專利名稱：一種納米泡溶液及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥及化學(xué)領(lǐng)域，涉及熒光-超聲影像對(duì)比劑，具體涉及一種雙功能熒光-超聲影像對(duì)比劑的制備方法和其醫(yī)學(xué)診斷之用途，特別涉及其作為影像對(duì)比劑在腫瘤診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
超聲對(duì)比劑是一種在臨床腫瘤診斷中提高超聲影像診斷效果的靜脈注射劑。目前常用的超聲對(duì)比劑包括微泡超聲造影劑和納米泡超聲造影劑。近年研究表明，粒徑在500納米以下的納米級(jí)脂質(zhì)體造影劑能通過腫瘤血管間隙達(dá)到靶部位，其造影增強(qiáng)效果優(yōu)于微泡造影劑。同時(shí)，超聲對(duì)比劑在藥物共輸送的應(yīng)用有著較大的前景。但是，已有的納米泡和 微泡超聲造影劑成像時(shí)間都小于30分鐘，其在體內(nèi)對(duì)腫瘤選擇的特異性不理想。同時(shí)磷脂質(zhì)體的納米泡對(duì)腎臟和肝臟都有潛在毒性，并且存在安全性問題。腫瘤靶向的超聲造影劑主要是通過對(duì)泡的包膜表面進(jìn)行腫瘤靶向分子的特異性修飾，從而可以與特定腫瘤組織受體緊密結(jié)合，實(shí)現(xiàn)超聲的組織特異性成像。但是，由于腫瘤血管在不同生長(zhǎng)階段表現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)特性，需要對(duì)包膜表面進(jìn)行多種配體修飾以達(dá)到有效的增強(qiáng)效果，因此實(shí)際臨床應(yīng)用不聞。近年來，熒光成像方法因其在外科手術(shù)中的術(shù)中熒光應(yīng)用而迅猛發(fā)展。在術(shù)中熒光應(yīng)用中，腫瘤特異性的熒光探針成像可以準(zhǔn)確顯示腫瘤位置和大小，從而為切除潛在腫瘤組織提供了有效的方案并提高了患者的生存率。除此之外，熒光成像在動(dòng)物模型中研究藥物動(dòng)力學(xué)如分布，吸收和代謝等提供了新的方法學(xué)手段。因此，新型雙功能熒光-超聲納米泡作為影劑影像對(duì)比劑如能實(shí)現(xiàn)腫瘤特異性成像，其作為腫瘤診斷，藥物共輸送和動(dòng)力學(xué)研究，以及術(shù)中熒光的影像對(duì)比劑有著極大的意義和前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的任務(wù)是提供一種納米泡溶液，提供一種新的雙功能熒光-超聲納米泡，使其作為影像對(duì)比劑在體內(nèi)具有腫瘤選擇性的造影成像功能，并提供該納米泡的制備方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明提供的納米泡溶液，由以下百分重量比的組分組成中櫚酸抗壞血酸酯0· 10-0. 50%I，2-十六烷二醇0· 002-0. 02 %吐溫60 :0· 03-0. 15%羥乙基淀粉及其類似葡聚糖1· 0-3. 0%殼聚糖0·0005-0. 0015%熒光染料0·0001-0. 0004%五聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺酯0· 0001-0. 0006%
磷酸鹽緩沖溶液96-99 %，在所述的納米泡中含由全氟丙烷氣體。各組分優(yōu)選的百分重量比為中櫚酸抗壞血酸酯0· 37%I，2-十六烷二醇0· 01%吐溫60 :0.1%羥乙基淀粉及其類似葡聚糖2%殼聚糖0.00125%
