專利名稱：一種基于硅納米線的藥物載體制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種納米材料藥物載體的制備方法，具體涉及一種基于硅納米線的藥物載體的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著納米生物技術(shù)的快速發(fā)展，近年來納米材料作為藥物載體進(jìn)行癌癥治療得到了廣泛的關(guān)注。傳統(tǒng)的抗癌藥物，如鹽酸阿霉素(DOX)和紫杉醇(PTX)，會(huì)分布于正常組織中并且能夠快速的被腎臟清除，只有極少量的抗腫瘤藥物能夠累積在癌癥 部位發(fā)揮作用(Clin. Cancer. Res. 1999, 5, 1703-1707;Pharm. Res. 2003, 20, 1337-1350;Clin. Cancer.Res. 2005，11，8782-8788;Nat. Rev. Cancer. 2006，6，583-592.)，因而在癌癥治療方面受到極大的限制。為提高抗腫瘤藥物在作用部位的藥物濃度，其有效的策略之一是設(shè)計(jì)高載藥效率的藥物載體。近年來，許多納米材料由于其較大的比表面積、多孔結(jié)構(gòu)等優(yōu)良的性能被用于設(shè)計(jì)成高載藥量的納米藥物載體，如基于介孔硅的藥物載體裝載DOX的量為1200mg/g (ACS nano2010, 4，529-539;ACS Nano2011,5,7462-7470;Angew. Chem.1nt.Ed. 2011，50，8853-8857.);氧化石墨烯負(fù)載 DOX 的量達(dá)至Ij 2350mg/g (J. Phys. Chem.C.2008，112，17554-17558;J. Am. Chem. Soc. 2008，130，10876-10877;Small2011, 7，460-464.);而單壁碳納米管具有極高的DOX負(fù)載效率達(dá)到4000mg/g (ACS Nano2007, I, 50-56.)。然而盡管在癌癥治療領(lǐng)域取得如此巨大的進(jìn)步，發(fā)展具有更高載藥效率的新型納米藥物載體依然勢在必行。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種基于娃納米線的具有更聞負(fù)載效率的藥物載體的制備方法。與傳統(tǒng)娃技術(shù)相比，娃納米結(jié)構(gòu)(如納米點(diǎn)、納米線、納米球等)具有良好的生物相容性、優(yōu)良的光電性質(zhì)、在體內(nèi)易降解和極易進(jìn)行表面修飾的優(yōu)點(diǎn)(Nature2000,408，440-444;Science2003, 299，1874-1877;J.Am.Chem.Soc. 2007, 129, 7228-7229 ; Angew. Chem.1nt. Ed. 2009, 121, 134-138; J. Am. Chem.Soc. 2009, 131，4434-4438 ; J. Am. Chem. Soc. 201 1, 133, 14192-14195 ; Nat.Mater. 2009, 8, 331-336;Nano Lett. 2012，12，5532-5538.)。因而，硅納米材料被廣泛用于生物領(lǐng)域，尤其是娃納米線(silicon nanowires, SiNWs)被廣泛用于生物應(yīng)用領(lǐng)域，如基于SiNWs腫瘤成像和癌癥熱治療的納米探針(Angew. Chem.1nt.Ed.2011，123，3136-3139;ACS Nano2012, 6，2582-2590;Nano. Lett. 2012，12，1845-1850.)。近期相關(guān)工作表明硅納米線由于大的比表面積和多孔結(jié)構(gòu)在催化領(lǐng)域得到了很好的應(yīng)用(J. Am. Chem. Soc. 2009，131，17738-17739 ; Nano. Lett. 2009，9，4539-4543 ; Nano.Lett. 2009, 9，3550-3554.)，而大的比表面積和多孔結(jié)構(gòu)也是增大載藥率的兩個(gè)重要因素。
