專利名稱：一種間充質(zhì)干細(xì)胞注射液及其制備方法和在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞注射液及其制備方法和在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病的發(fā)病率越來(lái)越高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)在全球糖尿病病人有I. 5億，專家預(yù)測(cè)到2025年將達(dá)3個(gè)億，其中75%在印度、中國(guó)等發(fā)展中國(guó)家，世界華人患糖尿病有上升趨勢(shì)，中國(guó)大陸已由十幾年前1%的發(fā)病率上升到目前的2. 5^3. 25%，城市成年人糖尿病的發(fā)病率接近 10% ο
糖尿病主要分為I型、2型、妊娠期和其他類型糖尿病。I型糖尿病(TlDM)以胰島β細(xì)胞損害特點(diǎn)，其中IA型為T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)自身免疫病，在遺傳易感因素與環(huán)境因素相互作用下，體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)逐漸失衡，以胰島β細(xì)胞損害導(dǎo)致嚴(yán)重胰島素分泌障礙為特點(diǎn)，血糖持續(xù)升高為標(biāo)志。由于TlDM患者胰島β細(xì)胞功能差,血糖難以控制,容易出現(xiàn)感染、糖尿病微血管病變和酮癥酸中毒等危重并發(fā)癥，嚴(yán)重影響青少年的生長(zhǎng)發(fā)育。英國(guó)糖尿病前瞻性研究(UKPDS)顯示，2型糖尿病(T2DM)患者在確診糖尿病時(shí)，其胰島β細(xì)胞功能減退多達(dá)50%，胰島素分泌已明顯不足，同時(shí)隨著病程的延長(zhǎng)，胰島B細(xì)胞功能每年以6% 8%的速度下降。持續(xù)高血糖可直接損傷β細(xì)胞功能及削弱胰島β細(xì)胞對(duì)血糖升高的胰島素分泌反應(yīng)，并降低胰島素介導(dǎo)的葡萄糖運(yùn)轉(zhuǎn)，致血糖進(jìn)一步升高形成惡性循環(huán)。因此許多研究者致力于研究如何保護(hù)或恢復(fù)胰島β細(xì)胞，以改變或延長(zhǎng)2型糖尿病自然病程。目前糖尿病的治療主要依賴藥物和胰島素來(lái)控制血糖，不能治愈糖尿病，患者從發(fā)病開始就需使用藥物治療，需要終生服用降糖藥物和/或注射胰島素。胰島移植為治愈糖尿病提供了可能性，但由于胰島來(lái)源受限，且配型困難，手術(shù)成功率低，治療后需要長(zhǎng)期服用抗免疫排斥藥物，限制了此技術(shù)的廣泛應(yīng)用。而且，目前以胰島素為主的治療方法，雖可有效緩解糖尿病癥狀，但是胰島素治療并不能徹底解決胰島β細(xì)胞損傷的問題，因此，尋找促進(jìn)胰島β細(xì)胞再生與修復(fù)的治療方法成為醫(yī)學(xué)界亟待解決的重大課題。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是干細(xì)胞家族的重要成員，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入和自我復(fù)制等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注。MSCs在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為胰島、神經(jīng)、血管內(nèi)皮、骨、軟骨、肌肉、肝臟、心肌等多種組織細(xì)胞，除此之外，MSCs還具有低免疫原性和獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用，能逃避免疫識(shí)別、抑制免疫應(yīng)答。胎盤、臍帶來(lái)源的MSCs具有分化潛力大、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低、取材方便、無(wú)道德倫理問題的限制、易于工業(yè)化制備等特征，以上生物學(xué)特性使其有可能成為用于組織修復(fù)、抑制免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生和代謝性疾病細(xì)胞治療最具臨床應(yīng)用前景的多能干細(xì)胞。綜上，目前糖尿病的治療主要解決的是控制血糖，不能從根本上治療糖尿病，患者需終生服藥，藥物的毒副作用對(duì)患者的生活影響也很大。而且隨著糖尿病病程的進(jìn)展，如果血糖控制不良，很快便會(huì)出現(xiàn)糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥，如糖尿病視網(wǎng)膜病、糖尿病腎病、糖尿病周圍神經(jīng)病變、甚至是糖尿病足等危重并發(fā)癥。目前的藥物與胰島素治療并不能很好的避免這些情況的發(fā)生，修復(fù)并再生胰島β細(xì)胞，恢復(fù)內(nèi)源性胰島素分泌，自主控制血糖才是治療糖尿病的根本?，F(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)目前糖尿病的治療主要依賴于飲食控制、運(yùn)動(dòng)療法、藥物與胰島素綜合治療。這些療法的綜合運(yùn)用可以短時(shí)間內(nèi)控制血糖穩(wěn)定，但只是依賴外來(lái)藥物降低血糖，不能有效修復(fù)損傷的胰島功能，不能從根本上治療糖尿病及阻止病情的進(jìn)展。而且很多降血糖藥物都有很嚴(yán)重的副作用， 比如嚴(yán)重的低血糖、腹瀉、肝腎功損害等。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中糖尿病的治療方法存在的上述缺陷和不足，本發(fā)明提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞注射液及其制備方法和在制備治療糖尿病中的應(yīng)用，通過本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明解決了患者長(zhǎng)期服藥和注射胰島素的困境，可以從根本上達(dá)到治療糖尿病的目的。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