熒光染料0·00024%五聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺酯(λ 0003%磷酸鹽緩沖溶液97%。所述的突光染料可以是青色素(Cyanine)、得克薩斯紅(Texas red)或阿歷克斯突光團(tuán)系列(Alexa Fluor)。本發(fā)明提供的納米泡溶液的制備方法，包括以下步驟步驟一、配制混懸液稱取羥乙基淀粉、中櫚酸抗壞血酸酯、1，2-十六烷二醇，羥乙基淀粉與中櫚酸抗壞血酸酯和1，2_十六烷二醇的重量比為200 37 1，加入到磷酸鹽緩沖溶液中，磷酸鹽緩沖溶液與羥乙基淀粉、櫚酸抗壞血酸酯和1，2-十六烷二醇的重量比為48 I;再加入吐溫60，吐溫60與羥乙基淀粉的重量比為I : 20，加氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH為7，制成混懸液；步驟二、超聲處理將制成的混懸液放置于冰浴中使其溫度降至10攝氏度，向體系通入經(jīng)過2 μ m濾膜過濾的全氟丙烷氣體10分鐘即開始超聲，超聲中保持持續(xù)通全氟丙烷氣體至超聲結(jié)束，超聲條件使超聲變幅桿置于反應(yīng)液液面2毫米深以保證反應(yīng)物和氣體充分混合，于540瓦超聲功率下超聲80個(gè)周期，其中每一周期的超聲工作時(shí)間為5秒、間歇時(shí)間為10秒，整個(gè)超聲過程使溶液溫度維持在15攝氏度以下，超聲80個(gè)周期完成后，加入低分子量殼聚糖溶液，殼聚糖溶液與吐溫60的重量比為I : 80 ;再進(jìn)行第二次超聲，超聲條件為36瓦超聲40周期，其中每一周期的超聲時(shí)間為5秒、間歇時(shí)間為10秒，得到乳白色溶液；所述的低分子量殼聚糖溶液的配置方法是取O. 5克低分子量殼聚糖和O. 5克乙酸，加入99克水配置而成；步驟三、離心將得到的乳白色溶液于4攝氏度下250g離心45分鐘，溶液分為三層，最下層為未形成納米泡的膜材料沉淀，中間層為納米泡溶液，最上層為粒徑較大的微米泡，收集中間層的納米泡溶液，然后加入作為熒光染料的cy5. 5N-羥基琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液，cy5.5N-羥基琥珀酰亞胺酯與殼聚糖的重量比為I : 5. 2，充入全氟丙烷氣體保護(hù)氣并于4攝氏度保存12小時(shí)后再加入五聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液 五聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺酯與殼聚糖的重量比為I : 4. 2，充入全氟丙烷氣體保護(hù)氣并于4攝氏度保存24小時(shí)得到含全氟丙烷氣體的納米泡溶液。上述方法中所述的作為熒光染料的cy5. 5N_羥基琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液的濃度可以為20毫克/毫升；所述的五聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液的濃度可以為I. 5暈克/暈升。本發(fā)明提供的納米泡溶液可作為熒光對(duì)比劑用于超聲及熒光成像。以本發(fā)明提供的納米泡溶液(又可稱為雙功能熒光-超聲納米泡)作為造影對(duì)比劑，在小鼠皮下腫瘤活體模型中，能顯著地提高超聲對(duì)腫瘤的成像性，增強(qiáng)效果持續(xù)2小時(shí)以上，同時(shí)在熒光成像中，明確顯示腫瘤的位置和大小，24小時(shí)后對(duì)腫瘤影像效果依然顯著。進(jìn)一步的代謝實(shí)驗(yàn)表明，雙功能熒光-超聲納米泡造影對(duì)比劑主要分布在小鼠的膀胱和腫瘤中，肝臟無明顯分布，其潛在毒性低。同時(shí)，皮下腫瘤在解剖后，雙功能熒光-超聲納米泡作為造影對(duì)比劑對(duì)腫瘤組織的范圍和位置顯示明確，其潛在腫瘤組織分布顯著，與沒有術(shù)中熒光的成像對(duì)比有其無法比擬的明顯優(yōu)勢(shì)。因此，本發(fā)明的雙功能熒光-超聲納米泡溶液作為腫瘤診斷對(duì)比劑，藥物共輸送和藥物動(dòng)力學(xué)研究，以及術(shù)中熒光的影像對(duì)比劑 有著獨(dú)特的創(chuàng)新性。實(shí)驗(yàn)資料主要化學(xué)藥品和試劑美國(guó)sigma-Aldrich公司，百靈威科學(xué)公司，阿拉丁試劑公司，國(guó)藥試劑公司等。