基于上述的理論基礎(chǔ)，發(fā)明人首次發(fā)展了利用硅納米線作為新型納米載體裝載抗腫瘤藥物。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案本發(fā)明的基于硅納米線的藥物載體的制備方法，具體包括下述步驟用緩沖溶液將硅納米線配成2(T200微克每毫升的體系，加入抗腫瘤藥物混合成溶液，在2(T37攝氏度下振蕩3 30小時(shí)，離心并用相同緩沖溶液清洗3 10次，除去上層未結(jié)合的抗腫瘤藥物，得到下層沉淀即為硅納米線-抗腫瘤藥物復(fù)合物。優(yōu)選的，所述的硅納米線直徑為50 150納米、長度為250 750納米。優(yōu)選的，所述的緩沖溶液pH為4 10。 優(yōu)選的，所述的緩沖溶液為PB緩沖液、PBS緩沖液或碳酸鹽緩沖液，其中PB緩沖液表示磷酸鹽緩沖液，PBS緩沖液表示加了氯化鈉的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明以硅納米線復(fù)合鹽酸阿霉素(DOX)為例，做負(fù)載效率測定及硅納米線-鹽酸阿霉素(SiNW-DOX)復(fù)合物對體外和體內(nèi)癌癥細(xì)胞的殺傷研究，但不限于D0X，紫杉醇(PTX)及其他的抗腫瘤藥物亦同樣適用。優(yōu)選的，所述的抗腫瘤藥物為鹽酸阿霉素或紫杉醇。將上層未結(jié)合的DOX溶液用紫外-可見-近紅外光譜儀測定DOX在特定吸收峰處的吸光值，從而計(jì)算出硅納米線載藥效率，其負(fù)載效率不低于10000毫克每克，甚至可以達(dá)到20000毫克每克以上。利用3- (4，5-二甲基噻唑_2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽標(biāo)準(zhǔn)比色(MTT)法進(jìn)行硅納米線-抗腫瘤藥物復(fù)合物對體外癌癥細(xì)胞的殺傷研究，本發(fā)明制備得到的SiNW-DOX復(fù)合物在細(xì)胞層面起到良好的殺傷癌細(xì)胞的作用；在4飛周齡雌性Balb/c裸鼠右側(cè)背部皮下注射0. ro. 2毫升密度為5 X IO6IX IO7的癌細(xì)胞懸液進(jìn)行硅納米線-抗腫瘤藥物復(fù)合物對體內(nèi)癌癥細(xì)胞的殺傷研究，本發(fā)明制備得到的SiNW-DOX復(fù)合物在較長時(shí)間內(nèi)抑制腫瘤生長增加了小鼠存活率。本發(fā)明的方法極大地提高了傳統(tǒng)抗腫瘤藥物在載體中的負(fù)載效率，操作安全，快速簡便。所得的硅納米線-抗腫瘤藥物復(fù)合物能夠在細(xì)胞及活體層面不僅能夠起到良好的殺傷癌細(xì)胞的作用，還能夠起到藥物緩釋從而在較長時(shí)間內(nèi)抑制腫瘤生長的作用。由于硅納米線具有極大的載藥效率可以作為納米藥物廣泛用于癌癥治療領(lǐng)域。


為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的有關(guān)本發(fā)明的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1是本發(fā)明制備得到的SiNW-DOX復(fù)合物在細(xì)胞層面殺傷癌細(xì)胞的對比曲線圖；圖2是本發(fā)明制備得到的SiNW-DOX復(fù)合物在活體層面通過藥物緩釋殺傷癌細(xì)胞，抑制腫瘤生長的對比曲線圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的基于硅納米線的藥物載體的制備方法，具體包括下述步驟用緩沖溶液將硅納米線配成2(T200微克每毫升的體系，加入抗腫瘤藥物混合成溶液，在2(T37攝氏度下振蕩3 30小時(shí)，離心并用相同緩沖溶液清洗3 10次，除去上層未結(jié)合的抗腫瘤藥物，得到下層沉淀即為硅納米線-抗腫瘤藥物復(fù)合物。優(yōu)選的，所述的硅納米線直徑為5(Tl50納米、長度為25(T750納米。優(yōu)選的，所述的緩沖溶液pH為4 10。優(yōu)選的，所述的緩沖溶液為PB緩沖液、PBS緩沖液或碳酸鹽緩沖液。
·
優(yōu)選的，所述的抗腫瘤藥物為鹽酸阿霉素或紫杉醇。下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。以下具體實(shí)施方式
