一種高效表達(dá)抗癌基因的受特定miRNA調(diào)控的在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中特異增殖的腺病毒及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種受miRNA調(diào)節(jié)的能夠在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中特異性増殖的重組腺病毒載體。其特征在于：在該病毒的至少一個增殖必需基因的3端非翻譯區(qū)中插入至少一個miRNA的靶點(diǎn)核苷酸序列；所述的miRNA在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)缺失或降低而在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)正常，從而使得經(jīng)此改造后的重組腺病毒在缺失或低表達(dá)所述miRNA的腺病毒中特異性的増殖，而在正常表達(dá)所述miRNA的正常細(xì)胞中不增殖，因此不會對其產(chǎn)生細(xì)胞毒性。
【專利說明】—種高效表達(dá)抗癌基因的受特定miRNA調(diào)控的在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中特異增殖的腺病毒及其用途
[0001]發(fā)明領(lǐng)域:
本發(fā)明一般的涉及重組腺病毒載體。跟具體地說說，本發(fā)明涉及一種基于HIiRNA的調(diào)控可在膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的重組腺病毒載體以及其構(gòu)建方法和用途。
[0002]【背景技術(shù)】:
基因治療是一種新型的治療手段，可治療多種疾病，包括癌癥、遺傳病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。過去幾年里，全世界的基因治療取得了巨大的進(jìn)步。截止2008年9月，臨床試驗(yàn)總數(shù)已達(dá)1432項(xiàng)，第一個基因治療藥物-“今又生”已由我國深圳賽百諾公司自主研發(fā)，并獲準(zhǔn)上市(參見 http://www.wiley.c0.uk/genmed/clincal/)。 [0003]腺病毒是目前基因治療最常見的載體之一，全球近1/4的基因治療臨床試驗(yàn)方案采用腺病毒作為載體。腺病毒相比較于其他載體的優(yōu)勢在于:(1)裝載容量大；(2)能夠感染的細(xì)胞種類廣泛，轉(zhuǎn)導(dǎo)率較高，能夠有效轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂期和非分裂期的細(xì)胞；(3)在細(xì)胞中以游離狀態(tài)存在，不整合到靶細(xì)胞基因組中，因而不會引起插入突變，無致癌性；(4)滴度高(可達(dá)1012vp/mL)，穩(wěn)定性好，便于儲存和運(yùn)輸，易于規(guī)模化生產(chǎn)和運(yùn)輸。
[0004]人腺病毒分為A，B，C，D，E，F(xiàn)六個亞屬共49個血清型。目前應(yīng)用于基因治療的腺病毒載體絕大多數(shù)是C亞屬的2及5血清型腺病毒。隨著病毒學(xué)，分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，人們已經(jīng)完成了多個腺病毒全基因組的測序，并對其基因的結(jié)構(gòu)及其功能進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，能有效地對腺病毒基因進(jìn)行改造。例如，以組織特異性啟動子調(diào)控E1A、E1B的表達(dá)、缺失ElA的長度為24bp的Rb蛋白的結(jié)合區(qū)、缺失ElB 55kD、19kD基因等。改造后的腺病毒能在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行選擇性復(fù)制和增殖，而在正常細(xì)胞內(nèi)，増殖能力被大大削弱。
[0005]但是，改造后的腺病毒載體仍存在一定的問題，以腫瘤基因治療為例，首先，腫瘤產(chǎn)生的機(jī)制非常復(fù)雜，異質(zhì)性很強(qiáng)，病人和病人之間，腫瘤與腫瘤之間，同一腫瘤的不同腫瘤細(xì)胞之間均存在明顯差異。例如，端粒酶雖然已被報道在腫瘤中異常表達(dá)，但其表達(dá)量變化較大，在某些病人、腫瘤類型或某些腫瘤細(xì)胞群體中其表達(dá)情況與正常細(xì)胞無異，這使得端粒酶啟動子調(diào)控ElA的重組腺病毒載體在這種情況下不能選擇性的在腫瘤細(xì)胞中有效增殖，從而影響治療效果。其次，腫瘤組織中的物理因素如纖維化，混入正常細(xì)胞以及壞死區(qū)域也可能限制腺病毒擴(kuò)散。再次，某些腫瘤細(xì)胞膜上的科薩奇腺病毒受體表達(dá)量低限制了腺病毒的感染效率。第四，病人的免疫反應(yīng)限制腺病毒的増殖和擴(kuò)散。目前，美國ONYX藥物公司嘗試單獨(dú)應(yīng)用Elb 55kD蛋白缺失的腺病毒(0NYX-015治療腫瘤，其臨床的有效率僅為 15-20% (Nemunaitis et al.，2000 ；US 5677178 ；US 5801029)
因此，基因治療領(lǐng)域非常需要可以選擇性地在腫瘤細(xì)胞中增殖而在正常細(xì)胞中不增殖的腺病毒載體系統(tǒng)。從而實(shí)現(xiàn)更有效，更特異地在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)外源基因，同時最大限度地避免對正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
