專利名稱：一種中藥水蛭提取物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水蛭提取物的制備方法。
背景技術(shù)：
水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是經(jīng)典的破血逐瘀類中藥，以干燥全體入藥，別名馬鱉、肉鉆子、螞蟥、馬蜞、吸血蟲、紅蛭、水麻貼、沙塔干等。水蛭種類復(fù)雜，全世界有300多種，我國分布有60多種。古代醫(yī)書中記載有利用螞蟥治療多種疾病，謂其“主逐惡血、瘀血、月閉、破血消積聚……”。醫(yī)圣張仲景用其祛邪扶正，治療“瘀血”、“水結(jié)”之癥，顯示了其獨特的療效。后世張錫純贊此藥“存瘀血而不傷新血，純系水之精華生成，于氣分絲毫無損，而血瘀默然于無形，真良藥也”。中國藥典收載的水蛭(Hirudo)為水蛭科動物螞蟥 Whitmania pigra Whitman、水輕 Hirudo nipponica Whitman 或柳葉螞蟥 Whitmaniaacranulata Whitman的干燥全體。夏、秋二季捕捉,用沸水燙死,曬干或低溫干燥。分布于東北、山東、江蘇、安徽、浙江、江西、湖北、湖南等地。具有破血通經(jīng)，逐瘀消癥之功效。用于血瘀經(jīng)閉,癥瘕痞塊,中風(fēng)偏癱,跌撲損傷。水蛭中抗凝血活性成分主要為蛋白質(zhì)、多肽及游離氨基酸類。其中，以水蛭素(hirudin)的研究最為透徹,它是由Mark Wardt于1955年最先從新鮮水蛭的唾液腺中分離得到并加以確定的，是一種由66個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，是目前已知作用最強的凝血酶特異性抑制劑。水蛭素呈酸性，溶于水、生理鹽水及吡啶中，幾不溶于醇、丙酮及苯，遇熱或在稀酸中均易變質(zhì)。干燥藥材中水蛭素已被破壞。此外尚含NLP-I (new leechprotein-1)、螞蟥多肽、肝素(heparin),抗血栓素(antithromfin)等。傳統(tǒng)中藥水蛭以干燥全體入藥，基本不含水蛭素，但同樣也檢測到了抗凝活性，這說明水蛭中所含的抗凝血成分不一定只存在于新鮮唾液中，而應(yīng)該是體內(nèi)本身所含有的。現(xiàn)代研究表明，傳統(tǒng)中藥水蛭的藥理活性成分主要為多肽和氨基酸類，其藥理作用主要表現(xiàn)為(1)抗凝作用；(2)抗血栓作用；(3)腦缺血再灌注損傷保護作用；(4)血管內(nèi)皮功能損傷保護作用等。因此，以水蛭多肽和/或氨基酸作為主要活性成分的水蛭提取物具有極大的臨床應(yīng)用價值和市場開發(fā)價值。但是，活性多肽不耐熱，且對化學(xué)試劑敏感，導(dǎo)致不同提取方法或不同炮制品生物活性偏差較大。尋求一種最大限度地保留水蛭多肽生物活性的提取分離方法，以水蛭多肽和/或氨基酸提取物為主要成分制成具有抗凝、抗血栓作用的藥物，已經(jīng)成為一個熱門的研究方向。目前，中藥水蛭臨床應(yīng)用多以原粉、水煎煮、水煎醇沉、有機溶劑提取等方法。原粉入藥異味較重，臨床服用順從性較差，并且吸收效果較差；水煎煮、水煎醇沉、有機溶劑提取等方法，由于加熱或化學(xué)試劑處理，導(dǎo)致水蛭活性成分的生物活性破壞較大。而酶解法生理活性較強，但并不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決現(xiàn)有方法制備的中藥水蛭提取物中水蛭活性成分的生物活性破壞較大的問題，而提出的一種中藥水蛭提取物的制備方法。本發(fā)明的一種中藥水蛭提取物的制備方法，是按以下步驟進行的一、取干水蛭研磨成粉末，加入4 10倍重量的純化水，室溫下攪拌浸潰12 24h，在轉(zhuǎn)速為IOOOOrpm的條件下進行離心，取上清液；二、采用分子量截留為50KDa IOOKDa超濾膜對步驟一中的上清液進行超濾處理，收集濾過液A ;三、采用分子量截留為IKDa 5KDa超濾膜對濾過液A進行超濾處理，分別收集截留液和濾過液B，其中截留液作為提取物I ;取濾過液B，過樹脂柱，收集水洗液；四、對水洗液進行減壓濃縮，然后冷卻至4 5°C，再加入4 5°C的乙醇至含醇量達70 80%，然后攪拌均勻，靜置10 13h，過濾，收集上清液；五、對上 清液進行低溫減壓濃縮，得提取物II，將提取物I和II按生藥量I : I混合得提取物III，將上述提取物
