型或包含多劑的制劑的藥物制劑的形式。藥物形式和其配制方法以及其它成分、載體和稀釋劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且在文獻(xiàn)中有描述。例如，描述于下列專著：Remington's Pharmaceutical Sciences, ed.20, 2000, Mack PublishingCompany, Easton, USA。
[0213]術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和輔助性成分”包含本領(lǐng)域已知的任何溶劑、分散介質(zhì)、表面活性劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑(例如抗細(xì)菌劑、抗真菌劑)等滲劑。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的載體可包含多種類型的載體、稀釋劑和賦形劑，這取決于所選的施用途徑和需要的劑型，例如液體、固體和氣霧劑形式，用于口服、胃腸外、吸入、表面，以及所選的形式對于施用途徑(例如注射)是否必須是無菌的。本發(fā)明的藥物組合物的優(yōu)選施用途徑是胃腸外，包括注射途徑，例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、腫瘤內(nèi)或通過單次或連續(xù)靜脈內(nèi)輸注。
[0214]在一個實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物可以通過直接注射至腫瘤來施用。在另一實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物可通過靜脈內(nèi)施用。在另一實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物可皮下或腹膜內(nèi)施用。用于胃腸外施用的藥物組合物可以是藥學(xué)上可接受的水性或非水性介質(zhì)中的溶液或分散體，所述介質(zhì)緩沖至合適的pH和與體液等滲(如果必要)，并且還可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和可溶性物質(zhì)，其使得組合物與受體的組織或血液相容?？砂诮M合物中的其它成分是例如水、醇例如乙醇、多元醇例如甘油、丙二醇，液體乙二醇，脂質(zhì)例如甘油三酯，植物油，脂質(zhì)體。合適的流動性和物質(zhì)粒度可通過涂覆性物質(zhì)例如卵磷脂和表面活性劑例如羥丙基纖維素、聚山梨酸酯等來提供。
[0215]用于液體胃腸外組合物的合適的等滲劑是例如糖，例如葡萄糖，和氯化鈉，及其組
口 ο
[0216]或者，用于通過注射或輸注施用的藥物組合物可以是粉末形式，例如凍干的粉末，用于在臨使用前以合適的載體例如無菌無熱源水進(jìn)行重構(gòu)。
[0217]用于胃腸外施用的本發(fā)明的藥物組合物也可具有經(jīng)鼻施用的形式，包括溶液、噴霧劑或氣霧劑。優(yōu)選地，用于經(jīng)鼻施用的形式可以是水溶液，并且是等滲的或緩沖至保持從大約5.5至大約6.5的pH，以維持類似于鼻分泌物的性質(zhì)。此外，其將包含防腐劑或穩(wěn)定劑，例如熟知的鼻內(nèi)制劑中包含的那些。
[0218]組合物可包含多種抗氧化劑，其延遲一種或多種成分的氧化。此外，為了防止微生物的作用，組合物可包含多種抗細(xì)菌和抗真菌試劑，包括例如，但不限于，尼鉬金酯類，氯丁醇，硫柳汞，山梨酸和這種類型的類似的已知物質(zhì)。一般地，本發(fā)明的藥物組合物可以包含例如至少大約0.01wt%的活性成分。更具體地,組合物可包含1%至75%重量的活性成分，或例如25%至60%重量，但不限于這些數(shù)值。施用于患者包括人類的根據(jù)本發(fā)明的組合物的實際劑量將由物理和生理因素決定，例如體重、病況的嚴(yán)重性、被治療的疾病的類型，之前或同時的治療性干預(yù)，患者和施用途徑。合適的單元劑量，總劑量和組合物中的活性成分的濃度將由主治醫(yī)生決定。
[0219]組合物可例如以下列劑量施用:大約I μ g/kg體重至大約1000mg/kg患者體重，例如5mg/kg體重至100mg/kg體重,或5mg/kg體重至500mg/kg體重。融合蛋白和包含它的組合物顯示出抗癌或抗腫瘤活性，可用于治療癌癥疾病。本發(fā)明還提供了如上所述的本發(fā)明的融合蛋白用于治療哺乳動物包括人類中的癌癥疾病的用途。本發(fā)明還提供了治療哺乳動物包括人類中的腫瘤(neoplastic) /癌癥的方法，包括向有此需要的受試者施用抗腫瘤/抗癌有效量的如上所述的本發(fā)明的融合蛋白，任選為合適的藥物組合物的形式。
[0220]本發(fā)明的融合蛋白可用于治療血液惡性腫瘤，例如白血病，肉芽腫病，骨髓瘤和其它血液惡性腫瘤。融合蛋白也可用于治療實體瘤，例如乳腺癌、肺癌包括非小細(xì)胞肺癌，結(jié)腸癌，胰腺癌，卵巢癌，膀胱癌，前列腺癌，腎癌，腦癌等。用于治療癌癥的融合蛋白的合適的施用途徑特別為胃腸外途徑:以注射或輸注的形式、在組合物中和以適合于該施用途徑的形式施用本發(fā)明的融合蛋白。本發(fā)明將以下列一般性程序和具體融合蛋白的實例進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
[0221]用于過表達(dá)融合蛋白的一般性程序
[0222]質(zhì)粒的制備
[0223]靶融合蛋白的氨基酸序列用作模板以產(chǎn)生編碼它的DNA序列，包含針對在大腸桿菌中的表達(dá)優(yōu)化了的密碼子。此程序允許增大在大腸桿菌中進(jìn)行靶蛋白合成的后續(xù)步驟的效率。然后自動化合成得到的核苷酸序列。另外，將限制性酶Ndel的切割位點(在引導(dǎo)鏈的5’末端)和Xhol的切割位點(在引導(dǎo)鏈的3’末端)添加到得到的編碼靶蛋白的基因中。它們用于將基因克隆進(jìn)入載體pET28a(Novagen)。它們也可用于將編碼蛋白的基因克隆進(jìn)入其它載體。從該構(gòu)建體表達(dá)而來的靶蛋白在N末端可任選地具有多聚組氨酸標(biāo)簽(6個組氨酸)，其之前是凝血酶識別的位點，該位點用于后續(xù)通過親和層析進(jìn)行純化。一些靶在不使用任何標(biāo)簽的情況下表達(dá)，特別是不使用組氨酸標(biāo)簽，隨后在SP瓊脂糖上純化。首先通過使用酶Ndel和Xhol對分離的質(zhì)粒進(jìn)行限制性分析、然后通過靶蛋白的整個閱讀框的自動化測序來確認(rèn)得到的構(gòu)建體的正確性。用于測序的引物互補(bǔ)于存在于載體中的T7啟動子的序列(5’ -TAATACGACTCACTATAGG-3’)和T7終止子的序列(5’ -GCTAGTTATTGCTCA GCGG-3’)。得到的質(zhì)粒用于在商業(yè)化大腸桿菌菌株中過表達(dá)靶融合蛋白，所述菌株根據(jù)生產(chǎn)商的推薦進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在選擇性培養(yǎng)基(LB瓊脂，卡那霉素50 μ g/ml, 1%葡萄糖)上獲得的菌落用于制備LB液體培養(yǎng)基(補(bǔ)充了 50 μ g/ml的卡那霉素和1%葡萄糖)中的過夜培養(yǎng)物。在搖動的溫育箱中生長大約15小時之后，培養(yǎng)物用于接種合適的培養(yǎng)物。
[0224]融合蛋白的過表達(dá)和純化一一般程序A
[0225]以過夜培養(yǎng)物接種含有卡那霉素(30 μ g/ml)和100 μ M硫酸鋅的LB培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物在37°C溫育直至600nm下的光密度(OD)達(dá)到0.60-0.80。然后加入IPTG至終濃度為0.25-lmM。在25°C搖動溫育后(3.5_20h)，將培養(yǎng)物在6，OOOg離心25分鐘。將細(xì)菌沉淀物重懸于含有50mM KH2PO4, 0.5M NaCl，IOmM咪唑，pH7.4的緩沖液中。將懸浮液在冰上超聲8分鐘(40%振幅，15秒脈沖，10秒間隔)。通過在20000g、4°C離心40分鐘而使得到的提取物澄清。以用于制備細(xì)菌細(xì)胞提取物的緩沖液平衡來預(yù)處理N1-Sepharose樹脂(GEHealthcare)。然后使用離心提取物后獲得的上清液將樹脂在4°C過夜溫育。然后將其載入色譜柱并以15-50倍體積的緩沖液50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, 20mM咪唑，pH7.4洗滌。使用含有0.5M NaCl pH7.4的50mM KH2PO4緩沖液中的咪唑梯度從柱洗脫獲得的蛋白。通過SDS-PAGE分析獲得的級份。將合適的級份組合并針對50mM Tris緩沖液，pH7.2，150mMNaCl, 500mM L-精氨酸，0.1mM ZnSO4, 0.01%Tween20在4°C過夜透析，同時，以凝血酶(1:50)切割Histag(如果存在的話)。切割之后，通過使用Benzamidine Sepharose?樹脂純化而從與Histag —起表達(dá)的祀融合蛋白分離凝血酶。在SP瓊脂糖上進(jìn)行不與Histag —起表達(dá)的祀融合蛋白的純化。通過SDS-PAGE電泳分析產(chǎn)物的純度(Maniatis等人，MolecularCloning.Cold Spring Harbor, NY, 1982)。
