專利名稱：一種具抗腫瘤活性的紫杉醇脂質(zhì)納米粒注射液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬制藥領(lǐng)域，涉及一種紫杉醇脂質(zhì)納米粒注射液，尤其涉及一種含有紫杉醇和維生素E的新型脂質(zhì)納米粒制劑的制備方法，具有高效抗腫瘤活性及克服腫瘤耐藥性。
背景技術(shù)：
紫杉醇是紅豆杉科這種生長(zhǎng)較慢的常綠喬木中分離得到的天然化合物。它具有較明顯并且獨(dú)特的抗腫瘤療效。紫杉醇通過(guò)作用于細(xì)胞內(nèi)微管蛋白來(lái)阻斷有絲分裂，使快速分裂的癌細(xì)胞死亡。同時(shí)，紫杉醇可引發(fā)細(xì)胞凋亡、調(diào)控免疫，使腫瘤細(xì)胞被殺傷或抑制。強(qiáng)大而獨(dú)特的抗腫瘤機(jī)理，使得紫杉醇已然成為現(xiàn)今世界上最熱門(mén)、最暢銷、最緊缺、最昂貴，同時(shí)也是臨床應(yīng)用最廣泛的抗腫瘤藥物。紫杉醇目前主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對(duì)肺癌、 大腸癌等也有一定的療效。紫杉醇的強(qiáng)大抗腫瘤療效是廣大患者的福祉，但是其極微小的溶解性制約了臨床應(yīng)用。紫杉醇不溶于水，溶解于氯仿、丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑。目前商品化的紫杉醇制劑是將其溶解于聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor)與乙醇1:1的溶劑(浮乳)中，使用時(shí)加水稀釋。然而聚氧乙烯蓖麻油會(huì)引起較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如中性粒細(xì)胞減少、骨髓抑制等。同時(shí)，聚氧乙烯蓖麻油與聚氯乙烯(PVC)接觸會(huì)產(chǎn)生焦碳酸二乙酯，易導(dǎo)致過(guò)敏。因此，該制劑不能與含有聚氯乙烯的容器、注射器等接觸，這極大地限制了它的使用。由此看來(lái)，改善紫杉醇的溶解性，尋找更加安全、低毒性的助溶劑是目前紫杉醇使用的一大要求。研究發(fā)現(xiàn)，維生素E具有抑制腫瘤生長(zhǎng)、降低或延緩腫瘤發(fā)生的作用。流行病學(xué)資料顯示，人體維生素E攝入量與腫瘤呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。體內(nèi)維生素E水平低的人比正常水平的人得肺癌的危險(xiǎn)性高2. 5倍。小鼠服用維生素E后能夠明顯降低致癌物誘導(dǎo)的皮膚癌和乳腺癌的幾率。給實(shí)驗(yàn)小鼠喂食含有較高濃度維生素E的小麥胚芽油，能夠明顯降低腹腔注射甲基膽蒽引起的皮膚癌的發(fā)病率。這主要是因?yàn)椋S生素E是一種較強(qiáng)的抗氧化劑，能夠抑制并清除體內(nèi)自由基，并阻斷致癌物亞硝胺的形成，保護(hù)細(xì)胞的正常活動(dòng)。而多種化學(xué)致癌物屬于強(qiáng)氧化劑，維生素E的抗氧化性質(zhì)能夠有效地防止此類致癌物對(duì)機(jī)體的損傷。其次，維生素E對(duì)免疫系統(tǒng)的保護(hù)作用。維生素E能夠明顯增強(qiáng)動(dòng)物體的免疫反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，維生素E可使雛雞的被動(dòng)免疫增強(qiáng)，使小鼠脾臟重量增加，輔助T細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)。當(dāng)維生素E缺乏時(shí)，淋巴細(xì)胞對(duì)有絲分裂原刺激后的增值能力降低，遲發(fā)超敏反應(yīng)降低；如果攝取超過(guò)需要量2-10倍的維生素E，可增強(qiáng)遲發(fā)超敏反應(yīng)，加強(qiáng)單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)顆粒物抗原的清除，提高宿主的免疫力。同時(shí)，維生素E能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，維生素E對(duì)小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤、小鼠黑色素瘤、大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用。維生素E還能夠誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤、大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的產(chǎn)生形態(tài)分化，使細(xì)胞體積增大。