具有aaagugc種子序列的微小rna在制備白介素8抑制劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種具有AAAGUGC種子序列的微小RNA在制備白介素8（interleukin8,IL8）抑制劑中的應(yīng)用。具有AAAGUGC種子序列的微小RNA能夠直接靶向IL8mRNA的3’非編碼區(qū)，有效抑制IL8的分泌，減少細(xì)胞內(nèi)源性IL8的產(chǎn)生。因此，具有AAAGUGC種子序列的微小RNA可作為內(nèi)源性IL8生成抑制劑用于預(yù)防或治療因IL8產(chǎn)生或增高所致的各種疾病或疾病狀態(tài)。
【專利說(shuō)明】具有AAAGUGC種子序列的微小RNA在制備白介素8抑制劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種具有AAAGUGC種子序列的微小RNA的新用途，尤其是一種具有AAAGUGC種子序列的微小RNA在制備白介素8抑制劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，也是腫瘤患者死亡的主要原因。1971年，F(xiàn)olkman等研究發(fā)現(xiàn):腫瘤血管生成是腫瘤迅速生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，其為腫瘤細(xì)胞輸送所需的氧氣和其他養(yǎng)分。目前研究認(rèn)為與腫瘤血管新生有關(guān)的分子很多，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFs)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(I3DGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGFP )、白介素8 (interleukin 8，IL8)等，其中，VEGF及其受體已經(jīng)成為腫瘤研究的熱點(diǎn)課題和抗腫瘤生物治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)，為腫瘤的臨床治療提供了新的治療途徑和有效藥物，是腫瘤治療理論上的一個(gè)重大突破。
[0003]趨化因子(chemokines)是指能吸引細(xì)胞向一定方向移行的小分子分泌性蛋白質(zhì)，是細(xì)胞因子超家族的成員，其中IL8是最早發(fā)現(xiàn)的趨化因子。在體內(nèi)，IL8的細(xì)胞來(lái)源較為廣泛，生理或病理的多種細(xì)胞刺激因素均可引發(fā)細(xì)胞IL8的表達(dá)，其中，脂多糖/內(nèi)毒素(LPS)、白介素1β (ILli3)、腫瘤壞死因子a (TNF_a)等炎性信號(hào)可刺激組織中的單核、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL8，缺氧、化療藥物、應(yīng)激等可刺激許多腫瘤細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞包括基質(zhì)細(xì)胞(血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等)和腫瘤浸潤(rùn)的白細(xì)胞等產(chǎn)生IL8，植物血凝素(PHA)、佛波酯(TPA或PMA)等誘導(dǎo)劑也可誘導(dǎo)IL8的產(chǎn)生，雌激素、雄激素、地塞米松等類固醇激素亦可影響IL8產(chǎn)生。此外，許多疾病狀態(tài)，其中在惡化和/或造成該疾病中涉及趨化因子IL8的過(guò)度表達(dá)。IL8與表達(dá)其受體的細(xì)胞特異性結(jié)合后，通過(guò)激活絲蘇氨酸激酶、蛋白酪氨酸激酶(PTK)及Rho-鳥苷三磷酸酶(Rho-GTPases)及其相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，通過(guò)調(diào)節(jié)多種基因及蛋白的表達(dá)發(fā)揮其生物學(xué)作用。IL8對(duì)中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞有趨化作用，同時(shí)對(duì)中性粒細(xì)胞還有激活作用，可誘導(dǎo)其脫顆粒、呼吸爆發(fā)等，對(duì)入侵的病原體發(fā)揮吞噬殺傷和清除作用，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。IL8與表達(dá)其受體的腫瘤細(xì)胞及腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合后，可影響內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成及內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖和生存，并在腫瘤局部還有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤浸潤(rùn)中性粒細(xì)胞移動(dòng)的作用。亦有研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物及應(yīng)激等引起的IL8反應(yīng)可能與腫瘤細(xì)胞的化療耐藥有關(guān)。因此，IL8的表達(dá)與腫瘤血管形成、腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。目前研究證實(shí)，趨化因子介導(dǎo)的疾病很多，包括:內(nèi)毒素性休克、感染性休克、缺血再灌注損傷、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、成人呼吸窘迫綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、血管生成等。近年研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、甚至腫瘤細(xì)胞等也可產(chǎn)生IL8，通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管形成等影響腫瘤細(xì)胞的增殖、存活及運(yùn)動(dòng)，在腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。因此，阻斷IL8的生物學(xué)作用有望成為新的腫瘤治療策略和手段。
