一種特異抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的新型靶向肽tmtp1-kla的制備與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種特異抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的新型靶向肽TMTP1-KLA的制備與應(yīng)用，其技術(shù)特征在于：制備一種能夠同時識別高轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞并可抑制腫瘤細(xì)胞生長與轉(zhuǎn)移的多肽TMTP1-GG-D(KLAKLAK)2，該多肽可將抗菌肽特異性地輸送到惡性腫瘤組織及轉(zhuǎn)移灶局部，以選擇性的殺傷具有高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞，而沒有明顯的毒副作用，有效抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移，有望成為一種抗腫瘤新藥，可以解決目前腫瘤分子靶向治療技術(shù)和實(shí)踐中關(guān)鍵的不足之處。本發(fā)明的目的，在于提供一種能夠同時特異性識別和抑制具有高轉(zhuǎn)移潛能傾向的腫瘤細(xì)胞的多肽，從而克服現(xiàn)有靶向性藥物存在副作用大、特異性不強(qiáng)等問題，以期在臨床治療中發(fā)揮高效、特異的腫瘤抑制和殺滅作用，使這一新的多肽可達(dá)到更大程度上靶向性殺滅腫瘤細(xì)胞的治療目的，此外，本發(fā)明也將為后繼其他分子治療提供一種新的設(shè)計模式。
【專利說明】一種特異抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的新型靶向肽TMTP1-KLA的制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種特異抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的新型靶向肽TMTP1-KLA的制備與應(yīng)用，其技術(shù)特征在于:制備一種能夠同時識別高轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞并可抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的多肽TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2，該多肽可以選擇性的殺傷具有高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞，而沒有明顯的毒副作用，有效抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。
【發(fā)明內(nèi)容】
屬于蛋白質(zhì)多肽領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的一類疾病。確切證據(jù)表明，90%以上的惡性腫瘤患者最終死于腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。近年來，腫瘤治療取得了長足進(jìn)步，特別是對白血病、惡性淋巴瘤等的治療有了突破，但對危害人類生命健康最嚴(yán)重的、占惡性腫瘤大多數(shù)的實(shí)體瘤(如卵巢癌、胃癌、肝癌等)的治療未能達(dá)到滿意的效果。傳統(tǒng)的惡性腫瘤治療模式(手術(shù)、放療、化療)雖然是目前腫瘤治療的主要手段，但尚無法做到從根本上清除腫瘤，且由于缺乏特異性，在取得療效的同時也往往帶來較大的毒副作用。隨著生物技術(shù)的革命性進(jìn)展和對惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的深入研究，臨床醫(yī)學(xué)包括腫瘤學(xué)發(fā)生了重大變革，具有較低不良反應(yīng)和良好療效的分子靶向治療越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視，代表了腫瘤治療的未來趨勢。
[0003]腫瘤分子靶向治療是利用具有一定特異性的載體，將藥物或其他殺傷腫瘤細(xì)胞的活性物質(zhì)選擇性地運(yùn)送到腫瘤部位，把治療作用或藥物效應(yīng)盡量限定在特定的靶細(xì)胞、組織或器官內(nèi)，而不影響正常細(xì)胞、組織或器官的功能，從而提高療效、減少毒副作用的一種方法，又稱為“導(dǎo)彈治療”。目前腫瘤分子靶向治療的手段主要有兩類:單克隆抗體和靶向性多肽(Homing peptide)。癌癥治療性抗體目前已有近10年歷史,第一種應(yīng)用此技術(shù)制備的抗體在美國已通過FDA的認(rèn)證。我們知道，單鏈抗體(ScFv)在臨床應(yīng)用中具有巨大的潛力，然而快速的血漿清除及大量生產(chǎn)的困難限制了它的實(shí)際應(yīng)用。Afanasieva TA等利用噬菌體抗體庫篩選并獲得了一種抗VEGF的單鏈抗體(ScFv — V65)。動物實(shí)驗(yàn)證明，這種抗體在荷瘤鼠體內(nèi)可以明顯抑制腫瘤生長，與對照組比較達(dá)50%。之后，他們對腺病毒進(jìn)行改造，使之能編碼、合成ScFv - V65，這樣表達(dá)出來的ScFv — V65融合蛋白其半衰期明顯延長，血漿清除率降低。當(dāng)給荷瘤小鼠應(yīng)用這種重組病毒后，其腫瘤生長明顯受到限制；當(dāng)重復(fù)多次系統(tǒng)給藥時，這種抑制作用更為明顯。實(shí)驗(yàn)證明，ScFv作為一種新的基因治療方法，克服了傳統(tǒng)抗體治療的許多局限性，具有廣闊的應(yīng)用前景。針對腫瘤抗原設(shè)計的單克隆抗體，業(yè)已成為腫瘤導(dǎo)向治療中最常用的載體，但這些單克隆抗體的種類卻非常有限，并且在實(shí)際應(yīng)用中還存在以下缺點(diǎn):①體積較大，在腫瘤組織、細(xì)胞中穿透力較弱，并可被肝臟及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)非特異性攝取、吞噬對肝臟、骨髓的劑量相關(guān)毒性作用免疫原性強(qiáng)。
