專(zhuān)利名稱(chēng)：一種復(fù)合人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的甲殼素纖維增強(qiáng)膠原基骨組織工程支架及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域。更確切地說(shuō)，本發(fā)明涉及用于骨缺損修復(fù)的一種復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的甲殼素纖維增強(qiáng)膠原基骨組織工程支架及制備方法。
背景技術(shù)：
骨組織作為人體最大、同時(shí)也是最容易引起缺損的組織器官，每年有數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的骨組織損壞患者需要接受手術(shù)治療。骨移植是修復(fù)骨缺損的傳統(tǒng)方法。自體骨移植是目前最常用的療法，但供體的有限性限制了其應(yīng)用，而且增加患者的痛苦。異體骨具有抗原性，特別是在植入量較大時(shí)，常會(huì)引起劇烈的免疫排斥反應(yīng)。骨組織工程可以實(shí)現(xiàn)骨的再
生，為臨床骨缺損的修復(fù)提供新的方法和途徑。近幾年來(lái)，骨組織工程的應(yīng)用研究已經(jīng)在骨科、矯形外科、口腔外科及顱面外科等多個(gè)領(lǐng)域蓬勃展開(kāi)。骨組織工程通常是采用具有一定性能的材料與細(xì)胞或者生長(zhǎng)因子復(fù)合成支架，然后將其植入體內(nèi)進(jìn)行骨缺損的修復(fù)。骨組織工程用材料通常需制備成三維多孔材料以便于在植入體內(nèi)后細(xì)胞、血管和組織等的長(zhǎng)入；此外還需要具有一定的力學(xué)性能。膠原是骨組織的主要成份之一，它為鈣化組織提供必不可少的三維結(jié)構(gòu)，對(duì)礦物沉積有誘導(dǎo)作用。用鈣鹽溶液與磷酸鹽溶液交替處理膠原，可使磷酸鈣沉積于其表面，不但可提高其力學(xué)整合性，也使得材料的成分更加接近于天然骨。但是這樣制備出的材料通常是粉末狀。制備成具有一定力學(xué)性能的三維多孔材料通常需要與用高分子聚合物與該粉末狀材料復(fù)合。聚乳酸PLA是最早被美國(guó)美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)用于人體的高分子聚合物之一，具有良好的生物相容性和成型性。通過(guò)溶于某些有機(jī)溶劑并在模具中冷凍干燥，可被制備成三維多孔材料。但是，作為骨組織工程用材料，PLA有其本身無(wú)法克服的缺點(diǎn)1.制成三維多孔材料后，其強(qiáng)度不夠；并且隨著降解的進(jìn)行，強(qiáng)度降低太快。2. PLA在體內(nèi)可降解，產(chǎn)物為無(wú)毒的乳酸。但是，由于骨組織工程通常需要植入材料量大，隨著大量PLA降解產(chǎn)物乳酸在局部的聚集，導(dǎo)致局部組織內(nèi)的PH值下降，從而刺激局部組織而發(fā)生無(wú)菌性炎癥[Daniels A, Heller A, Heller J. Toxicity of absorbable polymers proposed forfracture fixation devices. Mar. Biol. 1996; 125:525-529] 甲殼素是自然界中廣泛存在的一類(lèi)天然多糖，具有良好的生物相容性和生物降解性。其降解產(chǎn)物N-乙酰葡萄糖和氨基葡萄糖具有明顯堿性，可以中和聚乳酸的降解產(chǎn)物——乳酸，并且在體內(nèi)不堆積，對(duì)人體無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)免疫原性。目前可從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)到由甲殼素紡織成的高強(qiáng)纖維。甲殼素纖維CHF降解速率，尤其是強(qiáng)度衰減方面慢于聚乳酸。所以加入甲殼素纖維，制備纖維增強(qiáng)復(fù)合材料，有望改善聚乳酸PLA本身的不足。所以，本發(fā)明用礦化膠原MC、具有良好生物相容性的高分子聚合物聚乳酸PLA以及天然甲殼素紡織成的高強(qiáng)纖維CHF復(fù)合制備成三維多孔骨組織工程材料，然后再和細(xì)胞復(fù)合成骨組織工程支架。人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞hBMSC與其他的種子細(xì)胞相比，取材方便，有強(qiáng)大的增殖和分化為成骨質(zhì)細(xì)胞的潛能，不存在免疫排斥反應(yīng)。