一種新型抗病毒多肽及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種新型抗病毒多肽AVP-W2及其制備方法與應(yīng)用，其特征在于分離的多肽基因序列為SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列，其AVP-W2的前體組織形式編碼74個(gè)氨基酸殘基，由22個(gè)殘基信號(hào)肽、17個(gè)殘基成熟肽和35個(gè)殘基前體肽三個(gè)部分組成，且具有SEQ?ID?NO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了抗病毒多肽AVP-W2在制備治療抑制HIV病毒增殖藥物方面的應(yīng)用?？共《窘Y(jié)果實(shí)驗(yàn)表明合成多肽AVP-W2對(duì)MeV和HIV增殖的高效抑制作用，在10μg/mL時(shí)，AVP-W2對(duì)MeV和HIV的抑制率就可以達(dá)到100％抑制。
【專利說(shuō)明】一種新型抗病毒多肽及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體涉及一種高效抗病毒功能的多肽。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種東亞鉗蝎抗病毒多肽在抗麻疹病毒(MeV)和人免疫缺陷病毒(HIV)中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]病毒感染是一個(gè)嚴(yán)重危害人類健康的疾病，這個(gè)問(wèn)題困擾了人類多年。早在公元前412年的古希臘時(shí)期，希波克拉底就已經(jīng)記述了類似流感的疾病；1742年至1743年由流感病毒引起的流行性感冒曾殃及90%的東歐人；1889年至1894年席卷西歐的“俄羅斯流感”，發(fā)病范圍廣泛，死亡率很高；1918年，一場(chǎng)致命的流感席卷全球，造成了 2000萬(wàn)至5000萬(wàn)人死亡；1957年“亞洲流感”及1968年“香港流感”的爆發(fā)，就美國(guó)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)看,分別有7萬(wàn)人和3.4萬(wàn)人因此喪命；流感病毒平均每年在美國(guó)也導(dǎo)致11萬(wàn)多人住院，3.4萬(wàn)人死亡。1981年6月，美國(guó)疾病控制中心首先報(bào)道了 5例獲得性人類免疫缺陷癥，隨后，在美國(guó)和其他國(guó)家都陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了類似癥狀的病人，后在全世界大規(guī)模傳播開(kāi)來(lái)；至2003年艾滋病毒感染新例達(dá)到近550萬(wàn)例，使全世界艾滋病毒(HIV)攜帶者和病人(AIDS)數(shù)量達(dá)到3430萬(wàn)人。報(bào)告指出，除非出現(xiàn)奇跡，大部分病人將在今后10年內(nèi)死亡。自人類發(fā)現(xiàn)艾滋病后，已有1880萬(wàn)人死于該絕癥；由SARS病毒引起的“非典”在2003年爆發(fā)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)字，2003年全球累計(jì)非典病例共8422例，全球因非典死亡人數(shù)919人，病死率近11%。從這些統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可以看出，病毒感染已經(jīng)對(duì)人類的健康造成極大的危害，并且還正在繼續(xù)危害人類的健康。
[0003]病毒分布廣泛，能引起各種人類疾病，難以治療，危害人類健康。比如HIV病毒引起的獲得性人類免疫缺陷癥(AIDS)，該病患者的免疫功能部分或完全喪失，CD4+細(xì)胞數(shù)目減少，繼而發(fā)生機(jī)會(huì)性感染、腫瘤等，臨床表現(xiàn)多種多樣。該病傳播速度快、病死率高，且目前無(wú)法治愈；流感目前沒(méi)有藥物可以治愈，市面上的流感藥物只能夠減輕流感癥狀，通過(guò)人體自身的免疫能力對(duì)抗病毒?，F(xiàn)在比較有效的方法是注射流感疫苗預(yù)防，有效率為70%至90%。由于流感病毒極其容易發(fā)生變異，每年流行的流感病毒類型不一樣，因此必須每年注射疫苗才能發(fā)揮作用；乙肝沒(méi)有辦法治愈，但是可以其控制不發(fā)作，一旦感染，終生攜帶。病毒很難殺滅，是由于病毒使用了寄主的活動(dòng)機(jī)制?，F(xiàn)有的抗病毒藥物一般為病毒遺傳物質(zhì)復(fù)制的抑制劑，這些抑制劑也會(huì)抑制人體的遺傳物質(zhì)復(fù)制，所以對(duì)人體也是具有毒性的，所以現(xiàn)在最積極的預(yù)防病毒的方法仍然還是接種疫苗。但是有些病毒如流感、HIV，其自身遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定，容易發(fā)生突變，從而使得在此之前的疫苗對(duì)這種新的突變病毒的預(yù)防作用降低或者完全失效。而陽(yáng)離子防御肽的發(fā)現(xiàn)使人們看到了治療病毒疾病的新方法。