[0004]而靶向性多肽是目前認(rèn)為比較理想的一種腫瘤靶向性治療的載體，它們具有:①血漿清除速度快、高親和力、高特異性；②良好的組織穿透性，能被腫瘤細(xì)胞攝?。虎垡子诨瘜W(xué)合成并且低免疫原性的特點(diǎn)，可減少、避免上述單克隆抗體的不足。因而近年來，許多學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向應(yīng)用肽庫技術(shù)尋找能與腫瘤細(xì)胞、腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的短肽，以達(dá)到靶向腫瘤的目的。肽庫技術(shù)是將基因型、表型及分子結(jié)合活性與噬菌體/細(xì)菌的可擴(kuò)增性結(jié)合在一起，是一種高效的篩選技術(shù)。目前已成功的應(yīng)用于抗原表位分析、單抗篩選、蛋白質(zhì)功能拮抗多肽或模擬多肽的確定等方面。Arap W等對乳腺癌荷瘤小鼠進(jìn)行肽庫篩選后獲得一系列與腫瘤血管特異性結(jié)合的短肽，其中的R⑶序列被證實(shí)可與α V整合素結(jié)合。將RGD序列與阿霉素交聯(lián)后應(yīng)用于荷瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)藥物的抗腫瘤療效顯著增加而毒性作用明顯減少。Laakkonen P等利用噬菌體肽庫篩選獲得靶向乳腺癌腫瘤及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的導(dǎo)向性多肽LyP-Ι，為早期診斷腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶靶向性治療奠定了基礎(chǔ)。KarassevaN等發(fā)現(xiàn)了可與上皮生長因子受體一 2 (ErbB-2)特異性結(jié)合的6肽KCCYSL，它可特異性與乳腺癌及前列腺癌細(xì)胞系結(jié)合，而與正常細(xì)胞則無結(jié)合。另外，Noda K等利用噬菌體肽庫技術(shù)篩選并獲得了能與腫瘤細(xì)胞表面碳水化合物抗原(carbohydrate antigens)特異性結(jié)合的肽段。Peletskaya EN等報道了利用肽庫技術(shù)篩選與Thomsen-Friedenreich (TF)腫瘤相關(guān)抗原特異性結(jié)合的肽段。TF抗原在大約90%的原發(fā)癌灶、淋巴瘤以及它們的轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞表面表達(dá)，并與腫瘤轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)有關(guān)。而Landon LA等則通過一系列的改造，大大增強(qiáng)了篩選獲得的肽段與TF抗原的親和力及其水溶性。
[0005]抗菌肽是一種天然免疫系統(tǒng)中的小分子多肽，具有抗腫瘤活性，熱穩(wěn)定性好、水溶性好、選擇性強(qiáng)、毒副反應(yīng)低、無免疫原性、作用迅速、抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，不僅可以抑殺細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲，對多種癌細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞和實(shí)體瘤也有明顯的抑制作用，在腫瘤的分子靶向治療中具有重要意義。目前已發(fā)現(xiàn)98種抗菌肽具有抗腫瘤活性，這些抗菌肽一般由12~55個氨基酸殘基組成。與傳統(tǒng)的抗腫瘤化療藥物相比，抗菌肽可以選擇性作用于腫瘤細(xì)胞，對正常細(xì)胞損傷小，對人體幾乎沒有毒性，而且不易產(chǎn)生耐藥性，其為人們獲得一種理想的化療藥物帶來了希望。利用腫瘤的表面分子為靶點(diǎn)，將特異性分子與抗菌肽結(jié)合，由其介導(dǎo)抗菌肽與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，可達(dá)到特異性殺傷腫瘤的效應(yīng)。Warren等針對前列腺腫瘤特異性抗原PSMA設(shè)計出被2個Y谷氨酰修飾的穿孔肽，對PSMA陽性的前列腺細(xì)胞有高度的溶細(xì)胞活性，對PSMA陰性的細(xì)胞沒有作用。β LH的片段與horl4的復(fù)合物，可以選擇性殺傷卵巢癌細(xì)胞。蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體也可用來轉(zhuǎn)運(yùn)抗菌肽，Jeffrey等將抗菌肽1)(1(1^1(1^1()2與載體2?1025結(jié)合，經(jīng)注射后對實(shí)體瘤產(chǎn)生了很好的抑制效果。