感染性戊型肝炎病毒基因型3的重組體相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求于2011年11月1日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/554,323號(hào)和于2011年1月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/431,377號(hào)的權(quán)益，所述申請(qǐng)各自在此通過(guò)引用并入本文用于所有目的。對(duì)作為ASCII文本文件提交的序列表的參考載入文件77867-827343_SEQLIST.TXT中的序列表，創(chuàng)建于2012年1月10日，其為62,887個(gè)字節(jié)，機(jī)器格式IBM-PC，MS-Windows操作系統(tǒng)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文中用于所有目的。發(fā)明背景由于在發(fā)展中國(guó)家引起急性肝炎的流行病和散發(fā)性病例，戊型肝炎病毒臭名昭著：實(shí)例包括，1956年新德里爆發(fā)期間出現(xiàn)了29300名病例以及在達(dá)爾富爾的國(guó)內(nèi)難民營(yíng)(InternallyDisplacedPersonsCamp)6個(gè)月內(nèi)報(bào)道了2621名病例，其中如已報(bào)道的(1)，孕婦具有26-31％的最高死亡率(2)。HEV是發(fā)展中國(guó)家成年人急性肝炎的最重要或第二重要的原因。但與近期的教條相反，該病毒并不局限于發(fā)展中國(guó)家，并且隨著對(duì)感染傳播潛能的認(rèn)識(shí)以及針對(duì)該病毒進(jìn)行的測(cè)試，散發(fā)性病例在工業(yè)化國(guó)家中正在越來(lái)越多的得到確認(rèn)。從歷史上看，戊型肝炎被描述為經(jīng)腸傳播的，不會(huì)發(fā)展為慢性病的自身限制性肝炎(3)。然而，最近在歐洲鑒定出首例慢性戊型肝炎，并且慢性病自此被證明發(fā)生在免疫功能低下的實(shí)體器官移植接受者和HIV感染個(gè)體中(4,5,6,7)。雖然戊型肝炎感染通常會(huì)導(dǎo)致輕度至中度的疾病，但偶爾在急性病例中，在慢性感染患者以及尤其在患有慢性肝病或懷孕的那些患者中，引起暴發(fā)性肝功能衰竭(1,2,4,5,6,7,8)。此外，戊型肝炎一直被誤診為藥物誘導(dǎo)的肝損傷，從而使藥物試驗(yàn)或治療方案復(fù)雜化(9)。自1983年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已記錄的HEV傳播幾乎無(wú)一例外地與被污染的水聯(lián)系在一起；在攝入未煮熟的鹿肉后，HEV感染的發(fā)現(xiàn)突然改變了(10,11)。戊型肝炎目前被認(rèn)為不僅是發(fā)展中國(guó)家的水源性疾病，而且是工業(yè)化國(guó)家涌現(xiàn)的食源性疾病(11,12)。HEV為具有7.2kb的基因組大小的小的非包膜、單鏈RNA病毒(3)。HEV的7.2kb基因組是具有三個(gè)重疊的閱讀框(ORF)的單鏈的正義RNA。約前5kb用作ORF1多蛋白的mRNA；所述多蛋白是否經(jīng)蛋白水解加工仍是未知的。ORF1包含編碼甲基轉(zhuǎn)移酶/尿苷轉(zhuǎn)移酶、NTP酶/解旋酶、RNA依賴(lài)的RNA聚合酶和泛素化活性的區(qū)域。此外，ORF1編碼Y區(qū)和X，或未知功能的大區(qū)以及位于ORF中間附近的高變區(qū)(HVR)。HVR的長(zhǎng)度和序列在毒株和基因型之間不同：其耐受小的缺失，但復(fù)制水平在細(xì)胞培養(yǎng)物中嚴(yán)重被揭制。ORF2和ORF3從單一的雙順?lè)醋觼喕蚪MRNA翻譯，以分別產(chǎn)生660個(gè)氨基酸的衣殼蛋白和113-114個(gè)氨基酸的蛋白。所述ORF3蛋白對(duì)病毒顆粒從培養(yǎng)細(xì)胞中的有效釋放是重要的，并為獼猴感染所必需的。至目前為止，已識(shí)別了感染人的四種HEV基因型(17)。基因型1和2感染只在人中被鑒定，而基因型3和4的病毒已從除人之外的豬、鹿、貓鼬、牛和兔中分離出來(lái)(18)?；蛐?和4在豬中廣泛存在，并且未煮熟的豬肉可為動(dòng)物源性人感染的主要來(lái)源(12，18)。然而，跨物種傳播還未被廣泛研究并且很可能存在另外的人畜共患性?xún)?chǔ)庫(kù)。HEV感染長(zhǎng)期被認(rèn)為是持續(xù)2-7周的急性感染，并且不會(huì)發(fā)展成慢性病。然而，最近，慢性HEV感染已在免疫抑制的器官移植患者或艾滋病患者中被鑒定出來(lái)。更出乎意料的是，這些慢性病患者者中的一些已發(fā)展出神經(jīng)系統(tǒng)癥狀并從腦脊液中分離出HEV。這些慢性病例已被鑒定為基因型3感染。HEV通常在體內(nèi)復(fù)制至低滴度，其極難在培養(yǎng)的細(xì)胞中生長(zhǎng)，并且大部分病毒的生命周期是未知的。Okamoto及其同事們最近使基因型3和基因型4毒株適合在兩種人細(xì)胞系，即A549肺細(xì)胞和PLC/PRF/5肝癌細(xì)胞中復(fù)制至高滴度(19,20)。遠(yuǎn)未了解戊型肝炎的流行病學(xué)，特別是人畜共患方面需要進(jìn)一步研究。因此，有必要開(kāi)發(fā)可在細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制的HEV基因型毒株。另外，有開(kāi)發(fā)HEV疫苗，例如，用于基因型3毒株的疫苗的必要。本發(fā)明部分涉及分離自慢性感染患者的基因型3病毒的發(fā)現(xiàn)(5)，其適合在人肝癌細(xì)胞中生長(zhǎng)，并用于鑒定允許HEV感染的一組人、豬和鹿細(xì)胞培養(yǎng)物。本發(fā)明另外涉及所述適應(yīng)病毒的特征以鑒定提供在細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制能力的序列變化。發(fā)明簡(jiǎn)述如以上所解釋的，直至最近，戊型肝炎很少在工業(yè)化國(guó)家中被鑒定出來(lái)。戊型肝炎如今逐漸在整個(gè)西歐、一些東歐國(guó)家和日本被報(bào)道：這些病例大部分是由基因型3所致，該基因型在豬中是特有的，并且這些病例被認(rèn)為是經(jīng)動(dòng)物傳染獲得的。然而，未能很好地了解傳播途徑。將感染人的HEV分為非動(dòng)物源性(1型，2型)基因型和動(dòng)物源性(3型，4型)基因型。HEV的細(xì)胞培養(yǎng)是低效且受限的，因此迄今為止，HEV僅在人細(xì)胞系中培養(yǎng)。本發(fā)明部分涉及對(duì)HEV基因型3病毒的新毒株的鑒定。HEV的Kernow-C1毒株(基因型3)，其分離自慢性感染患者，用于鑒定允許感染的人、豬和鹿的細(xì)胞系。所述Kernow-C1毒株對(duì)在人肝癌細(xì)胞中生長(zhǎng)的適應(yīng)情況選擇了包含人核糖體蛋白基因的174個(gè)核糖核苷酸(58個(gè)氨基酸)的插入和其它突變的罕見(jiàn)病毒重組體。在本發(fā)明的上下文中，在論述實(shí)施例部分中所述的實(shí)驗(yàn)中鑒定的174個(gè)核糖核苷酸的插入方面，Kernow病毒基因組中的插入片段包含171個(gè)核糖核苷酸，其本身僅編碼57個(gè)氨基酸。然而，由于其插入密碼子內(nèi)的核糖核苷酸之間，其插入導(dǎo)致了58個(gè)新的氨基酸。因此，在此該插入被稱(chēng)作具有174個(gè)核糖核苷酸并編碼58個(gè)氨基酸。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及cDNA克隆以開(kāi)發(fā)將所需序列插入HEV而不會(huì)滅活該病毒的載體平臺(tái)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基因型3戊型肝炎病毒的野生型毒株及其細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的子代。