[0006]微小RNA (microRNA)是生物體內(nèi)源的小片段RNA，通過與靶基因成熟mRNA的3端非翻譯區(qū)中的靶點(diǎn)核苷酸序列，抑制靶基因蛋白的翻譯。微小RNA具有高度的組織特異性和時序性，在不同類型的細(xì)胞中表達(dá)水平差異大。近幾年的研究表明，微小RNA表達(dá)的失調(diào)和腫瘤發(fā)生相關(guān)，多個在正常組織細(xì)胞中的表達(dá)的微小RNA在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)確實(shí)或顯著下調(diào)。
[0007]因而可借助微小RNA的調(diào)控機(jī)制及其在腫瘤組織與正常組織的表達(dá)差異，利用在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)確實(shí)或降低而在正常細(xì)胞中表達(dá)正常的微小RNA調(diào)控腺病毒的増殖必需基因的表達(dá)不受影響，能大量増殖與復(fù)制，達(dá)到治療目的。
[0008]

【發(fā)明內(nèi)容】

_9] 發(fā)明目的
為了使得腺病毒載體選擇性地在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中增殖而在正常神經(jīng)和膠質(zhì)細(xì)胞中不增殖，同時最大限度地避免對正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性，我們構(gòu)建由膠質(zhì)瘤細(xì)胞低表達(dá)的微小RNA靶位點(diǎn)調(diào)控其增殖的腺病毒載體。
_0] 技術(shù)解決方案
本發(fā)明提供了一種重組腺病毒載體，其特征在于:在該腺病毒載體的至少一個増殖必需基因的3端非翻譯區(qū)中插入至少一個微小RNA靶位點(diǎn):所述微小RNA在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)缺失或降低而在正常細(xì)胞中表達(dá)正常。
[0011]在一個實(shí)施方案中，所述微小RNA可以選自miR-7，miR-16, miR-19a, miR-20a,miR-26b, miR-124, miR-128, miR-129, miR-137, miR-139, miR-140, miR-146b,miR-181b, miR-184, miR-205, miR-218, miR-219_5p，miR-328 和 miR-451 中的至少一種。所述微小RNA優(yōu)選選自miR-`124，miR-128, miR-146b和miR-218中的至少一種。
[0012]在一個實(shí)驗(yàn)方案中，所述微小RNA靶位點(diǎn)序列由一個或數(shù)個相同的微小RNA靶位點(diǎn)序列以串聯(lián)重復(fù)的方式構(gòu)成。
[0013]在一個實(shí)施方案中，所述微小RNA靶位點(diǎn)序列由一個或數(shù)個不同的微小RNA靶位點(diǎn)以串聯(lián)重復(fù)的方式構(gòu)成。
[0014]在一個實(shí)施方案中，所述的腺病毒増殖必需基因是腺病毒早期表達(dá)基因(E1A，ElB, E2，E4)或晚期表達(dá)基因。
[0015]在一個實(shí)施方案中，所述的腺病毒増殖必需基因可以同時受腫瘤特異激活順勢元件的調(diào)控，或被缺失或突變。
[0016]在一個實(shí)施方案中，所述的重組腺病毒的基因組中可操作的連接有外源基因，所述外源基因選自抑癌基因，有抑制血管生成作用的基因，前藥轉(zhuǎn)化酶基因，促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因，促進(jìn)細(xì)胞自噬基因，抗體基因和疫苗基因中的至少一種。
[0017]在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于:在所述腺病毒載體的至少一個増殖必需基因的3端非翻譯區(qū)中至少插入一個微小RNA靶位點(diǎn)核苷酸序列，所述微小RNA在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)缺失或降低而在正常細(xì)胞中表達(dá)正常。
[0018]在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及重組腺病毒載體的用途:其用于使重組腺病毒選擇的在相應(yīng)微小RNA表達(dá)確實(shí)或降低的腫瘤細(xì)胞中増殖，而在正常表達(dá)該微小RNA的正常細(xì)胞中不增殖。
[0019]在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及重組腺病毒載體的用途:其用于使重組腺病毒基因組中科操作的連接的外源基因選擇性的在缺乏或降低相應(yīng)微小RNA表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，而在正常表達(dá)該微小RNA的正常細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)。本發(fā)明還涉及所述蟲子腺病毒載體用于抑制腫瘤細(xì)胞的生長的用途。
[0020]技術(shù)效果
與現(xiàn)有的基因治療方法相比，本發(fā)明有如下有益效果:
本發(fā)明在至少一個腺病毒増殖必需基因的3端非翻譯區(qū)中至少插入一個在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)確實(shí)或降低而正常細(xì)胞表達(dá)正常的微小RNA靶位點(diǎn)核苷酸序列，成功實(shí)現(xiàn)了腺病毒在缺失或降低該微小RNA的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性復(fù)制和増殖，使外源基因隨腺病毒復(fù)制而大量表達(dá)，達(dá)到治療效果。而在正常表達(dá)該微小RNA的細(xì)胞，腺病毒的増殖必需基因不能合成，腺病毒不能増殖與復(fù)制，減少對正常細(xì)胞的損害。本發(fā)明還可聯(lián)合腫瘤細(xì)胞特異激活的順式作用元件(如腫瘤特異性啟動子)控制腺病毒相同或其他增殖必需基因，進(jìn)一步提高基因治療的靶向性與安全性。
[0021]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]附圖1
含有5型腺病毒ElA序列的質(zhì)粒pXCl，其中標(biāo)注了內(nèi)切酶雄a /的位置。
[0023]附圖2
受miR-124，miR-128，miR-146b和miR-218調(diào)控5型腺病毒0A_4MREs在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中復(fù)制情況的比較。橫坐標(biāo)表示各種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系以及正常細(xì)胞系。縱坐標(biāo)表示腺病毒0A-4MREs和Ad-WT感染細(xì)胞48小時后的病毒產(chǎn)量(pfu/mL)。
[0024]附圖3` 受miR-124，miR-128, miR-146b和miR-218調(diào)控5型腺病毒0A_4MREs對膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞體外殺傷效果的比較。橫坐標(biāo)表示加入的腺病毒0A-4MRES和Ad-WT的MOI值?？v坐標(biāo)表示實(shí)驗(yàn)孔(施加病毒)與對照孔(未施加病毒)光吸收的比值。
[0025]附圖4
受miR-124，miR-128，miR-146b和miR-218調(diào)控5型腺病毒0A_4MREs對膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞體內(nèi)殺傷效果的比較。橫坐標(biāo)表示腫瘤體積測量的時間(天)。縱坐標(biāo)表示腫瘤的體積(mm3)。
【具體實(shí)施方式】
[0026]實(shí)施例1
受miR-124，miR-128, miR-146b和miR-218調(diào)控的含5型腺病毒ElA的載體構(gòu)建由加拿大Microbix Biosystem公司購得含有5型腺病毒22_5790bp序列的pXCl質(zhì)粒(含完整的5型腺病毒ElA區(qū)域，見附圖1)，使用限制性內(nèi)切酶雄a /進(jìn)行酶切得到線性化pXCl載體。于上海生工公司合成引物I和引物2，該兩個引物互為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得含有ElA的1116-1185bp序列以及單酶切位點(diǎn)汾I, Age /和/的雙鏈DNA片段。使用連接酶將該雙鏈DNA片段與線性化pXCl載體連接，得到重組質(zhì)粒pXCl-BAS。pXCl-BAS中被引入了位于終止密碼子TAA后的單酶切位點(diǎn)BstB I, Age I和Sal I。
[0027]弓丨物I (5，-3，):AACCGCCTTTGTTTGCTGAATGAGTTGATGTAAGTTTAATAAAGGGTGAGATAATGTTT
引物 2 (5’ -3’ ):
GTCGACGCAACCGGTACGTTCGAATTAAACATTATCTCACCCTTTATTAAACTTACAT于上海生工公司合成引物3-6。其中引物3和4含有各兩個拷貝的miR-124和miR-128的靶位點(diǎn)(下劃線部分)，引物5和6含有各兩個拷貝的miR-146b和miR-218的靶位點(diǎn)(下劃線部分)。引物3和4退火后與妨I /Age /雙酶切處理的pXCl-BAC載體連接，得到含有miR-124和miR-128的靶位點(diǎn)的過渡載體pXCl_124_128。弓丨物5和6退火后與命e I /Sal /雙酶切處理的pXCl-124-128載體連接，得到含有miR-124，miR-128, miR_146b和miR-218的靶位點(diǎn)的載體pXCl-4MREs。該載體含有受上述4種微小RNA調(diào)控的5型腺病毒ElA序列以及同于腺病毒重組的病毒基因組左臂。
[0028]引物3 (5，-3’): CGAAACAAACACCGTGCCTTAAACAAACACCGTGCCTTAAACAAACACCCACTGTGAACAAACACCCACTGTGAAA
引物 4 (5，-3，): CCGGTTTCACAGTGGGTGTTTGTTCACAGTGGGTGTTTGTTTAAGGCACGGTGTTTGTTTAAGGCACGGTGTTTGTTT
引物 5 (5’-3，): CCGGTACAAACACCGAGAACTACAAACACCGAGAACTACAAACACCTGTGCTTACAAACACCTGTGCTTG
引物 6 (5，-3，): TCGACAAGCACAGGTGTTTGTAAGCACAGGTGTTTGTAGTTCTCGGTGTTTGTAGTTCTCGGTGTTTGTA實(shí)施例2