[0226]融合蛋白的過表達(dá)和純化一一般程序B
[0227]以過夜培養(yǎng)物接種含有卡那霉素(30 μ g/ml)和100 μ M硫酸鋅的LB培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物在37°C溫育直至600nm下的光密度(OD)達(dá)到0.60-0.80。然后加入IPTG至終濃度為0.5-lmM。在25°C搖動溫育20h后，將培養(yǎng)物在6000g離心25分鐘。將過表達(dá)后的細(xì)菌細(xì)胞在弗氏細(xì)胞壓碎器中在含有50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, IOmM咪唑，5mMβ -巰基乙醇，0.5mMPMSF(苯基甲基磺酰氟)，pH7.8的緩沖液中破碎。通過在8000g離心50分鐘使得到的提取物澄清。使用獲得的上清液過夜溫育N1-Sepharose樹脂。然后將結(jié)合了蛋白的樹脂載入色譜柱。為了洗掉含有非結(jié)合性蛋白的級份，以15-50倍體積的緩沖液50mM KH2PO4, 0.5MNaCl，IOmM咪唑，5mM β -巰基乙醇，0.5mM PMSF (苯基甲基磺酰氟)，pH7.8洗滌柱。然后，為了洗掉大部分的特異性與床結(jié)合的蛋白，以含有50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, 500mM咪唑，10%甘油，0.5mM PMSF, pH7.5的緩沖液洗滌柱。通過SDS-PAGE分析獲得的級份(Maniatis等人，Molecular Cloning.Cold Spring Harbor, NY, 1982)。將含有革巴蛋白的級份組合(如果蛋白是與組氨酸標(biāo)簽一起表達(dá))，以凝血酶切割(lU/4mg蛋白，16°C，8小時)以除掉多聚組氨酸標(biāo)簽。然后將級份針對配制緩沖液(500mM L-精氨酸，50mM Tris, 2.5mM ZnSO4, pH7.4)透析。
[0228]此外，在本說明書中最初表達(dá)、隨后被除去的組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)在Ex.N0.中被稱為a)。最初表達(dá)為不具有組氣酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)在Ex.N0.中被稱為b)。
[0229]實施例1:SEQ.N0.1的融合蛋白
[0230]SEQ.N0.1的蛋白是具有203個氨基酸的長度和23.3kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中人甲胎蛋白的34個氨基酸的片段(SEQ.N0.27)連接于TRAIL114-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽和TRAIL序列之間插入了被尿激酶uPA識別的切割位點的序列(SEQ.N0.46)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。
[0231]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖1，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.1和SEQ.N0.50。
[0232]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.1用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.50。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá),使用大腸桿菌BL21 (DE3)菌株或來自Novagen的Tuner (DE3) pLysS菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0233]實施例2:SEQ.N0.2的融合蛋白
[0234]SEQ.N0.2的蛋白是具有178個氨基酸的長度和20.5kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中人甲胎蛋白的8個氨基酸的片段(SEQ ID N0:28)連接于序列TRAIL114-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽和TRAIL序列之間插入了被尿激酶uPA識別的切割位點的序列(SEQ.N0.46)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。
[0235]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖1，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼 序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.2和SEQ.N0.51。
[0236]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.2用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.51。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌BL21 (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0237]實施例3:SEQ.N0.3的融合蛋白
[0238]SEQ.N0.3的蛋白是具有179個氨基酸的長度和20.5kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中人甲胎蛋白的8個氨基酸的序列(SEQ.N0.28)連接于序列TRAIL121-281的C末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽與TRAIL的序列之間插入了彼此連續(xù)的被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點序列(SEQ.N0.45)和被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。 [0239]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖1，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.3和SEQ.N0.52。
[0240]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.3用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.52。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌BL21 (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0241]實施例4:SEQ.N0.4的融合蛋白
[0242]SEQ.N0.4的蛋白是具有204個氨基酸的長度和23.2kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中人甲胎蛋白的34個氨基酸的片段(SEQ.N0.27)連接于序列TRAIL121-281的C末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽與TRAIL的序列之間插入了彼此連續(xù)的被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)和尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。
