專利名稱：嵌合抗原受體hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物與新醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。具體說是一種嵌合抗原受體hF vn L-⑶8-0X40-⑶3 ζ的制備及其用他途。其制備涉及利用分子生物學(xué)技術(shù)將編碼人凝血因子VII輕鏈(human factor VII light chain, hFVIIL)、0)8的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)及0X40和CD3 ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列依次連接起來，得到編碼嵌合抗原受體hF YD L-⑶8-0X40-⑶3 ζ的融合基因片段，并在其5’末端插入信號肽Ig κ的編碼序列。然后將該基因片段插入慢病毒表達(dá)載體，包裝成慢病毒。利用該慢病毒感染人T細(xì)胞，使T細(xì)胞表達(dá)該嵌合抗原受體。這種T細(xì)胞能夠識別腫瘤細(xì)胞表面的組織因子，用于腫瘤治療。
背景技術(shù)：
嵌合抗原受體是模擬T細(xì)胞受體功能的人工受體，由抗原識別結(jié)構(gòu)域(配體或單 鏈抗體)和T細(xì)胞的一系列信號結(jié)構(gòu)域依次連接而成。利用嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞能夠?qū)⑴潴w或抗體的特異性識別作用與T細(xì)胞的效應(yīng)功能聯(lián)合起來，進(jìn)行腫瘤靶向免疫治療。此療法是對人體自身T細(xì)胞加以改造后用于治療，相對于放、化療，其毒副作用較弱。由于嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞通過其抗原識別結(jié)構(gòu)域識別腫瘤細(xì)胞表面抗原，然后啟動殺傷作用，因此其治療具有靶向性。由于該種T細(xì)胞通過其嵌合抗原受體直接識別腫瘤細(xì)胞表面抗原，然后通過其信號結(jié)構(gòu)域直接將識別信號傳遞至胞內(nèi)，激活T細(xì)胞的殺傷活性，因此可以繞開常規(guī)細(xì)胞免疫的主要組織相容復(fù)合體(MHC)限制性，從而有效克服腫瘤細(xì)胞MHC表達(dá)量低造成的免疫逃逸，并可以靶向非蛋白質(zhì)腫瘤抗原。組織因子(TF)高表達(dá)于多種惡性腫瘤細(xì)胞(肺癌、乳腺癌、肝癌等)及腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，而在正常細(xì)胞及正常血管內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)。因此，TF是腫瘤靶向治療的潛在位點(diǎn)。凝血因子VII是TF的天然配體，其與TF結(jié)合的親和力(以Kd值表示)可達(dá)10_12Μ，而目前報(bào)道的抗TF抗體與TF的親和力僅為10_8-10_9 M0正常生理情況下，活化的凝血因子VII由N端的輕鏈和C端的重鏈兩部分構(gòu)成，輕鏈主要負(fù)責(zé)受體結(jié)合活性，重鏈主要負(fù)責(zé)凝血酶活性。因此，人凝血因子VII輕鏈(human factor W light chain,hF VII L)可以作為針對組織因子的抗腫瘤藥物的靶向載體。嵌合抗原受體靶點(diǎn)識別結(jié)構(gòu)域的靈活性及其與T細(xì)胞表面的空間距離，對于嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞的特異殺傷活性至關(guān)重要。⑶8是⑶8+ T細(xì)胞表面的一個(gè)天然Marker，其hinge區(qū)是一個(gè)柔性區(qū)域。因此，其hinge區(qū)和跨膜區(qū)可以用來連接嵌合抗原受體的靶點(diǎn)識別結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域。⑶3分子通過鹽橋與T細(xì)胞受體(TCR)相連，其胞內(nèi)段含有三個(gè)免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)，TCR識別并結(jié)合由MHC分子提呈的抗原肽后，導(dǎo)致⑶3的ITAM的酪氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而激活T細(xì)胞。因此，CD3分子是T細(xì)胞活化過程中的重要分子，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域是T細(xì)胞活化所必需的。0X40是T細(xì)胞的共刺激分子，它與T細(xì)胞中的受體結(jié)合后可以有效阻止T細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞因子的生產(chǎn)，對維持T細(xì)胞的殺傷活性，提升T細(xì)胞的存活能力具有重要作用。