腫瘤造模鼠源性肝癌細(xì)胞H22由中國(guó)科學(xué)院上海生命學(xué)院細(xì)胞培養(yǎng)中心提供，細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(Invitrogen)中，輔以10%熱滅活小牛血清(FBS)，25毫摩爾/升HEPE緩沖溶液，2毫摩爾/升L-谷氨酰胺，O. I毫摩爾/升非必需氨基酸，I. O毫摩爾/升丙酮酸鈉，50U/mL青霉素，50微克/毫升鏈霉素。雌性BALB/c裸鼠(SFP級(jí)，約20g/只)由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。動(dòng)物試驗(yàn)規(guī)范由華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院審查委員會(huì)提供。鼠源性肝癌細(xì)胞H22先于RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后腹腔接種到BALB/c小鼠中生長(zhǎng)。4天后處死小鼠抽取腹水，PBS洗滌一次，皮下接種到BALB/c裸鼠后背部進(jìn)行腫瘤造模。主要儀器設(shè)備納米泡的制備裝置為Y99-II DN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(選擇變幅桿為020 mm，中國(guó)寧波新芝生物科技股份有限公司)，日本尼康儀器有限公司尼康Eclipse80i顯微鏡，動(dòng)態(tài)激光散射儀(Nano_ZS90，Malvern)，美國(guó)L0GIQ7的超聲系統(tǒng)(GEHealthcare),美國(guó)I VIS Lumina XR 成像系統(tǒng)(Caliper Life Sciences)等。雙功能熒光-超聲納米泡的粒徑分析使用尼康Eclipse 80i顯微鏡觀察納米泡的顯微形態(tài)，物鏡為Plan Apochromat VC IOOx油鏡。雙功能熒光-超聲納米泡溶液與磷酸鹽緩沖溶液混合后加到載玻片上在IOOx油鏡下采集納米泡的圖片(尼康NIS-Elements BR圖像采集軟件，實(shí)測(cè)為400到800納米的納米泡(見圖I)。雙功能熒光-超聲納米泡熒光圖像是采取類似的方法獲得，使用的是1X71倒置顯微鏡(Olympus Corporation, Japan)。結(jié)果表明，Cy5. 5-熒光染料是直接連接在納米泡的表面(見圖2)。雙功能熒光-超聲納米泡的水合動(dòng)力半徑使用動(dòng)態(tài)激光散射儀(Nano-ZS90，Malvern)測(cè)定，其平均粒徑在37攝氏度為394納米(圖3)。雙功能熒光-超聲納米泡溶液的體外超聲成像測(cè)定將裝有10毫升磷酸鹽緩沖溶液的乳膠手套置于水浴中，超聲傳感器置于水浴裝置側(cè)面。超聲圖像采集系統(tǒng)為L(zhǎng)0GIQ7的超聲系統(tǒng)(GE Healthcare，USA)，傳感器為甲狀腺傳感器，于B模式室溫下分別采集5MHz和12MHz的超聲圖像(見圖4)。采集圖像前先保證乳膠手套和水浴中的氣泡已排除，再往乳膠手套底部注入150微升納米泡溶液。結(jié)果表明，雙功能熒光-超聲納米泡溶液在12MHz的超聲波成像探頭下，比5MHz的超聲波有著顯著的超聲成像效果(見圖4)。體內(nèi)超聲和熒光成像的測(cè)定在小鼠皮下瘤的超聲成像實(shí)驗(yàn)中，采用L0GIQ7超聲系統(tǒng)和甲狀腺傳感器，設(shè)置超聲頻率為12MHz。小鼠不需麻醉直接固定在平臺(tái)上，超聲傳感器輕輕置于腫瘤表面，采集注射前的超聲圖像。圖像采集后，小鼠尾靜脈注射100微升的雙功能熒光-超聲納米泡溶液，并在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)(10，30，60，120，240分鐘)采集小鼠皮下瘤的超聲圖像，每?jī)蓚€(gè)時(shí)間點(diǎn)間松開小鼠使其自由活動(dòng)。