Ellerby等人將抗菌肽序列d(KLAKLAK)2與血管定位序列組合，該定位抗菌肽通過線粒體途徑誘導(dǎo)血管生成性內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn)`表明該抗菌肽引起腫瘤細(xì)胞凋亡和壞死，Chen等報道了 RGD-tachyplesin誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，該凋亡受Fas死亡受體途徑和線粒體途徑共同調(diào)控，Mai等人將抗菌肽序列d(KLAKLAK)2與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列PTD結(jié)合，該抗菌肽在體外可迅速誘導(dǎo)一系列腫瘤細(xì)胞凋亡，并且可以通過定位注射引起體內(nèi)實(shí)體瘤的凋亡，因此認(rèn)為該抗菌肽可用于臨床治療可觸及的實(shí)體瘤，并可用于放療、免疫治療和基礎(chǔ)化學(xué)治療的聯(lián)合輔助治療。
[0006]在前期研究工作中，我們利用細(xì)菌鞭毛肽庫對具有不同轉(zhuǎn)移潛能的前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行正負(fù)篩選，獲得一段5肽序列，命名為“TMTP1”;令人驚喜的是，TMPl肽對高轉(zhuǎn)移前列腺癌腫瘤、高轉(zhuǎn)移潛能的乳腺癌具有很好的靶向能力；此外，TMTPl肽對前列腺癌的自發(fā)肝轉(zhuǎn)移灶即使直徑僅有Imm亦有很好的識別能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們通過肽庫技術(shù)篩選獲得的TMTPl是一種靶向性良好的腫瘤導(dǎo)向肽，有望應(yīng)用于惡性腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶的早期診斷及治療。本發(fā)明在前期工作基礎(chǔ)上將特異性殺傷腫瘤的抗菌肽序列d(KLAKLAK)2與TMTPl融合，可將抗菌肽特異性地輸送到惡性腫瘤組織及轉(zhuǎn)移灶局部，靶向性地殺滅腫瘤細(xì)胞，減輕對正常組織的毒副作用，有望成為一種抗腫瘤新藥，迄今尚未見有相關(guān)報道。
[0007]本發(fā)明的目的，在于提供一種能夠同時特異性識別和抑制具有高轉(zhuǎn)移潛能傾向的腫瘤細(xì)胞的多肽，從而克服現(xiàn)有靶向性藥物存在副作用大、特異性不強(qiáng)等問題，以期在臨床治療中發(fā)揮高效、特異的腫瘤抑制和殺滅作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]基于以上技術(shù)背景和重大的醫(yī)療需求，本發(fā)明提供了一種嵌合的促進(jìn)高轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞凋亡的靶向性多肽，其含有與一種抗微生物肽連接的高轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞導(dǎo)向肽。通過該方案獲得的靶向性多肽具有高效靶向抑制高轉(zhuǎn)移潛能腫瘤生長與增殖、可有效抑制其轉(zhuǎn)移等明顯優(yōu)勢，而對正常的細(xì)胞或組織沒有明顯的毒副作用，可以解決目前腫瘤分子靶向治療技術(shù)和實(shí)踐中關(guān)鍵的不足之處。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種嵌合的促進(jìn)高轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞凋亡的靶向性多肽，其特征是:它是由一個具有靶向高轉(zhuǎn)移潛能傾向的腫瘤導(dǎo)向肽TMTP1、兩個甘氨酸GG和一個抗菌肽D (KLAKLAK)2組成。
[0010]與現(xiàn)有的抗腫瘤多肽相比，本發(fā)明達(dá)到了以下效果:
I本靶向性多肽是由一個具有靶向高轉(zhuǎn)移潛能傾向的腫瘤導(dǎo)向肽TMTPl及抗菌肽d(KLAKLAK)2構(gòu)建而成，在理論和實(shí)際上達(dá)到了抗微生物肽殺傷效應(yīng)的同時盡可能提高腫瘤導(dǎo)向肽TMTPl靶向特性的效果。由于這種全新的設(shè)計，使這一新的多肽可達(dá)到更大程度上靶向性殺滅腫瘤細(xì)胞的治療目的，此外，本發(fā)明也將為后繼其他分子治療提供一種新的設(shè)計模式。
[0011]2對腫瘤細(xì)胞系及正常對照細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該靶向性多肽對正常細(xì)胞無明顯影響，而對于有高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞，包括前列腺癌和胃癌，有顯著的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)。
[0012]3對腫瘤動物模型的體內(nèi)研究證實(shí)，通過腹腔注射的用藥途徑，該靶向性多肽對受試的所有腫瘤動物模型均具顯著的治療作用，并可有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，且對動物無明顯的治療相關(guān)毒性。