I、II、III進行冷凍干燥，即得中藥水蛭提取物。本發(fā)明在室溫條件下，采用水浸潰進行提取中藥水蛭中活性成分，采用分子量截留分別為50KDa IOOKDa和IKDa 5KDa的超濾膜進行超濾處理，收集分子量在IKDa IOOKDa之間的多肽類，在不破壞多肽類活性的條件下對多肽進行了有效提取、分離和濃縮，避免了常規(guī)處理方法中加熱或有機試劑對多肽活性的破壞。對于分離得到的分子量小于IKDa 5KDa的游離氨基酸等小分子物質(zhì)，采用樹脂吸附法以及低溫70 80%乙醇沉淀法去除雜質(zhì)，得到純度相對較高的小分子提取物。其中，多肽類提取物(提取物I)中多肽含量> 90% ;小分子提取物(提取物II)中多肽含量> 30%，游離氨基酸類含量> 20%，糖類含量> 25% ;混合提取物(提取物III)中多肽含量> 55%，游離氨基酸類含量> 12%,糖類含量> 17%。經(jīng)藥效學(xué)篩選證實，本發(fā)明制備的提取物I、II、III均具有明顯的抗凝、抗血栓活性。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式的一種中藥水蛭提取物的制備方法，是按以下步驟進行的一、取干水蛭研磨成粉末，加入4 10倍重量的純化水，室溫下攪拌浸潰12 24h，在轉(zhuǎn)速為IOOOOrpm的條件下進行離心，取上清液；二、采用分子量截留為50KDa IOOKDa超濾膜對步驟一中的上清液進行超濾處理，收集濾過液A ;三、采用分子量截留為IKDa 5KDa超濾膜對濾過液A進行超濾處理，分別收集截留液和濾過液B，其中截留液作為提取物I ;取濾過液B，過樹脂柱，收集水洗液；四、對水洗液進行減壓濃縮，然后冷卻至4 5°C，再加入4 5°C的乙醇至含醇量達70 80%，然后攪拌均勻，靜置10 13h，過濾，收集上清液；五、對上清液進行低溫減壓濃縮，得提取物II，將提取物I和II按生藥量I : I混合得提取物III，將上述提取物I、II、III進行冷凍干燥，即得中藥水蛭提取物。本實施方式在室溫條件下，采用水浸潰進行提取中藥水蛭中活性成分，采用分子量截留分別為50KDa IOOKDa和IKDa 5KDa的超濾膜進行超濾處理，收集分子量在IKDa IOOKDa之間的多肽類，在不破壞多肽類活性的條件下對多肽進行了有效提取、分離和濃縮，避免了常規(guī)處理方法中加熱或有機試劑對多肽活性的破壞。對于分離得到的分子量小于IKDa 5KDa的游離氨基酸等小分子物質(zhì)，采用樹脂吸附法以及低溫80%乙醇沉淀法去除雜質(zhì)，得到純度相對較高的小分子提取物。其中，多肽類提取物(提取物I)中多肽含量>90%;小分子提取物(提取物II)中多肽含量>30%，游離氨基酸類含量>20%，糖類含量> 25%;混合提取物(提取物III)中多肽含量> 55%，游離氨基酸類含量> 12%,糖類含量> 17%。經(jīng)藥效學(xué)篩選證實，本實施方式制備的提取物I、II、III均具有明顯的抗凝、抗血栓活性。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中的干水蛭粉末的目數(shù)為20 40目。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是步驟一中室溫攪拌下浸潰16h。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同的是步驟三中的樹脂柱為DlOl樹脂柱、AB-8樹脂、X-5樹脂、HPD400樹脂或活性炭。其它步驟及參數(shù)與具體 實施方式一至三之一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同的是步驟四中靜置12h。