每次使用4只小鼠，所有小鼠在尾靜脈注射雙功能熒光-超聲納米泡溶液后的一個(gè)星期內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)異?；蛩劳?。結(jié)果表明，皮下腫瘤在未注射對(duì)比劑前，在B超造影圖像中，腫瘤的實(shí)體為無超聲反射區(qū)并呈不規(guī)則的形狀，同時(shí)整個(gè)腫瘤的周圍界面與內(nèi)臟分界不明顯(圖5)。在注射雙功能熒光-超聲納米泡溶液30分鐘后，B超造影圖像中整個(gè)腫瘤的周圍界面顯著，和腫瘤實(shí)體的無超聲反射區(qū)呈一個(gè)封閉的的內(nèi)暗外亮不規(guī)則的輪廓(圖5)。同時(shí)，超聲造影的增強(qiáng)效果持續(xù)保持在2小時(shí)以上。然后在4小時(shí)后逐漸消失。這一結(jié)果表明，腫瘤的超聲影像增強(qiáng)效應(yīng)是與注射了雙功能熒光-超聲納米泡溶液后直接導(dǎo)致的。
我們的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)對(duì)正常大鼠微靜脈注射雙功能熒光-超聲納米泡溶液后，大鼠的正常肝臟組織在B超造影圖像中除了血管在注射后2分鐘內(nèi)略有增強(qiáng)外，并無明顯超聲增強(qiáng)效應(yīng)，見圖6。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述的腫瘤超聲增強(qiáng)效應(yīng)相對(duì)照，表明雙功能熒光-超聲納米泡溶液在活體動(dòng)物腫瘤模型在B對(duì)腫瘤組織有一定的靶向性。在熒光成像實(shí)驗(yàn)中，主要使用I VIS Lumina XR成像系統(tǒng)(CaliperLifeSciences, USA)采集熒光圖像。cy5. 5的熒光成像圖是通過設(shè)定的535，570，605和640nm四個(gè)激發(fā)波長(zhǎng),采集一系列圖像以消除背景熒光的干擾,然后運(yùn)用Living Image software圖像分離處理的方法后得到的圖像(由美國(guó)Caliper Life Sciences提供)。首先，小鼠用異氟烷(河北九派制藥股份有限公司)麻醉后，采集注射前的腫瘤的熒光圖像。然后，在腫瘤裸鼠中注射100微升的雙功能熒光-超聲納米泡溶液或?qū)φ諢晒饣旌弦?，麻醉后采集注射后的熒光圖像，并在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)(O. 5，1,2,4,6,10和24小時(shí))分別采集熒光圖像，每?jī)蓚€(gè)時(shí)間點(diǎn)間使小鼠蘇醒。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖7)，雙功能熒光-超聲納米泡溶液能在注射后30分鐘內(nèi)，選擇性的富集在小鼠的腫瘤中，在注射后4小時(shí)后達(dá)到最高值。腫瘤中的熒光能持續(xù)保持24小時(shí)以上。而當(dāng)小鼠注射了對(duì)照的熒光混合液后，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤中無明顯熒光富集，其主要的熒光成像的位置在小鼠的腎臟中。同時(shí)，運(yùn)用熒光成像能研究相關(guān)雙功能熒光-超聲納米泡溶液在體內(nèi)分布這一功能，我們研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙功能熒光-超聲納米泡溶液還主要分布在小鼠的膀胱中，這一分布在24小時(shí)后明顯減弱，表明膀胱中的雙功能熒光-超聲納米泡溶液通過尿液排除體外。進(jìn)一步運(yùn)用熒光成像比較小鼠的肝臟組織和腫瘤組織發(fā)現(xiàn)，肝臟中無熒光累積，而腫瘤組織有著很強(qiáng)的熒光發(fā)射。這些結(jié)果證實(shí)了雙功能熒光-超聲納米泡溶液在體內(nèi)具備現(xiàn)有超聲納米泡和微泡無法比擬的腫瘤靶向選擇性。術(shù)中熒光圖像的對(duì)比實(shí)驗(yàn)在腫瘤裸鼠中注射100微升的雙功能熒光-超聲納米泡溶液24小時(shí)后，生理解剖后將皮下腫瘤部位顯示出，采集黑白照片圖像和熒光圖像。在圖像軟件中進(jìn)行圖像對(duì)比，見圖8，結(jié)果表明，熒光圖像顯示的腫瘤位置大小明顯要大于黑白照片圖像中顯示的腫瘤，并且，腫瘤的邊界輪廓顯示清晰，證明雙功能熒光-超聲納米泡溶液能夠作為術(shù)中熒光對(duì)比劑的應(yīng)用。
