專利名稱：霍亂弧菌o1群多糖結(jié)合疫苗、其制備方法及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗制備領(lǐng)域，具體地說，涉及一種霍亂弧菌01群多糖結(jié)合疫苗、其制備方法及應用。
背景技術(shù)：
兼具保護抗原和必要毒力因子的病原菌表面多糖(如LPS或CPS)是制備多糖疫苗的基礎(chǔ)。利用肺炎球菌、腦膜炎球菌、沙門氏菌等表面多糖制備的疫苗已經(jīng)上市，正發(fā)揮著重要的預防作用。然而，多糖疫苗不能激發(fā)嬰幼兒體內(nèi)產(chǎn)生相應的保護性抗體；在成人中，多糖疫苗雖然可激發(fā)產(chǎn)生高滴度的抗菌抗體，但是激發(fā)產(chǎn)生的抗體屬Th細胞不依賴性抗原(Ti-Ag)，抗體僅為IgM。如果將具有保護性質(zhì)的細菌表面多糖與蛋白質(zhì)進行共價結(jié)合，則不僅能夠解決上述問題，而且多糖蛋白質(zhì)結(jié)合疫苗還可以激發(fā)T細胞依賴的抗體應答。 LTB為大腸桿菌不耐熱腸毒素的無毒亞單位，可以和大多數(shù)哺乳動物細胞膜上的神經(jīng)結(jié)苷脂(GMl)受體結(jié)合。LTB可以作為某些半抗原的穩(wěn)定載體，當它與化學偶聯(lián)或基因融合的抗原同時進入體內(nèi)之后，會激起融合表位抗原的免疫原性，使機體產(chǎn)生強烈的免疫反應，達到免疫保護作用。LTB可作為良好的蛋白半抗原和弱抗原的載體，同時還可以賦予半抗原免疫原性，增強弱抗原的免疫原性。同時，LTB與霍亂菌素B亞基(CTB)的氨基酸有80%的同源性，具有相似的免疫原性和免疫調(diào)制作用，研究表明，兩者皆可引起強的抗毒素反應，與抗原聯(lián)合使用后可增強免疫反應。目前，霍亂依然是世界各國重要的公共衛(wèi)生問題之一，控制霍亂流行的長效機制依賴于良好的個人衛(wèi)生、無污染飲用水的供應以及恰當?shù)墓残l(wèi)生設(shè)施。然而，短期內(nèi)在諸多霍亂流行的國家和地區(qū)很難通過在這些方面的有效管理使霍亂流行得以控制，再者，臨床分離的致病菌株抗藥性日趨嚴重，因此急需有效的霍亂疫苗作為預防霍亂流行的一項公共衛(wèi)生措施?，F(xiàn)階段新型霍亂疫苗的研究主要集中在利用口服免疫激發(fā)粘膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，該類口服霍亂疫苗已經(jīng)經(jīng)過臨床試驗，上市銷售；另一類多糖結(jié)合疫苗在I、II期臨床研究中證明有效，成為新型霍亂疫苗研發(fā)的新方向，此類疫苗，由滅活的霍亂弧菌細菌菌體和霍亂毒素B亞單位組成(WC/BS)，臨床結(jié)果顯示，該疫苗可為處于霍亂流行區(qū)的難民提供有效預防，得到WHO的大力推薦；再一類疫苗為基因重組的CVD103-HgR減毒活疫苗，雖然該疫苗在美國臨床試驗中顯示有60-100%的保護力，然而，疫苗株可能通過水平基因轉(zhuǎn)移或基因重組導致毒力回歸，不推薦用于公共衛(wèi)生防御。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型的霍亂弧菌01群多糖結(jié)合疫苗、其制備方法及應用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種霍亂弧菌01群多糖結(jié)合疫苗，其為霍亂弧菌Ol群表面多糖與蛋白載體的偶聯(lián)物，且所述霍亂弧菌01群表面多糖為霍亂弧菌01群的小川型或稻葉型血清型經(jīng)脫毒后的LPS (脂多糖，Lipopolysaccharide)。前述多糖結(jié)合疫苗中，所述霍亂弧菌01群表面多糖與蛋白載體的重量比為O. 2-3:1，優(yōu)選 O. 2-2:1，更優(yōu)選 1:1。前述多糖結(jié)合疫苗中，所述的蛋白載體為霍亂毒素B亞單位(Cholera Toxin Bsubunit, CTB)或大腸桿菌不耐熱腸毒素 B 亞單位(Heat-Labile Toxin B Subunit, LTB)。由于LTB能夠調(diào)節(jié)與自身免疫性疾病(關(guān)節(jié)炎、糖尿病、多發(fā)性硬化癥等)有關(guān)的Thl型反應，因此LTB比CTB更具優(yōu)勢，優(yōu)選使用的蛋白載體為LTB。前述多糖結(jié)合疫苗中，還含有藥用賦形劑，例如乳糖等。前述多糖結(jié)合疫苗中，還含有鋁鹽佐劑和/或硫柳汞。所述鋁佐劑如氫氧化鋁、磷酸招或硫酸招。