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本文所述的基因型3戊型肝炎病毒的野生型毒株序列的載體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如本文所述的復(fù)制型基因型3戊型肝炎病毒、或來(lái)源于如本文所述的復(fù)制型基因型3戊型肝炎病毒的嵌合病毒或減毒病毒、以及例如可用于研究戊型肝炎的人畜傳播和用于HEV疫苗和免疫原性組合物的開(kāi)發(fā)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的感染性cDNA克隆。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及HEV疫苗，其包含來(lái)自本文所述的基因型3戊型肝炎病毒的序列及其減毒病毒衍生物。在一方面，本發(fā)明涉及感染性戊型肝炎病毒(HEV)cDNA克隆，其中所述cDNA克隆與SEQIDNO:l有至少95％的序列一致性，并且如參考SEQIDNO:5的HEV核苷酸序列所確定的在ORFl中包含插入片段。在一些實(shí)施方案中，所述HEVcDNA克隆包含SEQIDNO:l的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述HEVcDNA克隆在ORFl序列中有插入片段，該插入片段編碼長(zhǎng)度為20-100個(gè)氨基酸的符合讀框的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述插入片段編碼長(zhǎng)度為30、35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個(gè)氨基酸的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述ORF1中的插入片段與SEQIDNO:9有至少50％的一致性，或至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的一致性。在一些實(shí)施方案中，所述ORF1中的插入片段與SEQIDNO:9有至少90％的一致性，或至少95％、至少96％、至少97％或至少98％的一致性。在一些實(shí)施方案中，所述插入片段包含SEQIDNO:9所示的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述插入片段在HEV的ORF1-編碼區(qū)內(nèi)的位置，其中所述插入片段的第一氨基酸序列相對(duì)于SEQIDNO:6所示的氨基酸序列為氨基酸750。在另一方面，本發(fā)明涉及包含戊型肝炎病毒(HEV)核酸序列的感染性cDNA克隆，其中所述克隆在編碼ORF1的高變區(qū)的核酸序列區(qū)域中包含插入片段。在一些實(shí)施方案中，所述HEVcDNA克隆在ORF1序列中有插入片段，其中所述插入片段編碼長(zhǎng)度為20-100個(gè)氨基酸的符合讀框的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述插入片段編碼長(zhǎng)度為30、35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個(gè)氨基酸的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述ORF1中的插入片段與SEQIDNO:9有至少50％的一致性，或至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的一致性。在一些實(shí)施方案中，所述ORF1中的插入片段與SEQIDNO:9有至少90％的一致性，或至少95％、至少96％、至少97％或至少98％的一致性。在一些實(shí)施方案中，所述插入片段包含SEQIDNO:9所示的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述插入片段在ORF1的高變區(qū)中，例如所述插入片段正好在第749位之后，使得插入氨基酸序列起始于第750位，如參考SEQIDNO:6所確定的。在一些實(shí)施方案中，所述感染性cDNA克隆為基因型3HEV。在一些實(shí)施方案中，所述cDNA克隆為基因型1HEV。在一些實(shí)施方案中，所述感染性cDNA克隆為基因型2或基因型4克隆。在又一方面，本發(fā)明涉及包含細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，所述細(xì)胞包含例如如之前兩段中所述的、本發(fā)明的感染性cDNA克隆中任一種cDNA克隆的RNA轉(zhuǎn)錄物。在另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生疫苗的方法，所述方法包括將來(lái)自本發(fā)明的cDNA克隆，例如上述cDNA克隆的RNA轉(zhuǎn)錄物引入細(xì)胞系(例如人細(xì)胞系或豬細(xì)胞系)中，并得到由所述cDNA克隆產(chǎn)生的病毒。在又一方面，本發(fā)明提供了由如本文所述的感染性HEV克隆產(chǎn)生的病毒以及包含此類(lèi)病毒的藥物組合物。在一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生疫苗的方法，所述方法包括將包含與啟動(dòng)子可操作地連接的編碼具有SEQIDNO:4或SEQIDNO:8所示序列的ORF2的異源核酸序列的表達(dá)盒引入宿主細(xì)胞中；并得到ORF2蛋白。在又一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生疫苗的方法，所述方法包括將獲自基因型3HEV的感染性cDNA克隆的RNA引入細(xì)胞系中，其中所述HEV克隆相對(duì)于SEQIDNO:5所示的HEV核酸序列，在編碼ORF1高變區(qū)的核酸序列區(qū)域中包含長(zhǎng)度為至少10個(gè)氨基酸的插入片段；并且其中所述RNA不能產(chǎn)生ORF3。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞系為豬細(xì)胞系或人細(xì)胞系。本發(fā)明還涉及得到在細(xì)胞培養(yǎng)物中具有復(fù)制能力的HEV毒株的方法，所述方法包括從慢性感染患者中獲得病毒；感染培養(yǎng)中的細(xì)胞系，連續(xù)傳代所述病毒，例如至少3代、至少4代、至少5代、至少6代或更多代；以及選擇在細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制的來(lái)自慢性感染患者的突變體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及利用產(chǎn)生自復(fù)制性HEVcDNA克隆的RNA轉(zhuǎn)錄物的HEV病毒作為評(píng)價(jià)目標(biāo)產(chǎn)品的HEV病毒狀況的指示物。在一些實(shí)施方案中，此類(lèi)方法包括將如本文所述的已知量HEV病毒加入待分析材料，例如血液、水、食品中；將所述材料進(jìn)行去除病毒的過(guò)程，例如過(guò)濾、加熱等；以及在病毒去除過(guò)程之后確定材料樣品中存在的所加HEV病毒的量。殘留HEV病毒的量指示病毒去除過(guò)程的功效。附圖簡(jiǎn)述圖1.Kernow-C1病毒在人肝癌細(xì)胞中生長(zhǎng)的適應(yīng)情況。將大約等量的糞便中的病毒(方框)或在HepG2/C3A細(xì)胞中連續(xù)傳代6次的病毒(圓圈)以低MOI接種于HepG2/C3A細(xì)胞上，并通過(guò)HepG2/C3A細(xì)胞上的空斑形成測(cè)定和RT-PCR來(lái)分別定量釋放到培養(yǎng)基中的感染性病毒(圖A)和總病毒(圖B)。所有收獲的樣品和保留的接種物的空斑測(cè)定一式三份，根據(jù)代碼同時(shí)進(jìn)行：直接比較表明糞便接種物，其產(chǎn)生少得多的病毒，實(shí)際上比傳代接種物包含的感染性病毒多5倍。注意FFU和RNA尺度上的差異。誤差棒為標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖2.人細(xì)胞和豬細(xì)胞上戊型肝炎病毒的滴度比較。將每種病毒的連續(xù)稀釋物一式三份接種到8孔腔室玻片中的人HepG2/C3A細(xì)胞(實(shí)心柱)或LLC-PK1豬細(xì)胞(空心柱)上。