[0013]4制備出腫瘤導(dǎo)向肽與抗菌肽的靶向性多肽，作為一種有效的抗腫瘤藥物，可發(fā)揮抗腫瘤的協(xié)同作用，使其既具有抗菌肽高效毒性效應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，又能在高轉(zhuǎn)移潛能腫瘤組織富集，從而進(jìn)一步降低新型抗腫瘤多肽的臨床用藥量，提高量效比，降低毒副作用。應(yīng)用于研究在體外和體內(nèi)對細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移和凋亡的影響，以及具有易發(fā)生轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤如前列腺癌、胃癌的輔助治療。
[0014]四、【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1、抗腫瘤多肽的構(gòu)建示意圖；
圖2、抗腫瘤多肽體內(nèi)外對腫瘤細(xì)胞的靶向識別作用；
圖3、抗腫瘤多肽抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；
圖4、抗腫瘤多肽鏡下誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變；
圖5、抗腫瘤多肽流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用；圖6、抗腫瘤多肽抑制腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的作用；
圖7、抗腫瘤多肽體內(nèi)抗腫瘤生長作用；
圖8、抗腫瘤多肽體內(nèi)對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用
五、【具體實(shí)施方式】:
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0015]依照本發(fā)明的技術(shù)方案制備的一種嵌合的促進(jìn)高轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞凋亡的靶向性多肽，它是由一個具有靶向高轉(zhuǎn)移潛能傾向的腫瘤導(dǎo)向肽TMTPl、兩個甘氨酸GG和一個抗菌肽D (KLAKLAK)2組成。
[0016](一)TMTPl-GG-D (KLAKLAK)2 多肽的設(shè)計與合成:
在TMTPl的N端和C端分別加上一個甘氨酸和一個半胱氨酸，并利用兩個半胱氨酸氧化成二硫鍵，形成環(huán)肽結(jié)構(gòu)，序列如下:GCGNVVRQGC-GG- (KLAKLAK-KLAKLAK) d。cys 二硫鍵環(huán)化，使TMPl具有更穩(wěn)定的空間構(gòu)象；(KLAKLAK-KLAKLAK) d用右旋氨基酸。用無菌水溶解合成的TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2多肽，分裝后一 20°C保存。
[0017](二)TMTPl-GG-D(KLAKLAK)2多肽對多種高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞靶向識別效應(yīng)的體內(nèi)外研究
1.細(xì)胞培養(yǎng)
I)用棉手套從液氮內(nèi)取出保種的PC-3M-1E8，MKN-45，小鼠成纖維細(xì)胞NIH 3T3細(xì)胞，人正常肝細(xì)胞系L02，人正常乳腺細(xì)胞MCF-10A，HEK293細(xì)胞，迅速放入37°C水浴鍋內(nèi)搖動，快速解凍。
[0018]2)待細(xì)胞完全解凍為懸液后，800rpm，室溫離心5分鐘，用75%乙醇噴灑消毒，超凈細(xì)胞臺內(nèi)用Iml加樣槍小心吸棄凍存液，加新鮮RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，補(bǔ)RPMI1640培養(yǎng)基至總體積約6ml。置37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0019]3)次日在倒置顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞貼壁良好，只有少許死亡細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中，吸棄陳舊培養(yǎng)基，進(jìn)行首次換液，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
[0020]4)48小時后再次觀察，可見復(fù)蘇細(xì)胞融合已達(dá)80%_90%，準(zhǔn)備傳代。吸棄舊培養(yǎng)基，用經(jīng)高壓滅菌過的PBS輕柔洗2遍，加37 °C預(yù)熱了的0.25%胰酶，覆蓋培養(yǎng)瓶底，擰緊蓋子在顯微鏡下觀察，細(xì)胞界限變清楚，細(xì)胞開始變圓時，吸棄培養(yǎng)瓶內(nèi)胰酶，擰好培養(yǎng)瓶的蓋子，放置I分鐘后，用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液使消化下來的細(xì)胞充分分散。并按1:3傳代，補(bǔ)足培養(yǎng)液，吹均勻后置37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0021]5) 2-3天換培養(yǎng)液一次。
[0022]6)選擇處于對數(shù)生長細(xì)胞進(jìn)行體外效應(yīng)實(shí)驗(yàn)。