前述多糖結(jié)合疫苗在使用時，將疫苗溶于pH值6. (T9. O (優(yōu)選pH7. O )的緩沖體系中，制成噴霧劑或液體劑；所述緩沖體系為磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽或酒石酸鹽緩沖體系。本發(fā)明還提供制備所述霍亂弧菌01群多糖結(jié)合疫苗的方法，包括以下步驟O大規(guī)模培養(yǎng)霍亂弧菌后，滅活，離心并收集菌體；2)分離純化霍亂弧菌01群LPS ；3)脫除LPS中的內(nèi)毒素成分，透析、過濾、干燥后得純化的O-SP (O特異多糖，0-specificpolysaccharides) ；4)用溴化氰活化霍亂弧菌01群0-SP,以乙二酰肼為間隔劑,碳二亞胺為連接劑，將霍亂弧菌01群O-SP和載體蛋白進行偶聯(lián)；5)去除偶聯(lián)物中的內(nèi)毒素，分裝即得。其中，步驟3)為采用酸(如醋酸)水解法脫除LPS中的類脂A等內(nèi)毒素成分。本發(fā)明進一步提供所述霍亂弧菌01群多糖結(jié)合疫苗在制備用于預防或治療由霍亂弧菌01群引起的疾病的藥物中的應用。本發(fā)明提供的霍亂弧菌01多糖結(jié)合疫苗新配方制劑具有良好的生物活性，通過粘膜免疫，不良反應率低，更易被潛在用戶接受，可有效激發(fā)機體產(chǎn)生抗霍亂弧菌01群細菌抗體和抗霍亂毒素抗體。


圖I為本發(fā)明實施例9中霍亂弧菌01多糖結(jié)合疫苗的抗毒抗體檢測結(jié)果。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實施例I霍亂弧菌01群LPS的制備分別取購自中國醫(yī)學細菌保藏管理中心的霍亂弧菌(V. cholerae)CMCC 18001 (古典生物型、小川血清型)和霍亂弧菌(V. cholerae)CMCC 16012 (El Tor生物型、稻葉血清型)凍干工作種子批菌種，經(jīng)活化、發(fā)酵后離心獲得霍亂弧菌01群的菌體，用于制備LPS。取培養(yǎng)后離心得到的濕菌體IOOg,加入無熱源的雙蒸懼水至IOOOmL,充分混勻后，加入等體積95%的苯酚，用Imol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7. 0，68°C攪拌lh，迅速冷卻至10°C，水浴攪拌30min，4°C、8000g離心3h，吸取上清，依次加入終濃度為25%的乙醇、1%。的CaCl2、3%的醋酸鈉，4°C孵育過夜；9000rpm、4°C，離心6h，加入終濃度為75%的乙醇，沉淀過夜；6000rpm、4°C，離心lh，棄上清；加入RNA酶、DNA酶、蛋白酶K，孵育去除核酸、菌體蛋白；再次酚抽提，無熱源水充分透析，冷凍干燥，為精制LPS。 實施例2霍亂弧菌O-SP的制備采用酸水解法脫去LPS組成中的內(nèi)毒素成分-類脂A后，即得0-SP。分別取霍亂弧菌CMCC 18001和霍亂弧菌CMCC 16012凍干后的LPS，用1%冰醋酸溶解至終濃度為10mg/mL，沸水浴孵育90min后，冷卻至室溫，lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 0，經(jīng)60000g離心5h后收集上清；4°C，用無熱原的雙蒸水充分透析，經(jīng)O. 22 μ m濾膜過濾，真空干燥，即為精制0-SP。