體外實(shí)驗(yàn)顯示，維生素E能夠直接抑制前列腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能夠增強(qiáng)抗腫瘤藥物(例如阿霉素)的療效，降低毒副作用。再次，維生素E可保護(hù)體內(nèi)維生素A和維生素C不被氧化破壞，這些維生素的存在可維持機(jī)體免疫系統(tǒng)進(jìn)行正常的生理活動(dòng)，維持正常免疫功能。通過(guò)這一過(guò)程，維生素E起到了間接保護(hù)機(jī)體、預(yù)防癌變的作用。除此之外，維生素E與其他各類抗腫瘤藥合并使用的潛力很大，可能達(dá)到增強(qiáng)抗癌療效、減小毒性的作用。以上研究結(jié)果都可以表明，維生素E對(duì)人體維持正常的免疫功能、增強(qiáng)體抗力、抵御癌變都有積極的作用。同時(shí)，維生素E是一種油狀脂質(zhì)，其對(duì)紫杉醇的溶解性較好?？梢詽M足臨床給藥對(duì)藥物含量的要求。腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化學(xué)藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，稱多藥耐藥(MDR)，是造成腫瘤化學(xué)藥物治療(化療)失敗的主要原因。統(tǒng)計(jì)表明,腫瘤年死亡率中，屬內(nèi)在性多藥耐藥(intrinsicMDR)的腫瘤，包括消化器官、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤引起的約占61%;屬獲得性多藥耐藥(acquired MDR)的腫瘤，包括皮膚癌、乳腺癌、生殖器癌、內(nèi)分泌腫瘤、白血病和淋巴瘤，約占33%。這就是說(shuō)，90%以上腫瘤患者死因都與耐藥有關(guān)。另一方面，新發(fā)現(xiàn)的藥物如紫杉醇和治療慢性粒性白血病的STI-571.，都是剛用于臨床就發(fā)現(xiàn)有耐藥性，這使問(wèn)題更加嚴(yán)重。因此，腫瘤耐藥基因的表達(dá)和逆轉(zhuǎn)MDR的研究成為腫瘤治療亟待解決的問(wèn)題。 關(guān)于腫瘤天然耐藥性產(chǎn)生的原因尚未完全闡明。根據(jù)腫瘤細(xì)胞的耐藥特點(diǎn)，耐藥可分為原藥耐藥(PDR)和MDR兩大類。前者指只對(duì)誘導(dǎo)藥物產(chǎn)生耐藥性而對(duì)其他藥物不產(chǎn)生交叉耐藥性，如抗代謝藥甲氨蝶呤(MTX)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)等；后者則是指腫瘤細(xì)胞一旦對(duì)某種化療藥物產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)對(duì)其他結(jié)構(gòu)上無(wú)關(guān)，作用機(jī)理亦各異的藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性，這是一種獨(dú)特的廣譜耐藥現(xiàn)象。許多天然來(lái)源的抗腫瘤藥物如生物堿類抗癌藥物(秋水仙堿、長(zhǎng)春堿、三尖杉酯堿和紫杉醇等)，蒽環(huán)類抗癌抗生素(阿霉素和柔紅霉素)，鬼臼毒素類及合成藥(米托蒽醌和胺苯吖啶)都極易發(fā)生多藥耐藥。有關(guān)多藥耐藥形成機(jī)制近年來(lái)已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。目前認(rèn)為，腫瘤耐藥機(jī)制主要有
(I)藥理耐藥是指由機(jī)體對(duì)藥物的影響所導(dǎo)致的耐藥，如藥物進(jìn)入機(jī)體代謝增強(qiáng)或活化障礙、腫瘤血供不足、藥物組織穿透力差、藥物避難所的形成等，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞外藥物有效濃度降低。(2)生化耐藥是指腫瘤細(xì)胞的遺傳性及生化特性發(fā)生復(fù)雜的變化，致使細(xì)胞通過(guò)不同途徑對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，主要有(I)細(xì)胞膜/核膜蛋白，即藥物輸出泵如P-糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)、肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)和乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)，能夠使細(xì)胞內(nèi)藥物外排增加或囊泡隔離，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低或藥物分布改變。。