[0023]2.TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2多肽的靶向識別效應(yīng)的體外研究
1)1 μ I FITC標(biāo)記的TMTPl-GG-D(KLAKLAK)2和FITC-錯序肽分別與PC-3M-lE8，MKN-45，小鼠成纖維細(xì)胞NIH 3T3細(xì)胞，人正常肝細(xì)胞系L02，人正常乳腺細(xì)胞MCF-10A，HEK293細(xì)胞孵育4小時，此后洗去未結(jié)合的多肽溶液，固定細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡下觀察。
[0024]可見FITC-GG-D(KLAKLAK)2與PC-3M-1E8，MKN_45細(xì)胞結(jié)合，顯示強(qiáng)膜熒光染色；而錯序肽與PC-3M-1E8細(xì)胞，MKN-45細(xì)胞無結(jié)合，僅顯示為背景染色；此外，F(xiàn)ITC-TMP1與小鼠成纖維細(xì)胞NIH 3T3細(xì)胞，人正常肝細(xì)胞系L02，人正常乳腺細(xì)胞MCF-10A，HEK293細(xì)胞亦無結(jié)合，僅顯示為背景染色(圖2)。
[0025]3.原代裸鼠皮下瘤模型的建立
1)取處于對數(shù)生長期的PC-3M-1E8前列腺癌細(xì)胞和MKN-45胃癌細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，800rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，無菌PBS重懸細(xì)胞，通過計數(shù)板計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度。
[0026]2)將雄性裸鼠固定后，拿棉簽蘸碘伏消毒裸鼠左側(cè)大腿根部皮膚，用Iml注射器取200 μ 1PC-3M-1E8前列腺癌細(xì)胞懸液(濃度為1.5 X 101°/!)，注射到消毒過的皮下。即每只裸鼠接種3X IO6個細(xì)胞。共注射雄性裸鼠3只。
[0027]3)將雌性裸鼠固定后，拿棉簽蘸碘伏消毒裸鼠左側(cè)大腿根部皮膚，用Iml注射器取200 μ I MKN-45胃癌細(xì)胞懸液(濃度為I X 101°/!),注射到消毒過的皮下。即每只裸鼠接種2 X 106/L個細(xì)胞。共注射雌性裸鼠3只。
[0028]4)放入SPF環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)，每天觀察注射部位的腫瘤形成情況，待10天左右皮下腫瘤已經(jīng)明顯形成后，隔天觀察腫瘤生長情況并用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最大徑及最小徑的值。
[0029]4.TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2多肽的靶向識別效應(yīng)的體內(nèi)研究
1)PC-3M-1E8前列腺癌皮下瘤荷瘤小鼠尾靜脈注入FITC標(biāo)記的TMTP1_GG_D (KLAKLAK)220 μ M，并于不同時段處死小鼠，左心室注射5ml PBS沖洗后，取腫瘤組織，行冰凍切片，冰無水乙醇:丙酮(I: I)固定，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。
[0030]結(jié)果顯示:TMTP1-GG-D(KLAKLAK)2 20 μ M在荷瘤小鼠體內(nèi)循環(huán)24h后，在腫瘤部位聚集，腫瘤組織切片可見較強(qiáng)熒光信號，結(jié)果說明:FITC- TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2在體內(nèi)亦有很好的腫瘤導(dǎo)向性，可靶向高轉(zhuǎn)移潛能的PC-3M-1E8前列腺癌和MKN-45胃癌。(圖2)。
[0031](三)TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2多肽對多種高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞靶向殺傷效應(yīng)的體外研
究
1.MTT (噻唑藍(lán))實(shí)驗(yàn)操作步驟:
I)消化上述對數(shù)生長期細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞懸液的濃度，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種到96孔板，8000個/孔。
[0032]2)置37°C，5%C02溫箱培養(yǎng)培養(yǎng)過夜。
[0033]3)加入以下濃度的無菌多肽TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2: 5、10、15、20 μ M，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，同時各設(shè)3孔未加多肽的空白對照組及調(diào)零孔(無細(xì)胞，只有等體積的培養(yǎng)基)。置37°C，5%C02溫箱培養(yǎng)過夜。
[0034]4)24小時后，用加樣槍小心吸棄孔內(nèi)上清，加入90 μ IRPMI1640培養(yǎng)液，接著加入10 μ g MTT 溶液(5mg/ml)。37。。，5%C02 溫箱培養(yǎng) 4h。
[0035]5)將96孔板置離心機(jī)內(nèi)，常溫800rpm離心5分鐘。