[0004]陽(yáng)離子防御肽是一類由宿主生成，并且在天然免疫中特異性發(fā)揮防御性作用的一類小肽。這一類小分子多肽通常由10-50個(gè)氨基酸構(gòu)成，靜電荷從+2到+9不等，在生物體抵御微生物的入侵中發(fā)揮重要的作用。根據(jù)結(jié)構(gòu)的差別，陽(yáng)離子防御肽可以分為如下幾類:含有2-4個(gè)P片層的兩親性分子、兩親性a螺旋、卷曲結(jié)構(gòu)、以及含有高級(jí)結(jié)構(gòu)的分子。陽(yáng)離子防御肽在體內(nèi)對(duì)細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)、以及病毒的侵染均有有效的抵御作用。研究表明，蜂毒溶血肽Melitiin和天蠶素Cecropins在亞毒性濃度下通過(guò)阻遏基因表達(dá)來(lái)抑制人免疫缺陷病毒HIV-1的增殖，爪蟾抗病毒肽Magainin-2對(duì)皰疹病毒HSV-1和HSV-2有一定的抑制效果，這些多肽都是a螺旋類陽(yáng)離子防御肽。目前的研究表明，a螺旋類陽(yáng)離子防御肽特異性作用于有包膜的RNA病毒及DNA病毒，其作用方式通常是作用于病毒進(jìn)入的過(guò)程，或者是直接作用于病毒的包膜。例如，Dermas印tin就是通過(guò)作用于HIV的包膜而引起HIV的失活，從而達(dá)到抗病毒的作用。所以，陽(yáng)離子防御肽不再是傳統(tǒng)的疫苗防治，而是通過(guò)直接抑制病毒達(dá)到抗病毒的目的。
[0005]蝎子中陽(yáng)離子防御肽的研究也已經(jīng)有多年的歷史。其中除了從淋巴系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的防御肽外，更多的是從蝎毒腺中分離到的防御肽，例如hadrurin, Scorpine, opistoporin,parabutoporin, ISCT, pandinin。這些肽的功能都已經(jīng)得到有效的鑒定。本室長(zhǎng)期從事蝎毒素的研究，目前從文庫(kù)中篩選并鑒別的系列陽(yáng)離子多肽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是在于提供了一種抗病毒的多肽，抗病毒活性高，該抗病毒肽含有17個(gè)氨基酸，生產(chǎn)成本低，水溶性好。
[0007]本發(fā)明涉及一種抗病毒多肽在制備治療或預(yù)防麻疹病毒(MeV)和人免疫缺陷病毒(HIV)感染的藥物中的應(yīng)用，具有抑制病毒感染的功能，抑制效果好，無(wú)副作用。多肽AVP-W2在制備MeV和HIV引起疾病的治療或預(yù)防藥物中的應(yīng)用，其在預(yù)防和治療由MeV和HIV所引起的感染效果顯著。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，采用化學(xué)合成的方法，獲得了蝎毒抗病毒多肽AVP-W2，抗病毒試驗(yàn)結(jié)果表明，抗病毒多肽AVP-W2對(duì)MeV和HIV有明顯的抑制作用。當(dāng)AVP-W2的濃度達(dá)到10 u g/mL時(shí)，AVP-W2對(duì)MeV和HIV的抑制率就可以達(dá)到100%抑制。ABP-W2是一種具有抗病毒能力陽(yáng)離子防御肽，目前的研究結(jié)果顯示ABP-W2抗病毒能力強(qiáng)，毒性低；加上ABP-W2只有17個(gè)氨基酸，工業(yè)生產(chǎn)成本低，所以將陽(yáng)離子抗病毒肽ABP-W2應(yīng)用于抗病毒藥物具有廣闊的前景。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種新型抗病毒多肽AVP-W2，其特征在于分離的東亞鉗蝎抗病毒的多肽的編碼基因，其序列為SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；其AVP-W2的前體組織形式編碼74個(gè)氨基酸殘基，由22個(gè)殘基信號(hào)肽、17個(gè)殘基成熟肽和35個(gè)殘基前體肽三個(gè)部分組成，且具有SEQ IDN02所示的氨基酸序列。