[0004]眾所周知，IL8的生物學(xué)作用是通過(guò)IL8與其受體CXCRl (IL8RA)、CXCR2 (IL8RB)特異性結(jié)合并啟動(dòng)一系列胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。參與這些環(huán)節(jié)中的任一因素出現(xiàn)異常都會(huì)影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的正常進(jìn)行并影響最終的效應(yīng)，其中，IL8與其受體的數(shù)量和功能是決定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起始的關(guān)鍵。當(dāng)然，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的異常是否引起細(xì)胞功能的異?；蚣膊?，還要受細(xì)胞和機(jī)體代償調(diào)節(jié)功能的影響。目前臨床對(duì)感染性疾病的治療，除了應(yīng)用抗生素和激素外，主要著眼于趨化因子的作用。細(xì)胞因子抑制劑治療炎癥性疾病主要為單克隆抗體、天然受體拮抗劑等，IL8及其受體衍生物或抑制物已成為臨床研究的熱點(diǎn)。人們已經(jīng)制備并發(fā)明了多種IL8抑制劑，如抗IL8的單克隆抗體、IL8受體拮抗劑等，希望通過(guò)利用能與IL8特異性結(jié)合的抗IL8單克隆抗體或能與IL8受體CXCRl和/或CXCR2特異性結(jié)合的受體拮抗劑來(lái)阻斷IL8與其受體的相互作用，從而達(dá)到預(yù)防或治療由趨化因子IL8介導(dǎo)的疾病或疾病狀態(tài)的目的。但至今為止，人們對(duì)能抑制細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性IL8的抑制劑研究較少。
[0005]微小RNA (microRNAs，miRNAs)是一類長(zhǎng)度為19-25核苷酸(nt)的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，普遍存在于真核生物中。目前，miRNA的生物合成過(guò)程已被初步闡明:首先，核
基因組中miRNA基因在RNA聚合酶Π的作用下轉(zhuǎn)錄出具有帽子結(jié)構(gòu)、多聚腺苷酸尾、并有
莖一環(huán)結(jié)構(gòu)的初始miRNA(pr1-miRNA),后者被RNase III Drosha及其輔助因子Pasha /DGCB8構(gòu)成的復(fù)合體剪切成長(zhǎng)度約70nt的莖環(huán)狀前體miRNA (pre-miRNA), pre-miRNA在Ran-GTP依賴的核質(zhì)/細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin 5的作用下由核轉(zhuǎn)到胞質(zhì)中；然后，一種叫Dicer的核酶在反向激活的RNA結(jié)合蛋白(trans-activating region RNA- bindingprotein, TRBP)和AG02的協(xié)助下識(shí)別前體miRNA雙鏈的5'末端磷酸及3'末端突出，在RNA聚合酶III的參與下，在莖干的兩個(gè)螺旋轉(zhuǎn)彎處切成21~25 nt長(zhǎng)的雙鏈miRNA(miRNA: miRNA*)，隨后雙鏈miRNA在解旋酶(helicase)的作用下，最終形成成熟的單鏈miRNA (多數(shù)為miRNA，miRNA*通常被降解)并進(jìn)入核蛋白復(fù)合體并參與形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(miRNA-assoc iated RNA-1nduced silencing complex, miRISC)。成熟體 miRNA可與靶基因信使RNA (mRNA)的3’-非編碼區(qū)(3’-UTR)完全或不完全互補(bǔ)結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因mRNA降解和/或抑制靶基因的翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。目前，許多證據(jù)表明miRNAs在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，參與人體大約30%的基因調(diào)節(jié)，并與腫瘤、心血管疾病、肝病、免疫紊亂及代謝紊亂等多種疾病有關(guān)。
[0006]一般來(lái)說(shuō)，microRNA 5’ -端的2~8個(gè)堿基可與靶基因完全配對(duì)，這一段序列被稱之為microRNA的種子(seed)序列。具有“AAAGUGC”種子序列的人microRNAs,包括miR-17、miR_20ab、miR_106ab、miR_519d、miR-93 等，其序列分別由以下核苷酸組成:
hsa-miR-17 (MIMAT0000070)的序列為:
5’ -CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3’，(SEQ ID N0.1)
hsa-miR-20a (MIMAT0 000075)的序列為:
5’ -UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG-3’，(SEQ ID N0.2)
hsa-miR-106a (MIMAT0000103)的序列為:
5’ -AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3’，(SEQ ID N0.3)
hsa-miR-519d (MIMAT0002853)的序列為:
5’ -CAAAGUGCCUCCCUUUAGAGUG-3’，(SEQ ID N0.4)hsa-miR-93 (MIMAT0000093)的序列為:
5’ -CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG-3’，(SEQ ID N0.5)
目前，雖然關(guān)于微小RNA (包括具有AAAGUGC種子序列的微小RNA)的研究報(bào)道很多，但迄今為止還沒(méi)有關(guān)于具有AAAGUGC種子序列的微小RNA在制備白介素8抑制劑中應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明是發(fā)現(xiàn)了具有AAAGUGC種子序列的微小RNA可以與白介素8基因mRNA的3’非編碼區(qū)(3，UTR)593~600位置的GCACUUU (A)完全互補(bǔ)結(jié)合，即具有AAAGUGC種子序列的微小RNA可以直接靶向IL8 mRNA的3’非編碼區(qū)，調(diào)控IL8的表達(dá)，從而發(fā)明了一種具有AAAGUGC種子序列的微小RNA在制備趨化因子白介素8 (interleukin 8，IL8)抑制劑中的應(yīng)用。
[0008]將本發(fā)明所述的具有AAAGUGC種子序列的微小RNA如miR-17、miR-20a、miR-106a的模擬物轉(zhuǎn)染惡性腫瘤細(xì)胞如膀胱癌細(xì)胞T24及誘導(dǎo)分化處理的白血病細(xì)胞NB4，miR-17、miR-20a、miR-106a的模擬物均能減少細(xì)胞內(nèi)源性IL8的分泌，表明具有AAAGUGC種子序列的微小RNA可作為細(xì)胞內(nèi)源性IL8生成抑制劑在制備趨化因子白介素8抑制劑中應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明所述的具有AAAGUGC種子序列的微小RNA能夠減少細(xì)胞內(nèi)源性IL8的產(chǎn)生，可用于預(yù)防或治療因IL8產(chǎn)生或增高所致的各種疾病或疾病狀態(tài)，如炎癥、內(nèi)毒素性休克、感染性休克、缺血再灌注損傷、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、成人呼吸窘迫綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、血管生成及某些惡性腫瘤等，其中，尤其用于預(yù)防或治療某些能自分泌IL8的惡性腫瘤及在抗腫瘤治療如化療或應(yīng)激等狀態(tài)下IL8表達(dá)或產(chǎn)生增多的惡性腫瘤。`【具體實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例1:
1.1L8是miR-17的直接靶基因
首先，本發(fā)明通過(guò)在線microRNA靶基因分析軟件分析了 IL8 mRNA 3’ UTR上可能存在的microRNA結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):IL8 mRNA 3’ UTR中只包含I個(gè)miR-17的結(jié)合位點(diǎn)，位于593-600處，并且該結(jié)合位點(diǎn)在脊椎動(dòng)物中具有廣泛保守性。然后，構(gòu)建了包含miR-17結(jié)合位點(diǎn)的IL8的3’ UTR報(bào)告基因載體以及將上述結(jié)合位點(diǎn)突變的3’ UTR的報(bào)告基因載體。具體實(shí)驗(yàn)方法如下:
a.以NB4細(xì)胞的基因組DNA為模板，使用IL8 mRNA 3’ UTR的特異性引物IL8-3’UTR-F/R (序列見(jiàn)下)擴(kuò)增了 960-bp大小的截短的IL8 mRNA 3’ UTR，其中包含miR-17的結(jié)合位點(diǎn)。擴(kuò)增IL8 mRNA 3’ UTR的引物序列如下:
IL8-3’ UTR-F:TATTGTGTGGGTCTGTTGTA (SEQ ID N0.6)
IL8-3’ UTR-R:TATTGACTGTGGAGTTTTGG (SEQ ID N0.7),擴(kuò)增片段長(zhǎng) 960bp。
[0011]b.將a步驟所得的野生型IL8 mRNA 3’ UTR片段(960_bp)定向構(gòu)建到熒光素酶報(bào)告基因載體PS1-CHECK中的熒光素酶基因編碼區(qū)下游3’ UTR的多克隆酶切位點(diǎn)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-17是否通過(guò)該結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合到IL8 mRNA 3’ UTR進(jìn)而抑制IL8基因的表達(dá)，利用定點(diǎn)突變的技術(shù)，將miR-17的結(jié)合位點(diǎn)2，4，6和8位堿基進(jìn)行突變。IL8 mRNA3’ UTR保守位點(diǎn)的定點(diǎn)突變帶入引物序列為:
IL8-3’ UTR-mutant-F:
GTTGTGAGGACATGTGGAACCTCATAAAGTTTTTTCATCATAAC (SEQ ID N0.8)
IL8-3’ UTR-mutant-R:
GTTATGATGAAAAAACTTTATGAGGTTCCACATGTCCTCACAAC (SEQ ID N0.9)c.為了分析miR-17是否可以直接作用于IL8基因mRNA 3’ UTR并抑制IL8基因的表達(dá)，將構(gòu)建的IL8 mRNA 3’ UTR報(bào)告基因及其突變體分別與miR-17模擬物和陰性對(duì)照模擬物共轉(zhuǎn)染，檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)情況，進(jìn)而分析miR-17對(duì)IL8 mRNA 3’ UTR靶向情況。其中,miR-17模擬物和陰性對(duì)照模擬物(negative control, NC)均由RNA雙鏈構(gòu)成,其序列分別為:
MiR-17模擬物:
正義鏈:CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG (SEQ ID N0.10)
反義鏈:ACCUGCACUGUAAGCACUUUGUU (SEQ ID N0.11)
陰性對(duì)照(negative control, NC)模擬物:
正義鏈:UUCUCCGAAAGUGUCACGUTT (SEQ ID N0.12)
反義鏈:ACGUGACACGUUCGGAGAATT (SEQ ID N0.13)
具體方法如下:轉(zhuǎn)染前一天，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種2.0 X IO5個(gè)293T細(xì)胞，培養(yǎng)液體積為每孔500μ1。20小時(shí)后待細(xì)胞融合度達(dá)85~90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。先用50μ1的OPT1-MEM稀釋IOOng野生型或者突變形式的IL8 mRNA 3’UTR報(bào)告基因載體和IOOnmol miR-17模擬物或?qū)φ漳M物，然后再用50μ1的OPT1-MEM稀釋1.44μ1的Iipofectamine 2000,用槍頭輕輕混勻，室溫靜置5分鐘。將稀釋的Iipofectamine 2000吸出加入到稀釋的質(zhì)粒和RNA中，輕輕用槍頭混勻，室溫靜置20分鐘。然后將制備好的復(fù)合物輕輕滴入到每孔培養(yǎng)液中，動(dòng)作要輕柔，以免造成293Τ細(xì)胞與培養(yǎng)孔底脫離。加好復(fù)合物后，再將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板輕柔的前后左右震蕩混勻。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，收獲細(xì)胞進(jìn)行報(bào)告基因分析。將細(xì)胞培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)液棄去，在每孔中加入500μ1的預(yù)冷PBS;再棄去PBS，每孔加入120μ1平衡到室溫的IX裂解液。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于搖床上震蕩15分鐘，然后將孔中的裂解液全部吸出轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，4 °C，12 000 g離心2分鐘，取出5μ1上清于新的離心管中，并加入45μ1的IX裂解液，將上清稀釋10倍。上機(jī)檢測(cè)時(shí)，在試管中加入40 μ? LAR底物，加入5μ1稀釋的上清，立即置于熒光檢測(cè)儀，讀取熒光素酶的熒光值。然后在同一管中加入40μ1 Stop & Glo液,立即置于熒光檢測(cè)儀,讀取海膽熒光素酶熒光值。計(jì)算每一個(gè)樣品的海膽熒光素酶的熒光值與熒光素酶的熒光值的比值，從而對(duì)每一個(gè)樣品的熒光值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，即可用來(lái)表示每個(gè)樣品的熒光強(qiáng)度。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)miR-17模擬物和野生型IL8 mRNA的3’ UTR報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染時(shí)，與陰性對(duì)照模擬物相t匕，miR-17模擬物可以顯著抑制熒光素酶活性；而miR-17模擬物和突變形式的IL8 mRNA3’ UTR報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶的活性明顯回復(fù)(見(jiàn)表1)，說(shuō)明IL8 mRNA 3’ UTR保守位點(diǎn)是miR-17結(jié)合的位點(diǎn)。
[0012]表1:miR-17模擬物對(duì)IL8 3’ UTR靶向作用的報(bào)告基因分析
-丨野生型IL83’ UTR 丨突變型IL83’ UTR
【權(quán)利要求】
1.一種具有AAAGUGC種子 序列的微小RNA在制備白介素8抑制劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P19/02GK103656676SQ201210350242
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月20日
【發(fā)明者】李傳剛, 李墨林 申請(qǐng)人:大連醫(yī)科大學(xué)