因此，本發(fā)明采用hBMSC與事先制備好的三維多孔材料復(fù)合而成骨組織工程支架以用于骨缺損的修復(fù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)了屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域的一種三維多孔骨組織工程材料與人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合而成的骨組織工程支架及其制備方法。所述骨組織工程材料含有礦化膠原MC、具有良好生物相容性的高分子聚合物聚乳酸PLA以及天然甲殼素紡織成的高強(qiáng)纖維CHF。它們采用物理混合和超聲波分散技術(shù)相結(jié)合的方法復(fù)合而成。所述膠原為I型牛皮膠原。所述生物降解性高分子材料聚乳酸PLA為聚L-乳酸或聚D，L-乳酸，分子量為1.0X 105-2. 0X 105kDa。所述高強(qiáng)天然多糖甲殼素纖維CHF的斷裂強(qiáng)力為4. 5-4. 7cN，其表面經(jīng)過(guò)脫乙?；幚?，脫乙酰度為80-85%。所述人的間充質(zhì)干細(xì)胞為hBMSC為人胚胎骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。所述的膠原，它為礦化組織提供必不可少的三維結(jié)構(gòu)，對(duì)礦物沉積有誘導(dǎo)作用。用鈣鹽溶液與磷酸鹽溶液交替處理膠原，使得磷酸鈣沉積于其表面，從而使膠原進(jìn)行礦化，這樣不但提高了其力學(xué)整合性，也使得材料的成分更加接近于天然骨。所述的聚乳酸PLA對(duì)整個(gè)三維材料起支撐作用，通過(guò)溶于有機(jī)溶劑并在模具中冷凍干燥，得到多孔材料。所述的甲殼素纖維CHF的功能之一是起增強(qiáng)作用，功能之二是因?yàn)樗慕到猱a(chǎn)物本身具有明顯的堿性，從而在體內(nèi)中和聚乳酸的酸性降解產(chǎn)物。所述復(fù)合人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的甲殼素纖維增強(qiáng)膠原基骨組織工程支架的制備方法包括下列各個(gè)步驟1.制備礦化膠原MC。首先將膠原溶解于乙酸中，然后在膠原溶液中依次緩慢滴加等量體積的O. 5M CaCljPO. 3M Na2HPO4，之后在攪拌同時(shí)緩慢滴加NaOH溶液至pH值為6 8。靜置溶液2 4天，除去上清，離心分離出沉淀，沉淀物用去離子水反復(fù)清洗三次后，放入凍干機(jī)內(nèi)冷凍干燥，隨后研磨制得干粉即為礦化膠原MC。2.確定合適的聚乳酸PLA和甲殼素纖維CHF添加比例。PLA和CHF按不同比例分別浸泡于含有一定溶解酵素的PBS溶液中，分別在一定時(shí)間內(nèi)測(cè)定浸泡液的pH值，最后選用PH值波動(dòng)較小的PLA和CHF的添加比例。經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)得出當(dāng)CHF和PLA的質(zhì)量含量之比為O. 25-0. 3時(shí)，材料浸泡液pH值波動(dòng)最小。3.確定甲殼素纖維CHF的合適長(zhǎng)度。纖維只有在其長(zhǎng)度大于一個(gè)臨界長(zhǎng)度的情況下，才能對(duì)基體產(chǎn)生增強(qiáng)作用。但是在纖維含量一定的情況下，如果纖維的長(zhǎng)度太長(zhǎng)，增強(qiáng)材料的壓縮強(qiáng)度會(huì)略有下降。在本試驗(yàn)所能涉及的范圍內(nèi)，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)，得到甲殼素纖維CHF的合適長(zhǎng)度為1. 4-1. 6_。4.將分子量為1.0X 105-2. 0X 105kDa的聚乳酸PLA溶于1,4-二氧六環(huán)中，配成濃度為100-150g/L的溶液。加入一定含量礦化膠原MC粉末(PLA :MC=1)，超聲波分散30-60min，然后加入一定含量的甲殼素纖維CHF(CHF PLA=0. 25-0. 3)，在常溫下經(jīng)過(guò)2_4小時(shí)的磁力攪拌并超聲波分散3-5小時(shí)，制得骨組織工程材料混合液體。
5.采用冷凍干燥的方法制備三維多孔骨組織工程材料。將上述第4步配成的混合溶液倒入聚四氟乙烯模具中，置于_20°C冰箱中冷凍24-48小時(shí)后，將模具轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24-36小時(shí)，為了將溶劑徹底清除，冷凍干燥后的材料需在40-60°C的真空干燥箱中烘干24-48小時(shí)。之后，將材料用環(huán)氧乙烷蒸氣消毒6-12小時(shí)，即為本發(fā)明所述的三維多孔骨組織工程材料。6.人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞hBMSC與三維多孔材料共培養(yǎng)。