[0009]本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了新型抗病毒多肽AVP-W2的制備方法，:首先構(gòu)建高質(zhì)量東亞鉗蝎毒腺組織cDNA文庫(kù):
(1)蝎毒腺總RNA的分離和mRNA純化；
(2)cDNA的第一鏈和第二鏈合成，雙鏈cDNA與pSPORTl載體的連接和轉(zhuǎn)化，獲得蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)；
(3)在構(gòu)建文庫(kù)的基礎(chǔ)上，隨機(jī)挑選50克隆子進(jìn)行測(cè)序，序列分析發(fā)現(xiàn)W2克隆子為一個(gè)新的東亞鉗蝎抗病毒肽基因，命名為AVP-W2 ；
(4)在10ii g/mL時(shí)，AVP-W2對(duì)MeV和HIV的抑制率就可以達(dá)到100%抑制。
[0010]本發(fā)明還公開(kāi)了含有新型抗病毒多肽AVP-W2及一種或多種藥用輔料的組合物。其中所述的組合物為固體制劑或液體制劑。固體制劑為膠囊、軟膠囊、片劑、含片、顆粒劑或滴丸；液體制劑為口服液或注射液。
[0011]本發(fā)明所用到的輔料指的是藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑及其它添加劑形成的化合物，可采用乳糖或淀粉做載體，明膠，羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等是合適的結(jié)合劑或成顆劑。作為崩解劑可選用淀粉或微晶纖維素，常以滑石粉，膠體硅膠，硬脂酸甘油酯，硬脂酸鈣或鎂等作為合適的抗粘合劑和潤(rùn)滑劑。例如，可通過(guò)壓制濕顆粒來(lái)制備片劑。活性成分與載體以及選擇性的與一份崩解添加劑組成混合物，該混合物與粘合劑的含水溶液，醇性或含水醇性溶液在合適的設(shè)備中進(jìn)行顆?；?，干燥顆粒隨后加入其它的崩解劑，潤(rùn)滑劑和抗粘劑將此混合物壓片。
[0012]本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了新型抗病毒多肽AVP-W2在制備治療或預(yù)防麻疹病毒的藥物中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了新型抗病毒多肽AVP-W2在制備治療或預(yù)防人免疫缺陷病毒的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明首先構(gòu)建高質(zhì)量東亞鉗蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)，具體包括蝎毒腺總RNA的分離和mRNA純化，cDNA的第一鏈和第二鏈合成，雙鏈cDNA與pSPORTl載體(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen)的連接和轉(zhuǎn)化,獲得蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)。在構(gòu)建文庫(kù)的基礎(chǔ)上，隨機(jī)挑選50克隆子進(jìn)行測(cè)序，序列分析發(fā)現(xiàn)W2克隆子為一個(gè)新的東亞鉗蝎抗病毒肽基因，命名為AVP-W2o 其序列為 SEQ ID NO:1 所不的核苷酸序列:tactaggaaaatgaaagttaaattccttctcgctgtcttcttgatcgt tttggttgttactgatcattgtcatgcattggtcggacttctcccttcggtgatcggagggctggtatcagcattcaagggccgaaggaaacgccagatggaagctcgattcgaaccccaaaataggaattacaggaaacgcgagctcgaccttgaaaagttattcgcaaatatgcctgattactgatctcaattactctttcagtttcatcgcttagcataagtttttcaagttactgccgctactattgcatcatgatgtgaattggttactttctaatataataaaaaa
[0014]AVP-W2的前體組織形式編碼74個(gè)氨基酸殘基，由三個(gè)部分組成，即信號(hào)肽(22個(gè)殘基)、成熟肽(17個(gè)殘基)和前體肽(35個(gè)殘基)?；谛舅厍绑wC末端殘基的加工規(guī)貝IJ, AVP-W2末端最后的殘基Phe被特異性羧肽酶(Carboxypeptidase)切除,且被酰氨化。因此本發(fā)明提供一個(gè)東亞鉗蝎蝎毒抗病毒肽:LVGLLPSVIGGLVSAFK-NH2(SEQ ID NO:2)。
