專利名稱：在動物細胞或動物組織中表達外源基因的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種表達外源基因的方法，尤其涉及一種將外源基因導入到動物細胞或動物組織中并進行表達的方法，屬于基因治療領域。
背景技術：
·基因治療自從1990年成功應用于SCID-Xl患者的治療至今已經(jīng)有二十幾年，一直以來基因治療的研究的很大的側重點在于基因轉移載體的選擇。由于將外源基因呈遞到機體內的真核細胞中并表達的工作基本上是需要病毒載體來完成的,所以各種病毒載體在臨床基因治療中的選擇和應用，在這些年來也是一個研究的重點，其中腺相關病毒載體(adeno-associated virus, AAV)是最近研究中最為成功的，但同時也存在一些問題。目前，國內外關于基因治療載體的選擇問題開始偏向于桿狀病毒載體，其中，最常用的是桿狀病毒載體是 Autographa californica multiple nucleopoIyhedrovirus(AcMNPV);它是一類專一性感染節(jié)肢動物的大型桿狀包膜病毒，90-180Kb之間的環(huán)狀雙鏈DNA基因組包裝在桿狀衣殼內。由于近年來關于其研究越來越多并且越來越深入，力口之其操作安全方便，在用于各種外源基因的表達并作為一種新型的基因治療載體方面受到高度重視(Cory and Bishop, 1997, Molecular Biotechnology, 303-313)。有些早期初步探索中闡述有一些桿狀病毒作為基因轉移表達載體在哺乳動物細胞中作用的困難和缺點(Sandig et al. , 1996, Journal of Molecular Medicine, 205-212),但是在最近的研究中發(fā)現(xiàn)桿狀病毒作為一種新型的哺乳動物細胞基因轉移載體具有過去所采用的一些載體所不具備的特點，如重組桿狀病毒構建方便，易于大規(guī)模體外培養(yǎng)；外源基因容量大；感染哺乳動物細胞后不具備細胞毒性，安全性好，不會整合到細胞的基因組中，不會進行病毒DNA復制，其自身啟動子在哺乳動物細胞內沒有活性等。然而，用AcMNPV做為哺乳動物的外源基因呈遞(基因治療)的載體存在著非常難以克服的困難，即動物血液中的補體成分能夠滅活AcMNPV病毒粒子，使外源基因導入哺乳動物細胞的效率非常低，由此失去實用價值(Sandig et al.,1996, Hum. Gene Ther. 7:1937-1945 ；Hofmann and Strauss, 1998, GeneTher. 5:531-536)。上述問題限制了桿狀病毒AcMNPV在基因治療中的應用范圍，使其應用范圍基本限于哺乳動物細胞，而不能用于生物個體的應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一是提供一種將外源基因導入哺乳動物細胞或生物個體的各個組織中進行基因呈遞的家蠶桿狀病毒載體；本發(fā)明的目的之二是提供一種構建所述基因呈遞的家蠶桿狀病毒載體的方法；本發(fā)明的目的之三是提供一種在動物細胞或動物組織中表達外源基因的方法。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種將外源基因導入哺乳動物細胞或生物個體的組織中進行基因呈遞的家蠶桿狀病毒載體，包括骨架載體以及重組到骨架載體上的外源基因的表達盒；