一種間充質(zhì)干細(xì)胞注射液，它包括以下組分間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量為2Χ105-1Χ107個(gè)/ml、質(zhì)量體積比為1-5%人血白蛋白、質(zhì)量體積比為O. 5%低分子肝素鈣、質(zhì)量體積比為1-20%復(fù)方氨基酸、質(zhì)量體積比為O. 3-0. 7%維生素C、余量為溶液介質(zhì)。對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述溶液介質(zhì)為復(fù)方電解質(zhì)溶液、葡萄糖或生理鹽水。對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于人臍帶和/或人胎盤，干細(xì)胞活力保持在85%以上。本發(fā)明還提供了所述的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液的制備方法，包括臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備和胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的制備。本發(fā)明還提供了所述的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述糖尿病包括I型和2型糖尿病。對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)制備好的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液在I周內(nèi)使用完畢。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是本發(fā)明采用的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于人臍帶和人胎盤，來(lái)源于胎盤和臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)量較大，制備體系易于質(zhì)控，易于產(chǎn)業(yè)化。間充質(zhì)干細(xì)胞注射液成分由人間充質(zhì)干細(xì)胞、人血白蛋白、低分子肝素鈣、復(fù)方氨基酸、O. 5%維生素C和溶解介質(zhì)組成，溶液介質(zhì)可以是勃脈力(復(fù)方電解質(zhì)溶液)或葡萄糖或生理鹽水組成。本發(fā)明用人間充質(zhì)干細(xì)胞注射液來(lái)修復(fù)損傷的胰島β細(xì)胞，恢復(fù)糖尿病患者的胰島功能，依靠?jī)?nèi)源性胰島素的分泌來(lái)降低血糖，從而達(dá)到從根本上治療糖尿病的目的。本發(fā)明可以逆轉(zhuǎn)糖尿病病程，使患者擺脫服用外源藥物和注射胰島素的不便、毒副反應(yīng)以及血糖控制不佳導(dǎo)致的嚴(yán)重并發(fā)癥，徹底治療糖尿病，所治療的糖尿病包括I型和2型糖尿病。結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的具體實(shí)施方式
后，本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清
λ·Μ
/E. ο


圖I為本發(fā)明中三組小鼠體內(nèi)的免疫細(xì)胞變化圖。圖2為本發(fā)明中三組小鼠空腹血糖與餐后血糖的比較圖。圖3為本發(fā)明中三組小鼠胰島病理切片比較圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例I
一、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備1.新鮮足月健康胎兒臍帶，用PBS緩沖液沖洗，所述PBS緩沖液含100kU/ L青霉素及100 mg/ L鏈霉素；
2.剪取6-8cm長(zhǎng)臍帶，將臍帶剪成2cm長(zhǎng)的小段，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗；
3.將臍帶組織塊剪碎成2-3mm3小塊；
4.將剪碎組織加入L-DMEM培養(yǎng)基洗滌，在500-700g條件下離心5分鐘，棄上清；
5.將組織塊和培養(yǎng)基按體積比2.5-3:1比例加入培養(yǎng)基，混勻組織塊，接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)；所述的培養(yǎng)基為含l-10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)及體積百分比10%-15%胎牛血清(FBS)的L-DMEM培養(yǎng)基；
6.24小時(shí)后補(bǔ)加步驟5所述的培養(yǎng)基；