因此，在嵌合抗原受體中加入共刺激分子0X40對于增強(qiáng)嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞的存活能力，增強(qiáng)其腫瘤細(xì)胞殺傷活性具有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種嵌合抗原受體hF W L-⑶8-0X40-⑶3 ζ ,它是一種融合蛋白。該嵌合抗原受體由人凝血因子VII輕鏈、⑶8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及0X40和⑶3 ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。該嵌合抗原受體的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. I所示。該嵌合抗原受體含有針對人組織因子的人凝血因子VII輕鏈，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 3所示。該嵌合抗原受體以⑶8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及0X40和⑶3 ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4所示。該嵌合抗原受體的編碼基因能夠被轉(zhuǎn)移至T細(xì)胞內(nèi)，用于修飾T細(xì)胞；利用該嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞，能夠通過識別腫瘤細(xì)胞表面的組織因子，殺死腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行腫瘤治療。 本發(fā)明通過基因合成技術(shù)合成由編碼⑶8的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)及0X40和⑶3 ζ胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列構(gòu)成的融合基因片段⑶8-0X40-⑶3 ζ。通過巢式PCR在人凝血因子VII輕鏈的5’端加上Ig κ信號肽編碼序列，得到融合基因序列IGK-hFVDL。然后通過重疊延伸PCR技術(shù)將融合基因片段IGK-hF YD L和⑶8-0X40-⑶3 ζ拼接成編碼嵌合抗原受體 hF VD L-CD8-0X40-CD3 ζ 的融合基因片段，命名為 IGK_hF W L-CD8-0X40-CD3 ζ。然后將該融合基因片段插入慢病毒表達(dá)載體中，包裝成攜帶IGK-hF W L-⑶8-0X40-⑶3 ζ編碼基因的慢病毒。利用該慢病毒感染T細(xì)胞，使T細(xì)胞表達(dá)該嵌合抗原受體。通過LDH細(xì)胞毒性分析實(shí)驗(yàn)證明該嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞具有特異殺傷作用。因此本發(fā)明所述的嵌合抗原受體hF W L-⑶8-0X40-⑶3 ζ可在腫瘤治療中應(yīng)用。


圖I是本發(fā)明所述的在人凝血因子Vn輕鏈(hF vn L)編碼基因的5’端加上Ig K信號肽編碼序列的3次巢式PCR擴(kuò)增電泳圖，圖中，I泳道DNA分子量標(biāo)記；2泳道用Pl和P4進(jìn)行第一次巢式PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物(482 bp) ；3泳道用引物P2和P4進(jìn)行第二次巢式PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物(509 bp)；4泳道用引物P3和P4進(jìn)行第三次巢式PCR擴(kuò)增得到的融合基因片段 IGK-hF VIIL (537 bp)；圖2是本發(fā)明所述編碼嵌合抗原受體IGK-hF W L-CD8-0X40-CD3 ζ的融合基因全長序列擴(kuò)增電泳圖，圖中，I泳道=DNA分子量標(biāo)記；2泳道編碼IGK-hF YD L的DNA片段(537 bp) ;3泳道編碼CD8-0X40-CD3 4的DNA片段(661 bp) ;4泳道編碼嵌合抗原受體IGK-hF YD L-CD8-0X40-CD3 ζ 的融合基因片段(1198 bp)。圖3是本發(fā)明所述的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒(pLVX-IGK-hF W L-CD8-0X40-CD3 ζ )的示意圖，其中，逆時(shí)針序列為正向基因片段，順時(shí)針為反向基因片段。圖4是本發(fā)明所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒PLVX-IGK-hF W L-CD8-0X40-CD3 ζ的限制性內(nèi)切酶酶切片段電泳鑒定圖，其中，I泳道DNA分子量標(biāo)記；2泳道慢病毒表達(dá)質(zhì)粒 pLVX-IGK-hF YD L-CD8-0X40-CD3 ζ (9390 bp) ;3 泳道用限制性內(nèi)切酶 EcoR I和Xba I雙酶切慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLVX-IGK-hF W L-CD8-0X40-CD3 ζ后所得到的編碼IGK-hF YD L-CD8-0X40-CD3 ζ 的 DNA 片段(1198 bp)和載體片段(8192 bp)；圖5是流式檢測嵌合抗原受體hF W L-⑶8-0X40-⑶3 ζ在T細(xì)胞中的表達(dá)效率圖。