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至四之一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至五之一不同的是步驟四和步驟五中的低溫減壓濃縮是指在55 60°C的條件下進行減壓濃縮。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至五之一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一至六之一不同的是步驟二中采用分子量截留為50KDa或IOOKDa超濾膜。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至六之一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一至七之一不同的是步驟三中采用分子量截留為lKDa、3KDa或5KDa超濾膜。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至七之一相同。通過以下試驗驗證本發(fā)明有益效果本試驗的中藥水蛭提取物的制備方法一、將干水蛭研磨成粉末，取IOg干水蛭粉末，加入60L純化水，室溫攪拌浸潰16小時。在轉(zhuǎn)速為IOOOOrpm的條件下進行離心，取上清液；二、采用分子量截留為50KDa超濾膜進行超濾處理，收集濾過液，待截留液體積為5L時，用20L純化水分4次反復(fù)稀釋并繼續(xù)超濾截留液?；旌鲜占臑V過液，采用分子量截留為3KDa超濾膜進行超濾處理，待截留液體積為5L時，用40L純化水分8次反復(fù)稀釋并繼續(xù)超濾截留液，分別收集截留液和濾過液。收集截留液5L，作為提取物I，冷凍保存。取濾過液，過DlOl樹脂柱(生藥樹脂=5:1)，收集水洗液，低于60°C減壓濃縮至5L，將藥液冷卻至4 5°C，加入4 5°C乙醇至含醇量達80%，攪拌均勻，靜置12小時，濾過，收集上清液，低于60°C減壓濃縮至5L，得提取物II，將提取物I和II按生藥量I : I混合得提取物III。將提取物I、II、III分別進行冷凍干燥，得提取物I、II、III的干燥品，O 4°C保存。通過福林酚法測定提取物中多肽含量提取物I中多肽含量> 98%;提取物II中多肽含量彡35% ;提取物III中多肽含量彡57%。通過柱前衍生HPLC法測定提取物中游離氨基酸類含量提取物II中游離氨基酸類含量> 24% ;提取物III中游離氨基酸類含量> 14%。苯酚-硫酸法測定提取物中糖類含量提取物II中糖類含量> 25% ;提取物III糖類含量> 17%。對本試驗制備的中藥水蛭提取物I、II、III進行藥效學(xué)試驗I、體外給藥對家兔血漿復(fù)鈣時間(Tk)的影響采用O. 5g生藥/ml的濃度試驗，活性由強至弱依次為提取物III組(Tk =246. 8±12. 36s) >提取物 I 組(Τκ = 168. O±2. 62s) >提取物 II 組(Τκ = 163. 6±3. 46s)>水浸提物組(Tk= 126. 0±1. 47s)，水煎煮提取物組、水煎醇沉法提取物組和丙酮提取物組與生理鹽水空白對照組比較沒有明顯區(qū)別。其中提取物III、I、II與生理鹽水(Tk =106. O ±3. 81s)空白對照比較有顯著性差異(P < O. 01)。2、對離體凝血酶時間(TT)的影響采用O. 5g生藥/ml的濃度試驗，活性由強至弱依次為提取物III組(TT104. O±4. 06s) >提取物 I 組(TT 86. 2±2. 59s) >提取物 II 組(TT 79. 6±3. 56s) >水浸提物組(TT 39. 2±2. 16s) >丙酮提取物組(TT 30. 4±1. 19s)，水煎煮提取物組和水煎醇沉法提取物組與生理鹽水空白對照組比較沒有明顯區(qū)別。其中提取物III、I、II與生理鹽水(TT 18. 4±1. 14s)空白對照比較有顯著性差異(P < O. 01)。3、全血凝塊溶解活性測定采用O. 5g生藥/ml的濃度試驗，提取物III組在5. 74小時全部溶解，提取物I組 在7. 36小時全部溶解，提取物II組在7. 52小時全部溶解，水浸提物組和丙酮提取物組在24小時內(nèi)均有部分溶解，水煎煮提取物組，水煎醇沉法提取物組、丙酮提取物組與生理鹽水空白對照組均未溶解。由此可知，本試驗制備的提取物I、II、III均具有明顯的抗凝、抗血栓活性。