實施例3表達大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位工程菌的構(gòu)建I. I根據(jù)NCBI公布的大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位編碼基因(GenBank登錄號 AB011677，其中864-1238為LTB編碼基因)人工合成該基因，設(shè)計引物，加入核酸內(nèi)切酶酶切位點，上游弓I物 LTB-F 5’-GATATAGATCTATGAATAAAGTAAAATG-3’(下劃線為 Bgl II 酶切位點)，下游弓 I 物 LTB-R 5 ’ -CCGCTCGAGCTAGTTTTCCATACTGAT-3 ’(下劃線為 Xho I 酶切位點)；I. 2以人工合成的LTB DNA片段為模板，經(jīng)PCR擴增獲得375bp的大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位的編碼基因片段(SEQ ID No. I)；I. 3將該目的基因片段用Bgl II和Xho I進行雙酶切，與用相同核酸內(nèi)切酶酶切的表達載體pET-22b進行連接，導入宿主細胞E. coli BL21 (DE3)，經(jīng)篩選得到高效分泌表達大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位的工程菌株，命名為E. coli MH-LTBOOI ；I. 4按照《生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程》的要求，建立大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位表達菌株三級菌種庫。實施例4大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位制備I. I種子液制備將實施例3制備的工作種子批菌種接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜制備種子液，供發(fā)酵罐接種用；I. 2細菌發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)可選擇適宜大腸桿菌生長的培養(yǎng)基，可流加甘油等作為補充碳源。當細菌生長到OD6tltlnm=IO時，加入終濃度為O. 2mmol/L的IPTG誘導目的蛋白產(chǎn)生，繼續(xù)培養(yǎng)4飛h后，停止培養(yǎng)；I. 3分離純化調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至6. 5,6500rpm、4°C連續(xù)離心發(fā)酵液,收集菌體,用PH6. O的磷酸緩沖液洗滌菌體2-3次，勻漿破碎，8000rpm、4°C連續(xù)離心，去除沉淀、收集上清，用< 3kD的超濾膜濃縮LTB溶液，并進行離子交換層析純化，用含lmol/L NaCl的磷酸緩沖液洗脫目標蛋白，在280nm波長下檢測層析峰，收集目標峰，得到LTB溶液。I. 4過濾、保存純化后的LTB溶液用O. 22 μ m微孔濾膜進行除菌過濾，分裝于大瓶中，于2 8°C保存?zhèn)溆?。實施?霍亂弧菌01群O-SP與LTB偶聯(lián)物的制備采用相同的方法分別制備霍亂弧菌01群小川型和稻葉型LPS偶聯(lián)物。將霍亂弧菌01群兩種0-SP，分別用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(ρΗ7·2)稀釋至10mg/mL,按多糖與溴化氰(lg/mL,溶于乙腈)1:1的質(zhì)量比進行混合,用NaOH調(diào)節(jié)pH值至10. 5，室溫孵育Ih ;調(diào)節(jié)pH值至8. 5，加入終濃度為O. lmol/L的乙二酰肼反應l(T20min，4°C孵育過夜。