其中P-gp介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)藥物“泵”出機(jī)制是產(chǎn)生腫瘤多藥耐藥的主要機(jī)制。P-gp是一種相對(duì)分子質(zhì)量為170kD的單鏈跨膜糖蛋白，也稱P170,由多藥耐藥基因I (multidrug resistancegene I，MDRl)編碼，MDRl的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥的發(fā)生。(2)細(xì)胞質(zhì)/核內(nèi)蛋白，即藥物靶酶活性改變?nèi)缍淙~酸還原酶(DHFR)是MTX的靶酶，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II是蒽環(huán)類和鬼臼毒素類藥物的靶酶，它們的含量及活性降低也能導(dǎo)致耐藥；酪氨酸激酶BCR-Abl是STI-571的靶酶，它的擴(kuò)增和突變都能產(chǎn)生耐藥；谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)活性代謝及結(jié)合能力增強(qiáng)，催化谷胱甘肽(GSH)與藥物及其代謝產(chǎn)物結(jié)合；細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶(PKC)活性改變加速Pgp磷酸化；Q6甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)，導(dǎo)致DNA修復(fù)功能增強(qiáng)等。但不管是以什么耐藥機(jī)制起作用，都以腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低為其特征。(3)凋亡耐藥大部分抗腫瘤藥物引起細(xì)胞死亡是通過(guò)細(xì)胞凋亡，而促凋亡基因的缺失或抗凋亡基因Bcl-2的過(guò)度表達(dá)都將相應(yīng)地導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。(4)微環(huán)境耐藥腫瘤細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)有賴于器官微環(huán)境，而器官微環(huán)境可以通過(guò)調(diào)節(jié)不同耐藥基因表達(dá)來(lái)影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。實(shí)驗(yàn)證明，耐藥表型是多基因的，它隨誘導(dǎo)的藥物不同，腫瘤種類、分化程度以及宿主微環(huán)境的不同而表現(xiàn)一種或幾種耐藥基因同時(shí)表達(dá)。目前克服腫瘤多藥耐藥主要有3種策略一是增加腫瘤細(xì)胞的藥物攝取量；二是減少藥物外排；三是采用生物技術(shù)相關(guān)的逆轉(zhuǎn)方法。第I種途徑可以通過(guò)運(yùn)用納米載藥技術(shù)實(shí)現(xiàn)克服腫瘤多藥耐藥。納米載藥系統(tǒng)由于粒徑小表面積大，表面吸附特性強(qiáng)，藥物在理化性質(zhì)、藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)等方面的表現(xiàn)和常規(guī)制劑有明顯不同，這是納米載藥系統(tǒng)能克服腫瘤多藥耐藥的物質(zhì)基礎(chǔ)。一般認(rèn)為，納米載體作為抗腫瘤藥物或各種耐藥調(diào)節(jié)劑的遞送載體，之所以能逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥，是因?yàn)樗梢酝ㄟ^(guò)主動(dòng)或被動(dòng)的方式，增加藥物在細(xì)胞內(nèi)的積累或者減少藥物的外排，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥。納米載體通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，內(nèi)吞作用可以分為吞噬和吞飲作用，其中后者作·用更普遍。通過(guò)對(duì)納米載體的修飾特別是多靶標(biāo)修飾，可以使藥物更精確地主動(dòng)靶向到特定部位或細(xì)胞。納米載體可以通過(guò)非特異性和受體介導(dǎo)的吞飲作用吸附結(jié)合到細(xì)胞膜表面而被內(nèi)化。內(nèi)化后的納米載藥系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)酶的作用下或微酸性的PH環(huán)境下釋放出藥物。眾多研究表明，運(yùn)用納米載體克服腫瘤耐藥性的強(qiáng)弱，與納米載體的大小，表面理化性質(zhì)和載體組成成分，存在著重大相關(guān)性。