中用到的儀器、藥品試劑包括恒溫振蕩器、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、紫外-可見-近紅外光譜儀、PB緩沖液、PBS緩沖液、碳酸鹽緩沖液、鹽酸阿霉素、改良型1640培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、低糖DMEM培養(yǎng)基、3- (4，5- 二甲基噻唑-2) -2，5- 二苯基四氮唑溴鹽(MTT )、十二烷基磺酸鈉(SDS )、濃鹽酸、生理鹽水。實(shí)施例1( I) SiNW-DOX 復(fù)合物制備將20微克SiNWs固體加入100微升pH=9的PB緩沖液中，然后和I毫升640微克每毫升的DOX溶液共同放入到一個(gè)1. 5毫升離心管中，于恒溫振蕩器中25攝氏度下反應(yīng)12個(gè)小時(shí)后，離心機(jī)中離心，PB緩沖液清洗可得到SiNW-DOX復(fù)合物溶液備用。(2) DOX裝載效率收集離心后的含有自由DOX的上清溶液，利用紫外-可見光-近紅外光譜儀通過比色法測定490納米處吸光值，計(jì)算得到裝載效率約為20800微克每克。(3) SiNW-DOX復(fù)合物細(xì)胞毒性研究將含20微克每毫升SiNW-DOX復(fù)合物的高糖DMEM培養(yǎng)基，加入含有HeLa細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育24小時(shí)，經(jīng)MTT法用酶標(biāo)儀檢測570納米處吸光值。經(jīng)計(jì)算HeLa細(xì)胞存活率下降到約40%。實(shí)施例2(I) SiNW-DOX 復(fù)合物制備將20微克SiNWs固體加入100微升pH=9的PBS緩沖液中，然后和I毫升700微克每毫升的DOX溶液共同放入到一個(gè)1. 5毫升離心管中，于恒溫振蕩器25攝氏度下反應(yīng)24個(gè)小時(shí)后，離心機(jī)中離心，PBS緩沖液清洗可得到SiNW-DOX復(fù)合物溶液備用。(2) DOX裝載效率收集離心后的含有自由DOX的上清溶液，利用紫外-可見光-近紅外光譜儀通過比色法測定490納米處吸光值，計(jì)算得到裝載效率為19000微克每克。(3) SiNW-DOX復(fù)合物細(xì)胞毒性研究將含5微克每毫升SiNW-DOX復(fù)合物的改良型-1640培養(yǎng)基，加入含有KB細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育48小時(shí)，經(jīng)MTT法用酶標(biāo)儀檢測570納米處吸光值。經(jīng)計(jì)算KB細(xì)胞存活率下降到約20%。實(shí)施例3(I) SiNW-DOX 復(fù)合物制備將20微克SiNWs固體加入100微升pH=8的碳酸鹽緩沖液中，然后和I毫升800微克每毫升的DOX溶液共同放入到一個(gè)1. 5毫升離心管中，于恒溫振蕩器20攝氏度下反應(yīng)30個(gè)小時(shí)后，離心機(jī)離心，碳酸鹽緩沖液清洗可得到SiNW-DOX復(fù)合物溶液備用。(2) DOX裝載效率收集離心后的含有自由DOX的上清溶液，利用紫外-可見光-近紅外光譜儀通過比色法測定490納米處吸光值，計(jì)算得到裝載效率為14000微克每克。 (3) SiNW-DOX復(fù)合物細(xì)胞毒性研究將含10微克每毫升SiNW-DOX復(fù)合物的改良型-1640培養(yǎng)基，加入含有A549細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育48小時(shí)，經(jīng)MTT法用酶標(biāo)儀檢測570納米處吸光值。經(jīng)計(jì)算A549細(xì)胞存活率下降到約30%。實(shí)施例4 (I) SiNW-DOX 復(fù)合物制備將20微克SiNWs固體加入100微升pH=8的PB緩沖液中，然后和I毫升900微克每毫升的DOX溶液共同放入到一個(gè)1. 5毫升離心管中，于恒溫振蕩器37攝氏度下反應(yīng)3個(gè)小時(shí)后，離心機(jī)離心，PB緩沖液清洗可得到SiNW-DOX復(fù)合物溶液備用。(2) DOX裝載效率收集離心后的含有自由DOX的上清溶液，利用紫外-可見光-近紅外光譜儀通過比色法測定490納米處吸光值，計(jì)算得到裝載效率為16000微克每克。(3) SiNW-DOX復(fù)合物細(xì)胞毒性研究將含15微克每毫升SiNW-DOX復(fù)合物的改良型-1640培養(yǎng)基，加入含有MCF-7細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育24小時(shí)，經(jīng)MTT法用酶標(biāo)儀檢測570納米處吸光值。