專利名稱：鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer, RA )感染是鴨、鵝、火雞等多種鳥類的一種高致病性、接觸傳染性疾病。本病以10-35日齡的雛鴨發(fā)病較多，發(fā)病率最高可達90%以上，死亡率為5%-75%，是影響?zhàn)B鴨業(yè)的重大傳染病之一。RA血清型眾多，目前世界范圍內(nèi)已確定的有21種，各血清型之間的交叉保護作用差。研究表明我國RA感染流行菌株的優(yōu)勢血清型是1、2和10型，目前國內(nèi)可用于預(yù)防RA感染的疫苗為鴨傳染性漿膜炎滅活油乳劑疫苗，為預(yù)防單一血清I型鴨疫里默氏桿菌感染的疫苗，對國內(nèi)經(jīng)常發(fā)生的血清2型和10型鴨疫里默氏桿菌感染無預(yù)防保護作用。由于細菌培養(yǎng)基等因素的限制使得培養(yǎng)的菌數(shù)很難達到制備三價滅活疫苗的菌數(shù)要求，迄今尚無包括血清I型、2型和10型鴨疫里默氏桿菌在內(nèi)的RA三價滅活疫苗的研究報道或商品化疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗及其制備方法。本發(fā)明提供的鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗可用于預(yù)防血清I型、血清2型和血清10型鴨疫里默氏桿菌感染。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗，所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗包含鴨疫里默氏桿菌血清I型滅活全菌、血清2型滅活全菌和血清10型滅活全菌以及佐劑。本發(fā)明的另一方面，所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗的菌株為血清I型CH3株、血清2型NJ3株和血清10型HXb2株。本發(fā)明的另一方面，所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗中，滅活CH3株、NJ3株和HXb2株的抗原含量分別都大于等于4X IO9 CFU/mL,2X IO9 CFU/mL和2X IO9 CFU/mL。本發(fā)明的另一方面，所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗中血清I型、2型、10型抗原與佐劑的混合重量比例為I :1 1 :7。本發(fā)明的另一方面，所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗是滅活全菌疫苗。本發(fā)明的另一方面，所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗佐劑為白油佐劑或者Montanide ISA 70 VG 佐劑。本發(fā)明的另一實施方面，一種鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗的制備方法包括下列步驟
(I)所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗各組成菌株滅活抗原的制備取血清1、2和10型鴨疫里默氏桿菌制苗用菌株CH3、NJ3和HXb2分別接種到TSB中復(fù)蘇后劃線接種于TSA平板上，置適溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，肉眼觀察，挑選呈奶油狀、微藍色半透明的特征單菌落分別進行一級和二級種子繁殖后，培養(yǎng)至對數(shù)生長期進行細菌的大量繁殖，經(jīng)純度檢驗和細菌計數(shù)后加入福爾馬林，適宜溫度下振蕩后進行滅活；分別取各滅活菌液少量接種于TSA平板適溫培養(yǎng)過夜，進行無菌檢驗，應(yīng)無細菌生長；
(2)所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗各組分的配制與疫苗乳化，根據(jù)細菌計數(shù)結(jié)果，分別將CH3、NJ3或HXb2滅活菌液稀釋或濃縮；取各滅活菌液混勻，加入Montanide ISA70 VG佐劑于攪拌機低速攪拌后，高速攪拌乳化I分鐘/次，2次以上，即為鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗。本發(fā)明的另一方面，一種鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗的制備方法包括下列步驟
(I)所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗各組成菌株滅活抗原的制備，取-80 °C保存的血清1、2、10型RA制苗用菌株CH3、NJ3、HXb2分別接種到TSB中復(fù)蘇后劃線接種于TSA平板上，置5% 0)2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)24小時。肉眼觀察，挑選呈奶油狀、微藍色半透明的特征單菌落分別進行一級和二級種子繁殖后，在通氣量I. O SLPM,轉(zhuǎn)速400rpm，培養(yǎng)基PH值
7.4，接種量為體積比5%的條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期進行細菌的大量繁殖，經(jīng)純度檢驗和細菌計數(shù)后加入體積比O. 4 %福爾馬林，37°C 200 rpm振蕩15小時進行滅活；分別取各滅活菌液少量接種于TSA平板37 0C 5% CO2培養(yǎng)24 h，進行無菌檢驗。應(yīng)無細菌生長。(2)所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗各組分的配制與疫苗乳化。根據(jù)細菌計數(shù)結(jié)果，分別將CH3、NJ3或HXb2滅活菌液稀釋或濃縮至4X 101° CFU/mL,2X IO10 CFU/mL或2 X IO10 CFU/mL ;取各滅活菌液各I份混勻，加入Montanide ISA 70 VG佐劑7份于攪拌機低速攪拌30秒后，高速攪拌乳化I分鐘/次X 2次，即為鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗。本發(fā)明的另一方面，鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗于TSA或TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，應(yīng)無細菌生長，于室溫保存6個月或4 °C保存I年應(yīng)無分層現(xiàn)象發(fā)生，3倍劑量疫苗接種10日齡易感鴨安全，易感鴨分別用免疫劑量(O. 3 mL)于5日齡和15日齡頸部皮下接種后，應(yīng)產(chǎn)生I :400以上針對CH3、NJ3和HXb2的血清抗體，對3個半數(shù)致死量YL4、Yb2和HXb2的攻毒保護應(yīng)在90%以上。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明可以有效地預(yù)防國內(nèi)養(yǎng)鴨地區(qū)流行的血清I型、血清2型和血清10型鴨疫里默氏桿菌的感染。本發(fā)明提供一種鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗，可用于免疫預(yù)防血清I型、2型和10型鴨疫里默氏桿菌感染的鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗。本發(fā)明血清I型、2型和10型鴨疫里默氏桿菌單價油乳劑滅活疫苗具有良好的對各自血清型菌株感染的免疫保護效果(90%以上)。本發(fā)明對篩選獲得的制苗用血清I型菌株CH3、血清2型菌株NJ3和血清10型菌株HXb2進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化、最佳免疫劑量的確定、疫苗佐劑的篩選、疫苗制備以及檢驗規(guī)程的制定。通過對上述條件進行優(yōu)化、篩選，最終獲得本發(fā)明提供的一種鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗。本發(fā)明疫苗對易感鴨可在5日齡左右進行首次免疫，首次免疫后10日左右進行二次免疫。本發(fā)明疫苗對易感雛鴨進行免疫后對血清I型、2型和10型鴨疫里默氏桿菌強毒菌株攻毒的免疫保護率均達到100%。本發(fā)明可用于預(yù)防雛鴨免受國內(nèi)主要流行的血清I型、2型和10型鴨疫里默氏桿菌感染，為國內(nèi)外首創(chuàng)。


圖I是本發(fā)明RA制苗用菌株在不同液體培養(yǎng)基的生長曲線；
圖2是本發(fā)明不同免疫劑量二次免疫后血清抗體效價；
圖3是本發(fā)明不同佐劑二次免疫后血清抗體效價。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。本發(fā)明中未標(biāo)注的試劑和原料均為市場上購買所得。I :制苗用候選菌株的復(fù)壯以及鑒定
我們的前期研究獲得了血清I型、2型和10型制苗用候選菌株CH3株，NJ3株和HXb2株。將該三個候選菌株分別經(jīng)過易感鴨體內(nèi)復(fù)壯后進行菌株的形態(tài)、生化反應(yīng)特性、分子生物學(xué)特性以及免疫保護率鑒定。將復(fù)壯后的菌株在胰酶大豆肉湯(TSB )和胰酶大豆瓊脂平板(TSA)上傳代50次，每隔5代對其菌株的形態(tài)、生化反應(yīng)特性(氧化酶、過氧化氫酶試驗為陽性；尿素分解、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、硫化氫產(chǎn)生試驗為陰性；不發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、木糖、甘露糖和山梨醇；液化明膠)、分子生物學(xué)特性(PCR擴增16SrRNA，ompA基因和groEL基因均為陽性反應(yīng)，序列測定結(jié)果正確)以及免疫保護率進行鑒定，表明3個菌株在體外連續(xù)傳代50次后的各種特性均不發(fā)生變化。2 :制苗用候選菌株體外培養(yǎng)條件的優(yōu)化
分別對3個疫苗候選菌株的液體培養(yǎng)基和高密度發(fā)酵技術(shù)進行了研究。比較研究疫苗候選菌株在TSB (北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯(TSB-YE，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，TSB+0. 5%酵母浸出液(YE，英國OXOID公司)，TSB+1. 5% YE和P-L肉湯中的增菌效果，結(jié)果表明TSB-YE的增菌效果明顯優(yōu)于其他液體培養(yǎng)基，RA CH3、NJ3、HXb2在TSB-YE中培養(yǎng)10-12 h即可達到生長高峰，菌數(shù)達I. 4-I. 7 X IO10 CFU/mL。RA制苗用菌株CH3、NJ3、HXb2在不同液體培養(yǎng)基的生長曲線見圖1，可以看出TSB-YE培養(yǎng)基對血清1、2、10型制苗用菌株的增菌效果優(yōu)于其他液體培養(yǎng)基，3個制苗用菌株均在TSB-YE中生長迅速，培養(yǎng)10-12小時即可達對數(shù)生長中后期。本研究建立了高密度發(fā)酵RA的液體培養(yǎng)技術(shù)。利用液體發(fā)酵裝置，運用正交試驗設(shè)計方法，分別測定了通氣量(SLPM，分別為2. O，I. O，和O. I)、轉(zhuǎn)速(rpm,分別為400，200和100)、培養(yǎng)基酸堿度(PH值，分別為7.0，7.4和7.8)以及接種量(％，分別為1，3和5)對RA血清1、2、10型制苗用菌株發(fā)酵的影響，具體試驗分組如下
權(quán)利要求