以上實(shí)驗(yàn)證明，雙功能熒光-超聲納米泡溶液是一種新型雙功能的超聲和熒光的影像對(duì)比劑，在體內(nèi)具有腫瘤選擇性的造影成像功能，其體內(nèi)主要分布在腫瘤和膀胱中，因此其潛在生物毒性低。同時(shí)，雙功能熒光-超聲納米泡溶液作為術(shù)中熒光影像對(duì)比劑對(duì)腫瘤邊界有著明確的定位，在醫(yī)學(xué)應(yīng)用上有著良好的應(yīng)用前景。


圖I :雙功能熒光-超聲納米泡溶液在IOOx油鏡下采集納米泡的圖片(尼康NIS-Elements BR圖像采集軟件，表明納米泡實(shí)測(cè)為400到800納米。圖2 :雙功能熒光-超聲納米泡的黑白圖像㈧和cy5. 5熒光圖像⑶。圖像是采取是1X71倒置顯微鏡(Olympus Corporation, Japan),在黑白光以及突光濾片獲得的。結(jié)果表明，Cy5. 5-熒光染料是直接連接在納米泡的表面。圖3 :雙功能熒光-超聲納米泡的水合動(dòng)力半徑使用動(dòng)態(tài)激光散射儀(Nano_ZS90， Malvern)測(cè)定，其平均粒徑在37攝氏度為394納米。圖4 :雙功能熒光-超聲納米泡溶液的體外超聲成像測(cè)定裝置如圖。將裝有10毫升磷酸鹽緩沖溶液的乳膠手套置于水浴中，超聲傳感器置于水浴裝置側(cè)面。超聲圖像采集系統(tǒng)為L(zhǎng)0GIQ7的超聲系統(tǒng)(GEHealthCare，USA)，傳感器為甲狀腺傳感器，于B模式室溫下分別采集5MHz和12MHz的超聲圖像。結(jié)果表明，雙功能熒光-超聲納米泡溶液在12MHz的超聲波成像探頭下，比5MHz的超聲波有著顯著的超聲成像效果。圖5 :小鼠皮下瘤的超聲成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖中A :注射前，B:注射后30分鐘，C :注射后2小時(shí)，D :注射后4小時(shí)；超聲圖像采集在小鼠尾靜脈注射100微升的雙功能熒光-超聲納米泡溶液前后，采用L0GIQ7超聲系統(tǒng)和甲狀腺傳感器，設(shè)置超聲頻率為12MHz。結(jié)果表明，皮下腫瘤在未注射對(duì)比劑前，在B超造影圖像中，腫瘤的實(shí)體為無超聲反射區(qū)并呈不規(guī)則的形狀，同時(shí)整個(gè)腫瘤的周圍界面與內(nèi)臟分界不明顯。在注射雙功能熒光-超聲納米泡溶液30分鐘后，B超造影圖像中整個(gè)腫瘤的周圍界面顯著，和腫瘤實(shí)體的無超聲反射區(qū)呈一個(gè)封閉的的內(nèi)暗外亮不規(guī)則的輪廓。同時(shí)，超聲造影的增強(qiáng)效果持續(xù)保持在2小時(shí)以上。然后在4小時(shí)后逐漸消失。圖6 :大鼠的正常肝臟組織的超聲成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖中A :注射前，B :注射后；在當(dāng)對(duì)正常大鼠微靜脈注射雙功能熒光-超聲納米泡溶液后，大鼠的正常肝臟組織在B超造影圖像中除了血管在注射后2分鐘內(nèi)略有增強(qiáng)外，并無明顯超聲增強(qiáng)效應(yīng)(A)。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述的腫瘤超聲增強(qiáng)效應(yīng)相對(duì)照，表明雙功能熒光-超聲納米泡溶液在活體動(dòng)物腫瘤模型在B對(duì)腫瘤組織有一定的靶向性。