將購(gòu)買(mǎi)到的2-3代人胚胎骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以l-3X103cellS/cm2的密度接種在上述第5步制備的三維多孔骨組織工程材料上，待4-6小時(shí)細(xì)胞貼壁后加入含有10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)液每3天換新液。7天后用PBS沖洗三次材料以除去沒(méi)有粘附到材料的細(xì)胞。最終得到本發(fā)明所公開(kāi)的復(fù)合人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的甲殼素纖維增強(qiáng) 膠原基骨組織工程支架。本發(fā)明的有益效果是通過(guò)上述方法得到的復(fù)合人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的甲殼素纖維增強(qiáng)膠原基骨組織工程支架有以下且不限于以下的優(yōu)點(diǎn)1.所制備的骨組織工程材料具有三維結(jié)構(gòu)和85-90%的高孔隙率。最大孔徑達(dá)200 μ m以上。這樣的結(jié)構(gòu)有助于細(xì)胞、血管、組織的長(zhǎng)入，從而促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。2.材料中含有礦化膠原MC。膠原為礦化組織提供必不可少的三維結(jié)構(gòu)，對(duì)礦物沉積有誘導(dǎo)作用。用鈣鹽溶液與磷酸鹽溶液交替處理，從而得到礦化膠原MC。MC的加入使得材料具有很好的力學(xué)整合性，成分更接近于天然骨。3.高分子聚合物聚乳酸PLA的加入使得材料具有很好的成型性。加入高強(qiáng)甲殼素纖維CHF對(duì)材料起到進(jìn)一步增強(qiáng)作用，使得其力學(xué)性能接近于天然骨。4.材料可降解。甲殼素纖維CHF的降解產(chǎn)物中和了聚乳酸PLA的酸性降解產(chǎn)物，從而為細(xì)胞、組織的長(zhǎng)入提供更好的環(huán)境。此外，甲殼素作為一種多聚糖，接近于自然骨胞外基質(zhì)，它的加入使得材料具有更好的細(xì)胞相容性。5.該骨組織工程材料能夠促使與其共培養(yǎng)的人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨質(zhì)細(xì)胞分化。本發(fā)明所公開(kāi)的骨組織工程支架在植入山羊脛骨25mm節(jié)段骨缺損8周后能夠完全修復(fù)該骨缺損，并且修復(fù)效果與自體骨無(wú)明顯差別。所以，本發(fā)明所公開(kāi)的骨組織工程支架具有三維多孔結(jié)構(gòu)，良好的力學(xué)性能、生物相容性和骨修復(fù)能力，很有希望應(yīng)用于臨床。


附圖1所示為本發(fā)明所公開(kāi)的骨組織工程支架掃描電鏡照片，顯示材料為多孔結(jié)構(gòu)，細(xì)胞在材料上粘附得很好。附圖2所示為附圖1的放大掃描電鏡圖，顯示細(xì)胞偽足緊密貼附在材料表面，材料和細(xì)胞在圖中分別用白色和黑色箭頭標(biāo)出。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明為滿(mǎn)足骨組織缺損修復(fù)的需求而提供一種復(fù)合人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維多孔骨組織工程支架的制備方法。所述骨組織工程材料主要含有礦化膠原MC、具有良好生物相容性的高分子聚合物聚乳酸PLA以及天然甲殼素紡織成的高強(qiáng)纖維CHF。它們采用物理混合和超聲波分散技術(shù)相結(jié)合的方法復(fù)合而成。經(jīng)過(guò)多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定，所述甲殼素纖維CHF和聚乳酸PLA的合適質(zhì)量含量之比為 O. 25-0. 3。經(jīng)過(guò)多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定，甲殼素纖維CHF的合適長(zhǎng)度為1. 4-1. 6mm。所述骨組織工程材料采用模具成型和隨后的冷凍干燥以獲得三維多孔結(jié)構(gòu)。所述人的間充質(zhì)干細(xì)胞為hBMSC為人胚胎骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。經(jīng)過(guò)多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定，細(xì)胞在該骨組織工程支架材料上合適的接種密度為1-3X 103cellS/cm2下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但該實(shí)施例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。