所述骨架載體是家蠶桿狀病毒BmNPV DNA ；所述外源基因的表達盒由啟動子、外源基因和終止子組成；其中，所述啟動子是哺乳動物啟動子，所述哺乳動物啟動子可以是CMV啟動子、人巨細胞病毒早期啟動子(CMV-1E)、人延伸因子1-亞基啟動子、Rous肉瘤長末端重復序列、人Ieukosialin基因啟動子、鼠3-磷酸甘油激酶I (PGKI)基因啟動子、人泛素蛋白(ubiquitin)C基因啟動子、由雞肌動蛋白啟動子和CMV增強子序列構成的雜合啟動子或鼠乳房瘤病毒(MMTV)啟動子等，優(yōu)選為CMV啟動子(其核苷酸序列為SEQ ID No. 3所示)或CAG啟動子；所述的終止子優(yōu)選是SV40-polyA尾終止子(其核苷酸序列為SEQ ID No. 4所示)。所述的外源基因可以是報告基因(例如，可以是綠色熒光蛋白EGFP基因或熒光素酶報告基因(SEQ ID No. 2))、抗原基因、治療遺傳病用的相關基因、抑癌基因、其它功能基因或RNAi等。 本發(fā)明提供了一種將外源基因導入哺乳動物細胞或生物個體的組織中進行基因呈遞的家蠶桿狀病毒載體的構建方法，該方法包括(I)將外源基因的表達盒克隆到轉移載體上，構建得到含有外源基因的重組轉移載體；(2)將所構建的含有外源基因的重組轉移載體與桿狀病毒共轉染昆蟲細胞進行同源重組，即得。其中，所述外源基因的表達盒由哺乳動物啟動子、外源基因和終止子組成；所述哺乳動物啟動子是CMV啟動子、人巨細胞病毒早期啟動子、人延伸因子1-亞基啟動子、Rous肉瘤長末端重復序列、人Ieukosialin基因啟動子、鼠3-磷酸甘油激酶I基因啟動子、人泛素蛋白C基因啟動子、由雞β_肌動蛋白啟動子和CMV增強子序列構成的雜合啟動子或鼠乳房瘤病毒啟動子；所述的終止子優(yōu)選是SV40-polyA尾終止子；所述的轉移載體優(yōu)選是PVL1393轉移載體；所述的外源基因可以是報告基因、抗原基因、治療遺傳病用的相關基因或抑癌基因等；其中，所述的報告基因優(yōu)選是綠色熒光蛋白EGFP基因或熒光素酶報告基因；所述的桿狀病毒是BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV, EoSNPV、HaNPV, HzNPV,LdMNPV, MbMNPV, OpMNPV, SIMNPV, SeMNPV 或 TeNPV ;優(yōu)先為家蠶桿狀病毒 BmNPV。本發(fā)明進一步提供了一種將外源基因導入動物細胞或動物組織并進行表達的方法，包括將本發(fā)明所構建的家蠶桿狀病毒載體感染昆蟲宿主或昆蟲細胞；培養(yǎng)被感染的昆蟲宿主或昆蟲細胞對家蠶桿狀病毒載體進行擴增；收獲并純化所擴增的產(chǎn)物。所述的昆蟲宿主優(yōu)選為家蠶、野蠶、蓖麻蠶、樟蠶、樗蠶、柞蠶、日本柞蠶、野天蠶、苜蓿尺蠖、茶尺蠖、甘蘭夜蛾、秋粘蟲、粉紋夜蛾、行軍蟲、棉鈴蟲、美國棉粘蟲、煙青蟲、煙草夜蛾、東方粘蟲或舞毒蛾；所述的昆蟲細胞優(yōu)選是家蠶細胞、野蠶細胞、蓖麻蠶細胞、樟蠶細胞、樗蠶細胞、昨蠶細胞、日本昨蠶細胞、野天蠶細胞、苜猜尺蠖細胞、茶尺蠖細胞、甘蘭夜蛾細胞、秋粘蟲細胞、粉紋夜蛾細胞、行軍蟲細胞、棉鈴蟲細胞、美國棉粘蟲細胞、煙青蟲細胞、煙草夜蛾細胞、東方粘蟲細胞或舞毒蛾細胞；所述的感染是將家蠶桿狀病毒載體通過口食來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體或透過表皮來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體；優(yōu)選的，所述的感染是將家蠶桿狀病毒載體感染家蠶細胞或將家蠶桿狀病毒載體穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲或蛹體，在感染3-6天后收集含重組桿狀病毒的家蠶幼蟲或蛹的體液或組織勻漿；其中，所述的蛹體優(yōu)選為1-2天的