[0243]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖1，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.4和SEQ.N0.53。
[0244]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.4用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.53。產(chǎn)生包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá),使用來自Stratagene的大腸桿菌BL21DE3pLysSRIL菌株或來自Novagen的Tuner(DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0245]實施例5:SEQ.N0.5的融合蛋白
[0246]SEQ.N0.5的蛋白是具有230個氨基酸的長度和26kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中人甲胎蛋白的34個氨基酸的片段(SEQ.N0.27)連接于序列TRAIL95-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽和TRAIL序列之間插入了彼此連續(xù)的被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。
[0247]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖1，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.5和SEQ.N0.54。
[0248]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.5用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.54。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá),使用來自Novagen的大腸桿菌Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0249]實施例6:SEQ.N0.6的融合蛋白[0250]SEQ.N0.6的蛋白是具有238個氨基酸的長度和26.7kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中人甲胎蛋白的34個氨基酸的片段(SEQ.N0.27)連接于序列TRAIL95-281的C末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽和TRAIL序列之間插入了彼此連續(xù)的被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)和被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。在TRAIL序列和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點序列之間，融合蛋白額外地包含柔性半胱氨酸-丙氨酸連接子(SEQ.N0.47)。[0251]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖2，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯不于序列表中的SEQ.N0.6和SEQ.N0.55。
[0252]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.6用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.55。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá),使用來自Novagen的大腸桿菌Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0253]實施例7:SEQ.N0.7的融合蛋白
[0254]SEQ.N0.7的蛋白是具有213個氨基酸的長度和24.1kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中人甲胎蛋白的8個氨基酸的片段(SEQ.N0.28)連接于序列TRAIL95-281的C末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽序列和TRAIL序列之間插入了彼此連續(xù)的被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)和被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。在TRAIL序列和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點序列之間，融合蛋白額外地包含柔性半胱氨酸-丙氨酸連接子(SEQ.N0.47)。
[0255]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖2，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.7和SEQ.N0.56。
[0256]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.7用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.56。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá),使用來自Novagen的大腸桿菌Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0257]實施例8.SEQ.N0.8的融合蛋白
[0258]SEQ.N0.8的蛋白是具有191個氨基酸的長度和23kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中源自P21WAF蛋白的肽的20個氨基酸的片段(SEQ.N0.29)連接于序列TRAIL121-281的N末端作為效應(yīng)子肽。此外，觸角足蛋白結(jié)構(gòu)域的片段(SEQ.N0.49)連接于效應(yīng)子蛋白的C末端作為轉(zhuǎn)運肽，其幫助穿過細(xì)胞膜并且將融合肽轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞。在轉(zhuǎn)運序列與TRAIL序列之間插入了彼此連續(xù)的被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。
[0259]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖2，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.8和SEQ.N0.57。
[0260]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.8用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.57。產(chǎn)生了兩種形式的包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，一種允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點的序列，第二形式無任何標(biāo)簽，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá),使用來自Novagen的大腸桿菌Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。[0261]實施例8A:SEQ.N0.75的融合蛋白