圖7 :小鼠皮下瘤的熒光成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖中A :熒光對(duì)照，B :雙功能熒光-超聲納米泡；其中a :注射如，b :注射后30分鐘，c :注射后4小時(shí),d :注射后6小時(shí)；滅光圖像米集在小鼠尾靜脈注射100微升的雙功能熒光-超聲納米泡溶液前后，主要使用IVIS LuminaXR成像系統(tǒng)(Caliper LifeSciences,USA)采集熒光圖像；cy5. 5的熒光成像圖是通過設(shè)定的535, 570,605和640nm四個(gè)激發(fā)波長(zhǎng),采集一系列圖像以消除背景突光的干擾,然后運(yùn)用Living Image software圖像分離處理的方法后得到的圖像。結(jié)果表明，雙功能突光-超聲納米泡溶液能在注射后30分鐘內(nèi)，選擇性的富集在小鼠的腫瘤中，在注射后4小時(shí)后達(dá)到最高值。腫瘤中的熒光能持續(xù)保持24小時(shí)以上。而當(dāng)小鼠注射了對(duì)照的熒光混合液后，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤中無明顯熒光富集，其主要的熒光成像的位置在小鼠的腎臟中。這些結(jié)果證實(shí)了雙功能熒光-超聲納米泡溶液在體內(nèi)具備現(xiàn)有超聲納米泡和微泡無法比擬的腫瘤靶向選擇性。 圖8 :術(shù)中熒光圖像的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖中A :黑白照片圖像，B :熒光疊加圖像；在腫瘤裸鼠中注射100微升的雙功能熒光-超聲納米泡溶液24小時(shí)后，生理解剖后將皮下腫瘤部位顯示出，采集黑白照片圖像和熒光圖像。結(jié)果表明，熒光圖像顯示的腫瘤位置大小明顯要大于黑白照片圖像中顯示的腫瘤，并且，腫瘤的邊界輪廓顯示清晰，證明雙功能熒光-超聲納米泡溶液能夠作為術(shù)中熒光對(duì)比劑的應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I雙功能熒光-超聲納米泡的制備法稱取I. 20克羥乙基淀粉200/0. 5，220毫克中櫚酸抗壞血酸酯，22毫克1，2_十六烷二醇加入到58毫升無菌的磷酸鹽緩沖溶液中，加入2毫升3 % w/w吐溫60的PBS溶液和300微升IN氫氧化鈉溶液制成混懸液，放置于冰浴中使其溫度降至10攝氏度，向體系通入經(jīng)過O. 2 μ m濾膜過濾的全氟丙烷氣體10分鐘，開始超聲，超聲中保持持續(xù)通全氟丙烷氣體至超聲結(jié)束，超聲條件使超聲變幅桿置于反應(yīng)液液面2毫米深以保證反應(yīng)物和氣體充分混合，于540瓦超聲功率下超聲80個(gè)周期，其中每一周期的超聲工作時(shí)間為5秒、間歇時(shí)間為10秒，整個(gè)超聲過程使溶液溫度維持在15攝氏度以下，超聲80個(gè)周期完成后，加入150微升O. 5% w/w低分子量殼聚糖溶液，再進(jìn)行第二次超聲，超聲條件為36瓦超聲40周期，其中每一周期的超聲時(shí)間為5秒、間歇時(shí)間為10秒，得到約50mL乳白色溶液；將得到的乳白色溶液于4攝氏度下250g離心45分鐘，溶液分為三層，最下層為未形成納米泡的膜材料沉淀，中間層為納米泡溶液，最上層為粒徑較大的微米泡，收集中間層的納米泡溶液，然后在每5毫升的納米泡溶液中加入作為熒光染料的O. 6微升cy5. 5N-羥基琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液(20毫克/毫升)，充入全氟丙烷氣體保護(hù)氣并于4攝氏度保存12小時(shí)后再加入10微升五聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液(I. 5毫克/毫升)，充入全氟丙烷氣體保護(hù)氣并于4攝氏度保存24小時(shí)得到含全氟丙烷氣體的納米泡溶液。實(shí)施例2雙功能熒光-超聲納米泡靜脈注射劑以雙功能熒光-超聲納米泡為活性成分的靜脈注射劑。以上制備的納米泡溶液為無菌制備，可以直接作為靜脈注射劑。