三天后，對(duì)玻片編碼，對(duì)ORF2蛋白進(jìn)行免疫染色，手動(dòng)計(jì)數(shù)終點(diǎn)空斑。不破壞代碼直至對(duì)所有樣品計(jì)數(shù)。學(xué)生t檢驗(yàn)p值為0.006-0.016。圖3.鹿細(xì)胞中ORF2的差異化翻譯。(A)將鹿細(xì)胞用所示毒株感染，3天后進(jìn)行免疫染色并將含ORF2蛋白(實(shí)線(xiàn))、ORF3蛋白(虛線(xiàn))以及兩種蛋白(陰影線(xiàn))的所有細(xì)胞計(jì)數(shù)。(B)將鹿細(xì)胞和S10-3人細(xì)胞用表達(dá)雙順?lè)醋觤RNA的CMV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，所述雙順?lè)醋觤RNA包含Sar-55(CMV-Sar)序列、Kernow-Cl(CMV-Kernow)序列或其中前29個(gè)核苷酸序列被Kernow-Cl的前29個(gè)核苷酸序列替代的Sar-55序列(CMV-MT29)。兩天后，通過(guò)FACS對(duì)ORF2或ORF3蛋白免疫染色的細(xì)胞進(jìn)行定量并依照染色細(xì)胞百分比計(jì)算ORF2與ORF3之比(如上所示)。圖4.人序列插入至Kernow-Cl的高變區(qū)。人核糖體基因S17序列與通過(guò)從在HepG2/C3A細(xì)胞中傳代6次的病毒中擴(kuò)增的RT-PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序獲得的序列的比較。插入片段側(cè)翼的HEV序列用下劃線(xiàn)標(biāo)示。(A)核苷酸:HEV(SEQIDNO:11)、S17(SEQIDNO:12)；(B)氨基酸HEV(SEQIDNO:13)、S17(SEQIDNO:14)。圖5.S10-3細(xì)胞用連續(xù)的質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。所示限制性片段用從第6代病毒準(zhǔn)種中擴(kuò)增的相應(yīng)片段取代。新的構(gòu)建體用作下一次取代的本底并重復(fù)該程序直至所有的p1被p6序列取代。在同一實(shí)驗(yàn)中對(duì)所有的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)染和對(duì)ORF2蛋白的免疫染色：在轉(zhuǎn)染后3天收獲三份樣品并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)試。給出相鄰樣本的學(xué)生t檢驗(yàn)P值。P<0.05被認(rèn)為是顯著的。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏。圖6.X區(qū)域中氨基酸882,904和965回復(fù)突變降低了轉(zhuǎn)染水平。將S10-3細(xì)胞用缺少CCA和X區(qū)域突變的5'ORFl質(zhì)粒、包含CCA和X區(qū)域突變的ORFl/CCA質(zhì)粒、p6和包含CCA但無(wú)X區(qū)域突變的回復(fù)突變質(zhì)粒來(lái)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6天對(duì)三份樣品的細(xì)胞進(jìn)行免疫染色并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分析。給出P值并且誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖7.從P6去除S17序列消除了大部分點(diǎn)突變的適應(yīng)作用。將S10-3細(xì)胞用帶或不帶S17序列的p1和p6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后第4天將三份樣品用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。P值均<0.0001除了pl/S17對(duì)比p6delS17。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差圖8.在S17插入片段存在下來(lái)自O(shè)RF2的熒光色素酶的表達(dá)是大量且延長(zhǎng)的。在缺失S17插入片段或X基因區(qū)突變的p6基因組中，ORF2病毒的衣殼蛋白用gaussia熒光色素酶取代。在轉(zhuǎn)染S10-3細(xì)胞后，每24小時(shí)完全更換培養(yǎng)基。圖A由帶S17插入片段的基因組(實(shí)心柱)或不帶S17插入片段的基因組(陰影柱)產(chǎn)生的熒光色素酶單位的比值在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)之上的括號(hào)中示出，誤差棒為標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖B從由缺失三種X基因突變的兩個(gè)獨(dú)立的cDNA克隆編碼的基因組的平均熒光色素酶產(chǎn)生(點(diǎn)柱和交叉陰影的柱)比p6/luc基因組的平均熒光色素酶產(chǎn)生(實(shí)心柱)下降了1/2.3-1/5.1。比值每個(gè)時(shí)間點(diǎn)之上的括號(hào)中示出。圖9.S17插入片段中的同義突變對(duì)轉(zhuǎn)染效率幾乎無(wú)影響。將保守氨基序列的突變引入S17插入片段中的54/58密碼子(突變體#1)或41/58密碼子(突變體#2)的第三個(gè)堿基中并將RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染至S10-3細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染的效率通過(guò)轉(zhuǎn)染后5天三份樣品的流式細(xì)胞術(shù)來(lái)確定。圖10.編碼不同HVR的p6基因組轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)染效率的比較情況。將三份樣品在轉(zhuǎn)染后第5天或第6天接受流式細(xì)胞術(shù)。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差并且方括號(hào)內(nèi)表示學(xué)生t檢驗(yàn)P值。編碼58個(gè)氨基酸的S17插入片段的174nt缺失或用以下替代，A：來(lái)自第1代的114nt的GTP酶或綠色熒光蛋白(GFP)的3’端174nt。#1和#2為兩個(gè)獨(dú)立的克隆。P6對(duì)比任何其它基因組的P值＝<0.0003。B：編碼GFP的前58個(gè)氨基酸的5’174nt，#1-3＝3個(gè)獨(dú)立的克隆。P6對(duì)比任何其它基因組的P值＝<0.001。C：S17插入片段的5’、中間或3’87nt的一半。P6對(duì)比任何其它基因組的P值＝<0.0002。D：117nt的S19核糖體蛋白基因插入片段。#1和#2為兩個(gè)獨(dú)立的克隆。P6對(duì)比任何其它基因組的P值＝<0.001并且3種GFP克隆之間的P值＝>0.27。圖11.由p6編碼的基因組或病毒可在豬LLC-PK1細(xì)胞中復(fù)制并感染豬LLC-PK1細(xì)胞。A：用缺少或包含S17插入片段的p6的轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染的豬細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后第5天通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)定。B：從轉(zhuǎn)染HepG2/C3A細(xì)胞的培養(yǎng)基中收獲的p6病毒的三份樣品在編碼下在HepG2/C3A細(xì)胞(空心柱)和LLP-C1細(xì)胞(點(diǎn)柱)上進(jìn)行平行滴定。圖12.S17插入片段對(duì)S10-3和BHK-21細(xì)胞的Sar55轉(zhuǎn)染的作用。S10-3(A)和BHK-21(B)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)。