1.制備礦化膠原MC。首先將I克膠原溶解于1. 5升乙酸中，然后在膠原溶液中依 次緩慢滴加200ml的O. 5M CaCljPO. 3M Na2HPO4，之后在攪拌同時(shí)緩慢滴加NaOH溶液至pH值為6. 9。靜置溶液3天，除去上清，離心分離出沉淀，沉淀物用去離子水反復(fù)清洗三次后，放入凍干機(jī)內(nèi)冷凍干燥，隨后研磨制得干粉即為礦化膠原MC。2.將分子量為2. OX 105kDa的I克聚L-乳酸PLLA溶于10毫升1，4_ 二氧六環(huán)中，磁力攪拌I小時(shí)。然后加入I克礦化膠原MC粉末，超聲波分散45分鐘，然后加入長(zhǎng)度為1. 5mm的甲殼素纖維CHF0. 25克，在常溫下經(jīng)過(guò)3小時(shí)的磁力攪拌并超聲波分散4小時(shí)，制得骨組織工程材料混合液體。3.采用冷凍干燥的方法制備三維多孔骨組織工程材料。將上述第2步配成的混合液倒入聚四氟乙烯模具中，置于_20°C冰箱中冷凍36小時(shí)后，將模具轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥36小時(shí)，為了將溶劑徹底清除，冷凍干燥后的材料在60°C的真空干燥箱中烘干24小時(shí)。之后，將材料用環(huán)氧乙烷蒸氣消毒10小時(shí)，即為本發(fā)明所述的一種三維多孔骨組織工程材料。4.人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞hBMSC與三維多孔材料共培養(yǎng)。將購(gòu)買(mǎi)到的3代人胚胎骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以3X103cellS/cm2的密度接種在上述第3步制備的三維多孔骨組織工程材料上，待6小時(shí)細(xì)胞貼壁后加入含有10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)液每3天換新液。7天后用PBS沖洗三次材料以除去沒(méi)有粘附到材料的細(xì)胞。最終得到本發(fā)明所公開(kāi)的一種復(fù)合人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的甲殼素纖維增強(qiáng)膠原基骨組織工程支架。
權(quán)利要求
1.一類(lèi)新穎的三維多孔纖維增強(qiáng)材料與人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合而成的骨組織工程支架。所述三維多孔材料由礦化膠原MC、高分子聚合物聚乳酸PLA以及天然甲殼素紡織成的高強(qiáng)纖維CHF復(fù)合而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原為I型牛皮膠原；高分子材料聚乳酸PLA為聚L-乳酸或聚D, L-乳酸，分子量為1. OX 105-2. OX 105kDa ;甲殼素纖維CHF的斷裂強(qiáng)力為4. 5-4. 7cN,其表面經(jīng)過(guò)脫乙酰基處理，脫乙酰度為80-85%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的礦化膠原MC是由膠原經(jīng)鈣鹽溶液與磷酸鹽溶液處理后得到，它不但提高了其力學(xué)整合性，也使得材料的成分更加接近于天然骨。聚乳酸PLA對(duì)整個(gè)三維材料起支撐作用，通過(guò)溶于有機(jī)溶劑并在模具中冷凍干燥，得到多孔材料。甲殼素纖維CHF的功能之一是起增強(qiáng)作用，功能之二是因?yàn)樗慕到猱a(chǎn)物本身具有明顯的堿性，從而在體內(nèi)中和聚乳酸的酸性降解產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維多孔材料采用物理混合和超聲波分散技術(shù)相結(jié)合的方法復(fù)合而成。采用模具成型和隨后的冷凍干燥以獲得三維多孔結(jié)構(gòu)。所述人的間充質(zhì)干細(xì)胞為hBMSC為人胚胎骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。整個(gè)骨組織工程支架的制備方法包括下列各步驟 (1)制備礦化膠原MC。首先將膠原溶解于乙酸中，然后在膠原溶液中依次緩慢滴加等量體積的0. 5M CaCl2和0. 3M Na2HPO4,之后在攪拌同時(shí)緩慢滴加NaOH溶液至pH值為6 8。靜置溶液2 4天，除去上清，離心分離出沉淀，沉淀物用去離子水反復(fù)清洗三次后，放入凍干機(jī)內(nèi)冷凍干燥，隨后研磨制得干粉即為礦化膠原MC。
