蟲草素用于制備預防和治療動脈粥樣硬化的藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及蟲草素(3′-脫氧腺苷)的醫(yī)藥新用途。具體涉及蟲草素用于制備預防和治療動脈粥樣硬化及與動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的藥物的用途。藥效學實驗證明，蟲草素可顯著抑制ApoE-/-小鼠主動脈粥樣硬化斑塊的形成，降低高血脂動物的血清TC、TG和LDL-c水平，提高動物血清中的總抗氧化能力和SOD活性，并降低MDA含量，同時顯著降低血清中白細胞介素2和白細胞介素8的水平，抑制炎癥發(fā)生。細胞實驗表明，蟲草素可以顯著抑制單核細胞RAW267.4攝取膽固醇，同時促進膽固醇從細胞中流出。
【專利說明】蟲草素用于制備預防和治療動脈粥樣硬化的藥物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛹蟲草提取物中單一成分的蟲草素(3'-脫氧腺苷)的醫(yī)藥新用途。具體涉及蟲草素用于制備預防和治療動脈粥樣硬化及與動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的藥物的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著社會的進步和生活方式的改變，動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)病率逐年升高。研究顯示，動脈粥樣硬化是一種與脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)的全身性疾病，其病變特點是血液中的脂質(zhì)，特別是膽固醇在動脈血管壁內(nèi)膜沉積形成粥樣斑塊，導致動脈硬化。動脈粥樣硬化發(fā)生于心、腦等重要器官時，將引起組織缺血性改變，造成嚴重后果，例如心絞痛、心肌梗塞、腦梗塞、腎組織梗塞和四肢動脈栓塞等，是當今嚴重危害人類健康的常見病。
[0003]動脈粥樣硬化的病因十分復雜，發(fā)病機制也尚未完全闡明。目前普遍可接受的觀點認為,低密度脂蛋白(LDL)被過氧化形成氧化低密度脂蛋白(oxLDL)，進而被巨噬細胞和血管平滑肌細胞吞噬和沉積，形成巨噬源性泡沫細胞和肌源性泡沫細胞，最終導致兩種泡沫細胞壞死崩解，形成糜粥樣壞死物，粥樣斑塊形成。有多種因素參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，主要包括聞脂血癥、氧化應激和炎癥等。
[0004]脂質(zhì)一直以來被認為是導致動脈粥樣硬化的元兇。血漿脂質(zhì)以脂蛋白的形式存在。根據(jù)脂蛋白的顆 粒大小及密度，可將血漿脂蛋白分為四族:乳糜微粒(CM)，極低密度脂蛋白(VLDL)，低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)。高脂血癥的實質(zhì)是血漿中CM、VLDL.LDL的增多和(或)HDL減少，更本質(zhì)的是ApoA-1降低和ApoB和ApoE的增高。研究證明，LDL增多是動脈粥樣硬化發(fā)病的最主要因素。天然LDL的核心含有大量不飽和脂肪酸，在氧自由基的作用下，經(jīng)過一系列反應，成為氧化低密度脂蛋白(OxLDL)。OxLDL促進單核細胞粘附于內(nèi)皮并移至內(nèi)膜下，增生和分化為巨噬細胞。巨噬細胞通過清道夫受體聚積OxLDL，轉(zhuǎn)變?yōu)閱魏思毎葱缘呐菽毎Ｍ瑫rOxLDL還引起平滑肌細胞增生和移行，誘導清道夫受體表達，從而使平滑肌細胞聚積OxLDL，成為平滑肌細胞源泡沫細胞。OxLDL具有細胞毒性作用，LDL氧化過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物可直接損傷內(nèi)皮細胞，并抑制內(nèi)皮舒張因子的合成，損傷動脈壁正常的舒縮功能。OxLDL還增強花生四烯酸代謝和血栓素B2的產(chǎn)生，減少膜脂的流動性，并使前列腺素12和血栓素A2代謝紊亂，降低血小板流動性，促使血小板聚集，引起血管痙攣，血栓形成。最終導致粥樣斑塊的形成。