受miR-124，miR-128, miR-146b和miR-218調(diào)控5型腺病毒的重組和包裝用于腺病毒重組包裝的細(xì)胞系人胚腎成纖維細(xì)胞HEK-293購自加拿大MicrobixBiosystem公司。該細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)5型腺病毒的ElA蛋白，并且易于轉(zhuǎn)染。將含有腺病毒基因組左臂和右臂的質(zhì)粒同時導(dǎo)入該細(xì)胞中，可以發(fā)生同源重組進(jìn)而生產(chǎn)具有感染活性的腺病毒。將含腺病毒基因組左臂的pXCl-4MREs與含病毒基因組右臂的質(zhì)粒pBHG同時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過同源重組獲得具有感染力的腺病毒0A-4MRES。該重組腺病毒ElA的表達(dá)受到微小RNA miR-124, miR-128, miR-146b和miR-218的調(diào)控，在不表達(dá)或低表達(dá)上述微小RNA的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ElA能夠表達(dá)，從而促使腺病毒高效増殖；在正常表達(dá)上述微小RNA的正常神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞中ElA表達(dá)受到抑制，因而阻止了腺病毒的復(fù)制，從而使得重組腺病毒0A-4MRES具備了腫瘤靶向性。
[0029]實(shí)施例3
受miR-124，miR-128，miR-146b和miR-218調(diào)控5型腺病毒0A_4MREs在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中復(fù)制情況的比較
將10M0I的重組腺病毒0A-4MREs和野生型腺病毒(Ad_WT，ElA表達(dá)不受miR-124，miR-128，miR-146b 和 miR-218 的調(diào)控)感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 U-87 MG, U-251 MG, U-373 MG和M059J，從膠質(zhì)瘤病人的腫瘤組織中培養(yǎng)的原代細(xì)胞GT-1和GT-2以及正常細(xì)胞膠質(zhì)細(xì)胞NES，正常神經(jīng)細(xì)胞HCN-2，正常內(nèi)皮細(xì)胞HUV-EC-C，正常肝臟細(xì)胞L-02和正常成纖維細(xì)胞MRC-5。2小時后，吸凈培養(yǎng)基，并用PBS洗3次，再添加新鮮培液。2天后反復(fù)凍溶細(xì)胞3次后吸取上清，在HEK293細(xì)胞中使用TCID5tl法測定病毒滴度。結(jié)果見附圖2。0A_4MREs在正常細(xì)胞NES，HCN-2, HUV-EC-C, L-02和MRC-5中都幾乎檢測不到増殖，而在膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U-87 MG, U-251 MG, U-373 MG, M059J, GT-1 和 GT-2 中，0A-4MRE 的増殖能力僅受到微弱的影響(與野生型腺病毒Ad-WT的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，仍然保持在較高水平，表現(xiàn)出腫瘤特異性的増殖方式。相比之下，未經(jīng)改造的野生型腺病毒Ad-WT在所有細(xì)胞中均表現(xiàn)出很強(qiáng)的増殖能力，不具備腫瘤特異性。
[0030]實(shí)施例4
受miR-124，miR-128，miR-146b和miR-218調(diào)控5型腺病毒0A_4MREs對膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞體外殺傷效果的比較
將IXlO4的上述正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞鋪于96孔板，每孔加入0.01，0.02, 0.05,
0.1, 0.2, 0.5, I, 2，5，10, 20, 50 和 100M0I 的 0A_4MREs 和 Ad_WT，病毒感染細(xì)胞后 7天，每孔加入MTT溶液(5mg/mL) 20uL, 4小時后，加入100 μ L DMSO0用酶標(biāo)儀檢測595nm下每孔的吸收值。以加入病毒MOI值為橫軸，實(shí)驗(yàn)孔與對照孔光吸收的比值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)果見附圖3。0A-4MREs對正常細(xì)胞NES, HCN-2, HUV-EC-C, L-02和MRC-5幾乎沒有殺傷作用，而對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-87 MG, U-251 MG, U-373 MG, M059J, GT-1和GT-2，0A-4MRE顯示出很強(qiáng)的殺傷能力，與野生型腺病毒Ad-WT相當(dāng)。因此0A-4MRE的殺傷能力表現(xiàn)出很強(qiáng)的腫瘤特異性。相比之下，未經(jīng)改造的野生型腺病毒Ad-WT在所有細(xì)胞中均表現(xiàn)出很強(qiáng)的殺傷作用，不具備腫瘤特異性，對正常細(xì)胞的毒副作用較強(qiáng)。
[0031]實(shí)施例5
受miR-124，miR-128，miR-146b和miR-218調(diào)控5型腺病毒0A_4MREs對膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞體內(nèi)殺傷效果的比 較