權(quán)利要求
1.一種中藥水蛭提取物的制備方法，其特征在于中藥水蛭提取物的制備方法是按以下步驟進行的一、取干水蛭研磨成粉末，加入4 10倍重量的純化水，室溫攪拌下浸潰12 24h，在轉(zhuǎn)速為IOOOOrpm的條件下進行離心，取上清液；二、采用分子量截留為50KDa IOOKDa超濾膜對步驟一中的上清液進行超濾處理，收集濾過液A ;三、采用分子量截留為IKDa 5KDa超濾膜對濾過液A進行超濾處理，分別收集截留液和濾過液B，其中截留液作為提取物I ;取濾過液B，過樹脂柱，收集水洗液；四、對水洗液進行減壓濃縮，然后冷卻至4 5°C，再加入4 5V的乙醇至含醇量達70 80 %，然后攪拌均勻，靜置10 13h，過濾，收集上清液；五、對上清液進行低溫減壓濃縮，得提取物II，將提取物I和II按生藥量I I混合得提取物III，將上述提取物I、II、III進行冷凍干燥，即得中藥水蛭提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種中藥水蛭提取物的制備方法，其特征在于步驟一中的干水蛭粉末的目數(shù)為20 40目。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種中藥水蛭提取物的制備方法，其特征在于步驟一中室溫攪拌下浸潰16h。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種中藥水蛭提取物的制備方法，其特征在于步驟三中的樹脂柱為DlOl樹脂柱、AB-8樹脂、X-5樹脂、HPD400樹脂或活性炭。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種中藥水蛭提取物的制備方法，其特征在于步驟四中靜置12h。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種中藥水蛭提取物的制備方法，其特征在于步驟四和步驟五中的低溫減壓濃縮是指在55 60°C的條件下進行減壓濃縮。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種中藥水蛭提取物的制備方法，其特征在于步驟二中采用分子量截留為50KDa或IOOKDa超濾膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種中藥水蛭提取物的制備方法，其特征在于步驟三中采用分子量截留為lKDa、3KDa或5KDa超濾膜。
全文摘要
一種中藥水蛭提取物的制備方法，它涉及一種水蛭提取物的制備方法。本發(fā)明是要解決現(xiàn)有方法制備的中藥水蛭提取物中水蛭活性成分的生物活性破壞較大的問題。制備方法一、取水蛭粗粉加入純化水，攪拌浸漬，離心后取上清液；二、對上清液進行超濾，收集濾過液A；三、對濾過液A進行超濾，收集截留液和濾過液B，截留液作為提取物I；取濾過液B過樹脂柱，收集水洗液；四、對水洗液進行減壓濃縮，冷卻后加入乙醇調(diào)節(jié)含醇量，攪拌，靜置，過濾，收集上清液；五、對上清液進行濃縮，得提取物II，將提取物I和II合得提取物III，將提取物I、II、III進行冷凍干燥，即得中藥水蛭提取物。本發(fā)明的提取物均具有抗凝、抗血栓活性。本發(fā)明應(yīng)用于中藥領(lǐng)域。
文檔編號A61K35/62GK102920736SQ20121050430
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者裴福成, 劉景國, 隋艷君, 解黎雯, 李文軍, 鄭玥, 肇靜靜, 李文春, 單鈺毓, 王英新 申請人:哈藥集團中藥二廠