過夜體系使用Sephadex G_25柱進行層析,收集VO峰,凍干備用。衍生后的多糖與載體蛋白LTB按0.8:1的質(zhì)量比混合，用I. Omol/LHCl調(diào)節(jié)pH值至5. 5,加入與多糖等量的碳二亞胺室溫下孵育lh。用Sepharose 4FF凝膠層析,純化O-SP-LTB偶聯(lián)物，收集Vtl峰，再經(jīng)O. 22 μ m濾膜除菌過濾，獲得O-SP-LTB偶聯(lián)物。參照《中華人民共和國藥典》(2010年版)規(guī)定的方法檢定蛋白含量、分子大小、鑒別試驗、內(nèi)毒素含量及無菌試驗等，項目合格后儲存于2-8°C備用。實施例6霍亂弧菌01群O-SP與CTB偶聯(lián)物的制備將霍亂弧菌01群兩種0-SP，分別用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(ρΗ7·2)稀釋至10mg/mL,按多糖與溴化氰(lg/mL,溶于乙腈)1:1的質(zhì)量比進行混合,用NaOH調(diào)節(jié)pH值至
10.5，室溫孵育Ih ;調(diào)節(jié)pH值至8. 5，加入終濃度為O. lmol/L的乙二酰肼反應l(T20min，4°C孵育過夜。次天，用含5mmol/L EDTA的磷酸緩沖液(pH7. 5)超濾換液，衍生后的多糖與載體蛋白CTB按O. 75:1的質(zhì)量比混合，調(diào)pH值至5. 5，加入與多糖等量的碳亞二胺室溫下孵育2 4h。用S印harose 4FF凝膠層析，純化莢膜多糖-DT偶聯(lián)物，收集Vtl峰，再經(jīng)O. 22 μ m濾膜除菌過濾，獲得獲得O-SP-CTB偶聯(lián)物。 參照《中華人民共和國藥典》(2010年版)規(guī)定的方法檢定蛋白含量、分子大小、鑒別試驗、內(nèi)毒素含量及無菌試驗等，項目合格后儲存于2-8°C備用。實施例7霍亂弧菌01群多糖結(jié)合疫苗的制備(蛋白載體為LTB)用O. 005mol/L磷酸緩沖液(pH7. O)稀釋實施例5制備的O-SP-LTB偶聯(lián)物，加入硫柳汞，疫苗組分以多糖質(zhì)量計，含量為2. 5X (I±30%) 48/1111，調(diào)節(jié)？!1值至7.0。實施例8霍亂弧菌01群多糖結(jié)合疫苗的制備(蛋白載體為CTB)用O. 005mol/L磷酸緩沖液(pH7. O)稀釋實施例6制備的O-SP-CTB偶聯(lián)物，加入硫柳汞，疫苗組分以多糖質(zhì)量計，含量為2. 5X (I±30%) 48/1111，調(diào)節(jié)？!1值至7.0。實施例9霍亂弧菌01群多糖結(jié)合疫苗的效果檢測將體重為12_16g雌性小白鼠隨機分組，每組15只，分別用上述0_SP_LTB偶聯(lián)物、未偶聯(lián)的0-SP、LTB、0-SP混合物(即小川型和稻葉型)于第1、14、28天進行免疫，同時設(shè)生理鹽水對照組。每組小鼠共免疫3次，每只小鼠每針次免疫劑量為2. 5 μ g0-SP-LTB偶聯(lián)物或
2.5 μ g0-SP混合物或相同劑量的多糖與LTB的混合物，注射體積為0. ImL,于第I、14、28天進行皮下免疫，同時設(shè)生理鹽水對照組。末次免疫2周后眼眶取血，制備血清。TTC法檢測殺弧菌抗體，試驗方法參照霍亂防治手冊(第五版)?？苟究贵w滴度提高8倍或更高具有臨床意義?？苟究贵w試驗結(jié)果如圖I所示，除生理鹽水對照組外，O-SP-LTB偶聯(lián)物、未偶聯(lián)的0-SP、LTB和O-SP混合物都可激發(fā)小鼠產(chǎn)生抗霍亂毒素抗體，其中O-SP-LTB偶聯(lián)物，即多糖-蛋白質(zhì)結(jié)合疫苗產(chǎn)生的抗體滴度升高效果尤其顯著(p〈0. 05)。以霍亂弧菌01型菌株569B為指示菌株，進行殺弧菌抗體試驗，抗體滴度提高4倍或更高具有臨床意義。如表I所示，多糖結(jié)合疫苗激發(fā)產(chǎn)生了顯著的殺弧菌抗體滴度(p〈0. 