7.每3天換一次培養(yǎng)基，第6天后換含體積比10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基，至8_9天細(xì)胞達(dá)80%左右融合時(shí)傳代；傳代培養(yǎng)基為含體積比10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基；
8.以后每3天傳代一次。二·胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的制備
1.用含100kU/ L青霉素及100 mg/ L鏈霉素的PBS緩沖液沖洗胎盤，沿胎盤邊緣將胎兒面羊膜慢慢剝離；
2.再次沖洗胎盤源羊膜，將羊膜剪成l_5mm3小塊；
3.將羊膜組織塊用含青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基混勻，在850g條件下離心IOmin ；
4.棄上清，每管加含體積比O.25%胰蛋白酶的DMEM培養(yǎng)基于37°C消化lOmin，在700-900g條件下離心IOmin ；
5.棄上清，每管加完全培養(yǎng)基后，在2200rpm條件下離心IOmin;所述完全培養(yǎng)基為含體積比10%的胎牛血清+100 kU/ L青霉素+100 mg/ L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基；
6.棄上清，羊膜組織塊接種于培養(yǎng)皿中，加完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)；每3天進(jìn)行半量換液；
7.至10-12天有細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞克隆形成后，棄掉組織塊，加完全培養(yǎng)基進(jìn)行培
養(yǎng);
8.至15-17天細(xì)胞克隆融合至80-90%，進(jìn)行細(xì)胞傳代。三、間充質(zhì)干細(xì)胞注射液的制備
一種間充質(zhì)干細(xì)胞注射液，它包括以下組分間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量為2 X IO5-I X IO7個(gè)/ml ；
質(zhì)量體積比為1-5%人血白蛋白；
質(zhì)量體積比為O. 5%低分子肝素鈣；
質(zhì)量體積比為1-20%復(fù)方氨基酸；
質(zhì)量體積比為O. 3-0. 7%維生素C ；
余量為溶液介質(zhì)。如配制IOOml干細(xì)胞注射液，該注射液由人血白蛋白原液5ml (質(zhì)量體積比終濃度為1%)、低分子肝素鈣O. 5ml (質(zhì)量體積比終濃度為O. 5%)、復(fù)方氨基酸Iml (質(zhì)量體積比終濃度為1%)、維生素C O. 5g(質(zhì)量體積比終濃度為0.5%)、勃脈力(復(fù)方電解質(zhì)溶液)93ml和間充質(zhì)干細(xì)胞組成。除間充質(zhì)干細(xì)胞外，注射液其余成分需提前配制，4°C預(yù)冷備用，間充 質(zhì)干細(xì)胞最終重懸在此溶液中，制成單細(xì)胞懸液，每毫升注射液中間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量為2X105。間充質(zhì)干細(xì)胞在2-15°C環(huán)境溫度中，48小時(shí)內(nèi)細(xì)胞仍保持為單細(xì)胞懸液狀態(tài)，細(xì)胞活力(臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)活力)保持在85%以上。本發(fā)明所述質(zhì)量體積比均代表質(zhì)量(g)與體積(ml)的比例。所述注射液可使間充質(zhì)干細(xì)胞在2_15°C溫度中48小時(shí)內(nèi)細(xì)胞仍保持為單細(xì)胞懸液狀態(tài)，細(xì)胞活力保持在85%以上。人血白蛋白和復(fù)方氨基酸均為臨床注射液成分，可為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，利于細(xì)胞的新陳代謝；維生素C的添加可維持各種過氧化物酶的活性，亦有利于細(xì)胞代謝和活性的保持。O. 5%低分子肝素的添加保證細(xì)胞在保存過程中維持良好的細(xì)胞分散狀態(tài)，減少了細(xì)胞間的黏附成團(tuán)及細(xì)胞黏附容器壁的現(xiàn)象，降低了臨床細(xì)胞輸注時(shí)可能發(fā)生的血管內(nèi)細(xì)胞成團(tuán)栓塞的危險(xiǎn)，同時(shí)也降低了細(xì)胞聚集而被輸液濾器過濾導(dǎo)致的細(xì)胞損失，而微量的肝素添加不會(huì)引發(fā)臨床出血等不良反應(yīng)。溶液介質(zhì)為勃脈力(復(fù)方電解質(zhì)溶液)或葡萄糖或生理鹽水，可以保持細(xì)胞的滲透壓，利于細(xì)胞的存活。該注射液組份可方便選擇多種臨床常用輸注液體做溶液介質(zhì)，以復(fù)方電解質(zhì)溶液為最佳。這種注射液非常利于間充質(zhì)干細(xì)胞的存活，且臨床輸注安全，細(xì)胞可在此保存液中可長(zhǎng)時(shí)間保持較高的活力，便于臨床的運(yùn)輸而不受時(shí)間的苛刻限制，解決了異地患者使用，細(xì)胞需要長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸?shù)膯栴}。四、間充質(zhì)干細(xì)胞注射液對(duì)NOD小鼠(I型糖尿病模型)治療的安全性和有效性實(shí)驗(yàn)