(2)確定合適的聚乳酸PLA和甲殼素纖維CHF添加比例。PLA和CHF按不同比例分別浸泡于含有一定溶解酵素的PBS溶液中，分別在一定時(shí)間內(nèi)測(cè)定浸泡液的pH值，最后選用PH值波動(dòng)較小的PLA和CHF的添加比例。經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)得出當(dāng)CHF和PLA的質(zhì)量含量之比為0. 25-0. 3時(shí)，材料浸泡液pH值波動(dòng)最小。
(3)確定甲殼素纖維CHF的合適長(zhǎng)度。纖維只有在其長(zhǎng)度大于一個(gè)臨界長(zhǎng)度的情況下，才能對(duì)基體產(chǎn)生增強(qiáng)作用。但是在纖維含量一定的情況下，如果纖維的長(zhǎng)度太長(zhǎng)，增強(qiáng)材料的壓縮強(qiáng)度會(huì)略有下降。在本試驗(yàn)所能涉及的范圍內(nèi)，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)，得到甲殼素纖維CHF的合適長(zhǎng)度為1. 4-1. 6mm。
(4)將分子量為1.0X105-2. 0X 105kDa的聚乳酸PLA溶于1,4-二氧六環(huán)中，配成濃度為100-150g/L的溶液。加入一定含量礦化膠原MC粉末(PLA :MC=1 )，超聲波分散30_60min，然后加入加入一定含量的甲殼素纖維CHF (CHF PLA=0. 25-0. 3)，在常溫下經(jīng)過(guò)2_4小時(shí)的磁力攪拌并超聲波分散3-5小時(shí)，制得骨組織工程材料混合液體。
(5)采用冷凍干燥的方法制備三維多孔骨組織工程材料。將上述第4步配成的混合溶液倒入聚四氟乙烯模具中，置于_20°C冰箱中冷凍24-48小時(shí)后，將模具轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24-36小時(shí)，為了將溶劑徹底清除，冷凍干燥后的材料需在40-60°C的真空干燥箱中烘干24-48小時(shí)。之后，將材料用環(huán)氧乙烷蒸氣消毒6-12小時(shí)，即為本發(fā)明所述的三維多孔骨組織工程材料。
(6)人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞hBMSC與三維多孔材料共培養(yǎng)。將購(gòu)買(mǎi)到的2-3代人胚胎骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以1-3X 103cellS/cm2的密度接種在上述第5步制備的三維多孔骨組織工程材料上，待4-6小時(shí)細(xì)胞貼壁后加入含有10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)液每3天換新液。7天后用PBS沖洗三次材料以除去沒(méi)有粘附到材料的細(xì)胞。最終得到本發(fā)明所公 開(kāi)的復(fù)合人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的甲殼素纖維增強(qiáng)膠原基骨組織工程支架。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域的一類(lèi)骨組織工程材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合的骨組織工程支架及其制備方法。所述骨組織工程材料由礦化膠原MC，聚乳酸PLA以及天然甲殼素紡織成的高強(qiáng)纖維CHF復(fù)合而成。MC的加入使得材料具有良好的力學(xué)整合性，成分接近于天然骨。PLA的加入使得材料具有良好的成型性。CHF不但對(duì)材料起到增強(qiáng)作用而且其降解產(chǎn)物中和了PLA的酸性降解產(chǎn)物。該骨組織工程材料可降解，具有三維多孔結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所公開(kāi)的該骨組織工程材料與人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合而成的支架在植入山羊脛骨25mm節(jié)段骨缺損8周后完全修復(fù)了該骨缺損，修復(fù)效果與自體骨無(wú)明顯差別，很有希望作為骨組織工程支架在臨床上得到應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61L27/56GK102989041SQ201210401919
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月22日
發(fā)明者李曉明, 黃瑾, 牛旭峰, 樊瑜波 申請(qǐng)人:北京航空航天大學(xué)