建議的注射劑量為O. 05毫升/千克。實(shí)施例3體內(nèi)超聲和熒光成像的測(cè)定在小鼠小鼠尾靜脈注射100微升的雙功能熒光-超聲納米泡溶液，超聲圖像采集系統(tǒng)為L(zhǎng)0GIQ7的超聲系統(tǒng)(GE Healthcare，USA)，傳感器為甲狀腺傳感器，于B模式室溫下采集12MHz的超聲圖像。在熒光成像實(shí)驗(yàn)中，主要使用IVIS Lumina XR成像系統(tǒng)(CaliperLife Sciences，USA)采集熒光圖像。cy5. 5的熒光成像圖是通過設(shè)定的535，570，605和640nm四個(gè)激發(fā)波長(zhǎng),采集一系列圖像以消除背景熒光的干擾,然后運(yùn)用Living Image software圖像分離處理的方法后得到的圖像。實(shí)施例4熒光圖像對(duì)比在腫瘤裸鼠中注射100微升的雙功能熒光-超聲納米泡溶液4-24小時(shí)內(nèi)，進(jìn)行生理解剖，將皮下腫瘤部位顯示出，采集黑白照片圖像和熒光圖像。主要使用IVIS LuminaXR成像系統(tǒng)(Caliper Life Sciences,USA)采集熒光圖像。cy5. 5的熒光成像圖是通過設(shè)
定的535, 570,605和640nm四個(gè)激發(fā)波長(zhǎng),采集一系列圖像以消除背景突光的干擾,然后運(yùn)用Living Image software圖像分離處理的方法后得到的圖像。
權(quán)利要求
1.一種納米泡溶液，由以下百分重量比的組分組成 中櫚酸抗壞血酸酯0. 10-0. 50% I，2-十六烷二醇0. 002-0. 02 %吐溫 60 :0. 03-0. 15% 羥乙基淀粉及其類似葡聚糖1. 0-3. 0% 殼聚糖0. 0005-0. 0015% 熒光染料0. 0001-0. 0004% 五聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺酯0. 0001-0. 0006% 磷酸鹽緩沖溶液96-99%， 在所述的納米泡中含由全氟丙烷氣體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的納米泡溶液，其特征在于，各組分的百分重量比為 中櫚酸抗壞血酸酯0. 37% I，2-十六烷二醇0.01%吐溫 60 0. 1% 羥乙基淀粉及其類似葡聚糖2% 殼聚糖0. 00125% 熒光染料0. 00024% 五聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺酯0. 0003% 磷酸鹽緩沖溶液97%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的納米泡溶液，其特征在于，所述的熒光染料可以是青色素(Cyanine)、得克薩斯紅(Texas red)或阿歷克斯突光團(tuán)系列(Alexa Fluor)。
4.權(quán)利要求I所述的納米泡溶液的制備方法，包括以下步驟 步驟一稱取羥乙基淀粉、中櫚酸抗壞血酸酯、1，2_十六烷二醇，羥乙基淀粉與中櫚酸抗壞血酸酯和1，2-十六烷二醇的重量比為200 37 1，加入到磷酸鹽緩沖溶液中，磷酸鹽緩沖溶液與羥乙基淀粉、櫚酸抗壞血酸酯和1，2-十六烷二醇的重量比為48 I;再加入吐溫60，吐溫60與羥乙基淀粉的重量比為I : 20，加氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH為7，制成混懸液； 步驟二 將制成的混懸液放置于冰浴中使其溫度降至10攝氏度，向體系通入經(jīng)過2 μ m濾膜過濾的全氟丙烷氣體10分鐘即開始超聲，超聲中保持持續(xù)通全氟丙烷氣體至超聲結(jié)束，超聲條件使超聲變幅桿置于反應(yīng)液液面2毫米深以保證反應(yīng)物和氣體充分混合，于540瓦超聲功率下超聲80個(gè)周期，其中每一周期的超聲工作時(shí)間為5秒、間歇時(shí)間為10秒，整個(gè)超聲過程使溶液溫度維持在15攝氏度以下，超聲80個(gè)周期完成后，加入低分子量殼聚糖溶液，殼聚糖溶液與吐溫60的重量比為I : 80 ;再進(jìn)行第二次超聲，超聲條件為36瓦超聲40周期，其中每一周期的超聲時(shí)間為5秒、間歇時(shí)間為10秒，得到乳白色溶液；所述的低分子量殼聚糖溶液的配置方法是取O. 