該實(shí)驗(yàn)選取8周齡雌性NOD小鼠60只，隨機(jī)分成3組，每組20只，分別為對(duì)照組、預(yù)防組和治療組。對(duì)照組給予生理鹽水尾靜脈注射；同時(shí)預(yù)防組給予間充質(zhì)干細(xì)胞注射液Iml(內(nèi)含間充質(zhì)干細(xì)胞I. OXlO6)尾靜脈注射；治療組小鼠發(fā)病后(連續(xù)2次空腹血糖值> 11.lmmol/L者為發(fā)病)給予間充質(zhì)干細(xì)胞注射液Iml (內(nèi)含間充質(zhì)干細(xì)胞I. O X IO6)尾靜脈注射，每日監(jiān)測(cè)小鼠血糖變化。觀察三個(gè)月后，處死動(dòng)物，心臟取血(約Iml)及胰腺組織病理切片進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)檢查。結(jié)果顯示間充質(zhì)干細(xì)胞注射液靜脈注射未引起急性毒理反應(yīng)及排斥反應(yīng)。預(yù)防組小鼠發(fā)病時(shí)間明顯遲于對(duì)照組，且發(fā)病率明顯低于對(duì)照組。間充質(zhì)干細(xì)胞注射液可以調(diào)節(jié)NOD小鼠體內(nèi)的免疫紊亂，增加Treg細(xì)胞的比例，降低效應(yīng)T細(xì)胞的作用，如圖I所示，與對(duì)照組相比，預(yù)防組與治療組的Treg細(xì)胞的比例明顯升高，效應(yīng)T細(xì)胞比例明顯下降，Ρ〈0·05。治療組和預(yù)防組小鼠空腹血糖及餐后血糖明顯低于對(duì)照組，如圖2所示，與對(duì)照組相比，預(yù)防組與治療組小鼠的空腹血糖與餐后血糖明顯降低，ρ〈0. 05。胰腺病理切片顯示治療組小鼠胰腺β細(xì)胞功能較對(duì)照組明顯恢復(fù)，胰島素分泌量明顯增加，如圖3所示，與對(duì)照組相比，治療組小鼠的胰島β細(xì)胞功能明顯恢復(fù)，胰島素分泌量明顯增加，Ρ〈0. 05。實(shí)施例2
臍帶和胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的制備同實(shí)施例I。如配制IOOml干細(xì)胞注射液，該注射液由人血白蛋白原液25ml (質(zhì)量體積比終濃 度為5%)、低分子肝素鈣O. 5ml (質(zhì)量體積比終濃度為O. 5%)、復(fù)方氨基酸20ml (質(zhì)量體積比終濃度為20%)、維生素C O. 5g(質(zhì)量體積比終濃度為O. 5%)、5%葡萄糖注射液54ml和間充質(zhì)干細(xì)胞組成。除間充質(zhì)干細(xì)胞外，注射液其余成分需提前配制，4°C預(yù)冷備用，間充質(zhì)干細(xì)胞最終重懸在此溶液中，制成單細(xì)胞懸液，每毫升注射液中間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量為I X IO70間充質(zhì)干細(xì)胞在2-15°C環(huán)境溫度中，48小時(shí)內(nèi)細(xì)胞仍保持為單細(xì)胞懸液狀態(tài)，細(xì)胞活力保持在85%以上。實(shí)施例3
臍帶和胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的制備同實(shí)施例I。如配制IOOml干細(xì)胞注射液，該注射液由人血白蛋白原液IOml (質(zhì)量體積比終濃度為2%)、低分子肝素鈣O. 5ml (質(zhì)量體積比終濃度為O. 5%)、復(fù)方氨基酸IOml (質(zhì)量體積比終濃度為10%)、維生素C O. 5g (質(zhì)量體積比終濃度為O. 5%)、0. 9%生理鹽水注射液79ml和間充質(zhì)干細(xì)胞組成。除間充質(zhì)干細(xì)胞外，注射液其余成分需提前配制，4°C預(yù)冷備用，配好的注射液在I周內(nèi)使用完畢。間充質(zhì)干細(xì)胞最終重懸在此溶液中，制成單細(xì)胞懸液，每毫升注射液中間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量為2X106。間充質(zhì)干細(xì)胞在2-15°C環(huán)境溫度中，48小時(shí)內(nèi)細(xì)胞仍保持為單細(xì)胞懸液狀態(tài)，細(xì)胞活力保持在85%以上。以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其進(jìn)行限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種間充質(zhì)干細(xì)胞注射液，其特征在于它包括以下組分 間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量為2 X IO5-I X IO7個(gè)/ml ； 質(zhì)量體積比為1-5%人血白蛋白； 質(zhì)量體積比為O. 5%低分子肝素鈣； 質(zhì)量體積比為1-20%復(fù)方氨基酸； 質(zhì)量體積比為O. 3-0. 7%維生素C ； 余量為溶液介質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液，其特征在于所述溶液介質(zhì)為復(fù)方電解質(zhì)溶液、葡萄糖或生理鹽水。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液，其特征在于所述間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于人臍帶和/或人胎盤，干細(xì)胞活力保持在85%以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液的制備方法，其特征在于提前配制好質(zhì)量體積比為1-5%人血白蛋白、質(zhì)量體積比為O. 