圖13.ORF3蛋白的缺失并不抑制HepG2/C3A培養(yǎng)物中細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的傳播。HepG2/C3A細(xì)胞用來(lái)自p6或p6/ORF3無(wú)效質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄物電穿孔，與天然的HepG2/C3A細(xì)胞混合并在37℃下培養(yǎng)。在4天的每一天收獲三份樣品，用甲醇固定并儲(chǔ)存于-80℃直至通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。兩種病毒的第5天的值P＝0.74表示每種構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)目相似。發(fā)明詳述定義本文所用術(shù)語(yǔ)“戊型肝炎病毒”(“HEV”)是指病毒、病毒類(lèi)型或病毒類(lèi)別。HEV歸于肝炎病毒屬并為帶有含三個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)和5'和3'順式作用元件的基因組大小為7.2kb的正義單鏈RNA二十面體病毒。ORF1編碼甲基轉(zhuǎn)移酶、蛋白酶、解旋酶和復(fù)制酶；ORF2編碼衣殼蛋白和ORF3編碼未定義功能的蛋白。單個(gè)已知血清型有四種主要的基因型。在本發(fā)明中，帶有HEV病毒的“慢性感染”患者有至少六個(gè)月的感染。所述感染的持續(xù)時(shí)間可例如通過(guò)測(cè)量患者中HEV序列的水平，通常通過(guò)測(cè)量血清或糞便樣品中病毒RNA的水平來(lái)測(cè)量。如本文所用的，就本發(fā)明HEV變體而言的“感染性”是指HEV在培養(yǎng)物中復(fù)制的能力。在本發(fā)明的上下文中，cDNA克隆被認(rèn)為是“感染性克隆”或“復(fù)制型cDNA克隆”，因?yàn)槠渚幋a能夠感染細(xì)胞并在細(xì)胞中復(fù)制的病毒RNA基因組。在典型的實(shí)施方案中，在體外利用噬菌體聚合酶從cDNA克隆合成病毒RNA基因組，并接著將所述RNA引入細(xì)胞中。在本發(fā)明中，“感染性”還指在細(xì)胞系中復(fù)制的能力。例如，當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，例如人或豬的肝細(xì)胞系或腎細(xì)胞系如HepG2肝癌細(xì)胞系或LLC-PK1腎豬細(xì)胞系時(shí)，相比于用未修飾成包含賦予復(fù)制能力的插入片段的基因型所獲得的轉(zhuǎn)染子數(shù)量，得到更大數(shù)量的轉(zhuǎn)染子，例如多至少10％、至少20％、至少50％、至少75％或至少100％或者更大數(shù)量的轉(zhuǎn)染子。在典型的實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)ORF2的水平以確定轉(zhuǎn)染子的更大數(shù)量。在一些實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)感染性病毒的數(shù)量(病毒產(chǎn)生的峰值)以確定本發(fā)明的HEV變體復(fù)制的能力。眾所周知的測(cè)定，例如，空斑測(cè)定可用作感染性病毒數(shù)目的測(cè)量手段。本文所用的“復(fù)制型”HEV毒株為“感染性”HEV毒株；并且“感染性”HEV毒株應(yīng)理解為“復(fù)制型”HEV毒株。測(cè)量ORF2產(chǎn)生的方法為本領(lǐng)域所熟知。例如，可應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微術(shù)。如本領(lǐng)域所理解的，盡管肝細(xì)胞和腎細(xì)胞可常用于評(píng)價(jià)本發(fā)明的變體在培養(yǎng)物中復(fù)制的能力，但還可使用其它細(xì)胞，例如MRC5肺細(xì)胞。當(dāng)結(jié)合例如細(xì)胞或核酸、蛋白或載體使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“重組”意指所述細(xì)胞、核酸、蛋白或載體已通過(guò)異源核酸或異源蛋白的引入或天然核酸或蛋白的改變來(lái)修飾，或者意指所述細(xì)胞來(lái)源于如此修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在天然(非重組)形式的細(xì)胞中不存在的基因或者表達(dá)以其它方式異常表達(dá)、低表達(dá)或完全不表達(dá)的天然基因。本文術(shù)語(yǔ)“重組核酸”意指，一般而言原本在體外通過(guò)例如使用聚合酶和核酸內(nèi)切酶進(jìn)行核酸的操作以在自然中通常不存在的形式形成的核酸。以這種方式，實(shí)現(xiàn)不同序列的可操作連接。因此線(xiàn)性形式的分離的核酸，或者通過(guò)連接通常不連接的DNA分子在體外形成的表達(dá)載體，兩者均被認(rèn)為是用于本發(fā)明目的的重組。應(yīng)理解的是一旦作出重組核酸并重新引入宿主細(xì)胞或生物體中，其將非重組地復(fù)制，即利用宿主細(xì)胞的體內(nèi)細(xì)胞機(jī)制而非體外的操縱；然而，一旦重組產(chǎn)生此類(lèi)核酸，雖然隨后非重組地復(fù)制，其仍被視為用于本發(fā)明目的的重組。同樣，“重組蛋白”為利用重組技術(shù)，即通過(guò)如上所述重組核酸的表達(dá)制備的蛋白。當(dāng)涉及蛋白或肽時(shí)，短語(yǔ)與抗體“特異性(或選擇性)結(jié)合”或與抗體“特異性(或選擇性)免疫反應(yīng)”是指其中抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合的結(jié)合反應(yīng)。在本發(fā)明的上下文中，抗體通常結(jié)合抗原例如本發(fā)明的HEV多肽，其親和力比其對(duì)其它抗原的親和力高至少10倍。本文可互換使用的術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白”指氨基酸殘基的聚合體。該術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合體，以及天然存在的氨基酸聚合體、包含修飾殘基的天然存在的氨基酸聚合體和非天然存在的氨基酸聚合體。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及功能與天然存在的氨基酸相似的氨基酸類(lèi)似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些氨基酸以及之后被修飾的氨基酸，例如，羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸絲氨酸。氨基酸類(lèi)似物是指具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，例如，與氫結(jié)合的碳、羧基、氨基和R基，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫亞砜、甲硫甲基亞砜。此類(lèi)類(lèi)似物可具有修飾的R基(例如，正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但保留了與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指這樣的化合物，該化合物具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，但類(lèi)似于天然存在的氨基酸發(fā)揮功能。氨基酸在本文可通過(guò)由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的其通常已知的三字母符號(hào)或單字母符號(hào)來(lái)指代。同樣地，核苷酸可通過(guò)公認(rèn)的單字母代碼來(lái)指代。術(shù)語(yǔ)“保守型取代”參考蛋白或肽使用以反映基本不改變分子活性(特異性或結(jié)合親和力)的氨基酸取代。