[0005]氧化應激與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系也非常密切。氧自由基(ROS)的過度積累可促使oxLDL的形成和內(nèi)皮細胞損傷。在單核細胞分化成巨噬細胞并吞噬大量oxLDL成為泡沫細胞后，泡沫細胞又產(chǎn)生R0S，作用于LDL形成oxLDL，從而加重氧化應激。另外，ROS可以作為第二信使傳遞血管緊張素II等細胞外信號，促進平滑肌細胞增殖和移行。增殖的平滑肌細胞和聚集的單核-巨噬細胞使脂肪紋演變?yōu)閲乐氐慕M織損傷，損傷向管腔內(nèi)突起，再經(jīng)鈣化和持續(xù)的纖維化，形成一個包裹被氧化脂質(zhì)內(nèi)核的纖維性帽狀結(jié)構(gòu)，這就是動脈粥樣斑塊。[0006]在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中，炎癥也發(fā)揮中的重要的作用。動脈粥樣硬化的危險因素如氧化脂蛋白、脂代謝紊亂、高血壓、糖尿病、肥胖癥與感染等均可啟動炎癥進程并促進其進一步發(fā)展。在動脈粥樣硬化動物模型中發(fā)現(xiàn)，炎癥標志物常隨著脂質(zhì)侵入動脈壁一起出現(xiàn)。血管內(nèi)皮的局部損傷會促使炎癥細胞粘附到內(nèi)皮上并移行侵入內(nèi)膜，，隨后再局部引發(fā)并維系持久的炎癥反應。巨噬細胞可以通過清道夫受體吞噬修飾或氧化的脂蛋白，轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎?。隨著炎癥的進展，激活的白細胞和內(nèi)皮細胞可釋放出多種生長因子，刺激平滑肌細胞和成纖維細胞增殖和遷移，由動脈壁中層進入內(nèi)膜，并刺激這些細胞生成新的結(jié)締組織，形成內(nèi)膜纖維肌性增殖性病變，從而使動脈粥樣硬化不斷加重。
[0007]由此可見，血液中高濃度的膽固醇及其在動脈血管壁內(nèi)膜的沉積是引起動脈粥樣硬化的最主要原因，高血脂、氧化應激和炎癥反應是促進動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的重要因素。
[0008]目前預防和治療動脈粥樣硬化的藥物主要是通過調(diào)血脂發(fā)揮作用。例如膽酸螯合樹脂(Bile acidsequestering resin)和新霉素(neomycin)可促進膽酸排出，加速膽固醇分解為膽酸，降低膽固醇。他汀類(Statin)可通過抑制3-羥-3-甲戊二酰輔酶A還原酶活性,減少膽固醇的合成,加速LDL的廓清，使血膽固醇和LDL下降，也可使血甘油三酯和VLDL下降。貝特類(Fibrate)是過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARa)的激動劑，降血甘油三酯的作用強于降膽固醇，并使HDL增高。而不飽和脂肪酸(unsaturatedfatty acid)可抑制脂質(zhì)在小腸的吸收和膽汁酸的再吸收，抑制肝臟脂質(zhì)和脂蛋白合成，促進膽固醇從糞便中排出，有降低血甘油三酯、VLDL、膽固醇、LDL和增高HDL的作用，尚可抑制血小板功能、減少血栓形成。但是由于這類藥物主要通過影響體內(nèi)代謝活動實現(xiàn)的，因此都有顯著的副作用。
[0009]除調(diào)血脂藥物之外，抗氧化劑也是治療動脈粥樣硬化的一種有效手段。抗氧化相關(guān)藥物可分為兩類:抗氧化劑和兼有抗氧化作用的藥物，前者已作為一個單獨分類的藥物類別，而后者則涉及范圍較廣，包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素受體阻滯劑(ARB)和他汀類藥物等?？寡趸瘎┓譃樘烊豢寡趸瘎?維生素E、維生素C、β胡蘿卜素、谷胱甘肽等)及合成抗氧化藥物如普羅布考(2，2'-雙(3，5-二叔丁基-4-羥基苯硫基)丙烷)。普羅布考是目前可用于臨床的最強抗氧化藥物，抗氧化強度是維生素E的5-6倍，與低密度脂蛋白(LDL)的結(jié)合能力遠大于其他脂溶性天然抗氧化劑。普羅布考可以通過抑制LDL的過氧化作用，進而阻止膽固醇在單核細胞/巨噬細胞中的加速積累來阻止或抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展。并且其抗動脈粥樣硬化作用與其對降低血漿膽固醇水平的作用無關(guān)。