第2種逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的策略大多是運(yùn)用針對(duì)P-gp或其他耐藥蛋白的化療增敏劑及耐藥調(diào)節(jié)劑如維拉帕米、環(huán)飽素等，但這些藥物中毒劑量與有效劑量相近，難以達(dá)到能逆轉(zhuǎn)的有效濃度，而且還存在作用靶點(diǎn)單一，選擇性低等問(wèn)題。RNA干擾技術(shù)是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，特別是通過(guò)小分子RNA片段(siRNA)沉默編碼P-gp的，為逆轉(zhuǎn)腫瘤的腫瘤多藥耐藥帶來(lái)新的曙光。RNA干擾技術(shù)同時(shí)還有高度特異性、高效率、高成功率等特點(diǎn)。但是siRNA體內(nèi)穩(wěn)定性和細(xì)胞靶向性差，借助納米載體可以使基因沉默技術(shù)更好的應(yīng)用。第3種逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的方法采用生物技術(shù)、基因技術(shù)等實(shí)現(xiàn)克服耐藥的效果。例如基因療法、反義寡核苷酸技術(shù)等。有文獻(xiàn)顯示，利用小干擾RNA介導(dǎo)的RNA干擾手段，可以下調(diào)特定基因表達(dá)，導(dǎo)致靶基因失活。利用此方法現(xiàn)在已可以實(shí)現(xiàn)使耐藥白血病對(duì)長(zhǎng)春新堿和多柔比星的敏感性增強(qiáng)。核酶是一擻輿有催化活性的RNA分子，可識(shí)別特異的核苷酸序列，并通過(guò)與目的RNA結(jié)合，切割致病基因編碼的mRNA而減少其表達(dá)，已成為一種有前途的分子靶向治療工具。利用核酶技術(shù)，，將6條抗MDRl積陰德錘頭狀核酶轉(zhuǎn)染到過(guò)度表達(dá)P-gp的人類白血病耐藥細(xì)胞系中后，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞P-gp的表達(dá)下降，P-gp的流出泵功能減弱。提高進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的藥物含量，達(dá)到克服耐藥的效果。1961年，瑞典的Wretlind首次在臨床使用脂肪乳作為靜脈注射營(yíng)養(yǎng)劑。開(kāi)創(chuàng)了脂肪乳劑的歷史，到今天脂肪乳劑的發(fā)展已經(jīng)有半個(gè)世紀(jì)的歷程。在這個(gè)過(guò)程中，脂肪乳結(jié)合脂質(zhì)體、納米材料等，由單一給藥方式發(fā)展為當(dāng)下研究熱點(diǎn)的納米級(jí)別給藥方式，例如固體脂質(zhì)納米粒(SLN)、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(NLC)和藥脂結(jié)合物(LDC)等幾種各具特色的給藥途徑。豐富了脂肪乳劑這一范疇。SLN的制備方法是將藥物溶解或分散于熔融狀脂質(zhì)，熔融狀脂質(zhì)在快速攪拌下分散于熱的水相中，制得初乳，初乳在高于熔點(diǎn)溫度環(huán)境下進(jìn)行均質(zhì)處理，得到固體脂質(zhì)納米粒?；蛘邔⒊跞榧尤氲捷^低溫的水相中，使其冷卻析出。然而，晶體行為因粒徑尺寸的改變而不同。比如，相變溫度會(huì)根據(jù)晶格減小而降低；晶形排列不規(guī)則的脂質(zhì)能夠更容易地進(jìn)行轉(zhuǎn)相。在保存過(guò)程中，幾天或幾小時(shí)的時(shí)間內(nèi)，大部分具有整齊晶形排列的固體脂質(zhì)納米粒都在分散介質(zhì)中產(chǎn)生了不同程度的藥物滲漏或藥物結(jié)晶析出。除此之外，較為有序的晶體排列明顯制約了藥物包載能力。而有序晶形的形成也取決于脂質(zhì)分子在化學(xué)結(jié)構(gòu)上的一致性。例如，在工業(yè)生產(chǎn)上使用高純 度的氨基丁三醇制備脂質(zhì)顆粒能夠得到晶形排列整齊的產(chǎn)物。對(duì)藥物有良好包載能力的必要條件之一是，在脂質(zhì)基質(zhì)中，脂質(zhì)的脂肪酸鏈與晶體內(nèi)部空隙之間要有足夠大的距離，以容納無(wú)定型態(tài)的藥物分子。而脂肪酸鏈之間的距離可以通過(guò)使用不同脂肪酸形成的甘油酯來(lái)增加，例如甘油酯分別含有飽和及不飽和的的脂肪酸鏈。SLN有較多明顯優(yōu)勢(shì)所使用的脂質(zhì)大多具有良好的生物相容性；適用于多種途徑給藥；同時(shí)，固體脂質(zhì)基質(zhì)在室溫環(huán)境下呈固態(tài)，內(nèi)部形成排列整齊的晶格形態(tài)，克服了在外環(huán)境下不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。