經(jīng)計(jì)算MCF-7細(xì)胞存活率下降到約30%。實(shí)施例5(I) SiNW-DOX 復(fù)合物制備將20微克SiNWs固體加入100微升pH=8的PBS緩沖液中，然后和I毫升1000微克每毫升DOX溶液共同放入到一個(gè)1. 5毫升離心管中，于恒溫振蕩器30攝氏度下反應(yīng)6個(gè)小時(shí)后，離心機(jī)離心，PBS緩沖液清洗可得到SiNW-DOX復(fù)合物溶液備用。(2) DOX裝載效率收集離心后的含有自由DOX的上清溶液，利用紫外-可見光-近紅外光譜儀通過比色法測定490納米處吸光值，計(jì)算得到裝載效率為14000微克每克。(3) SiNW-DOX復(fù)合物細(xì)胞毒性研究將含40微克每毫升SiNW-DOX復(fù)合物的改良型-1640培養(yǎng)基，加入含有MCF-7/Adr細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育48小時(shí)，經(jīng)MTT法用酶標(biāo)儀檢測570納米處吸光值。經(jīng)計(jì)算MCF-7/Adr細(xì)胞存活率下降到約45%。實(shí)施例6
(I) SiNW-DOX 復(fù)合物制備將20微克SiNWs固體加入100微升pH=7的PB緩沖液中，然后和I毫升1000微克每毫升DOX溶液共同放入到一個(gè)1. 5毫升離心管中，于恒溫振蕩器20攝氏度下反應(yīng)30個(gè)小時(shí)后，離心機(jī)離心，PB緩沖液清洗可得到SiNW-DOX復(fù)合物溶液備用。(2) DOX裝載效率收集離心后的含有自由DOX的上清溶液，利用紫外-可見光-近紅外光譜儀通過比色法測定490納米處吸光值，計(jì)算得到裝載效率為10000微克每克。(3) SiNW-DOX復(fù)合物細(xì)胞毒性研究將含20微克每毫升SiNW-DOX復(fù)合物的低糖DMEM培養(yǎng)基，加入含有U87MG細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育48小時(shí)，經(jīng)MTT法用酶標(biāo)儀檢測570納米處吸光值。經(jīng)計(jì)算U87MG 細(xì)胞存活率下降到約15%。實(shí)施例7SiNW_D0X復(fù)合物對體外癌癥細(xì)胞的殺傷研究將含20微克每毫升SiNW-DOX復(fù)合物的高糖DMEM培養(yǎng)基，加入含有HeLa細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育24小時(shí)，經(jīng)MTT法用酶標(biāo)儀檢測570納米處吸光值。經(jīng)計(jì)算HeLa細(xì)胞存活率下降到約40%。將HeLa細(xì)胞和KB細(xì)胞以每孔0. 8^3萬個(gè)的相同密度培養(yǎng)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37攝氏度5vol% 二氧化碳條件下培養(yǎng)過夜。將不同濃度(1. 25微克每毫升、2. 5微克每暈升、5微克每暈升、10微克每暈升和20微克每暈升)鹽酸阿霉素(D0X)、娃納米線(SiNW)和硅納米線-鹽酸阿霉素(SiNW-DOX)復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育24小時(shí)和48小時(shí)。然后，向每孔中加入20微升5毫克每毫升貯存在-20攝氏度中的MTT溶液，在37攝氏度條件下孵育4小時(shí)，向每孔中加入100微升經(jīng)過鹽酸酸化的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液將細(xì)胞裂解，用酶標(biāo)儀檢測570納米處吸光值。結(jié)果如圖1所示，圖1a與圖1b為HeLa細(xì)胞與不同濃度硅納米線、鹽酸阿霉素和硅納米線-鹽酸阿霉素復(fù)合物分別孵育24小時(shí)和48小時(shí)，在細(xì)胞層面殺傷HeLa細(xì)胞的結(jié)果；圖1c與圖1d為KB細(xì)胞與不同濃度硅納米線、鹽酸阿霉素和硅納米線-鹽酸阿霉素復(fù)合物分別孵育24小時(shí)和48小時(shí)，在細(xì)胞層面殺傷KB細(xì)胞的結(jié)果。