[0036]6)加樣槍小心吸棄孔內(nèi)液體。加入150 μ I 二甲基亞颯(DMSO)，置搖床上避光輕柔搖蕩巧分鐘，充分溶解結(jié)晶物。
[0037]7)上酶標(biāo)儀檢測490nm波長處各孔的吸光值。
[0038]8)結(jié)果的處理，所有吸光值均以平均值士 SD表示。以各株細(xì)胞的空白對照孔吸光值為對照，計算不同多肽濃度作用下的平均細(xì)胞存活率(即處理組平均值:空白對照組平均值)。
[0039]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:如圖3所示，TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2抗腫瘤多肽在不同作用濃度下(5-20 μ M)，劑量依賴性的顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，增加腫瘤細(xì)胞凋亡；20μΜTMTP1-GG-d(KLAKLAK)2引起95%的PE-3M-1E8細(xì)胞凋亡，幾乎100%MKN_45細(xì)胞凋亡，但是正常小鼠成纖維細(xì)胞NIH 3T3沒有明顯凋亡(約10%凋亡)。即TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2對前列腺癌PE-3M-1E8細(xì)胞劑量依賴性地發(fā)揮了劇烈的毒性作用，對胃癌MKN-45細(xì)胞也發(fā)揮了顯著的殺傷效應(yīng)，而對小鼠成纖維細(xì)胞NIH 3T3沒有明顯的細(xì)胞毒性。
[0040]2.倒置顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)步驟:
1)消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種到6孔板內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞密度，使孔板內(nèi)細(xì)胞融合度約 60%。
[0041]2)置37°C，5%C02溫箱培養(yǎng)培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁。
[0042]3)加入工作濃度為 10 μ M 的 TMTPl-GG-D (KLAKLAK)2
4)為檢測TMTPl小分子多肽對細(xì)胞的毒性，另外分別加入3 μ g/mlTMTPl，同樣設(shè)不加處理因素的對照孔。
[0043]5)作用24小時后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。
[0044]6)用不含EDTA的胰酶小心消化收集細(xì)胞。
[0045]7)將消化收集的細(xì)胞37°C，800rpm離心5分鐘。棄上清，用磷酸鹽PBS重懸細(xì)胞調(diào)整濃度，收集I X IO5個細(xì)胞，再次800rpm離心5分鐘，用PBS重復(fù)洗細(xì)胞一次。
[0046]8)吸棄PBS，加凱基凋亡試劑盒中的Binding Buffer500 μ L重懸細(xì)胞。
[0047]9)加 Annexinv-FITC 5 μ L,輕柔混勻后，加 Propidium 1dide 5μ?,混勻。
[0048]10)常溫，避光反應(yīng)10分鐘。
[0049]11) I小時內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。
[0050]12)調(diào)節(jié)流式細(xì)胞儀參數(shù)，將激發(fā)波長調(diào)到488nm;發(fā)射波長調(diào)到530nm。標(biāo)記早期凋亡細(xì)胞的AnnexinV-FITC用FLIC通道檢測，標(biāo)記壞死細(xì)胞的PI用FL3通道檢測。并用未加處理因素的空白對照細(xì)胞調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償，設(shè)定十字門，去除光譜重疊。
[0051]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:如圖4所示，與未處理的對照組相比，10 μ M的TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2作用后的MKN-45與PC-3M-1E8細(xì)胞明顯出現(xiàn)皺縮，體積變小，胞漿渾濁，染色質(zhì)邊緣化，細(xì)胞間隙增大，體積縮小，細(xì)胞周緣模糊，細(xì)胞折光性整體減弱，胞漿濃縮，核染色質(zhì)分布不均勻，偶見凋亡小體，細(xì)胞膜皺縮破裂等凋亡變化，作為對照的NIH 3T3細(xì)胞則沒有明顯光鏡下的變化。如圖5所示，與未處理的對照組相比，ΙΟμΜ的TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2顯著增加了 MKN-45與PC-3M-1E8細(xì)胞的凋亡率，并隨著作用時間的延長,凋亡率逐漸增加，48h達(dá)到高峰。
[0052]3.boyden 小室
1)消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種到6孔板內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞密度，使孔板內(nèi)細(xì)胞融合度約 60%。
[0053]2)置37°C，5%C02溫箱培養(yǎng)培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁。