[0262]SEQ.N0.75的蛋白是具有212個氨基酸的長度和24.13kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中來源于P21WAF蛋白的肽的20個氨基酸的片段(SEQ.N0.29)連接于序列TRAIL120-281的N末端作為效應(yīng)子肽。此外，觸角足蛋白結(jié)構(gòu)域的片段(SEQ.N0.49)連接于效應(yīng)子蛋白的C末端上作為轉(zhuǎn)運序列，所述轉(zhuǎn)運序列幫助穿過細(xì)胞膜并且將融合蛋白運入細(xì)胞。在轉(zhuǎn)運序列和TRAIL序列之間插入了彼此連續(xù)的被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。此外，在金屬蛋白酶切割位點與TRAIL的序列之間，融合蛋白包含額外的柔性連接子(SEQ.N0.77)。
[0263]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖2，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.75和SEQ.N0.76。
[0264]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.75用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.76。產(chǎn)生了兩種形式的包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，一種允許表達(dá)His標(biāo)簽和被凝血酶識別的位點，另一種不含任何標(biāo)簽，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0265]實施例9:SEQ.N0.9的融合蛋白
[0266]SEQ.N0.9的蛋白是具有231個氨基酸的長度和26.5kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中源自P21WAF蛋白的肽的20個氨基酸序列(SEQ ID NO: 29)連接于序列TRAIL95-281的C末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽與TRAIL序列之間，插入了彼此連續(xù)的被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)和被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。在TRAIL序列和切割位點序列之間，融合蛋白額外地包含柔性半胱氨酸-丙氨酸連接子(SEQ.N0.47)。此外，觸角足蛋白結(jié)構(gòu)域的片段(SEQ.N0.49)連接于效應(yīng)子肽的C末端，從而形成作為轉(zhuǎn)運序列的完整構(gòu)`建體的C末端片段，所述轉(zhuǎn)運序列幫助穿過細(xì)胞膜，并且將融合蛋白運入細(xì)胞。
[0267]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖2，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.9和SEQ.N0.58。
[0268]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.9用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.58。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá),使用來自Novagen的大腸桿菌Rosetta (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0269]實施例10:SEQ.N0.10的融合蛋白
[0270]SEQ.N0.10的蛋白是具有200個氨基酸的長度和22.8kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中結(jié)合FGF-2受體的結(jié)構(gòu)域的肽類似物的16個氨基酸的片段(SEQ.N0.26)連接于序列TRAIL120-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽與TRAIL序列之間插入了彼此連續(xù)的被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。在TRAIL序列與切割位點序列之間，整合蛋白質(zhì)額外地包含柔性半胱氨酸-丙氨酸連接子(SEQ.N0.47)。此外，切割位點序列與柔性連接子序列之間以及柔性連接子序列與TRAIL結(jié)構(gòu)域之間插入了由兩個甘氨酸殘基組成的幫助穩(wěn)定三聚體結(jié)構(gòu)的連接子。
[0271]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖2，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.10和SEQ.N0.59。
[0272]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.10用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.59。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌BL21(DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0273]實施例11:SEQ.N0.11的融合蛋白
[0274]SEQ.N0.11的蛋白是具有233個氨基酸的長度和26.5kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中源自D0C-2/DAB2的肽DD2的18個氨基酸的片段(SEQ.N0.30)連接于序列TRAIL95-281的C末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽與TRAIL序列之間插入了彼此連續(xù)的被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)和被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。效應(yīng)子肽的序列在其N末端連接于由7個Arg殘基組成的聚精氨酸轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域。轉(zhuǎn)運序列幫助穿過細(xì)胞膜并且將融合蛋白運輸進(jìn)入細(xì)胞。在TRAIL序列與切割位點之間，融合蛋白額外地包含柔性半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸連接子CAACAAACGGG。
[0275]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖3，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.11和SEQ.N0.60。
[0276]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.11用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.60。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，具根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌BL21 (DE3)或Tuner (DE3) pLysS菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分`離蛋白。
[0277]實施例12:SEQ.N0.12的融合蛋白
[0278]SEQ.N0.12的蛋白是具有590個氨基酸的長度和66.7kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中源自精氨酸支原體的精氨酸脫亞氨酶(SEQ.N0.31)連接于TRAIL121-281的C末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽與TRAIL序列之間插入了彼此連續(xù)的被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)識別的切割位點序列和被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。在TRAIL序列與金屬蛋白酶切割位點序列之間，融合蛋白額外地包含由甘氨酸和絲氨酸殘基組成的柔性連接子Gly Gly Ser Gly0在尿激酶切割位點序列與效應(yīng)子蛋白序列之間，融合蛋白額外地包含柔性甘氨酸-絲氨酸連接子 Gly Gly Gly Ser Gly0