[0010]蟲草素，又稱3’-脫氧腺苷，是中藥冬蟲夏草中含有的一種腺苷類活性成分。研究證明，蟲草素具有廣泛的藥理學活性，包括抗癌、抗炎、抗氧化、提高性能力以及保護血管內(nèi)皮細胞免于氧化和機械損傷等。本 申請人:前期的研究結(jié)果表明，蟲草素可以顯著降低高脂飼料誘導的高脂血癥動物模型的血清總膽固醇、低密度脂蛋白和甘油三酯水平，并且激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是其發(fā)揮降脂作用的主要途徑。由于高血脂、炎癥反應、過氧化和血管平滑肌細胞損傷也是AS的重要發(fā)病原因，同時激活AMPK對于AS的防治也有積極意義，因此蟲草素對上述病理事件的有益效果提示它對AS能具有重要的預防和治療作用。
[0011]近年來，一些研究組從血 管平滑肌損傷的角度對蟲草素的抗AS效果進行了初步的研究。Won 等(Won KJ, Lee SC, Lee CK, Lee HM, Lee SH, et al.(2009) Cordycepinattenuates neointimal formation byinhibiting reactive oxygen species-mediatedresponses in vascular smooth muscle cells in rats.J Pharmacol Sci 109:403-412.)和 Chang等(Chang ff,Lim S,Song H,Song Bff,Kim HJ,et al.(2008)Cordycepin inhibitsvascular smooth muscle cell proliferation.Eur J Pharmacol 597:64-69)通過大鼠頸動脈氣囊損傷模型和血管平滑肌細胞模型證明，蟲草素可以減少新生內(nèi)膜形成，抑制主動脈平滑肌細胞的遷移和增殖。但是球囊損傷動物模型主要模擬血管在機械應力下發(fā)生的動脈損傷和斑塊形成，與人類自然的AS發(fā)病機制和過程有很大差異，因此他們的數(shù)據(jù)尚不足以確認蟲草素對自然發(fā)生的，特別是對由于肥胖和高血脂導致的AS的治療作用。另外，抑制oxLDL的形成以及膽周醇在巨噬細胞內(nèi)的流入和流出調(diào)節(jié)已經(jīng)公認為是防治AS的重要靶點，但是到目前為止，尚沒有任何關(guān)于蟲草素抑制oxLDL的形成以及降低巨噬細胞攝取膽固醇并促進膽固醇從巨噬細胞流出的研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是提供一種蟲草素或其藥物組合物在制造用于預防和治療因膽固醇在動脈血管壁內(nèi)膜沉積造成的動脈粥樣硬化、以及與動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的藥物中的應用。
[0013]本發(fā)明通過動物藥理學實驗證明，蟲草素能夠顯著降低膽固醇在血管壁內(nèi)膜的沉積，避免形成粥樣斑塊，顯示可作為預防和治療動脈粥樣硬化及與動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的有效藥物。同時蟲草素可顯著降低高血脂動物的血清膽固醇和甘油三酯水平，提高動物的抗氧化能力， 清除活性氧，并對炎癥有顯著的抑制效果。細胞學實驗表明，蟲草素可顯著抑制單核細胞RAW267.4攝取膽固醇并促進膽固醇從細胞內(nèi)排出，表明蟲草素具有預防和治療動脈粥樣硬化及與動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的良好前景。