圖6是Western blot檢測人肺癌細(xì)胞NCI-H292、人乳腺癌MDA-MB-231、人結(jié)腸癌HCT-116、人肺癌A549、人成纖維細(xì)胞BJ和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中組織因子的表達(dá)量。圖7是本發(fā)明所述的嵌合抗原受體hF W L-⑶8-0X40-⑶3 ζ修飾的 T細(xì)胞對人肺癌細(xì)胞NCI-H292殺傷作用的LDH實(shí)驗(yàn)分析圖，其中，-^-CAR-TceIIs :嵌合抗原受體hF VD L-CD8-0X40-CD3 ζ修飾的T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組;爺T cells :不加修飾的T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組。圖8是本發(fā)明所述的嵌合抗原受體hF W L-⑶8-0X40-⑶3 ζ修飾的T細(xì)胞對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7殺傷作用的LDH細(xì)胞毒性分析圖，其中，■ Ε/Τ=10:1 :效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的數(shù)目比為10:1; O Ε/Τ=3:1 :效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的數(shù)目比為3:1 ;CAR-T:嵌合抗原受體hFVIIL-⑶8-0X40-⑶3 ζ修飾的T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組；GFP_T :對照病毒修飾的T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組；T :不加修飾的T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :嵌合抗原受體hF W L-⑶8-0X40-⑶3 ζ的慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建(一)融合基因片段IGK-hF VIIL-CD8-0X40-CD3 4 的制備Pl: 5’ -GCCAGCGTGATCATGAGCCGCGGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTG -3’Ig κ 信號肽hFVIILP 2: 5，-GCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATCAGCGCCAGCGTGATCATGAGCCGC-3，Ig κ信號肽P 3: 5， -ATATCTCGAGCCACCATGGACTTCCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCCTGC-3，EcoR IIg κ 信號肽P 4: 5， -GTGGTCGCGGCGCTGGCGTCGTGGTTCGGCCTTGGGGTTTGCTGGCATT-3>CD8 hingehF VIILP 5: 5， -AATGCCAGCAAACCCCAAGGCCGAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCAC-3，hF W LCD8 hingeP 6: 5， -AATT TCTAGATCAGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATGTG-3>Xba I0)3ζ以上引物由華大基因科技有限公司合成。以編碼人凝血因子VII的cDNA片段(ΝΜ_000131，購自廣州復(fù)能基因有限公司)為模板，用引物Pl和Ρ4進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，得到長482 bp的DNA片段。PCR反應(yīng)條件參照Primerstar DNA聚合酶(購自Takara公司)的說明書，反應(yīng)體系(50ul)如下雙蒸水31.5ul5 X 反應(yīng) buffer : IOuldNTP Mix 4ulPl (IOmM) : IulP4 (IOmM) : Iul人凝血因子YDcDNA (100ng/ul) 2ul