[0054]3)加入工作濃度為2 μ M的TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2，同樣設(shè)不加處理因素的對照孔。
[0055]4)作用12小時后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；用不含EDTA的胰酶小心消化收集細(xì)胞。
[0056]5)按 1:5無血清DMEM稀釋的基質(zhì)膠Growth factor-reduced Matrigel 約 50 μ I/孔鋪于8 μ m孔徑的聚碳酸酯微孔濾膜上，37°C放置0.5h后轉(zhuǎn)置室溫下干燥過夜。
[0057]6) Boyden下室加入25 μ I的ΝΙΗ3Τ3細(xì)胞上清液，上室加入200 μ I細(xì)胞濃度為
2XlOVml的細(xì)胞懸液，每孔設(shè)3個復(fù)孔。
[0058]7)置37°C、5%C02溫箱中培養(yǎng)8h后，擦去上室上細(xì)胞，倒置膜片(膜朝上)，甲醇固定，蘇木素染色，計數(shù)侵過濾膜的細(xì)胞數(shù)。共計數(shù)中央和四周各5個視野(X200)，取平均值。
[0059]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:如圖6所示，2μΜ的TMTPI _GG_D (KLAKLAK)2作用后的MKN-45與PC-3M-1E8細(xì)胞平均穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組，提示遷移侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少，且差異有顯著性。
[0060](四)TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2腫瘤靶向治療的體內(nèi)研究
1.前列腺癌和胃癌皮下瘤模型的建立
I)原代前列腺癌/胃癌皮下瘤生長至約IcmX Icm時，取皮下瘤生長狀態(tài)好的前列腺癌和胃癌裸鼠各2只，頸椎脫白術(shù)處死荷瘤裸鼠，在超凈工作臺內(nèi)用鋒利的無菌剪刀及鑷子剝離瘤體，置無菌生理鹽水中，去除結(jié)締組織，用剪刀將瘤體剪成約2mm3大小的瘤塊。
[0061]2)在超凈工作臺內(nèi)抓牢固定待移植裸鼠，碘伏消毒左側(cè)大腿根部，手術(shù)刀小心劃開一長約3mm消毒過的皮膚，鑷子小心鈍性分離皮下組織，選一剪碎的瘤塊置入其中，4.0號手術(shù)縫線縫合皮膚。前列腺癌移植20只裸鼠，胃癌移植16只裸鼠。
[0062]3)放回SFP級動物房繼續(xù)飼養(yǎng)，每天觀察移植部位的腫瘤形成情況，待7天左右皮下腫瘤已經(jīng)明顯形成后，隔天觀察腫瘤生長`情況并用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最大徑及最小徑的值。
[0063]2.前列腺癌和胃癌皮下瘤裸鼠分組處理
O當(dāng)前列腺癌/胃癌皮下移植瘤生長至約3mmX3mm時，將15只前列腺癌荷瘤裸鼠隨機(jī)分為3組，每組5只，每組為一籠，做好標(biāo)記。將12只胃癌荷瘤裸鼠隨機(jī)分為3組，每組4只，每組為一籠，做好標(biāo)記。
[0064]2)前列腺癌/胃癌皮下移植瘤荷瘤裸鼠分別接受以下處理(均為腹腔注射):第一組:50 μ M PBS (空白對照組)，第二組；50 μ M PBS TMTPI,第三組；50 μ MTMTP1-GG-d (KLAKLAK)2。
[0065]3.每3天按上述方式處理一次，并且每次處理前先用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最大徑及最小徑的值。
[0066]4.處理21天(治療8次)后，將各組前列腺癌皮下移植瘤裸鼠用乙醚麻醉后，相機(jī)拍照。并按公式V = 4/X (d/2) 2X (D/2)計算每次測量的腫瘤體積，d代表腫瘤最小徑的值，D代表腫瘤最大徑的值，繪制腫瘤體積增長曲線。拍照后停止處理，繼續(xù)飼養(yǎng)，每天觀察，直至第一次處理后第46天，觀察各組荷瘤裸鼠死亡情況，記錄死亡每天觀察，繪制各組裸鼠生存曲線。
[0067]5.處理21天(治療8次)后，將各組胃癌皮下移植瘤裸鼠用乙醚麻醉后處死，剝離腫瘤，將各組腫瘤先用相機(jī)拍照，再用PBS洗凈血跡后置3.7%多聚甲醛浸泡，固定液與瘤體的體積比為10:1，送武漢谷歌生物技術(shù)有限公司進(jìn)行石蠟包埋，4μπι切片。并按公式V=4/31 X (d/2) 2X (D/2)計算每次測量的腫瘤體積，d代表腫瘤最小徑的值，D代表腫瘤最大徑的值，繪制腫瘤體積增長曲線。[0068]6.胃癌原位模型的建立
I)原代胃癌皮下瘤生長至約IcmX Icm時，取皮下瘤生長狀態(tài)好的裸鼠2只，頸椎脫臼術(shù)處死荷瘤裸鼠，在超凈工作臺內(nèi)用鋒利的無菌剪刀及鑷子剝離瘤體，置無菌生理鹽水中，去除結(jié)締組織，用剪刀將瘤體剪成約Imm3大小的瘤塊。
[0069]2)將12只預(yù)備造模的雌性裸鼠禁食12小時后，腹腔注射速眠新麻醉，碘伏和75%酒精消毒裸鼠左側(cè)及中部腹部皮膚，鑷子夾起消毒過的皮膚，剪刀剪開腹壁，在正中旁的左側(cè)打開腹腔，將胃用鑷子小心拉出，用縫針小心反復(fù)輕刺胃大彎側(cè)前壁的漿膜層3-5次，選取一剪碎的新鮮胃癌皮下瘤瘤塊置于此處，然后用5-0可吸收縫線將瘤塊縫在刺傷的胃大彎漿膜層上。按正常解剖位置將胃放回腹腔，用1-0縫線縫合腹壁及皮膚。擦凈血潰，放回紫外線消毒的籠子繼續(xù)在SPF級動物房飼養(yǎng)。
[0070]7.胃癌原位腫瘤的處理