[0279]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖3，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.12和SEQ.N0.61。
[0280]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.12用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.61。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌BL21(DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0281]實施例13.SEQ.N0.13的融合蛋白
[0282]SEQ.N0.13的蛋白是具有187個氨基酸的長度和21.6kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中來自P16蛋白的10個氨基酸的肽(SEQ.N0.32)連接于TRAIL121-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽與TRAIL結(jié)構(gòu)域的N末端之間插入了彼此連續(xù)的被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。效應(yīng)子肽序列在其C末端連接于由觸角足蛋白結(jié)構(gòu)域片段的片段組成的轉(zhuǎn)運序列(SEQ.N0.49)。轉(zhuǎn)運序列幫助穿過細(xì)胞膜并且將融合蛋白轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞。
[0283]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖3，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.13和SEQ.N0.62。
[0284]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.13用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.62。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá),使用來自Novagen的大腸桿菌B.21 (DE3)菌株或來自Stratagene的BL21DE3pLysSRIL菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0285]實施例14.SEQ.N0.14的融合蛋白
[0286]SEQ.N0.14的蛋白是具有203個氨基酸的長度和23.6kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中MEK-1蛋白一ERK活化的抑制劑一的13個氨基酸的片段(SEQ.N0.34)連接于TRAIL121-281的C末端作為效應(yīng)子肽。在TRAIL的C末端和效應(yīng)子肽結(jié)構(gòu)域之間插入了彼此連續(xù)的被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)和被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。效應(yīng)子肽序列在其N末端連接于由觸角足蛋白結(jié)構(gòu)域片段的片段組成的轉(zhuǎn)運序列(SEQ.N0.48)。轉(zhuǎn)運序列幫助穿過細(xì)胞膜并且將融合蛋白轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞。在TRAIL序列與切割位點序列之間，融合蛋白額外地包含柔性甘氨酸-半胱氨酸連接子GS。
[0287]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯 示于圖3，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.14和SEQ.N0.63。
[0288]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.14用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.63。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌B.21 (DE3)菌株或來自Novagen的BL21DE3pLysSRIL菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0289]實施例15.SEQ.N0.15的融合蛋白
[0290]SEQ.N0.15的蛋白是具有205個氨基酸的長度和24kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中用作Akt共激活物的TCLl蛋白的PH結(jié)構(gòu)域的15個氨基酸的N末端片段(SEQ.N0.35)連接于TRAIL121-281的C末端作為效應(yīng)子肽。在TRAIL結(jié)構(gòu)域和效應(yīng)子肽之間插入了彼此連續(xù)的被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)和被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。效應(yīng)子肽序列在其N末端上連接于由觸角足蛋白結(jié)構(gòu)域片段的片段組成的轉(zhuǎn)運序列(SEQ.N0.48)。轉(zhuǎn)運序列幫助穿過細(xì)胞膜并且將融合蛋白轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞。在TRAIL序列與切割位點序列之間，融合蛋白額外地包含柔性甘氨酸-半胱氨酸連接子GS。
[0291]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖3，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.15和SEQ.N0.64。
[0292]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.15用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.64。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌B.21 (DE3)菌株或Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0293]實施例16.SEQ.N0.16的融合序列
[0294]SEQ.N0.16的蛋白是具有183個氨基酸的長度和21.2kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中用作E2F的抑制劑的六肽(SEQ.N0.36)連接于TRAIL121-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽與TRAIL結(jié)構(gòu)域之間插入了彼此連續(xù)的被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。此外，效應(yīng)子肽序列在其C末端連接于由觸角足蛋白結(jié)構(gòu)域片段的片段組成的轉(zhuǎn)運序列(SEQ.N0.49)。轉(zhuǎn)運序列幫助穿過細(xì)胞膜并且將融合蛋白轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞。
[0295]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖4，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯不于序列表中的SEQ.N0.16和SEQ.N0.65。