Primer star DNA 聚合酶0. 5ul將上述第一次PCR的產(chǎn)物跑I. 5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA片段回收試劑盒(購自天根生化科技有限公司)進(jìn)行DNA片段回收，具體方法見說明書。分別用P2/P4和P3/P4兩對引物，以前一次PCR產(chǎn)物為模板重復(fù)上述PCR操作，最終得到長度為537 bp的DNA片段，該DNA片段依次包含編碼Ig κ信號肽和人凝血因子VII輕鏈的編碼序列，并在5’端加上EcoR I的酶切位點(diǎn)。將該DNA片段命名為IGK-hF W L(見圖I)。(二)融合基因片段 IGK-hF VIIL-CD8-0X40-CD3 4 的制備構(gòu)建含有CD8的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)及0X40和CD3 ζ胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域編碼序列的質(zhì)粒 PUC57-CD8-0X40-CD3 ζ (CD8-0X40-CD3 ζ 的 DNA 編碼序列見序列表 SEQ ID NO. 5)，以其為模板，以引物Ρ5和Ρ6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長661 bp的DNA片段，P6中引入Xba I的酶 切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)條件參照Primer star DNA聚合酶(購自Takara公司)的說明書，反應(yīng)體系(50ul)如下雙蒸水31.5ul5 X 反應(yīng) buffer : IOuldNTP Mix 4ulP5 (IOmM) : IulP6 (IOmM) : IulpUC57-CD8-0X40-CD3 ζ (lOOng/ul) 2ulPrimer star DNA 聚合酶0. 5ul將上述PCR產(chǎn)物跑1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA片段回收試劑盒(購自天根生化科技有限公司)進(jìn)行DNA片段回收，具體方法按說明書進(jìn)行。得到編碼CD8的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)及0X40和⑶3 ζ胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域的DNA片段，命名為⑶8-0X40-⑶3 ζ。以回收得到的IGK-hF VIIL和CD8-0X40-CD3 ζ DNA片段為模板，用引物Ρ4和Ρ6進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增得到長度1198 bp，含有Ig κ信號肽、人凝血因子VII輕鏈、⑶8的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)及0X40和CD3 ζ胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域的DNA片段，命名為IGK-hF YD L-CD8-0X40-CD3 ζ(見圖2)。PCR反應(yīng)條件參照Primer star DNA聚合酶(Takara公司)的說明書，反應(yīng)體系(50ul)如下雙蒸水31.5ul5 X 反應(yīng) buffer : IOuldNTP Mix 4ulP3 (IOmM) : IulP6 (IOmM) : IulIGK- hF W L DNA 片段(lOOng/ul) lulCD8-0X40-CD3 ζ DNA 片段(lOOng/ul) lulPrimer star DNA 聚合酶0. 5ul(三)將融合基因片段IGK-hFW L-CD8-0X40-CD3 ζ插入慢病毒表達(dá)載體pLVX-IRES-puro將融合基因片段IGK-hF W L-CD8-0X40-CD3 ζ和慢病毒表達(dá)載體pLVX-IRES-ZsGreen(購自 Clontech 公司)用限制性內(nèi)切酶 EcoR I 和 Xba 1(購自 Fermentas公司)分別進(jìn)行雙酶切，具體方法見說明書。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用瓊脂糖凝膠DNA片段回收試劑盒(購自天根生化科技有限公司)進(jìn)行DNA片段回收，具體方法按說明書進(jìn)行。將回收的融合基因片段和載體片段通過T4連接酶(購自Fermentas公司)進(jìn)行連接，具體方法見說明書。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a，37°C培養(yǎng)后挑取單克隆，37°C培養(yǎng)12 h后用質(zhì)粒提取試劑盒(購自天根生化科技有限公司)提取質(zhì)粒，具體方法見說明書。提取的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I雙酶切鑒定(見圖3)。將鑒定正確的質(zhì)粒送華大基因科技有限公司對插入的融合基因片段進(jìn)行測序。將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為 pLVX-hF W L-CD8-0X40-CD3 ζ (見圖 4 )。實(shí)施例2 :嵌合抗原受體hF W L-CD8-0X40-CD3 ζ修飾的T細(xì)胞的制備(一)慢病毒的包裝制備