典型的保守型氨基酸取代是指將一種氨基酸取代為具有相似的化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的另一種氨基酸。以下六組各自包含彼此可進(jìn)行典型保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴(lài)氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。術(shù)語(yǔ)“核酸”是指單鏈或雙鏈的形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合體。除非特別限制，否則所述術(shù)語(yǔ)包括含有天然核苷酸的已知類(lèi)似物的核酸，所述天然核苷酸具有與參考核酸相似的結(jié)合特性并以與天然存在的核苷酸相似的方式代謝。除非另外說(shuō)明，否則特定的核酸序列還隱含地包括其保守修飾的變體(例如簡(jiǎn)并密碼子的取代)和互補(bǔ)序列以及明確表示的序列。術(shù)語(yǔ)“分離的”或“基本純化的”意指基本不含其他細(xì)胞組分的化學(xué)組合物。此類(lèi)組合物可在均質(zhì)狀態(tài)，盡管其可在干溶液或水溶液中。純度和均一性通常利用分析化學(xué)的技術(shù)例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法或質(zhì)譜來(lái)確定。制劑中存在的主要種類(lèi)的蛋白為基本上純化的。一般而言，基本上純化或分離的蛋白應(yīng)包含制劑中存在的所有大分子物質(zhì)的80％以上。在一些實(shí)施方案中，純化蛋白以代表存在的所有大分子物質(zhì)的90％以上、95％以上或純化至基本均質(zhì)，其中通過(guò)常規(guī)技術(shù)沒(méi)有檢測(cè)到其它大分子物質(zhì)種類(lèi)。在兩條或更多條核酸或多肽序列的情形下，術(shù)語(yǔ)“一致的”或百分比“一致性”是指當(dāng)在比較窗，或利用以下序列比較算法之一或通過(guò)手動(dòng)比對(duì)和目測(cè)檢查所測(cè)的指定區(qū)域內(nèi)進(jìn)行最大一致性比較和比對(duì)時(shí)，相同的或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸殘基(例如，在指定區(qū)域內(nèi)至少60％一致性、任選地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致性)的兩條或更多條序列或子序列?？蛇x地，百分比一致性可以是60％到100％的任一整數(shù)。這些定義也指核酸序列的互補(bǔ)物。通過(guò)在比較窗內(nèi)比較兩條最佳的對(duì)比序列來(lái)確定“序列一致性的百分比”，其中在所述比較窗中多核苷酸序列或多肽序列的部分與用于兩條序列最佳對(duì)比的參考序列(其不包含添加或缺失)相比，可包含添加或缺失(即空位)。所述百分比通過(guò)以下來(lái)計(jì)算：確定兩條序列中存在的相同的核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗中位置的總數(shù)并將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列一致性的百分比。本文所用“比較窗”包括參考任何一段連續(xù)位置數(shù)的區(qū)段，其中在兩條序列最佳對(duì)比后，序列可與連續(xù)位置數(shù)相同的參考序列進(jìn)行比較。用于比較的序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。適合確定序列一致性百分比和序列相似性的算法的實(shí)例為BLAST和BLAST2.0算法，其分別在Altschuletal.(Nuc.AcidsRes.25:3389-402,1977)和Altschuletal.(J.Mol.Biol.215:403-10,1990)中描述。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)為公眾獲取(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。該算法包括，首先通過(guò)鑒定查詢(xún)序列中長(zhǎng)度W的短字符來(lái)鑒定高得分序列對(duì)(HSP)，其當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字符對(duì)比時(shí)，匹配或滿(mǎn)足某正值閾值得分T。T被稱(chēng)為鄰近字符得分閾值(Altschuletal.,見(jiàn)以上)。這些最初的鄰近字符命中作為開(kāi)始搜索以找到包含它們的更長(zhǎng)的HSP的種子。所述字符命中沿每條序列雙向延伸，直到累積比對(duì)得分增加。對(duì)于核苷酸序列，利用參數(shù)M(一對(duì)匹配殘基得分；永遠(yuǎn)>0)和N(不匹配殘基罰分；永遠(yuǎn)<0)計(jì)算累積得分。對(duì)于氨基酸序列，利用評(píng)分矩陣以計(jì)算累積得分。出現(xiàn)以下情況時(shí)，每個(gè)方向中的字符命中延伸停止累積比對(duì)得分從其最大得到的值下降數(shù)量X；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)得分殘基對(duì)比的累積，累積得分達(dá)到0或0以下；或達(dá)到任一序列的末端時(shí)。所述BLAST算法參數(shù)W、T、和X決定了比對(duì)的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用以下缺省值：字長(zhǎng)(W)11、期望(E)10、M＝5、N＝-4和雙鏈的比較。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下缺省值：字長(zhǎng)3和期望(E)10，以及BLOSUM62評(píng)分矩陣(參見(jiàn)HenikoffandHenikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915,1989)算法(B)50、期望(E)10、M＝5、N＝-4和雙鏈的比較。出于本申請(qǐng)的目的，一致性百分比通常用設(shè)置為缺省參數(shù)的BLAST2算法來(lái)確定。當(dāng)用于給定氨基酸或多核苷酸序列的位置的上下文中時(shí)，“相應(yīng)的”、“參考”、“對(duì)比”或“相對(duì)于”當(dāng)給定氨基酸序列或多核苷酸序列與參考序列對(duì)比時(shí)，是指目標(biāo)指定序列的殘基位置。例如，當(dāng)指HEVORF1編碼序列的高變區(qū)中插入片段的位置時(shí)，所述目標(biāo)序列與HEVORF1參考序列比對(duì)并與所述參考序列對(duì)比以確定ORF1的插入點(diǎn)。除非另外說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)“一(a)”或“一(an)”通常意指“一個(gè)或多個(gè)”。引言本發(fā)明部分基于基因型3HEV毒株中序列突變的發(fā)現(xiàn)，該突變賦予了在細(xì)胞培養(yǎng)物的不同細(xì)胞類(lèi)型中復(fù)制的能力。本發(fā)明因而提供了編碼HEV基因型3蛋白的核酸序列或HEV基因型3蛋白的具有生物學(xué)功能的片段、診斷和治療試劑，以及使用如本文所述的HEV克隆例如用于制備疫苗的方法。在一方面，本發(fā)明涉及編碼戊型肝炎病毒基因型3Kernow毒株及其變體的復(fù)制型變體的全長(zhǎng)核苷酸序列的核酸，特別是cDNA。在另外的方面，本發(fā)明涉及通過(guò)將符合讀框的核酸序列插入戊型肝炎病毒核酸序列編碼ORF1的區(qū)域(例如，ORF1的高變區(qū))中，修飾戊型肝炎病毒毒株以增加所述毒株在細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制的能力。