[0296]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.16用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.65。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌B.21 (DE3)菌株或Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0297]實施例17.SEQ.N0.17的融合蛋白
[0298]SEQ.N0.17的蛋白是具有190個氨基酸的長度和22.3kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中微管蛋白的13個氨基酸的片段(SEQ.N0.37)連接于TRAIL121-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽與TRAIL結(jié)構(gòu)域的N末端之間插入了彼此連續(xù)的被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割 。此外，效應(yīng)子肽序列在其C末端連接于由6個精氨酸殘基組成的轉(zhuǎn)運肽。轉(zhuǎn)運序列幫助穿過細(xì)胞膜并且將融合蛋白轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞。
[0299]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖4，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.17和SEQ.N0.66。
[0300]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.17用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.66。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌B.21 (DE3)菌株或Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0301]實施例18:SEQ.N0.18的融合蛋白
[0302]SEQ.N0.18的蛋白是具有187個氨基酸的長度和21.7kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中微管蛋白的10個氨基酸的片段(SEQ.N0.38)連接于序列TRAIL121-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽和TRAIL結(jié)構(gòu)域N末端之間插入了彼此連續(xù)的被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。此外，效應(yīng)子肽序列在其C末端連接于由6個精氨酸殘在組成的轉(zhuǎn)運序列。轉(zhuǎn)運序列幫助穿過細(xì)胞膜并且將融合蛋白轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞。
[0303]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖4，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.18和SEQ.N0.67。
[0304]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.18用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.67。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌B.21 (DE3)或Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0305]實施例19.SEQ.N0.19的融合蛋白
[0306]SEQ.N0.19的蛋白是具有196個氨基酸的長度和22.54kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中蜂毒肽(SEQ.N0.39)連接于序列TRAIL121-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽和TRAIL結(jié)構(gòu)域N末端之間插入了彼此連續(xù)的被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。
[0307]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖4，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.19和SEQ.N0.68。
[0308]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.19用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.68。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌B.21 (DE3)或Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0309]實施例20.SEQ.N0.20的融合蛋白
[0310]SEQ.N0.20的蛋白是具有184個氨基酸的長度和21.4kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中源自蜂防衛(wèi)素的6個氨基酸的肽C2 (SEQ.N0.40)連接于序列TRAIL121-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽和TRAIL結(jié)構(gòu)域N末端之間插入了彼此連續(xù)的被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。此外，效應(yīng)子肽序列還在其C末端連接于由6個精氨酸組成的轉(zhuǎn)運序列。轉(zhuǎn)運序列幫助穿過細(xì)胞膜并且將融合蛋白轉(zhuǎn)運入細(xì)胞。
[0311]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示`于圖4，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.20和SEQ.N0.69。
[0312]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.20用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.69。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌B.21 (DE3)或Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0313]實施例2 L SEQ.N0.21的融合蛋白
[0314]SEQ.N0.21的蛋白是具有189個氨基酸的長度和21.4kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中結(jié)合FGF-2配體的8個氨基酸肽(SEQ.N0.41)的兩個重復(fù)序列連接于序列TRAIL121-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽之間插入了彼此連續(xù)的被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。此外，在第二效應(yīng)子肽和TRAIL結(jié)構(gòu)域序列之間插入了由兩個甘氨酸殘基組成的幫助穩(wěn)定三聚體結(jié)構(gòu)的連接子。
[0315]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖5，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.21和SEQ.N0.70。
[0316]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.21用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.70。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌B.21 (DE3)或Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0317]實施例22.SEQ.N0.22的融合蛋白