用QIAGEN公司的質(zhì)粒提取試劑盒(Catalog no. 12662)分別提取慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLVX-hF W L-CD8-0X40-CD3 ζ和輔助質(zhì)粒psPAX2、pMD2. G。三種質(zhì)粒以4:3:1的比例用lipo2000轉(zhuǎn)染試劑(購自Invitrogen公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,具體方法見lipo2000轉(zhuǎn)染試劑說明書。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將含有病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清吸入EP管中，4 V 2000 g離心10 min,轉(zhuǎn)移上清至新EP管中，4. 5 μ m濾器過濾后-80 °C保存。(二)T細(xì)胞的制備取10 ml健康人的新鮮血液，用淋巴細(xì)胞分離液(購自Mediatech公司)分離外周血單核細(xì)胞，具體方法見說明書。用含有300 IU/ml的IL-2、50 ng/ml的0KT-3和5%人AB血清(購自Invitrogen公司)的AIM-V培養(yǎng)基(購自Invitrogen公司)誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h,得到T細(xì)胞。(三)慢病毒感染T細(xì)胞及感染后T細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)從-80°C取出2 ml病毒液，加入終濃度為8 μ g/ml的聚凝胺(購自Sigma公司)，用該病毒液重懸I X IO6個(gè)上述誘導(dǎo)培養(yǎng)的T細(xì)胞。將細(xì)胞懸液加入24孔板的I個(gè)孔中，1000g，32°C，離心I h0 37°C, 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8 h后，lOOOg，32°C，再次離心I h。吸棄I. 4 ml培養(yǎng)上清，加入I. 4 ml新鮮的含有300 IU/ml的IL_2、50 ng/ml的0KT-3和5%人AB血清的AIM-V培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。每2-3天檢測一次細(xì)胞濃度，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到2 X IO6個(gè)/ml時(shí)，lOOOg，32°C，離心I h。吸取I ml細(xì)胞懸液，加入另一個(gè)孔中，分別向兩個(gè)孔中加入I ml新鮮的含有300 IU/ml的IL-2和5%人AB血清的AM-V培養(yǎng)基，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。如此反復(fù)，直至細(xì)胞擴(kuò)增至足夠的用量。(四)流式細(xì)胞術(shù)檢測嵌合抗原受體hFW L-⑶8-0X40-⑶3 ζ在T細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)效
率取IX IO6個(gè)上述慢病毒感染后并擴(kuò)增的T細(xì)胞和未感染的T細(xì)胞，1000 rpm離心5 min，重懸于80 μ PBS中，加入20 μ FITC標(biāo)記的山羊抗人IgG，F(xiàn) (ab’)2抗體(構(gòu)自eBioscience)，4°C孵育30 min，PBS洗滌細(xì)胞兩次，I ml PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測嵌合抗原受體hF W L-CD8-0X40-CD3 ζ在T細(xì)胞表面的表達(dá)效率為45. 2% (見圖5)。實(shí)施例3 :嵌合抗原受體hF W L-⑶8-0X40-⑶3 ζ修飾的T細(xì)胞的抗腫瘤作用(一)Western Blot檢測人腫瘤細(xì)胞表面組織因子的表達(dá)量取對數(shù)生長期的人肺癌細(xì)胞NCI-H292、人乳腺癌MDA-MB-231、人結(jié)腸癌HCT-116、人肺癌A549、人成纖維細(xì)胞BJ和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，PBS洗細(xì)胞3次，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，4°C,3000 rpm離心5 min收集細(xì)胞沉淀,加入300 μ I lysis buffer(20 mM Tris-HCl,PH 7.9，150 mM NaCl，10 mM KCl，O. 5 mM EDTA，0. 5% NP-40,10% Glycerol, I. 5 mM MgCl2,