[0015]本發(fā)明提供的一種高效抗麻疹病毒的多肽(SEQ ID NO:2)。通過(guò)固相化學(xué)合成的辦法，得到了純度達(dá)95%以上的合成多肽AVP-W2?？共《窘Y(jié)果表明合成多肽AVP-W2對(duì)MeV和HIV增殖的高效抑制作用，在10 ii g/mL時(shí)，AVP-W2對(duì)MeV和HIV的抑制率就可以達(dá)到100%抑制。
[0016]本發(fā)明涉及的AVP-W2抗病毒多肽，只含有17個(gè)氨基酸，生產(chǎn)成本低，水溶性好。對(duì)于MeV和HIV有良好的抑制作用，而且沒(méi)有副作用。與現(xiàn)有的抗病毒藥物相比，這個(gè)藥物具有更加直接而且有效的作用。
[0017]【具體實(shí)施方式】
下面結(jié)合實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，這里所述實(shí)施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)由權(quán)利要求來(lái)限定。本發(fā)明所用到的各種試劑均有市售。
[0018]實(shí)施例1:
一種蝎毒抗病毒多肽的制備。步驟如下:A:蝎毒腺總RNA的提取(Trizol LS 一步法:Trizol LS購(gòu)自美Invitrogen)
①取500mg的蝎尾腺在液氮中研成細(xì)粉末，加入IOml Trizol LS混勻，室溫(20-250C，以下相同)放置5分鐘；②然后加入2ml氯仿混合15秒，室溫放置2_3分鐘，4°C下12000g離心15分鐘；③取水相加I倍體積異丙醇，室溫放置10分鐘，4°C下12000g離心10分鐘得RNA沉淀；@沉淀用5ml75%乙醇洗滌，7500g離心5分鐘RNA沉淀干燥后溶于DEPC(diethypyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)處理的滅菌水,55-60°C保溫10分鐘以徹底溶解RNA。整個(gè)過(guò)程參照TRIZOL (Total RNA Isolation) Reagent Kit推薦方法進(jìn)行。制備的蝎毒腺總RNA采用甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量。得到了高質(zhì)量的蝎毒腺總RNA。
[0019]B:mRNA的分離純化
采用PolyA Tract mRNA分離系統(tǒng)(Promega, USA)分離和純化mRNA,其工作原理是基于寡聚核苷酸Oligo (dT)與mRNA 3’端poly (A)尾的互補(bǔ)配對(duì)特性，用生物素標(biāo)記Oligo (dT),通過(guò)它與mRNA 3’端poly(A)的退火形成雜交體,然后用標(biāo)有親合素的磁珠和磁性分離架捕獲并洗滌生物素Oligo (dT) /mRNA雜交體，最后用無(wú)RNA酶的ddH20將之洗脫下來(lái)，達(dá)到從總RNA中分離mRNA的目的。①樣品的制備:將RNA加入到含有32 P -巰基乙醇的800iU的GTC中。②探針的退火:取250pM濃度011§0((11')5111，加蒸餾水至50111 ；加入1.6ml預(yù)熱的稀釋緩沖液(dilution buffer已加入32 u I ^ -巰基乙醇)，與RNA混勻，70°C溫育5分鐘。③磁珠的活化:取1.2ml的磁珠SA-PMPS (購(gòu)自美Promega)于1.5ml的離心管中；用0.5 X SSC (氯化鈉和檸檬酸三鈉溶液:)重懸SA-PMPS，以磁架吸附磁珠，原體積
0.5 X SSC洗滌SA-PMPS3次。④mRNA的獲取:將70°C溫育的RNA與SA-PMPS混合，室溫放置5分鐘放磁架上吸附磁珠，棄上清液；2ml的0.5XSSC懸浮磁珠，洗滌重復(fù)2次，最后一次盡量去除SSC;加入無(wú)RNA酶的ddH20至磁珠中，輕輕混勻，然后離心(12000gX3分鐘)或磁架吸附磁珠；取上清，獲得mRNA。通過(guò)電泳和紫外測(cè)定mRNA的濃度和純度。⑤mRNA的沉淀:將④獲得的mRNA中加入糖原和2.5倍體積的無(wú)水乙醇，沉淀過(guò)夜，mRNA將用于cDNA的合成。關(guān)于mRNA分離的所有操作步驟見(jiàn)PolyA Tract mRNA分離系統(tǒng)的說(shuō)明書(shū)(Promega,USA)。
[0020]C:第一鏈 cDNA 合成