[0318]SEQ.N0.22的蛋白是具有188個氨基酸的長度和21.6kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中15個氨基酸的lasioglossin LL2 (SEQ.N0.42)連接于序列TRAILl 19-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽和TRAIL結(jié)構(gòu)域N末端之間插入了彼此連續(xù)的被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。
[0319]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖5，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.22和SEQ.N0.71。
[0320]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.22用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.71。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌B.21 (DE3)或Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0321]實施例23.SEQ.N0.23的融合蛋白
[0322]SEQ.N0.23的蛋白是具有193個氨基酸的長度和21.6kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中用作相互作用RasGAP - Aurora B的抑制劑的13個氨基酸的肽(SEQ.N0.43)連接于序列TRAIL121-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽和TRAIL結(jié)構(gòu)域之間插入了彼此連續(xù)的被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。此外，效應(yīng)子肽序列在其C末端連接于由8個精氨酸殘在組成的轉(zhuǎn)運序列。轉(zhuǎn)運序列幫助穿過細(xì)胞膜并且將融合蛋白運輸進(jìn)入細(xì)胞。此外，在金屬蛋白`酶切割位點序列與TRAIL結(jié)構(gòu)域序列之間插入了幫助穩(wěn)定三聚體結(jié)構(gòu)的半胱氨酸殘基。
[0323]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖5，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.23和SEQ.N0.72。
[0324]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.23用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.72。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌B.21 (DE3)或Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0325]實施例24.SEQ.N0.24的融合蛋白
[0326]SEQ.N0.24的蛋白是具有243個氨基酸的長度和27.8kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中與觸角足蛋白的17個氨基酸的轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域融合的pl6肽的38個氨基酸的片段(SEQ.N0.33)連接于序列TRAIL95-281的C末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽和TRAIL結(jié)構(gòu)域之間插入了彼此連續(xù)的被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)和被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。此外，在TRAIL序列與被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列之間插入了柔性半胱氨酸-丙氨酸連接子(SEQ.N0.47)。
[0327]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖5，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.24和SEQ.N0.73。[0328]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.24用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.73。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序A進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0329]實施例25.SEQ.N0.25的融合蛋白
[0330]SEQ.N0.25的蛋白是具有199個氨基酸的長度和23.4kDa的質(zhì)量的融合蛋白，其中P印27肽的類似物(SEQ.N0.44)連接于序列TRAIL120-281的N末端作為效應(yīng)子肽。在效應(yīng)子肽和TRAIL結(jié)構(gòu)域N末端之間插入了彼此連續(xù)的被尿激酶uPA識別的切割位點序列(SEQ.N0.46)和被金屬蛋白酶MMP識別的切割位點的序列(SEQ.N0.45)，因此效應(yīng)子肽在腫瘤環(huán)境中將進(jìn)行切割。
[0331]該融合蛋白的結(jié)構(gòu)顯示于圖5，其氨基酸序列和包含針對在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的DNA編碼序列分別顯示于序列表中的SEQ.N0.25和SEQ.N0.74。
[0332]上述結(jié)構(gòu)的氨基酸序列SEQ.N0.25用作模板以產(chǎn)生其編碼DNA序列SEQ.N0.74。產(chǎn)生了包含DNA編碼序列的質(zhì)粒，根據(jù)上述一般性程序進(jìn)行融合蛋白的過表達(dá)。根據(jù)一般程序B進(jìn)行過表達(dá)，使用來自Novagen的大腸桿菌BL21(DE3)或大腸桿菌Tuner (DE3)菌株。根據(jù)上述一般程序通過電泳分離蛋白。
[0333]實施例26:融合蛋白的抗腫瘤活性的測定
[0334]在體外在腫瘤細(xì)胞系中在細(xì)胞毒性測定中以及在體內(nèi)在小鼠中進(jìn)行了融合蛋白的抗腫瘤活性的測定。為了比較目的，使用了 rhTRAILl 14-281蛋白和安慰劑。
[0335]1.圓二色件(circular dichroism)測定
[0336]通過Ex.1a，Ex.2lPEx.8a的圓二色性(⑶)測定融合蛋白的制備物的質(zhì)量(就它們的結(jié)構(gòu)而言)。
[0337]圓二色性用于測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和構(gòu)象。CD方法使用蛋白結(jié)構(gòu)的光學(xué)活性，表現(xiàn)為使光偏振平面旋轉(zhuǎn)和橢圓偏振的出現(xiàn)。遠(yuǎn)紫外(UV)中的蛋白的CD光譜提供了關(guān)于主要多肽鏈的構(gòu)象的精確數(shù)據(jù)。
[0338]將待分析的蛋白的樣品在配制于由50mM Tris-HCl pH8, O, IOOmM NaCl, 10%甘油，0.1mM ZnCl2, 80mM蔗糖，5mM DTT組成的緩沖液后于具有12kD截留值的透析袋(Sigma-Aldrich)中透析。針對相對于蛋白制劑100倍過量(v/v)的緩沖液進(jìn)行透析，同時攪拌，在4°C持續(xù)數(shù)個小時。透析完成之后，將每個制劑離心(25000rpm，IOmin, 4°C )，收集適當(dāng)?shù)纳锨逡骸Ｍㄟ^Bradford法測定由此獲得的樣品中的蛋白濃度。