本發(fā)明利用重組遺傳學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，涉及合成編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸和在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)這些多核苷酸。一般而言，下述的重組DNA技術(shù)中的命名和實(shí)驗(yàn)室程序?yàn)楸绢I(lǐng)域熟知且常用的那些。公開(kāi)本發(fā)明中使用的通用方法的基礎(chǔ)文獻(xiàn)包括：Sambrook&Russell,MolecularCloning,ALaboratoryManual(分子克隆,實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(第3版,2001)；Kriegler,GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual(基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(1990)；以及CurrentProtocolsinMolecularBiology(現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù))(Ausubeletal,編輯,1994-2009以及更新的內(nèi)容,WileyInterscience)。復(fù)制型HEV毒株本發(fā)明涉及能在細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制的HEVcDNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有在細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制的能力的本發(fā)明的HEVcDNA，與具有SEQIDNO:l所示核苷酸序列的cDNA克隆有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性或更大的一致性。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的HEVcDNA編碼與SEQIDNO:2所示的ORF1序列有至少85％、通常為至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性或更大一致性的HEVORF1。在一些實(shí)施方案中，具有復(fù)制能力的依照本發(fā)明的全長(zhǎng)克隆與具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的cDNA克隆有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性或更大的一致性，并且相對(duì)于SEQIDNO:6在ORF1的高變區(qū)(其在SEQIDNO:6中通過(guò)下劃線(xiàn)表示)中包含插入片段。在一些實(shí)施方案中，插入片段起始于氨基酸750，如參考SEQIDNO:6確定的。在一些實(shí)施方案中，插入片段編碼長(zhǎng)度為約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、約100或約200個(gè)氨基酸或更多的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，插入氨基酸序列長(zhǎng)度為50-65個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，插入氨基酸序列長(zhǎng)度為35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，插入氨基酸序列長(zhǎng)度為至少40、45、50或55個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，插入片段長(zhǎng)度為58個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，插入片段具有SEQIDNO:9所示的序列。在一些實(shí)施方案中，編碼插入片段的核苷酸插入片段的大小為ORF1，長(zhǎng)度為約60個(gè)核苷酸至約300個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的復(fù)制型HEV克隆相對(duì)于SEQIDNO:5在編碼ORF2的區(qū)域中有突變。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的復(fù)制型HEV克隆相對(duì)于SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，在編碼ORF1高變區(qū)的區(qū)域中具有插入片段并且相對(duì)于SEQIDNO:5在編碼ORF2的區(qū)域中具有其它突變。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的復(fù)制型克隆具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的改變，其編碼相對(duì)于SEQIDNO:6的ORF1中的13個(gè)氨基酸位置和/或相對(duì)于SEQIDNO:8的ORF2的2個(gè)氨基酸位置。在一些實(shí)施方案中，復(fù)制型克隆具有如本文所述的插入片段和一個(gè)或更多個(gè)另外的突變，其編碼選自表4所示位置的氨基酸位置，所述位置相對(duì)于原始病毒在p6Kernow病毒中被突變。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的復(fù)制型HEVcDNA在ORF1中，通常在ORF1的高變區(qū)中包含插入片段。復(fù)制型HEVcDNA可為任何基因型。在一些實(shí)施方案中，HEV基因型1毒株在ORF1中包含插入片段。在一些實(shí)施方案中，HEV基因型3毒株在ORF1中包含插入片段。在一些實(shí)施方案中，HEV基因型2毒株或基因型4毒株在ORF1中包含插入片段。包含插入片段的依照本發(fā)明的HEVcDNA相對(duì)于不包含插入片段的cDNA，具有提高的在細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制的能力。在一些實(shí)施方案中，插入片段在ORF1的高變區(qū)中。在一些實(shí)施方案中，插入在第749位之后，使得插入氨基酸序列起始于ORF1蛋白序列的第750位，如參考SEQIDNO:6確定的。在一些實(shí)施方案中，插入片段編碼核糖體RNA蛋白的序列。插入片段例如可與SEQIDNO:9有至少75％、80％、85％、90％或95％或更大的一致性。在一些實(shí)施方案中，ORF1中的插入片段由SEQIDNO:10所示序列的下劃線(xiàn)部分編碼。復(fù)制型HEVcDNA可利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)來(lái)構(gòu)建。例如，全長(zhǎng)cDNA克隆可從通過(guò)RT-PCR產(chǎn)生的cDNA片段來(lái)裝配。然后，此類(lèi)cDNA克隆可被轉(zhuǎn)錄以得到用于轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中的RNA。如上所示，本發(fā)明包括作為實(shí)例如SEQIDNO:l所提供的參考cDNA序列的變體，其保留了在培養(yǎng)中的多種細(xì)胞系中復(fù)制的能力。此外，如本領(lǐng)域所理解的，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，應(yīng)理解的是可作出核苷酸的許多選擇，其將提供能夠指導(dǎo)HEV開(kāi)放閱讀框產(chǎn)生的DNA序列。由本發(fā)明的HEVcDNA編碼的多肽在另外的方面，本發(fā)明提供了由本發(fā)明的復(fù)制型HEVcDNA克隆編碼的多肽以及利用本發(fā)明的復(fù)制型HEVcDNA克隆產(chǎn)生此類(lèi)多肽的方法。