但正因?yàn)槿绱?，排列整齊的晶體之間的有限空間限制了 SLN的載藥能力。除此之外，SLN仍有很多潛在的問(wèn)題有限的藥物載藥量、藥物釋放曲線的多變、存放過(guò)程中的藥物滲漏等。這些問(wèn)題極大地限制了 SLN的使用?？上驳氖?，這些缺點(diǎn)可以被一定程度地減弱或者避免，這得益于新一代的脂質(zhì)納米給藥系統(tǒng)——具有良好藥物包載能力的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(NLC)的出現(xiàn)。NLC是在SLN基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的，它是以若干種空間結(jié)構(gòu)不相容的固體或者液體脂質(zhì)混合形成的具有特殊結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)作為基質(zhì)制備的新型的脂質(zhì)納米粒。通過(guò)混合不同種類固體脂質(zhì)和不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的液體脂質(zhì)得到一種新型的脂質(zhì)粒子，用來(lái)代替使用固體脂質(zhì)制作的SLN。不同相態(tài)脂質(zhì)的混合，使得納米粒中難以形成排列整齊的晶格形態(tài)，這使得脂質(zhì)內(nèi)儲(chǔ)藥空間明顯增大，藥物的空間容量增加，有效地提高載藥量，減少藥物滲漏。NLC的制備方法有微乳化法、高壓均質(zhì)法、溶劑擴(kuò)散法和溶劑乳化蒸發(fā)法。具體方法的選擇要取決于藥物的理化性質(zhì)。同一方法中選擇不同溫度、反應(yīng)時(shí)間等參數(shù)都會(huì)影響產(chǎn)物的理化性質(zhì)。研究表明，在納米粒表面修飾PEG對(duì)制劑的體內(nèi)分布、釋放時(shí)長(zhǎng)、靶向性等體內(nèi)行為都有較好的改善作用。DSPE-PEG2000對(duì)納米粒進(jìn)行表面修飾后，一端的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)親脂性較強(qiáng)，可以插入到納米粒里面，另一端的PEG鏈?zhǔn)侨犴g且親水性好的長(zhǎng)鏈，能夠吸附大量水分子，在納米粒表面形成一層水化膜，使納米粒的空間結(jié)構(gòu)時(shí)刻發(fā)生變化，而使巨噬細(xì)胞難以對(duì)其產(chǎn)生有效的識(shí)別，從而避免了單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS)的吸收和血漿蛋白的調(diào)理作用，增加了在血液中的循環(huán)時(shí)間，達(dá)到長(zhǎng)循環(huán)，同時(shí)有利于藥物順利到達(dá)靶向部位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具抗腫瘤活性的紫杉醇脂質(zhì)納米粒注射液，本發(fā)明提供的脂質(zhì)納米粒注射液處方包括紫杉醇藥物、脂質(zhì)材料、注射用水、表面活性劑、穩(wěn)定劑、金屬離子螯合劑，具體重量百分比組成是
紫杉醇O. 1%-5%
脂質(zhì)材料 5%-50%表面活性劑 1%-25%
穩(wěn)定劑5%-20%
金屬離子螯合劑 O. 1%-1%
其余為注射用水。為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，注射液的處方組成調(diào)整為
紫杉醇O. 1%-4%
脂質(zhì)材料 5%-30%
表面活性劑 3%-15%
穩(wěn)定劑 5%-15%
金屬離子螯合劑O. 1%-1%
其余為注射用水。本發(fā)明注射液優(yōu)選方案為
紫杉醇O. 5%-3%
脂質(zhì)材料 5%-25%
表面活性劑 3%-15%
穩(wěn)定劑 5%-15%
金屬離子螯合劑O. 1%-0. 5%
其余為注射用水。本發(fā)明中的脂質(zhì)材料選用維生素E、精制植物油、動(dòng)物油中的一種或其中任幾種的混合物；表面活性劑選用磷脂、聚乙二醇修飾磷脂(DSPE-PEG2000)、吐溫、泊洛沙姆、司盤(pán)、油酸、油酸鈉中的一種或其中任幾種的混合物；穩(wěn)定劑選用蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘氨酸、谷氨酸、山梨醇、甘露醇的一種或其中任幾種的混合物；金屬離子螯合劑選用乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)、乙二胺四乙酸鈉鈣鹽中的一種或其混合物。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種紫杉醇脂質(zhì)納米粒注射液的制備方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)