早期嫩蛹。呈遞外源基因DNA的骨架載體是家蠶桿狀病毒BmNPV，該呈遞骨架載體前面的啟動子為家蠶表達用的啟動子，在哺乳動物細胞中不能進行表達；為此，本發(fā)明將外源基因克隆到轉移載體上的哺乳動物啟動子和終止子SV40之間，構建了用于轉移外源基因的重組轉移載體，然后通過和家蠶桿狀病毒BmNPV共轉染昆蟲細胞進行同源重組得到重組桿狀病毒；所獲得的重組桿狀病毒可以將外源基因導入哺乳動物細胞(非洲綠猴腎細胞veix)細胞和人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y)或 生物個體的各個組織中進行基因呈遞。為了便于檢測，本發(fā)明分別以綠色熒光蛋白EGFP基因和熒光素酶報告基因作為外源基因分別構建得到了家蠶桿狀病毒呈遞載體，分別在動物細胞(Veix)細胞、SH-SY5Y細胞)或動物組織(小鼠組織、雞的組織)中進行呈遞和表達實驗，檢測動物細胞或動物組織內綠色熒光和熒光素酶的表達與否，并用熒光定量PCR測定其中細胞單位內的載體拷貝數(shù)以確定此載體的呈遞效率。實驗結果顯示以BmNPV構建的呈遞骨架載體可以很好地將外源基因導入動物細胞(Vero細胞、SH-SY5Y細胞)中并進行表達，同樣在動物個體的各個重要組織器官如腦、皮、肝、肺等中(小鼠、雞中)也有明顯的效果。因此，采用本發(fā)明以家蠶桿狀病毒BmNPV DNA作為骨架構建的能夠的將外源基因導入哺乳動物細胞或生物個體的組織中進行基因呈遞的家蠶桿狀病毒載體，不僅能很好應用于各種哺乳動物細胞的外源基因的呈遞或導入，也能很好地應用于哺乳動物(人)的DNA疫苗(將報告基因替換為抗原基因)、遺傳病的治療(將報告基因替換為治療遺傳病用的相關基因)、癌癥的治療(用抗癌基因等替換報告基因即可)、藥物靶標研究、基因互作、人源化的外源蛋白表達、作為RNAi用的小RNA的表達和合成等用途。因為BmNPV不會被動物血液中的補體等所滅活，因此可以將外露的囊膜蛋白如GP64基因等替換到其它桿狀病毒或其它病毒，也可達到同樣的效果。同理也可以在其它的桿狀病毒中發(fā)現(xiàn)有不能被動物血液中的補體等所滅活的桿狀病毒，或者通過雜交病毒的構建方式獲得此種類似功能.由此，本發(fā)明所構建的家蠶桿狀病毒載體能夠應用于在動物細胞或組織中表達外源基因、制備DNA疫苗、基因治療、藥物靶標研究或基因互作等方面的用途。本發(fā)明提供一種基因治療藥物或DNA疫苗，所述基因治療藥物或DNA疫苗包括本發(fā)明所構建的家蠶桿狀病毒載體和藥學上可接受的輔料。本發(fā)明更進一步的提供了一種呈遞外源基因的口服制劑，所述口服制劑包括有基因呈遞有效量的本發(fā)明的家蠶桿狀病毒載體和終濃度為25-35%的脂肪酸。


圖lpEGFP_N3載體示意圖。圖2pVL1393示意示意圖。圖3小鼠組織中綠色熒光強度對比(組織切片);A:肺部第11天綠色熒光觀察(左灌喂組，中注射組，右對照組);B;脾臟第11天綠色熒光觀察(左灌喂組，中注射組，右對照組)；C:腎臟第11天綠色熒光觀察(左灌喂組，中注射組，右對照組);D:腦部第11天綠色熒光觀察(左灌喂組，中注射組，右對照組)。圖4雞組織中綠色熒光強度對比(組織涂片)；A:肺部第11天綠色熒光觀察(左灌喂組，中注射組，右對照組);B;脾臟第11天綠色熒光觀察(左灌喂組，中注射組，右對照組)；C:腎臟第11天綠色熒光觀察(左灌喂組，中注射組，右對照組);D:腦部第11天綠色熒光觀察(左灌喂組，中注射組，右對照組)；E:淋巴第11天綠色熒光觀察(左灌喂組，中注射組，右對照組);F:法氏囊第11天綠色熒光觀察(左灌喂組，中注射組，右對照組)。圖5小鼠不同組織中熒光素酶對比。圖6雞不同組織中熒光素酶對比。