05)，多糖混合物雖然也可產(chǎn)生部分抗菌抗體，但不足以保護細菌的侵襲。表I結(jié)合疫苗殺弧菌抗體檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種霍亂弧菌01群多糖結(jié)合疫苗，其為霍亂弧菌01群表面多糖與蛋白載體的偶聯(lián)物，其特征在于，所述霍亂弧菌01群表面多糖為霍亂弧菌01群的小川型或稻葉型血清型經(jīng)脫毒后的LPS。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多糖結(jié)合疫苗，其特征在于，所述霍亂弧菌01群表面多糖與蛋白載體的重量比為O. 2-3:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多糖結(jié)合疫苗，其特征在于，所述的蛋白載體為霍亂毒素B亞單位或大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多糖結(jié)合疫苗，其特征在于，所述的蛋白載體為大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的多糖結(jié)合疫苗，其特征在于，其還含有藥用賦形劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的多糖結(jié)合疫苗，其特征在于，其還含有鋁佐劑和/或硫柳萊。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的多糖結(jié)合疫苗，其特征在于，使用時，將疫苗溶于pH值6. (T9. O的緩沖體系中，制成噴霧劑或液體劑；所述緩沖體系為磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽或酒石酸鹽緩沖體系。
8.制備權(quán)利要求1-4任一項所述霍亂弧菌01群多糖結(jié)合疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)大規(guī)模培養(yǎng)霍亂弧菌后，滅活，離心并收集菌體； 2)分離純化霍亂弧菌01群LPS； 3)脫除LPS中的內(nèi)毒素成分，透析、過濾、干燥后得純化的O-SP； 4)用溴化氰活化霍亂弧菌01群0-SP，以乙二酰肼為間隔劑，碳二亞胺為連接劑，將霍亂弧菌01群O-SP和載體蛋白進行偶聯(lián)； 5)去除偶聯(lián)物中的內(nèi)毒素，分裝即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟3)為采用酸水解法脫除LPS中的類脂A。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述霍亂弧菌01群多糖結(jié)合疫苗在制備用于預防或治療由霍亂弧菌01群引起的疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種霍亂弧菌O1群多糖結(jié)合疫苗，其為霍亂弧菌O1群表面多糖與蛋白載體的偶聯(lián)物，所述霍亂弧菌O1群表面多糖為霍亂弧菌O1群的小川型或稻葉型血清型經(jīng)脫毒后的LPS。本發(fā)明還提供所述多糖結(jié)合疫苗的制備方法及應用。本發(fā)明提供的霍亂弧菌O1多糖結(jié)合疫苗新配方制劑具有良好的生物活性，通過粘膜免疫，不良反應率低，更易被潛在用戶接受，可有效激發(fā)機體產(chǎn)生抗霍亂弧菌O1群細菌抗體和抗霍亂毒素抗體。
文檔編號A61P31/04GK102824632SQ201210337800
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月12日
發(fā)明者張靜飛, 陳磊, 魏文進, 曹天成, 何金娜 申請人:北京民海生物科技有限公司