①在 1.5ml Ep 管中加入 2 u I Not I Primer-adapter 和 6 u I mRNA (含 3 u gmRNA),70°C溫育IOmin,迅速放于冰上，離心后，加入下列成分:4 ii I 5X firststrand buffer ；2 ill 0.1M DTT ； I u I IOmM dNTPs ； I u I H2O0 輕輕混勻后離心，37°C 放至 2min ;②加入5U I逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻后取2iU，加liil[a-32P]dCTP(4iiCi)(示蹤管)。與上述反應(yīng)組分(樣品管)同時(shí)37°C溫育lh，然后放入冰上終止反應(yīng)對(duì)于示蹤管，依次加入43 u I 20mMEDTA(乙二胺四乙酸)和5iU酵母tRNA，混勻后，分別取兩份IOiU點(diǎn)于兩張濾膜上，1份用10% TCA洗3次，每次5min，95%乙醇洗I次，空氣干燥后，放入1.5ml閃爍液中(為1#樣品)；另1份空氣干燥后，放入1.5ml閃爍液(為2#樣品)。另30 ill示蹤液，加1.5 ii 17.5M醋酸氨(NH4Oac)和90 ill無(wú)水乙醇(-20 °C )，混勻后立即14，OOOrpm離心20min,棄上清，加入0.5ml 70%無(wú)水乙酉享(-20°C )，14, OOOrpm離心2min,棄上清，37°C干燥IOmin讓乙醇揮發(fā)，溶于10 ill TEN溶液，加入10 ill 2X加樣緩沖液，取10 ill用于堿性凝膠電泳。用[a-32P]dCTP標(biāo)記ADNA HindIII片段作分子量標(biāo)記；④混勻后室溫下放置15min，加入2 ill 0.2M EDTA終止反應(yīng)。取6 反應(yīng)液和6ml 2X堿性電泳緩沖液混勻，電泳5h后，用7% TCA浸泡20min，直至溴酚蘭變黃。然后用衛(wèi)生紙吸干(8h左右)，進(jìn)行放射自顯影；⑤對(duì)于樣品管，用于第二鏈的合成。
[0021]
【權(quán)利要求】
1.一種新型抗病毒多肽AVP-W2，其特征在于分離的東亞鉗蝎抗病毒的多肽的編碼基因，其序列為SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；其AVP-W2的前體組織形式編碼74個(gè)氨基酸殘基，由22個(gè)殘基信號(hào)肽、17個(gè)殘基成熟肽和35個(gè)殘基前體肽三個(gè)部分組成且具有SEQID N02所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1所述新型抗病毒多肽AVP-W2的制備方法，其特征在于:首先構(gòu)建高質(zhì)量東亞鉗蝎毒腺組織cDNA文庫(kù): (1)蝎毒腺總RNA的分離和mRNA純化； (2)cDNA的第一鏈和第二鏈合成，雙鏈cDNA與pSPORTl載體的連接和轉(zhuǎn)化，獲得蝎毒腺組織cDNA文庫(kù)； (3)在構(gòu)建文庫(kù)的基礎(chǔ)上，隨機(jī)挑選50克隆子進(jìn)行測(cè)序，序列分析發(fā)現(xiàn)W2克隆子為一個(gè)新的東亞鉗蝎抗病毒肽基因，命名為AVP-W2 ； (4)在10ii g/mL時(shí)，AVP-W2對(duì)MeV和HIV的抑制率就可以達(dá)到100%抑制。
3.—種藥物組合物，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的新型抗病毒多肽AVP-W2及一種或多種藥用輔料。
4.權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述的組合物為固體制劑或液體制劑。
5.權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述的固體制劑為膠囊、軟膠囊、片劑、含片、顆粒劑或滴丸；液體制劑為口服液或注射液。
6.權(quán)利要求1所述新型抗病毒多肽AVP-W2在制備治療或預(yù)防麻疹病毒的藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求6所述的新型抗病毒多肽AVP-W2在制備治療或預(yù)防人免疫缺陷病毒的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK103665112SQ201210328863
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月7日
【發(fā)明者】李虹 申請(qǐng)人:天津拓飛生物科技有限公司