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。實驗材料1.菌株、病毒株與載體大腸桿菌株Bmbacmid和BmNPV的構建參考有關文獻(發(fā)明專利申請公開號CN102286534A ;發(fā)明名稱表達多外源基因的昆蟲生物反應器及其構建方法和應用)；轉移載體PVL1393購自Invitrogen公司；家蠶細胞BmN、Bm_5和Sf_21細胞購自Invitrogen公司；非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)以及人神經(jīng)母細胞瘤細胞系(SH-SY5Y)購自美國的細胞和微生物保存機構ATCC ;大腸桿菌(ToplO，DH10B)和pGL_3載體購自Promega 公司；pEGFP_N3 載體(cpg biotech, CPCO12) ;pMD_18T 載體和 pMD-18T_simple 載體購自TaKaRa公司。2.酶與試劑限制性內切酶、連接酶為Promega公司產(chǎn)品。3.生化試劑IPTG, X-Gal, SDS為Sigma公司產(chǎn)品。Lipofectin、低融點瓊脂糖LMP、PCR試劑盒、T4DNA連接酶、RNA酶、Proteinase K、細胞培養(yǎng)基TC-100、胎牛血清及其它試劑購于Invitrogen公司，突光素酶試劑盒Luciferase Assay System購自Promega,。4.培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為LB (1%蛋白胨、O. 5%酵母提取物、I % NaCl，pH7. O)；昆蟲細胞培養(yǎng)基為TC-100 ；DMEM培養(yǎng)基購自Sigma公司和Invitrogen公司。5.弓丨物表I實驗中所用引物
權利要求
1.將外源基因導入哺乳動物細胞或生物個體的組織中進行基因呈遞的家蠶桿狀病毒載體，其特征在于包括骨架載體以及重組到骨架載體上的外源基因的表達盒；所述骨架載體是家蠶桿狀病毒BmNPV DNA ;所述外源基因的表達盒由哺乳動物啟動子、外源基因和終止子組成。
2.按照權利要求1所述的家蠶桿狀病毒載體，其特征在于所述哺乳動物啟動子是CMV 啟動子、人巨細胞病毒早期啟動子、人延伸因子1-亞基啟動子、Rous肉瘤長末端重復序列、 人Ieukosialin基因啟動子、鼠3-磷酸甘油激酶I基因啟動子、人泛素蛋白C基因啟動子、 由雞肌動蛋白啟動子和CMV增強子序列構成的雜合啟動子或鼠乳房瘤病毒啟動子；所述的終止子是SV40-polyA尾終止子。
3.按照權利要求1所述的家蠶桿狀病毒載體，其特征在于所述的外源基因是報告基因、抗原基因、治療遺傳病用的相關基因、抑癌基因或RNAi ;其中，所述的報告基因是綠色熒光蛋白基因或熒光素酶報告基因。
4.一種構建權利要求1-3任何一項所述家蠶桿狀病毒載體的方法,該方法包括(I)將外源基因的表達盒克隆到轉移載體上，構建得到含有外源基因的重組轉移載體； 所述外源基因的表達盒由哺乳動物啟動子、外源基因和終止子組成；(2)將所構建的含有外源基因的重組轉移載體與桿狀病毒共轉染昆蟲細胞，進行同源重組，即得。
5.按照權利要求4所述的方法，其特征在于所述的外源基因是報告基因、抗原基因、治療遺傳病用的相關基因、抑癌基因、、或 RNAi ;其中，所述的報告基因優(yōu)選是綠色熒光蛋白EGFP基因或熒光素酶報告基因；所述的轉移載體是PVL1393轉移載體；所述哺乳動物啟動子是CMV啟動子、人巨細胞病毒早期啟動子、人延伸因子1-亞基啟動子、Rous肉瘤長末端重復序列、人Ieukosialin基因啟動子、鼠3-磷酸甘油激酶I基因啟動子、人泛素蛋白C基因啟動子、由雞β-肌動蛋白啟動子和CMV增強子序列構成的雜合啟動子或鼠乳房瘤病毒啟動子；所述的終止子優(yōu)選是SV40-polyA尾終止子；所述的桿狀病毒是 BmNPV、AcMNPV, ApNPV, BsSNPV, CfMNPV, EoSNPV, HaNPV, HzNPV, LdMNPV, MbMNPV, OpMNPV, SIMNPV, SeMNPV 或 TeNPV ;優(yōu)先為家蠶桿狀病毒 BmNPV。所述的昆蟲細胞是家蠶細胞。