由圖1明顯的看出，硅納米線對癌細(xì)胞并無殺傷作用，鹽酸阿霉素和硅納米線-鹽酸阿霉素復(fù)合物保持基本一致的癌細(xì)胞殺滅趨勢，只是在低濃度時(shí)略有差異，低濃度時(shí)鹽酸阿霉素略好，漸漸的隨著濃度的增加硅納米線-鹽酸阿霉素復(fù)合物殺滅效果和鹽酸阿霉素基本相同。實(shí)施例8SiNW_D0X復(fù)合物對體內(nèi)癌癥細(xì)胞的殺傷研究在4飛周齡雌性Balb/c裸鼠右側(cè)背部皮下注射0. f 0. 2毫升密度為5X IO6^XlO7的癌細(xì)胞懸液。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到5(T250立方毫米時(shí)，為減少體重和腫瘤大小引起的誤差將裸鼠隨機(jī)分為四組，分別在瘤內(nèi)注射相同體積的生理鹽水、鹽酸阿霉素(D0X)、硅納米線(SiNW)和硅納米線-鹽酸阿霉素(SiNW-DOX)復(fù)合物。用游標(biāo)卡尺每兩天對每組裸鼠腫瘤長和寬進(jìn)行測量，用以下公式計(jì)算腫瘤體積ab2/2，a代表腫瘤長度，b代表腫瘤寬度；用以下公式計(jì)算腫瘤相對體積'、/'，V代表測量時(shí)腫瘤體積，Vci代表原始腫瘤體積。結(jié)果如圖2所示，可以清晰的看出，硅納米線-鹽酸阿霉素復(fù)合物在較長時(shí)間內(nèi)(30日)均能穩(wěn)定的抑制腫瘤的生長，而鹽酸阿霉素只在最初的一段時(shí)間(10天左右)能穩(wěn)定的抑制腫瘤的生長，之后的抑制效果越來越差，可見活體組織中能夠快速的清除DOX，只有少量的DOX能夠累積的發(fā)揮作用，而SiNW-DOX復(fù)合物卻能夠不斷緩釋DOX到活體組織中，使得活體組織中的DOX量維持穩(wěn)定，極大的延長了 DOX的藥效。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。不應(yīng)將權(quán)利要求中的任何附圖標(biāo)記視為限制所涉及的權(quán)利要求。此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式?！?br> 權(quán)利要求
1.一種基于硅納米線的藥物載體的制備方法，其特征在于，包括下述步驟用緩沖溶液將硅納米線配成2(Γ200微克每毫升的體系，加入抗腫瘤藥物混合成溶液， 在2(Γ37攝氏度下振蕩3 30小時(shí)，離心并用相同緩沖溶液清洗3 10次，除去上層未結(jié)合的抗腫瘤藥物，得到下層沉淀即為硅納米線-抗腫瘤藥物復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的硅納米線直徑為5(Γ150納米、長度為250 750納米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的緩沖溶液pH為Γ10。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的緩沖溶液為PB緩沖液、PBS緩沖液或碳酸鹽緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的抗腫瘤藥物為鹽酸阿霉素或紫杉醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于硅納米線的藥物載體的制備方法，用緩沖溶液將硅納米線配成20~200微克每毫升的體系，加入抗腫瘤藥物混合成溶液，在20~37攝氏度下振蕩3~30小時(shí)，離心并用相同緩沖溶液清洗3~10次，除去上層未結(jié)合的抗腫瘤藥物，得到下層沉淀即為硅納米線-抗腫瘤藥物復(fù)合物。本發(fā)明的方法極大地提高了傳統(tǒng)抗腫瘤藥物在載體中的負(fù)載效率，操作安全，快速簡便，所得的硅納米線-抗腫瘤藥物復(fù)合物能夠在細(xì)胞及活體層面不僅能夠起到良好的殺傷癌細(xì)胞的作用，還能夠起到藥物緩釋從而在較長時(shí)間內(nèi)抑制腫瘤生長的作用，由于硅納米線具有極大的載藥效率可以作為納米藥物廣泛用于癌癥治療領(lǐng)域。
文檔編號A61K31/704GK102989006SQ20121057941
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者何耀, 彭飛, 蘇媛媛, 李述湯 申請人:蘇州大學(xué)