在一些實(shí)施方案中，此類(lèi)多肽可完全或部分純化自通過(guò)轉(zhuǎn)染了本發(fā)明的核酸序列的細(xì)胞產(chǎn)生的戊型肝炎病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種多肽從本發(fā)明的核酸序列的片段重組產(chǎn)生。而在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是化學(xué)合成的。本發(fā)明的多肽，特別是結(jié)構(gòu)性多肽，可作為疫苗開(kāi)發(fā)中的免疫原或作為用于檢測(cè)生物樣品中HEV存在的診斷測(cè)定的開(kāi)發(fā)中的抗原。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有以下序列的多肽或片段：SEQIDNO:2或SEQIDNO:6所示的ORF1氨基酸序列；SEQIDNO:4或SEQIDNO:8所示的ORF2氨基酸序列；或SEQIDNO:3或SEQIDNO:7所示的ORF3氨基酸序列；或以上的片段或變體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽與SEQIDNO:4或SEQIDNO:8的ORF2蛋白有至少90％、95％或100％或更高一致性的序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽具有這樣的序列，該序列與SEQIDNO:4或SEQIDNO:8的ORF2蛋白的片段有至少95％、通常至少96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列一致性，其中所述片段長(zhǎng)度為至少200、至少300、至少400、至少500或至少600個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽具有與SEQIDNO:2或SEQIDNO:6的ORF1蛋白的片段至少85％、至少90％、至少95％、通常至少96％、97％、98％、99％或更高一致性的序列，其中所述片段長(zhǎng)度為至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少700、至少1000或至少1500個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:4、SEQIDNO:3或SEQIDNO:7的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多肽可用于，例如診斷和預(yù)后目的。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可用作免疫原以刺激抗體的產(chǎn)生。載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明的復(fù)制型病毒可培養(yǎng)于多種宿主細(xì)胞中。例如，在一些實(shí)施方案中，RNA獲自本發(fā)明的復(fù)制型cDNA克隆并被引入細(xì)胞系，例如人、豬、或嚙齒類(lèi)的肝細(xì)胞系中。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞系可為肝細(xì)胞系或腎細(xì)胞系，但還可應(yīng)用其它的細(xì)胞系，例如肺細(xì)胞系。在一些實(shí)施方案中，復(fù)制型cDNA克隆可被引入原代細(xì)胞培養(yǎng)物中，例如肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中。接著RNA產(chǎn)生感染性病毒。在一些實(shí)施方案中，可培養(yǎng)原代肝細(xì)胞，然后用HEV感染，或肝細(xì)胞培養(yǎng)物可來(lái)源于被感染動(dòng)物的肝臟。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種永生化方法可用于獲得來(lái)源于肝細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞系。例如，可將原代肝細(xì)胞培養(yǎng)物與多種細(xì)胞融合以保持穩(wěn)定性。本發(fā)明的cDNA克隆的感染性可用多種測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)。例如，在一些實(shí)施方案中，一旦將獲自cDNA克隆的RNA引入細(xì)胞中，便可評(píng)價(jià)蛋白例如ORF2的表達(dá)。在可選的實(shí)施方案中，可評(píng)價(jià)通過(guò)cDNA的初始RNA拷貝的引入而起始的病毒復(fù)制期間產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄物。在典型的實(shí)施方案中，本發(fā)明的HEV克隆的復(fù)制能力通過(guò)確定用HEV克隆獲得的轉(zhuǎn)染子的數(shù)量來(lái)評(píng)價(jià)(即，利用cDNA克隆的RNA拷貝獲得)。當(dāng)在細(xì)胞系例如HepG2或其它細(xì)胞系中測(cè)定時(shí)，在ORF1中有插入片段的本發(fā)明的各種cDNA克隆被認(rèn)為是，相對(duì)于缺少所述插入片段的相同cDNA克隆副本具有至少10％以上、通常至少20％以上或至少30％、40％、50％、80％或100％或更大數(shù)量的表達(dá)ORF2的轉(zhuǎn)錄子的復(fù)制型cDNA克隆。在本發(fā)明的上下文中，“復(fù)制型”cDNA克隆通常并非被直接引入細(xì)胞系中，而是用于體外轉(zhuǎn)錄。從轉(zhuǎn)錄獲得的RNA被引入細(xì)胞系中。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是還可測(cè)量檢測(cè)ORF2水平的備選終點(diǎn)，例如病毒顆粒的產(chǎn)生峰值。在一個(gè)實(shí)施方案中，可將人細(xì)胞在體外培養(yǎng)并用本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)染。然后可評(píng)價(jià)人細(xì)胞以確定該細(xì)胞是否顯示出HEV感染的任何跡象。此類(lèi)?ài)E象包括在細(xì)胞中檢測(cè)出病毒抗原，例如通過(guò)本領(lǐng)域通常已知的免疫熒光程序；通過(guò)蛋白印跡檢測(cè)病毒多肽；以及經(jīng)由諸如RT-PCR的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)新轉(zhuǎn)錄出的病毒RNA。經(jīng)此類(lèi)測(cè)試后，活的、感染性病毒顆粒的存在情況還可通過(guò)將細(xì)胞培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解液注射至健康、易感的動(dòng)物中，隨后用HEV感染的癥狀的表現(xiàn)來(lái)顯示。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的感染性核酸可引入宿主動(dòng)物，例如豬中，例如以評(píng)價(jià)HEV克隆的毒力。通過(guò)感染性核酸序列的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的病毒的毒力表型可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，例如通過(guò)肝酶水平(谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)或異檸檬酸脫氫酶(ICD))的測(cè)量或通過(guò)肝活檢的組織病理學(xué)來(lái)評(píng)價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可將編碼本發(fā)明多肽的核酸并入用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)盒中。表達(dá)系統(tǒng)為本領(lǐng)域熟知并且包括例如細(xì)菌如大腸桿菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。表達(dá)載體包括基于病毒的載體和質(zhì)粒載體。