(1)脂質(zhì)相的制備將處方量的脂質(zhì)、溶于脂質(zhì)的表面活性劑、聚乙二醇修飾磷脂、紫杉醇溶于適量無(wú)水乙醇中，減壓蒸發(fā)除去乙醇，得脂質(zhì)相；
(2)水相的制備將溶于水相的表面活性劑、穩(wěn)定劑、金屬離子螯合劑混合于注射用水，攪拌直至各部分溶解，得水相；
(3)初乳的制備脂質(zhì)相60°C加熱攪拌下，水相逐滴加入油相，得乳白色初乳；
(4)脂質(zhì)納米粒的制備將初乳至于高壓乳勻機(jī)中，在0-10°C下，以1000-1500bar壓力均質(zhì)15-30循環(huán)，至平均粒徑在150nm左右，得脂質(zhì)納米粒，將此乳劑灌封于輸液瓶中，充氮，置于蒸汽旋轉(zhuǎn)滅菌器中，滅菌，得紫杉醇納米粒。本發(fā)明所制備的紫杉醇納米粒，將大部分藥物包裹于脂質(zhì)內(nèi)部，避免了藥物與血液或其他體液的直接接觸，降低了藥物對(duì)注射部位的局部刺激性、降低毒性。由于本發(fā)明不含有聚氧乙烯蓖麻油及其他任何有機(jī)溶劑，避免了可能發(fā)生的過(guò)敏反應(yīng)或毒性反應(yīng)。其中含有的維生素E (生育酚)對(duì)紫杉醇有很好的溶解性，同時(shí)又具有提高人體免疫功能和防癌抗癌作用，與紫杉醇合用可以起到增強(qiáng)療效的作用。處方中的聚乙二醇修飾磷脂可以在納米粒表面形成一層水分子膜，減少吞噬細(xì)胞對(duì)納米粒的消除作用，延長(zhǎng)制劑在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，達(dá)到長(zhǎng)循環(huán)目的。同時(shí)，本制劑具有較強(qiáng)的克服腫瘤耐藥的特征，呈現(xiàn)較強(qiáng)的腫瘤治療功效。本發(fā)明根據(jù)傳統(tǒng)已有的產(chǎn)品，結(jié)合藥劑學(xué)發(fā)展前沿成果，提供了集科學(xué)性、實(shí)用性、新穎性、易于生產(chǎn)等特點(diǎn)為一身的制劑。本發(fā)明提供的一種新型紫杉醇靜脈脂質(zhì)納米粒注射液(注射用)，克服了現(xiàn)有的紫杉醇注射液制劑的缺點(diǎn)，這種制劑不含有任何有機(jī)溶劑，不含有對(duì)人體有毒性、刺激性的的溶劑，對(duì)人體無(wú)刺激性、無(wú)致敏性?？上F(xiàn)有制劑由于處方問(wèn)題帶來(lái)的不良反應(yīng)，達(dá)到安全、高效的治療目的。同時(shí)，這種新型的紫杉醇靜脈脂質(zhì)納米粒注射液具有優(yōu)良的克服腫瘤耐藥性的特點(diǎn)，這將極大提升紫杉醇對(duì)目前眾多腫瘤治療的功效。


圖I為粒子示意圖，其中I為水化層，2為聚乙二醇親水長(zhǎng)鏈，3為油性內(nèi)核，4為紫杉醇藥物；其中I為水化層，2為聚乙二醇親水長(zhǎng)鏈，3為油性內(nèi)核，4為紫杉醇藥物。圖2是制備工藝圖?！?圖3是納米粒粒徑分布圖。圖4是載藥納米粒的96h體內(nèi)分布圖譜。圖5是給藥后96h動(dòng)物體內(nèi)藥物在各器官的分布。圖6是模型動(dòng)物SK0V-3細(xì)胞腫瘤體積經(jīng)時(shí)變化。圖7是實(shí)驗(yàn)結(jié)束后模型動(dòng)物取出的實(shí)體瘤的平均重量。圖8是游離紫杉醇藥物對(duì)SK0V-3及耐藥細(xì)胞ST-30的毒性。圖9是載紫杉醇納米粒對(duì)SK0V-3及ST-30細(xì)胞的毒性。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例I 紫杉醇制劑的處方及制備工藝 處方I :
紫杉醇 I %
油酸 0.8%
磷脂 2 %
維生素E 5 %
膽固醇 I %
DSPE-PEG2000 O. 5%
鹿糖 10%
EDTA O. 5%
其余為注射用水。制備方法I :
(1)將處方量的維生素E、磷脂、油酸、膽固醇、DSPE-PEG2000、紫杉醇溶于適量無(wú)水乙醇中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得脂質(zhì)相；
(2)將蔗糖、EDTA、混合于注射用水，磁力攪拌直至各部分溶解，得水相；
(3)脂質(zhì)相60°C加熱攪拌下，水相逐滴加入脂質(zhì)相，快速攪拌lOmin，得乳白色初乳；
(4)將初乳至于高壓乳勻機(jī)中，于4°C下，以1500bar壓力均質(zhì)20次循環(huán)，至平均粒徑在150nm左右，將此乳劑灌封于輸液瓶中，充氮，置于蒸汽旋轉(zhuǎn)滅菌器中，滅菌，得紫杉醇納米粒。粒子示意圖參見(jiàn)圖1，制備工藝圖參見(jiàn)圖2。理化性質(zhì)