6.一種將外源基因導入動物細胞或動物個體組織并進行表達的方法，包括將權利要求1-3所述的家蠶桿狀病毒載體感染昆蟲宿主或昆蟲細胞；培養(yǎng)被感染的昆蟲宿主或昆蟲細胞對家蠶桿狀病毒載體進行擴增；收獲并純化所擴增的產(chǎn)物。
7.按照權利要求6所述的方法，其特征在于所述的昆蟲宿主是家蠶、野蠶、蓖麻蠶、樟蠶、樗蠶、柞蠶、日本柞蠶、野天蠶、苜蓿尺蠖、茶尺蠖、甘蘭夜蛾、秋粘蟲、粉紋夜蛾、行軍蟲、 棉鈴蟲、美國棉粘蟲、煙青蟲、煙草夜蛾、東方粘蟲或舞毒蛾；所述的昆蟲細胞是家蠶細胞、 野蠶細胞、蓖麻蠶細胞、樟蠶細胞、樗蠶細胞、昨蠶細胞、日本昨蠶細胞、野天蠶細胞、苜猜尺蠖細胞、茶尺蠖細胞、甘蘭夜蛾細胞、秋粘蟲細胞、粉紋夜蛾細胞、行軍蟲細胞、棉鈴蟲細胞、 美國棉粘蟲細胞、煙青蟲細胞、煙草夜蛾細胞、東方粘蟲細胞或舞毒蛾細胞；所述的感染是將家蠶桿狀病毒載體通過口食來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體或透過表皮來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體；優(yōu)選的，所述的感染是將家蠶桿狀病毒載體感染家蠶細胞或將家蠶桿狀病毒載體穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲或蛹體，在感染3-6天后收集含重組桿狀病毒的家蠶幼蟲或蛹的體液或組織勻漿；其中，所述的蛹體優(yōu)選為1-2天的早期嫩蛹。
8.權利要求1-3所述的家蠶桿狀病毒載體在制備基因治療藥物或DNA疫苗中的用途。
9.一種基因治療藥物或DNA疫苗，其特征在于，包括權利要求1-3所述的家蠶桿狀病毒載體和藥學上可接受的輔料。
10.一種呈遞外源基因的口服制劑，其特征在于包括基因呈遞有效量的權利要求1-3 所述的純化的家蠶桿狀病毒載體和終濃度為25-35%的脂肪酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在動物細胞或動物組織中表達外源基因的方法。本發(fā)明提供了一種將外源基因導入哺乳動物細胞或組織中進行基因呈遞的家蠶桿狀病毒載體，包括骨架載體家蠶桿狀病毒BmNPV以及重組到骨架載體上的外源基因的表達盒；所述外源基因的表達盒由哺乳動物啟動子、外源基因和終止子組成。本發(fā)明進一步公開了一種在動物細胞或動物組織中表達外源基因的方法，包括將構建的家蠶桿狀病毒載體感染昆蟲宿主或昆蟲細胞；培養(yǎng)被感染的昆蟲宿主或昆蟲細胞對家蠶桿狀病毒載體進行擴增；收獲并純化所擴增產(chǎn)物。本發(fā)明所構建的家蠶桿狀病毒基因呈遞載體在動物細胞中具有不可擴增、不會與動物細胞基因組進行重組、體外大量擴增方便、安全性高等優(yōu)點。
文檔編號A61K48/00GK102994550SQ201210408558
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月24日 優(yōu)先權日2012年10月24日
發(fā)明者張志芳, 姚斌, 李軼女, 易詠竹, 劉興健, 張渭蛟, 沈桂芳 申請人:中國農業(yè)科學院生物技術研究所