將U87-MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞注射至3-4周齡的雄性BalB/c小鼠(購自上海生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心)皮下(2X IO6/只)，待腫瘤生長至150 mm3左右時，將其隨機(jī)分成3組(n=6)，向瘤內(nèi)注射PBS或5 X IO8 pfu的0A-4MRES和野生型腺病毒Ad-WT。隨后每隔7天觀察腫瘤生長情況并用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小。腫瘤體積計(jì)算公式(mm3) =長X寬X寬/2，結(jié)果見附圖
4。0A-4MRES對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-87 MG顯示出很強(qiáng)的殺傷能力，與野生型腺病毒Ad-WT相當(dāng)。
[0032]
本發(fā)明中的實(shí)施例僅用于示例性的說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，其不限制本申請的保護(hù)范圍，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行的等價改良都包括在本申請的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種重組腺病毒載體，其特征在于:該病毒載體的至少一個增殖必需基因的3端非翻譯區(qū)中插入至少一個微小RNA靶點(diǎn)的核苷酸序列，所述的微小RNA在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)缺失或降低而在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)正常。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒載體，其特征在于所述微小RNA可以選自miR-124, miR-128, miR_146b and miR-218 中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒載體，其特征在于所述微小RNA靶點(diǎn)序列由一個或多個相同的微小RNA靶點(diǎn)序列以連續(xù)串聯(lián)方式構(gòu)成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒載體，其特征在于所述微小RNA靶點(diǎn)序列由一個或多個不同的微小RNA靶點(diǎn)序列以連續(xù)串聯(lián)或間隔串聯(lián)的方式構(gòu)成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒載體，其特征在于所述腺病毒增殖必需基因選自腺病毒早期表達(dá)基因:E1A，ElB, E2和E4中的至少一個。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒載體，其特征在于所述腺病毒增殖必需基因選自腺病毒晚期表達(dá)基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒載體，其特征在于所述重組腺病毒的基因組中還可操作的連接有外源基因，所述外源基因選自抑癌基因，有抑制血管生成作用的基因，前藥轉(zhuǎn)化酶基因，促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因，促進(jìn)細(xì)胞自噬基因，抗體基因和疫苗基因中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒載體，其特征在于所述重組腺病毒的基因組中還可操作的連接有選自缺氧反應(yīng)元件、細(xì)胞S期特異性啟動子、甲胎蛋白增強(qiáng)子及啟動子、癌胚抗原增強(qiáng)子及啟動子、酪氨酸酶增強(qiáng)子及啟動子、尿激酶纖維蛋白激活劑增強(qiáng)子及啟動子、ErbB2增強(qiáng)子及啟動子、ErbB3增強(qiáng)子及啟動子、ErbB4增強(qiáng)子及啟動子、DF3乳腺癌相關(guān)抗原增強(qiáng)子、前列腺素特異性抗原增強(qiáng)子及啟動子、腺血管舒緩素增強(qiáng)子及啟動子、EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的FR增強(qiáng)子和EB病毒BamH I C-啟動子中的至少一種順式作用元件，所述順式作用元件調(diào)控所述重組腺病毒的增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于在所述腺病毒至少一個增殖必需基因的3端非翻譯區(qū)中插入至少一個微小RNA的靶點(diǎn)核苷酸序列，所述微小RNA在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)缺失或降低而在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)正常。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述重組腺病毒載體的用途，其特征在于所述重組腺病毒用于選擇性的在缺失或低表達(dá)相應(yīng)微小RNA的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中増殖，而在正常表達(dá)該微小RNA的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)不增殖。
【文檔編號】A61P35/00GK103667347SQ201210329533
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月8日
【發(fā)明者】劉佳, 馬蕾娜, 郭國財 申請人:劉佳