1.一種鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗，其特征在于，所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗包含鴨疫里默氏桿菌血清I型滅活全菌、血清2型滅活全菌和血清10型滅活全菌以及佐劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗，其特征在于，所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗的菌株為血清I型CH3株、血清2型NJ3株和血清10型HXb2株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗，其特征在于，所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗中，滅活CH3株、NJ3株和HXb2株的抗原含量分別大于等于4 X IO9CFU/mL、2X IO9 CFU/mL 和 2X IO9 CFU/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗，其特征在于，所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗中血清I型、2型、10型抗原與佐劑的混合重量比例為I :1 :1 :7。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗，其特征在于，所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗是滅活全菌疫苗。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗，其特征在于，所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗佐劑為白油佐劑或者Montanide ISA 70 VG佐劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的一種鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗的制備方法，其特征在于，其包括下列步驟(1)所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗各組成菌株滅活抗原的制備取血清1、2和10型鴨疫里默氏桿菌制苗用菌株CH3、NJ3和HXb2分別接種到TSB中復(fù)蘇后劃線接種于TSA平板上，置適溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，肉眼觀察，挑選呈奶油狀、微藍色半透明的特征單菌落分別進行一級和二級種子繁殖后，培養(yǎng)至對數(shù)生長期進行細菌的大量繁殖，經(jīng)純度檢驗和細菌計數(shù)后加入福爾馬林，適宜溫度下振蕩后進行滅活；分別取各滅活菌液少量接種于TSA平板適溫培養(yǎng)過夜，進行無菌檢驗，應(yīng)無細菌生長；(2)所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗各組分的配制與疫苗乳化，根據(jù)細菌計數(shù)結(jié)果，分別將所述CH3、NJ3或HXb2滅活菌液稀釋或濃縮；取各滅活菌液混勻，加入MontanideISA 70 VG佐劑于攪拌機低速攪拌后，高速攪拌乳化I分鐘/次，2次以上，即為鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，其包括下列步驟(1)所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗各組成菌株滅活抗原的制備，取-80V保存的血清1、2、10型鴨疫里默氏桿菌制苗用菌株CH3、NJ3、HXb2分別接種到TSB中復(fù)蘇后劃線接種于TSA平板上，置5% CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)24小時，肉眼觀察，挑選呈奶油狀、微藍色半透明的特征單菌落分別進行一級和二級種子繁殖后，在通氣量I. O SLPM,轉(zhuǎn)速400rpm，培養(yǎng)基PH值7. 4，接種量為體積比5%的條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期進行細菌的大量繁殖，經(jīng)純度檢驗和細菌計數(shù)后加入體積比O. 4 %福爾馬林，37°C 200 rpm振蕩15小時進行滅活；分別取各滅活菌液少量接種于TSA平板37°C 5%C02培養(yǎng)24h，進行無菌檢驗，應(yīng)無細菌生長；(2)所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗各組分的配制與疫苗乳化根據(jù)細菌計數(shù)結(jié)果，分別將CH3、NJ3或HXb2滅活菌液稀釋或濃縮至4X 101° CFU/mL,2X IO10 CFU/mL或2X 101°CFU/mL;取各滅活菌液各I份混勻，加入Montanide ISA 70 VG佐劑7份于攪拌機低速攪拌30秒后，高速攪拌乳化I分鐘/次X 2次，即為鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗于TSA或TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，應(yīng)無細菌生長，于室溫保存6個月或4°C保存I年應(yīng)無分層現(xiàn)象發(fā)生，3倍劑量疫苗接種10日齡易感鴨安全，易感鴨分別用免疫劑量于5日齡和15日齡頸部皮下接種后，應(yīng)產(chǎn)生I =400以上針對CH3、NJ3和HXb2的血清抗體，對3個半數(shù)致死量YL4、Yb2和HXb2的攻毒保護應(yīng)在90%以上。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明公開了一種鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗，所述鴨疫里默氏桿菌三價滅活疫苗包含鴨疫里默氏桿菌血清1型滅活全菌、血清2型滅活全菌和血清10型滅活全菌以及佐劑。本發(fā)明對血清1型、2型和10型鴨疫里默氏桿菌強毒菌株攻毒的免疫保護率均達到100%。本發(fā)明具有良好的對各個組成血清型菌株感染的免疫保護效果。
文檔編號A61P31/04GK102908616SQ20121033823
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月13日
發(fā)明者于圣青, 丁鏟, 韓先干, 王小蘭, 仇旭升, 宋翠萍, 譚磊 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所