在一些實(shí)施方案中，HEV多肽和肽在人宿主細(xì)胞中表達(dá)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及由來(lái)自不同毒株的HEV序列組成的“嵌合核酸序列”。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合核酸序列可具有來(lái)自本發(fā)明的感染性克隆的序列，例如來(lái)自如本文所述的復(fù)制型cDNA克隆的編碼ORF1的多核苷酸，以及諸如來(lái)自另一種HEV毒株的編碼ORF2的多核苷酸的序列。此類(lèi)嵌合序列可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，可缺失感染性核酸序列中所包含的基因或5'或3'非翻譯區(qū)的全部或部分。然后，可將此類(lèi)序列轉(zhuǎn)染至帶突變序列的宿主細(xì)胞(動(dòng)物或細(xì)胞培養(yǎng)物)中。病毒復(fù)制可利用已知方法，例如RT-PCR來(lái)測(cè)量。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行HEV基因的中心部分的缺失，例如以保留存在于HEV多蛋白內(nèi)的蛋白之間并參與合適的多蛋白加工的切割位點(diǎn)邊界。在一些實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)本發(fā)明的核酸序列以具有用于在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表達(dá)的優(yōu)化密碼子。例如，可根據(jù)宿主使用的特定密碼子的頻率選擇密碼子，以增加特定原核宿主或真核宿主中出現(xiàn)的肽/多肽表達(dá)的速度。在一些實(shí)施方案中，選擇密碼子以產(chǎn)生具有所需性質(zhì)例如更長(zhǎng)半衰期的RNA轉(zhuǎn)錄物。在一個(gè)實(shí)施方案中，將轉(zhuǎn)染了本發(fā)明核酸序列的動(dòng)物細(xì)胞(例如人細(xì)胞)在體外培養(yǎng)，并通過(guò)將抗病毒活性的候選抗病毒劑(化學(xué)物質(zhì)、肽等)加入培養(yǎng)基中用候選試劑處理該細(xì)胞。接著經(jīng)過(guò)足夠的時(shí)間用于發(fā)生感染，之后通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法對(duì)比未處理的對(duì)照細(xì)胞來(lái)確定病毒復(fù)制的存在與否。此類(lèi)方法包括但不限于在細(xì)胞中檢測(cè)病毒抗原，例如通過(guò)本領(lǐng)域熟知的免疫熒光程序；使用病毒多肽特異的抗體通過(guò)蛋白印跡檢測(cè)病毒多肽；通過(guò)RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)新轉(zhuǎn)錄出的病毒RNA；以及通過(guò)將細(xì)胞培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解液注射至健康、易感的動(dòng)物中用隨后的HEV感染癥狀的表現(xiàn)來(lái)檢測(cè)活的、感染性病毒顆粒的存在情況。對(duì)照細(xì)胞(僅用核酸序列處理)得到的結(jié)果與處理細(xì)胞(核酸序列和抗病毒劑)得到的結(jié)果的比較表明，若有的話(huà)，候選抗病毒劑的抗病毒活性的程度。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解的是，此類(lèi)細(xì)胞可在暴露于本發(fā)明的核酸序列之前或之后用候選抗病毒劑處理以確定所述試劑針對(duì)病毒感染和復(fù)制的哪一階段或那些階段是有效的。復(fù)制型病毒的分離本發(fā)明還提供了利用慢性感染HEV患者作為病毒的另外來(lái)源獲得復(fù)制型病毒的方法。在典型的方法中，病毒分離自患者，通常為糞便樣品，并用于感染細(xì)胞系，例如肝癌細(xì)胞系。病毒連續(xù)傳代以使病毒適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)物的方法為本領(lǐng)域熟知。例如，病毒可利用以下方案來(lái)傳代。得到糞便樣品并勻漿以產(chǎn)生懸浮液，將懸浮液通過(guò)離心來(lái)澄清并使用澄清的懸浮液(或者病毒可通過(guò)超速離心進(jìn)一步純化，之后可將其稀釋于所選的培養(yǎng)基中)。將糞便懸浮液或血清的等分試樣覆蓋到小培養(yǎng)平皿或燒瓶中排干的單層細(xì)胞(例如，HepG2/C3A)上并孵育(例如，在約34.5℃的溫度下在CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)5小時(shí))。吸干接種物并加入細(xì)胞培養(yǎng)基。在相同溫度下繼續(xù)孵育。將培養(yǎng)基除去，每周更換一次或兩次培養(yǎng)基，并對(duì)所收集的培養(yǎng)基進(jìn)行能感染HepG2/C3A或另一種所需細(xì)胞系如LLC-PK細(xì)胞的病毒量的滴定。當(dāng)培養(yǎng)基中的病毒滴度已上升至足夠高的水平(例如，1000個(gè)空斑形成單位/mL)，將等分試樣移出并用于接種另一燒瓶或平皿的細(xì)胞(例如，HepG2細(xì)胞)并重復(fù)該程序，例如5次，直至培養(yǎng)基中的病毒達(dá)到所需滴度。為了獲得cDNA克隆，提取培養(yǎng)基等分試樣中的病毒RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，其通過(guò)PCR擴(kuò)增，通常作為重疊片段，并克隆。將T7聚合酶啟動(dòng)子并入到基因組的5'端并將唯一的限制性位點(diǎn)作為PCR引物的一部分并入到3'端。將cDNA片段用合適的限制性酶消化并連接到一起以產(chǎn)生全長(zhǎng)病毒基因組cDNA。將cDNA在大腸桿菌中擴(kuò)增、純化并在唯一的限制性位點(diǎn)線(xiàn)性化。將線(xiàn)性化的cDNA用T7聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄。該RNA隨后可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞并產(chǎn)生復(fù)制型病毒基因組、病毒蛋白和感染性病毒顆粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是這些方案有許多變化。以上概述的用于連續(xù)傳代和cDNA克隆的方案是方案的實(shí)例而并不意圖限制所應(yīng)用的方案。本發(fā)明的HEVcDNA、病毒和蛋白的用途利用本發(fā)明的cDNA克隆產(chǎn)生的戊型肝炎病毒可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中純化或部分純化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，病毒在其用作本發(fā)明的藥物組合物和疫苗中的免疫原之前是部分純化的。因此本發(fā)明涉及產(chǎn)生自本發(fā)明的HEV核酸序列的戊型肝炎病毒的用途。例如，相對(duì)于SEQIDNO:5在ORF1中有插入片段的HEV3型毒株(例如具有SEQIDNO:1所示序列的HEV3型或其變體)，用作活疫苗或被殺死的疫苗(例如福爾馬林滅活的)中的免疫原以預(yù)防哺乳動(dòng)物的戊型肝炎。在一些實(shí)施方案中，HEV3型毒株病毒有不可使用的ORF3。在此類(lèi)實(shí)施方案中，ORF3可通過(guò)突變或缺失失活。本發(fā)明還涉及重組HEV蛋白作為診斷試劑和疫苗的用途。作為免疫原起作用的疫苗，可為細(xì)胞、來(lái)自轉(zhuǎn)染了重組表達(dá)載體的細(xì)胞的細(xì)胞裂解液或包含所表達(dá)蛋白的培養(yǎng)物上清液?；蛘撸庖咴瓰椴糠只蚧炯兓闹亟M蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗利用直接的基因轉(zhuǎn)移來(lái)給予。這可經(jīng)由給予包含本發(fā)明核酸序列的真核表達(dá)...