I)胃癌原位移植瘤術(shù)后第7天，15只術(shù)后裸鼠隨機(jī)分為3組，每組5只，通過剪耳朵做好標(biāo)記。
[0071]2)移植瘤裸鼠分別接受以下處理(均為腹腔注射):第一組:50μΜ PBS(空白對照組)，第二組；50 μ M PBS TMTPl，第三組；50 μ M TMTPI_GG_D (KLAKLAK)2。
[0072]3 )每3天按上述方式處理一次。
[0073]4)處理10次后乙醚麻醉處理裸鼠，解剖裸鼠，取出原位瘤，肝臟，脾臟及腹壁轉(zhuǎn)移瘤，照相機(jī)拍照后，取原位瘤及各組織中肉眼可見的轉(zhuǎn)移瘤，PBS洗凈血跡后置3.7%多聚甲醛浸泡，固定液與瘤體的體積比為10:1，進(jìn)行石蠟包埋，4 μ m切片，石蠟切片HE染色。
[0074]5)記錄各組裸鼠原位瘤及轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生率，統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
[0075] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:如圖7所示，結(jié)果顯示TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2多肽顯著抑制了 PC-3M-1E8前列腺癌皮下瘤及MKN-45胃癌原位移植腫瘤的生長并且顯著延長了荷瘤裸鼠的生存期。TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2多肽處理后，荷瘤裸鼠的腫瘤體積明顯比對照組荷瘤裸鼠的腫瘤體積小(P〈0.05)。與PC-3M-1E8前列腺癌皮下瘤的治療效果相似，TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2靶向多肽顯著抑制了 MKN-45胃癌原位抑制腫瘤的體積，而對照組無明顯影響。
[0076]如圖8所示:對照組裸鼠的胃組織可見巨大的原位腫瘤，除TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2多肽處理組外，肝臟或脾臟上也可見明顯的白色轉(zhuǎn)移灶，腹壁也有較大的轉(zhuǎn)移瘤。如圖8所示，對照組裸鼠胃原位均100%發(fā)生腫瘤，80%發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，40%發(fā)生脾轉(zhuǎn)移，60%發(fā)生腹壁轉(zhuǎn)移，20%發(fā)生腎臟轉(zhuǎn)移，60%發(fā)生腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2多肽處理組裸鼠無肉眼可見肝脾腎轉(zhuǎn)移灶、腹壁轉(zhuǎn)移灶、腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。
[0077]以上數(shù)據(jù)顯示，新型抗腫瘤多肽TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2具有顯著抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的效應(yīng)，有望成為一種新型抗腫瘤藥物。
[0078]一種嵌合的促進(jìn)高轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞凋亡的靶向性多肽包括氨基酸序列如下: Gly-Cys-Gly-Asn-Val-Val-Arg-Gln-Gly-Cys—Gly-Gly-
D (Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Ala-Lys)
【權(quán)利要求】
1.一種特異抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的新型靶向肽TMTP1-KLA的制備與應(yīng)用，其特征是:一種嵌合的促進(jìn)高轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制其轉(zhuǎn)移的靶向性多肽，它是由一個具有靶向高轉(zhuǎn)移潛能傾向的腫瘤導(dǎo)向肽TMTP1、兩個甘氨酸GG和一個抗菌肽D(KLAKLAK)2組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的多肽，其特征在于所述對具有靶向高轉(zhuǎn)移潛能傾向的腫瘤導(dǎo)向妝為 Gly-Cys-Gly-Asn-Val-Val-Arg-Gln-Gly-Cys,抗菌妝為 D(Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Ala-Lys)。
3.權(quán)利要求1所述的新型靶向性多肽在體外抑制腫瘤的增殖、侵襲能力及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的新型靶向性多肽在抗腫瘤生長及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移中的用途。
【文檔編號】A61K38/10GK103656666SQ201210340385
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月14日
【發(fā)明者】馬丁, 王世宣, 周劍峰, 奚玲, 馬湘一 申請人:深圳市奧尼克斯基因技術(shù)有限公司