[0339]在Jasco J-710分光偏振計中，在具有0.2mm或Imm光程的石英杯中進(jìn)行濃度范圍為0.1-2.7mg/ml的蛋白的圓二色性測定。在71/min的氮氣流下進(jìn)行該測定，這允許在195至250nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行測定。測量參數(shù):光譜分辨率-1nm ;光束的半寬Inm ;靈敏性20mdeg, 一個波長的平均時間_8s,掃描速度10nm/min。
[0340]結(jié)果顯示為3次測量的平均值。rhTRAILl 14-281和Ex.1a，Ex.2a和Ex.8a的蛋白的圓二色性光譜顯示于圖6。
[0341]使用CDPro軟件在193_250nm范圍內(nèi)對獲得的光譜進(jìn)行數(shù)值分析。忽略掉光電倍增管中的電壓超過700V的點，因為該波長范圍內(nèi)的信噪比太低。
[0342]獲得的數(shù)據(jù)用于計算所分析的蛋白中的特定二級結(jié)構(gòu)含量，使用CDPio軟件(表
【權(quán)利要求】
1.融合蛋白，其包含: -結(jié)構(gòu)域(a)，其包含:可溶性hTRAIL蛋白序列的功能片段，該片段起始于不低于hTRAIL95的位置處的氨基酸；或具有至少70%序列同一性的所述功能片段的同源物；和-至少一個結(jié)構(gòu)域(b)，其為具有抗腫瘤細(xì)胞的抗增殖活性的效應(yīng)子肽的序列， 并且其中結(jié)構(gòu)域(b)的序列連接于結(jié)構(gòu)域(a)的C末端和/或N末端。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中結(jié)構(gòu)域(a)包含可溶性hTRAIL(SEQ.N0.78)蛋白序列的片段，起始于hTRAIL95至h TRAIL121的氨基酸，含端點，結(jié)束于氨基酸281。
3.權(quán)利要求1或2的融合蛋白，其中結(jié)構(gòu)域(a)選自hTRAIL95-281,hTRAILl 14-281,hTRAILl19-281, hTRAIL120-281 和 hTRAIL121_281。
4.權(quán)利要求1-3任一項的融合蛋白，其中結(jié)構(gòu)域(b)選自 -SEQ.N0.26的阻斷FGF-2受體的16個氨基酸的肽； -SEQ.N0.27的人甲胎蛋白的34個氨基酸的片段； -SEQ.N0.28的人甲胎蛋白的8個氨基酸的片段；
-SEQ.N0.29 的源自 p21WAF 的肽; -SEQ.N0.30 的來自 DOC-2/DAB2 蛋白的肽 DD2; -SEQ.N0.31的來自精氨酸支原體的精氨酸脫亞胺酶； -SEQ.N0.32的pl6肽的片段; -SEQ.N0.33的與觸角足蛋白的17個氨基酸的轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域融合的pl6肽的片段； -SEQ.N0.34的MEK-1蛋白的片段; -SEQ.N0.35的TCLl蛋白的PH結(jié)構(gòu)域的N末端片段；
-SEQ.N0.36 六妝 Phe-Trp-Leu-Arg-Phe-Thr; -SEQ.N0.37的13個氨基酸的微管蛋白片段； -SEQ.N0.38的10個氨基酸的微管蛋白片段； -SEQ.N0.39的蜂毒肽； -SEQ.N0.40的源自蜂防衛(wèi)素的6個氨基酸的肽C2; -SEQ.N0.41的結(jié)合FGF-2配體的8個氨基酸的肽；
-SEQ.N0.42 的 15 個氛基酸的 lasioglossin LL2 月太; -SEQ.N0.43的結(jié)合SH3RasGAP結(jié)構(gòu)域的13個氨基酸的肽； -SEQ.N0.44的P印27肽的類似物。
5.權(quán)利要求1-4任一項的融合蛋白，其在結(jié)構(gòu)域(a)與結(jié)構(gòu)域(b)之間包含結(jié)構(gòu)域(c )，結(jié)構(gòu)域(c )包含蛋白酶切割位點，其選自被金屬蛋白酶MMP識別的序列、被尿激酶uPA識別的序列，及其組合。
6.權(quán)利要求5的融合蛋白，其中被金屬蛋白酶MMP識別的序列是SEQID N0:45，被尿激酶uPA識別的序列是SEQ.N0.46。
7.權(quán)利要求5或6的融合蛋白，其中結(jié)構(gòu)域(c)是彼此相鄰的被金屬蛋白酶MMP識別的序列和被尿激酶uPA識別的序列的組合。
8.前述權(quán)利要求1至7任一項的融合蛋白，其中結(jié)構(gòu)域(b)另外地連接于選自下列的轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域⑷: -(dl)SEQ.N0.48的觸角足蛋白結(jié)構(gòu)域的片段，-(d2)SEQ.N0.49的觸角足蛋白結(jié)構(gòu)域的片段， -(d3)轉(zhuǎn)運通過細(xì)胞膜的聚精氨酸序列，其由6，7，8，9，10或11個Arg殘基組成， 及其組合。
9.權(quán)利要求8的融合蛋白，其中序列(d)位于融合蛋白的C末端上或N末端。
10.權(quán)利要求8的融合蛋白，其中轉(zhuǎn)運序列(d)位于結(jié)構(gòu)域(b)與(c)之間。
11.權(quán)利要求8的融合蛋白，其中序列(d)位于融合蛋白質(zhì)的C末端。
12.權(quán)利要求5至11任一項的融合蛋白，其額外地在結(jié)構(gòu)域(a)、(b)、(c)和/或(d)之間包含柔性空間連接子。
13.權(quán)利要求11的融合蛋白，其中柔性空間連接子選自SEQ.N0.47，序列Gly Gly Ser,序列Gly Gly Gly Ser Gly,兩個甘氨酸殘基Gly Gly,半胱氨酸殘基Cys,及其組合。
14.權(quán)利要求1的融合蛋白，其具有選自SEQ.N0.1; SEQ.N0.2; SEQ.N0.3; SEQ.N0.4 ; SEQ.N0.5 ; SEQ.N0.6 ; SEQ.N0.7 ; SEQ.N0.8 ; SEQ.N0.9 ; SEQ.N0.10 ; SEQ.N0.11; SEQ.N0.12; SEQ.N0.13 ; SEQ.N0.14，SEQ.N0.15，SEQ.N0.16 ; SEQ.N0.17; SEQ.N0.18; SEQ.N0.19; SEQ.N0.20; SEQ.N0.21; SEQ.N0.22; SEQ.N0.23; SEQ.N0.24; SEQ.N0.25 和 SEQ.N0.75的氨基酸序列。
15.前述權(quán)利要求任一項的融合蛋白，其是重組蛋白。
16.多核苷酸序列，編碼如權(quán)利要求1-14任一項中定義的融合蛋白。
17.權(quán)利要求16的多核苷酸序列,其針對在大腸桿菌中的遺傳表達(dá)進(jìn)行了優(yōu)化。
18.權(quán)利要求17的多核苷酸序列，其選自SEQ.N0.50; SEQ.N0.51; SEQ.N0.52; SEQ.N0.53 ; SEQ.N0.54 ; SEQ.N0.55 ; SEQ.N0.56 ; SEQ.N0.57 ; SEQ.N0.58 ; SEQ.N0.59 ; SEQ.N0.60 ; SEQ.N0.61; SEQ.N0.62 ; SEQ.N0.63 ; SEQ.N0.64 ; SEQ.N0.65 ; SEQ.N0.66 ; SEQ.N0.67; SEQ.N0.68; SEQ.N0.69; SEQ.N0.70; SEQ.N0.71; SEQ.N0.72; SEQ.N0.73，SEQ.N0.74 和SEQ.N0.76。
19.表達(dá)載體,其包含權(quán)利要求16至18的任一項的多核苷酸序列。
20.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求19中定義的表達(dá)載體。
21.權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，其為大腸桿菌細(xì)胞。
22.藥物組合物，其包含與藥學(xué)上可接受的載體組合的作為活性成分的權(quán)利要求1至15任一項中定義的融合蛋白。
23.權(quán)利要求22的藥物組合物，其為用于胃腸外施用的形式。
24.權(quán)利要求1至15任一項定義的融合蛋白，用于治療哺乳動物、包括人的腫瘤疾病。
25.治療哺乳動物、包括人的癌癥疾病的方法，包括向有此需要的受試者施用抗腫瘤有效量的權(quán)利要求1至15中定義的融合蛋白或者權(quán)利要求22或23中定義的藥物組合物。
【文檔編號】A61K38/17GK103562220SQ201280019018
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年4月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月19日
【發(fā)明者】J·S·皮克齊考蘭, S·D·波萊克, B·M·扎澤克, P·K·羅茲加, U·M·薩勞斯卡 申請人:阿達(dá)梅德公司