5%低分子肝素鈣、質(zhì)量體積比為1-20%復(fù)方氨基酸、質(zhì)量體積比為O. 3-0. 7%維生素C和溶液介質(zhì)，然后將間充質(zhì)干細(xì)胞重懸于上述溶液中制成單細(xì)胞懸液，使干細(xì)胞數(shù)量為2 X IO5-I X IO7個(gè)/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液的制備方法，其特征在于所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備包括以下步驟 (1).取新鮮足月健康胎兒臍帶，用含100kU/L青霉素及100mg/L鏈霉素的PBS緩沖液沖洗； (2).剪取6-8cm長(zhǎng)臍帶，將臍帶剪成2cm長(zhǎng)的小段，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗； (3).將臍帶組織塊剪碎成2-3_3小塊； (4).將剪碎組織加入L-DMEM培養(yǎng)基洗滌，在500-700g條件下離心5分鐘，棄上清； (5).將組織塊和培養(yǎng)基按體積比2.5-3:1比例加入培養(yǎng)基，混勻組織塊，接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，所述的培養(yǎng)基為含l-10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)及體積百分比10%-15%胎牛血清(FBS)的L-DMEM培養(yǎng)基； (6).24小時(shí)后補(bǔ)加步驟5所述的培養(yǎng)基； (7).每3天換一次培養(yǎng)基，第6天后換含體積比10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基，至8_9天細(xì)胞達(dá)80%左右融合時(shí)傳代，傳代培養(yǎng)基為含體積比10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基； (8).以后每3天傳代一次。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液的制備方法，其特征在于所述胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的制備包括以下步驟 (1).用含100kU/L青霉素及100mg/L鏈霉素的PBS緩沖液沖洗胎盤,沿胎盤邊緣將胎兒面羊膜慢慢剝離； (2).再次沖洗胎盤源羊膜，將羊膜剪成l_5mm3小塊； (3).將羊膜組織塊用含青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基混勻，在850g條件下離心IOmin ； (4).棄上清，每管加含體積比0.25%胰蛋白酶的DMEM培養(yǎng)基于37°C消化lOmin，在700-900g條件下離心IOmin ； (5).棄上清，每管加完全培養(yǎng)基后，在2200rpm條件下離心IOmin;所述完全培養(yǎng)基為含體積比10%的胎牛血清+100kU/L青霉素+100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基； (6).棄上清，羊膜組織塊接種于培養(yǎng)皿中，加完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)；每3天進(jìn)行半量換液； (7).至10-12天有細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞克隆形成后，棄掉組織塊，加完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng); (8).至15-17天細(xì)胞克隆融合至80-90%，進(jìn)行細(xì)胞傳代。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述糖尿病包括I型和2型糖尿病。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用，其特征在于制備好的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液在I周內(nèi)使用完畢。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞注射液及其制備方法和在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于人臍帶和胎盤，間充質(zhì)干細(xì)胞注射液成分由人間充質(zhì)干細(xì)胞、人血白蛋白、低分子肝素鈣、復(fù)方氨基酸、0.5%維生素C和溶解介質(zhì)組成，溶液介質(zhì)可以復(fù)方電解質(zhì)溶液或葡萄糖或生理鹽水組成。本發(fā)明用人間充質(zhì)干細(xì)胞注射液來(lái)修復(fù)損傷的胰島β細(xì)胞，依靠?jī)?nèi)源性胰島素的分泌來(lái)降低血糖，從而達(dá)到從根本上治療糖尿病的目的。本發(fā)明可以逆轉(zhuǎn)糖尿病病程，使患者擺脫服用外源藥物和注射胰島素的不便、毒副反應(yīng)以及血糖控制不佳導(dǎo)致的嚴(yán)重并發(fā)癥，徹底治療包括1型和2型的糖尿病。
文檔編號(hào)A61P3/10GK102920735SQ20121045831
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月14日
發(fā)明者魏斯溧, 高宏, 王麗, 胡建霞, 張學(xué)峰 申請(qǐng)人:青島奧克生物開發(fā)有限公司