0.5 mM PMSF, 2 mM DTT,2. 5 mM CaCl2)，冰上裂解 10 min，渦旋振蕩，2 min/次，共 5 次，17000g 4°C離心5 min，吸取上清。取適量上清液，用山羊抗人組織因子的單克隆抗體進(jìn)行western blot檢測，以β-actin為內(nèi)參。結(jié)果顯示組織因子在人肺癌細(xì)胞NCI-H292、人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，在人結(jié)腸癌HCT-116、人肺癌A549、人成纖維細(xì)胞BJ低表達(dá)，在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中不表達(dá)(見圖6)。(二)LDH釋放分析檢測嵌合抗原受體hF W L-CD8-0X40-CD3 ζ修飾的T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性分別取5 X IO4個(gè)人肺癌NCI-H292細(xì)胞(高表達(dá)組織因子)和人成纖維細(xì)胞BJ接種于96孔板，過夜培養(yǎng)后，分別向兩種細(xì)胞培養(yǎng)孔中按效應(yīng)細(xì)胞(E):靶細(xì)胞(Τ)=10、3的比例加入嵌合抗原受體hF W L-⑶8-0X40-⑶3 ζ修飾的T細(xì)胞(CAR-T)，對照病毒修飾的T 細(xì)胞(GFP-T)和未加修飾的T細(xì)胞(T)。共孵育5 h后，按照LDH細(xì)胞毒性分析試劑盒(購自Cayman Chemical公司)說明書進(jìn)行操作，檢測嵌合抗原受體hF W L-CD8-0X40-CD3 ζ修飾的T細(xì)胞對人肺癌NCI-H292細(xì)胞的特異殺傷活性。結(jié)果顯示嵌合抗原受體hF VD L-CD8-0X40-CD3 ζ修飾的T細(xì)胞(CAR-T)與對照組T細(xì)胞(GFP-T組和T細(xì)胞組)相t匕，在效靶比為10:1和3:1的情況下，對高表達(dá)TF的人肺癌NCI-H292細(xì)胞都具有更強(qiáng)的殺傷作用，且這種差異具有顯著性(P〈0. 05)(見圖7);對低表達(dá)TF的人成纖維細(xì)胞BJ的殺傷作用無顯著性差異(P>0. 05)(見圖8)。因此嵌合抗原受體hF W L-CD8-0X40-CD3 ζ修飾的T細(xì)胞對高表達(dá)TF的腫瘤細(xì)胞具有特異殺傷活性。
權(quán)利要求
1.一種嵌合抗原受體hFVDL-⑶8-0X40-⑶3 ζ，其特征在于該嵌合抗原受體由肽人凝血因子VII輕鏈、⑶8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及0X40和⑶3 ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。
2.如權(quán)利要求I所述的嵌合抗原受體hFVIIL-⑶8-0X40-⑶3 ζ，其特征在于該嵌合抗原受體的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. I所示。
3.如權(quán)利要求I所述的嵌合抗原受體hFVIIL-⑶8-0X40-⑶3 ζ，其特征在于該嵌合抗原受體含有針對人組織因子的人凝血因子Vn輕鏈，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 3所示。
4.如權(quán)利要求I所述的嵌合抗原受體hFVIIL-⑶8-0X40-⑶3 ζ，其特征在于該嵌合抗原受體以CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及0X40和CD3 ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4所示。
5.嵌合抗原受體hFYD L-⑶8-0X40-⑶3 ζ的用途，該嵌合抗原受體的編碼基因能夠被轉(zhuǎn)移至T細(xì)胞內(nèi)用于修飾T細(xì)胞，表達(dá)該嵌合抗原受體的T細(xì)胞用于腫瘤治療。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物與新醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。公開了一種嵌合抗原受體hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ及其用途。該嵌合抗原受體由人凝血因子Ⅶ輕鏈(human factor VII light chain，hFVIIL)、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及OX40和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。該嵌合抗原受體能用于修飾T細(xì)胞，修飾后的T細(xì)胞用于腫瘤的治療。
文檔編號A61P35/00GK102875685SQ20121037557
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者鄭駿年, 張青, 裴冬生, 楊潔, 李連濤, 李慧忠, 張寶福, 方琳, 趙鐵鎖, 程乾, 章龍珍 申請人:鄭駿年