5克低分子量殼聚糖和O. 5克乙酸，加入99克水配置而成； 步驟三將得到的乳白色溶液于4攝氏度下250g離心45分鐘，溶液分為三層，最下層為未形成納米泡的膜材料沉淀，中間層為納米泡溶液，最上層為粒徑較大的微米泡，收集中間層的納米泡溶液，然后加入作為熒光染料的cy5. 5N-羥基琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液，cy5.5N-羥基琥珀酰亞胺酯與殼聚糖的重量比為I : 5. 2，充入全氟丙烷氣體保護(hù)氣并于4攝氏度保存12小時(shí)后再加入五聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液，五聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺酯與殼聚糖的重量比為I : 4. 2，充入全氟丙烷氣體保護(hù)氣并于4攝氏度保存24小時(shí)得到含全氟丙烷氣體的納米泡溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的納米泡溶液的制備方法，其特征在于，所述的作為熒光染料的cy5. 5N-羥基琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液的濃度為20毫克/毫升；
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的納米泡溶液的制備方法，其特征在于，所述的五聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液的濃度為I. 5毫克/毫升。
7.權(quán)利要求I或2所述的納米泡溶液在超聲或熒光成像中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求I或2所述的納米泡溶液在制備超聲熒光對(duì)比劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求I或2所述的納米泡溶液在制備作為用于腫瘤診斷的影像對(duì)比劑中的應(yīng)用。
10.一種組合物，含有權(quán)利要求I所述的納米泡溶液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種納米泡溶液，即雙功能熒光-超聲納米泡，可作為造影對(duì)比劑，在小鼠皮下腫瘤活體模型中，能顯著地提高超聲對(duì)腫瘤的成像性，增強(qiáng)效果持續(xù)2小時(shí)以上，同時(shí)在熒光成像中，明確顯示腫瘤的位置和大小，24小時(shí)后對(duì)腫瘤影像效果依然顯著。代謝實(shí)驗(yàn)表明，雙功能熒光-超聲納米泡造影對(duì)比劑主要分布在小鼠的膀胱和腫瘤中，肝臟無明顯分布，其潛在毒性低。雙功能熒光-超聲納米泡作為造影對(duì)比劑對(duì)腫瘤組織的范圍和位置顯示明確，與沒有術(shù)中熒光的成像對(duì)比有其無法比擬的明顯優(yōu)勢(shì)。因此，本發(fā)明的雙功能熒光-超聲納米泡溶液作為腫瘤診斷對(duì)比劑，藥物共輸送和藥物動(dòng)力學(xué)研究,以及術(shù)中熒光的影像對(duì)比劑有著獨(dú)特的創(chuàng)新性和應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K49/00GK102940895SQ20121040870
公開日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者周琦冰, 麥麗誼, 姚安娜 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)