[0014]本發(fā)明還提供了一種用于預防和治療動脈粥樣硬化的藥物，其中含有蟲草素，以及藥學上可接受的輔助劑。該藥物可以制成注射劑、片劑、丸劑、分散劑、膠囊劑、軟膠囊、滴丸、顆粒劑、溶液、懸浮劑、乳劑等形式。該藥物的給藥途徑可以為口服、經(jīng)皮、經(jīng)脈或肌肉注射。
[0015]本發(fā)明通過動物藥理實驗，確定蟲草素或其藥物組合物的使用劑量范圍是12.5-50mg/kg/ 天。
[0016]根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將很清楚本發(fā)明的其他實施方案，下述實施方案僅作示例。在不違反本發(fā)明主旨及范圍的情況下，可對本發(fā)明進行各種改變和改進。這些改變和改進均應在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1蟲草素對ApoE-/-動脈粥樣硬化模型小鼠主動脈根部粥樣斑塊的HE染色圖片。正常組為喂食標準飼料的正常C57BL/6小鼠，其余組為喂食高脂飼料的ApoE-/-小鼠，模型組灌胃等體積自來水，陽性組和蟲草素組分別灌胃20mg/kg辛伐他汀和50mg/kg蟲草素。給藥24周后處死動物，取主動脈根部經(jīng)石蠟包埋后進行HE染色。
[0018]圖2蟲草素對高脂模型動物血清總抗氧化能力、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量的影響。雄性金黃地鼠隨機分成正常組、高血脂模型組和蟲草素3個劑量組(劑量分別為12.5、25和50mg/kg)，每組10只動物。正常組喂食標準飼料，其余組均喂食高脂飼料，同時灌胃給予相應藥物，高血脂模型組灌胃等體積自來水。給藥4周后利用試劑盒測量血清總抗氧化能力、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量。與模型組比較，*p < 0.05 ；**p < 0.01 ；***p < 0.001
[0019]圖3蟲草素對高脂模型動物血清IL-2和IL-8含量的影響。動物分組和處理如圖
2.給藥4周后利用ELISA試劑盒測定血清IL-2和IL-8含量。與模型組比較，*p < 0.05 ；**p < 0.01
[0020]圖4蟲草素對單核細胞RAW267.4攝取膽固醇(A)和膽固醇流出率(B)的影響。RAW267.4細胞用5 μ g/mLNBD-膽固醇和終濃度為0、0.1、I和10 μ M的蟲草素孵育，并于加藥后O、0.5、1、2、4、6h測量細胞內(nèi)NBD-膽固醇的熒光強度，計算膽固醇的攝入量。在膽固醇流出實驗中，RAW267.4細胞用5 μ g/mLNBD-膽固醇培養(yǎng)24h，隨后換新鮮無NBD-膽固醇的培養(yǎng)基并加入50 μ g/mL載脂蛋白A-1和終濃度為O、0.1、I和10 μ M的蟲草素，分別于加藥后0.5、1、2、4、6h測量培養(yǎng)基和細胞中的NBD-膽固醇含量，計算膽固醇流出率％ =培養(yǎng)基NBD-膽固醇含量/ (培養(yǎng)基NBD-膽固醇含量+細胞內(nèi)NBD-膽固醇含量)*100%?！揪唧w實施方式】
[0021]下面結(jié)合實施案例對本發(fā)明做進一步的詳細描述。
[0022]實施例1蟲草素減少ApoE-/-動脈粥樣硬化模型小鼠主動脈內(nèi)斑塊形成
[0023]取8周齡Apo E-/-小鼠32只，隨機分成模型組、辛伐他汀陽性組(20mg/kg)、蟲草素低(25mg/kg)和高(50mg/kg)劑量組(每組8)。各組均喂食高脂飼料，同時灌胃給予相應藥物，高血脂模型組灌胃等體積自來水。給藥24周后，采用HE染色法觀察主動脈根部測量粥樣斑塊面積與血管管腔面積的百分比，評價蟲草素抗動脈硬化的藥效學作用。
[0024]經(jīng)過24周的高脂飼料喂養(yǎng)，模型組動物的主動脈根部均出現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊，粥樣斑塊面積與血管管腔面積的百分比達到(28.76±3.80)%。蟲草素處理對主動脈粥樣硬化斑塊有明顯的抑制作用，低和高劑量組動物的粥樣斑塊面積與血管管腔面積的百分比分別為(22.30±3.60) %和(14.46±3.90) %。圖1顯示了不同組別動物主動脈根部粥樣斑塊的典型HE染色圖片。