由粒徑儀測(cè)得脂質(zhì)納米粒粒徑結(jié)果為Size 94. 2nm，納米粒粒徑分布圖參見(jiàn)圖3。根據(jù)標(biāo)記熒光染料指示體內(nèi)分布的結(jié)果顯示(圖4)，大部分藥物集中于腫瘤部位，說(shuō)明本產(chǎn)品具有腫瘤靶向性。隨著時(shí)間延長(zhǎng)藥量在腫瘤部位逐漸濃集，并且在96小時(shí)仍有大量的藥物存在于腫瘤部位，說(shuō)明藥物沒(méi)有被吞噬細(xì)胞清除，達(dá)到了體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)的效果。藥物在不同器官的分布結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明可以使藥物在腫瘤部位靶向濃集，參見(jiàn)圖5。模型動(dòng)物的體內(nèi)藥效學(xué)結(jié)果顯示相比于市售紫杉醇制劑，本制劑能夠更好地抑制腫瘤生長(zhǎng)，并且具有緩釋效果，參見(jiàn)圖6、圖7?？朔[瘤耐藥性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的制劑可以較明顯地克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性，使得本制劑對(duì)耐藥細(xì)胞的耐藥倍數(shù)明顯減小(圖8、圖9)。實(shí)施例2 處方2
紫杉醇 O. 5% 油酸 0.65%
卵磷脂 2.6%
維生素E 6 %
DSPE-PEG2000 1%
鹿糖 10.4%
膽酸鈉 O. 7%
EDTA O. 1%
其余為注射用水。制備方法2
(1)將處方量的維生素E、卵磷脂、油酸、紫杉醇、DSPE-PEG2000溶于適量無(wú)水乙醇中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得脂質(zhì)相；
(2)將蔗糖、膽酸鈉、EDTA混合于注射用水，磁力攪拌直至各部分溶解，得水相；
(3)脂質(zhì)相60°C加熱攪拌下，水相逐滴加入油相，快速攪拌lOmin，得乳白色初乳；
(4)將初乳至于高壓乳勻機(jī)中，以1100-1200bar壓力均質(zhì)15-30循環(huán)，至平均粒徑在150nm左右，將此乳劑灌封于輸液瓶中，充氮，置于蒸汽旋轉(zhuǎn)滅菌器中，滅菌，得紫杉醇納米粒。實(shí)施例3
處方3
紫杉醇 3 %
油酸 2.4%
卵磷脂 4 %
維生素E 15 %
膽固醇 1.2%
DSPE-PEG2000 1%蔗糖 10.05%
膽酸鈉 O. 7%
EDTA O. 5%
其余為注射用水。
制備方法3
(1)將處方量的維生素E、卵磷脂、油酸、紫杉醇、膽固醇、DSPE-PEG2000溶于適量無(wú)水乙醇中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得脂質(zhì)相；
(2)將蔗糖、膽酸鈉、EDTA混合于注射用水，磁力攪拌直至各部分溶解，得水相；
(3)脂質(zhì)相60°C加熱攪拌下，水相逐滴加入油相，快速攪拌lOmin，得乳白色初乳；
(4)將初乳至于高壓乳勻機(jī)中，以1100-1200bar壓力均質(zhì)15-30循環(huán)，至平均粒徑在150nm左右，將此乳劑灌封于輸液瓶中，充氮，置于蒸汽旋轉(zhuǎn)滅菌器中，滅菌，得紫杉醇納米粒。實(shí)施例4
處方4
紫杉醇 2 %
油酸 I %
卵磷脂 5.44%
維生素E 6. 4%
膽固醇 0.5%
DSPE-PEG2000 2%
鹿糖 11.8%
膽酸鈉 2. 2%
泊洛沙姆188 4. 4%
EDTA O. 5%
其余為注射用水。制備方法4
(1)將處方量的維生素E、卵磷脂、油酸、紫杉醇、DSPE-PEG2000溶于適量無(wú)水乙醇中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得脂質(zhì)相；
(2)將蔗糖、膽酸鈉、泊洛沙姆188、EDTA混合于注射用水，磁力攪拌直至各部分溶解，得水相；
(3)脂質(zhì)相60°C加熱攪拌下，水相逐滴加入油相，快速攪拌lOmin，得乳白色初乳；
(4)將初乳至于高壓乳勻機(jī)中，以1100-1200bar壓力均質(zhì)15-30循環(huán)，至平均粒徑在150nm左右，將此乳劑灌封于輸液瓶中，充氮，置于蒸汽旋轉(zhuǎn)滅菌器中，滅菌，得紫杉醇納米粒。實(shí)施例5
處方5
紫杉醇 I %
油酸 I %卵磷脂 2. 5%
大豆油 5. 2%
DSPE-PEG2000 O. 5%
鹿糖 15 %
膽酸鈉 O. 7%
EDTA O. 1%
其余為注射用水。
制備方法5
(1)將處方量的大豆油、卵磷脂、油酸、紫杉醇、DSPE-PEG2000溶于適量無(wú)水乙醇中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得脂質(zhì)相；
(2)將蔗糖、膽酸鈉、EDTA混合于注射用水，磁力攪拌直至各部分溶解，得水相；