[0025]實施例2蟲草素降低高脂血癥動物模型(金黃地鼠)血清膽固醇和甘油三酯水平
[0026]取SO-1OOg雄性金黃地鼠60只，隨機分成正常組、高血脂模型組、非諾貝特陽性對照組(40mg/kg)和蟲草素3個劑量組(劑量分別為12.5、25和50mg/kg)共6組(每組10)。正常組喂食標準飼料，其余組均喂食高脂飼料，同時灌胃給予相應藥物，高血脂模型組灌胃等體積自來水。給藥4周后，動物禁食8小時，處死動物并收集血液樣品，用于評估血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-c)和高密度脂蛋白(HDL-c)。
[0027]用蟲草素處理高脂血動物模型4周后，以非諾貝特為陽性對照藥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)灌胃蟲草素可以顯著降低動物的血清TC、TG和LDL-c，在25mg/kg的劑量下，效果已經(jīng)較為顯著(P < 0.05)(表 I)。
[0028]表1.蟲草素對高脂飼料誘發(fā)的高脂血癥金黃地鼠模型血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL-c)的影響(η = 10)[0029]
【權(quán)利要求】
1.蟲草素(3'-脫氧腺苷)在制備用于預防和治療動脈粥樣硬化以及動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的藥劑方面的應用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應用，其中所述藥劑的單位劑量在IO-1OOmg活性成分的范圍內(nèi)，優(yōu)選地10_60mg,更優(yōu)選地20-60mg,再更優(yōu)選地25_50mg活性成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的應用，其中所述藥劑被經(jīng)口給藥。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的應用，其中所述藥劑被經(jīng)皮、靜脈或肌肉注射。
5.一種用于預防和治療動脈粥樣硬化的藥物，其中含有蟲草素，以及藥學上可接受的輔助劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的藥劑，可以被制成注射劑、片劑、丸劑、分散劑、膠囊劑、軟膠囊、滴丸、顆粒劑、溶液、懸浮劑、乳劑的形式。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的藥劑，具有預防和治療動脈粥樣硬化的作用。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的藥劑，其能夠降低膽固醇在血管壁內(nèi)膜的沉積，避免形成粥樣斑塊。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的藥劑，其能夠降低高血脂動物的血清膽固醇和甘油三酯水平。
10.根據(jù)權(quán)利要求5的藥劑，其能夠提高動物的抗氧化能力，降低丙二醛水平。
11.根據(jù)權(quán)利要求5的藥劑，其具有良好的抗炎效果。
12.根據(jù)權(quán)利要求5的藥劑，其能夠抑制細胞攝取膽固醇并促進膽固醇從細胞內(nèi)排出。
【文檔編號】A61P39/06GK103893200SQ201210572179
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月26日
【發(fā)明者】郭鵬, 吳崇明, 朱平, 張雪, 欒虹 申請人:中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所