(3)脂質(zhì)相60°C加熱攪拌下，水相逐滴加入油相，快速攪拌lOmin，得乳白色初乳；
(4)將初乳至于高壓乳勻機(jī)中，以1100-1200bar壓力均質(zhì)15-30循環(huán)，至平均粒徑在150nm左右，將此乳劑灌封于輸液瓶中，充氮，置于蒸汽旋轉(zhuǎn)滅菌器中，滅菌，得紫杉醇納米粒。上述實(shí)施例2-5處方制備的樣品理化性質(zhì)指標(biāo)如下
I實(shí)例2 I實(shí)例3 I實(shí)例4 I實(shí)例I 粒徑 87. 3nm 153. 2nm 137. 4nm 90. 5nm 龜位|-20. 5 1-22.7 1-19.5 |-21.1 ~
權(quán)利要求
1.一種具抗腫瘤活性的紫杉醇脂質(zhì)納米粒注射液，其特征在于，該注射液的重量百分比組成是 紫杉醇O. 1%-5% 脂質(zhì)材料 5%-50% 表面活性劑 1%_25% 穩(wěn)定劑5%-20% 金屬離子螯合劑 O. 1%-1% 其余為注射用水； 其中脂質(zhì)材料選用維生素E、精制植物油、動(dòng)物油中的一種或其中任幾種的混合物；表面活性劑選用磷脂、聚乙二醇修飾磷脂、吐溫、泊洛沙姆、司盤(pán)、油酸、油酸鈉中的一種或其中任幾種的混合物；穩(wěn)定劑選用蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘氨酸、谷氨酸、山梨醇、甘露醇的一種或其中任幾種的混合物；金屬離子螯合劑選用乙二胺四乙酸二鈉鹽、乙二胺四乙酸鈉鈣鹽中的一種或其混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種具抗腫瘤活性的紫杉醇脂質(zhì)納米粒注射液，其特征在于，該注射液的重量百分比組成是 紫杉醇O. 1%-4% 脂質(zhì)材料 5%-30% 表面活性劑 3%-15% 穩(wěn)定劑 5%-15% 金屬離子螯合劑O. 1%-1% 其余為注射用水； 其中脂質(zhì)材料、表面活性劑、穩(wěn)定劑、金屬離子螯合劑的定義同權(quán)利要求I。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種具抗腫瘤活性的紫杉醇脂質(zhì)納米粒注射液，其特征在于，該注射液的重量百分比組成是 紫杉醇O. 5%-3% 脂質(zhì)材料 5%-25% 表面活性劑 3%-15% 穩(wěn)定劑 5%-15% 金屬離子螯合劑O. 1%-0. 5% 其余為注射用水； 其中脂質(zhì)材料、表面活性劑、穩(wěn)定劑、金屬離子螯合劑的定義同權(quán)利要求I。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的一種具抗腫瘤活性的紫杉醇脂質(zhì)納米粒注射液的制備方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn) (1)脂質(zhì)相的制備將處方量的脂質(zhì)、溶于脂質(zhì)的表面活性劑、聚乙二醇修飾磷脂、紫杉醇溶于適量無(wú)水乙醇中，減壓蒸發(fā)除去乙醇，得脂質(zhì)相； (2)水相的制備將溶于水相的表面活性劑、穩(wěn)定劑、金屬離子螯合劑混合于注射用水，攪拌直至各部分溶解，得水相； (3)初乳的制備脂質(zhì)相60°C加熱攪拌下，水相逐滴加入油相，得乳白色初乳； (4)脂質(zhì)納米粒的制備將初乳至于高壓乳勻機(jī)中，在0-10°C下，以1000-1500bar壓力均質(zhì)15-30循環(huán)，至平均粒徑在150nm左右，得脂質(zhì)納米粒，將此乳劑灌封于輸液瓶中，充氮，置于蒸 汽旋轉(zhuǎn)滅菌器中，滅菌，得紫杉醇納米粒。
全文摘要
本發(fā)明提供一種紫杉醇脂質(zhì)納米粒注射液，包括紫杉醇藥物、脂質(zhì)材料、注射用水、表面活性劑、穩(wěn)定劑、金屬離子螯合劑。本發(fā)明將大部分藥物包裹于脂質(zhì)內(nèi)部，避免了藥物與血液或其他體液的直接接觸，降低了藥物對(duì)注射部位的局部刺激性、降低毒性。不含有任何有機(jī)溶劑，不含有對(duì)人體有毒性、刺激性的溶劑，對(duì)人體無(wú)刺激性、無(wú)致敏性?？上F(xiàn)有制劑由于處方問(wèn)題帶來(lái)的不良反應(yīng)，達(dá)到安全、高效的治療目的。同時(shí)，這種新型的紫杉醇注射液具有優(yōu)良的克服腫瘤耐藥性的特點(diǎn)，這將極大提升紫杉醇對(duì)目前眾多腫瘤治療的功效。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102871963SQ201210399959
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者虞和永, 游劍, 李云龍, 胡富強(qiáng), 袁弘, 杜永忠 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)